CN102409408A - 一种利用微量基因组dna进行全基因组甲基化位点精确检测的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明在Illumina常规标签文库测序及甲基化常规测序基础上，结合常规文库标签测序方法，建立了新的利用微量基因组DNA进行全基因组甲基化位点精确检测的方法。而且本发明在使用微量基因组DNA进行甲基化文库构建时创新性的通过添加外源NA进行重亚硫酸盐高效共处理；同时不需要进行片段大小选择，在重亚硫酸盐处理后直接进行PCR扩增。本发明的方法克服了常规甲基化测序中不能混合样品，PCR扩增效率低及不能对微量DNA样品进行研究的缺点。

Description

一种利用微量基因组DNA进行全基因组甲基化位点精确检测的方法
技术领域
本发明涉及甲基化高通量测序技术领域，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序技术领域。另外，本发明还涉及标签测序技术以及实现多个样品在同一反应体系中进行构建标签文库的方法。本发明的方法特别适用于第二代测序技术，尤其是solexa测序技术。
背景技术
DNA甲基化是研究最为深入的表观遗传学机制，DNA甲基化在维持正常细胞功能、抑制寄生DNA成分对基因组完整性的损害、染色质结构修饰、X染色体失活、基因组印迹、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一[1]。
当今DNA甲基化研究主要方法有：全基因组芯片杂交、全基因组甲基化敏感(非敏感)类限制性内切酶酶切等，特异位点或部分范围基因采用重亚硫酸处理结合甲基化特异PCR等[2]。重亚硫酸盐处理(Bisulfite)结合测序是研究甲基化最常用也是最准确的方法。Illumina GA是当今应用最为普遍的新一代高通量测序仪器，现已经成功应用于全基因组甲基化测序研究[2]，主要流程是：文库构建首先需要将基因组DNA随机打断，然后对目的片段进行末端修复，在目的片段的3’末端连接“A”碱基，将3’末端带有“A”碱基的目的片段与DNA接头(也称为adapter)连接(C位点甲基化修饰)，然后进行重亚硫酸盐处理，之后进行片段选择，最后通过PCR反应将目的片段进行扩增，最后回收含有DNA接头的目的片段文库[2]，见图1。该方法的主要主要缺陷或问题是：1、不能混合多个样品进行甲基化文库构建；2、PCR扩增效率不高，需要多个循环(16个循环以上)扩增后方可得到足够量的文库进行高通量测序；3、文库构建起始需要基因组DNA 5-10μg以上，不适宜微量DNA样品建库。
发明内容
本发明在Illumina常规标签(也称为index)文库测序[3](图2)及甲基化常规测序[2](图1)基础上进行了三点创新的改变：1、将常规文库标签测序方法引入到甲基化测序研究中，并且修改了Illumina公司提供的常规文库标签测序接头序列(表1)，增加了6bp的碱基序列(可作为标签序列)，合成时采用甲基化修饰，增加后续PCR引物长度，对于重亚硫酸盐处理完的DNA这样有效增加了后续PCR扩增效率；2、在使用微量基因组DNA进行甲基化文库构建时创新性的通过添加外源DNA进行重亚硫酸盐高效共处理，对微量的DNA片段起到保护作用，最大限度的降低重亚硫酸盐对微量DNA的破坏，使得纳克级别(30-100ng)基因组整体水平高精度的甲基化检测成为现实；3、改变Illumina甲基化常规测序在重亚硫酸盐处理之前要经过片段大小选择，然后再进行PCR扩增的流程，摸索出了一个不需要进行片段大小选择，在重亚硫酸盐处理后直接进行PCR扩增的条件。克服了常规甲基化测序中不能混合样品，PCR扩增效率低及不能对微量DNA样品进行研究的缺点。本发明的微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库构建流程图参见图3。
表1基于Illumina GA的微量DNA全基因组甲基化高通量测序相关序列(5’-＞3’)
Figure BSA00000293360500021
本发明一方面提供了全基因组甲基化高通量测序的方法，在具体的实施方式中所述方法包括如下步骤：
步骤A目的基因组DNA及外源基因组DNA的片段化
起始目的研究材料和作为外源基因组DNA的材料可以为任意物种(例如人，植物，昆虫)的基因组DNA，片段化常用的方法包括雾化、超声片段化、HydroShear或酶切处理，将基因组DNA打断为大小100-200bp的片段。上述众多常用方法中优选地采用超声片段化法，外源基因组DNA优选地选择拟南芥基因组DNA。
步骤B基因组DNA的末端修饰
片段化的DNA需要进行末端修饰，首先利用聚合酶如Klenow、T4聚合酶和T4多聚核苷酸激酶以及dNTP补平末端，以产生平端化的DNA。然后利用Klenow Frgment(3’-5’exo-)聚合酶及dATP在补平的序列的3’末端加上“A”碱基。
步骤C微量建库接头连接及重亚硫酸盐处理
3’末端加上“A”碱基的序列在T4连接酶的作用下与特殊设计且甲基化修饰的微量建库接头(C位点甲基化修饰)进行连接。然后在两端加了接头的片段中加入200ng片段化了的拟南芥基因组DNA，然后一起用重亚硫酸盐处理，从而使非甲基化胞嘧啶转换为尿嘧啶。
步骤D PCR扩增及文库切胶纯化
以重亚硫酸盐转换后的DNA为模板，加入针对微量建库接头序列特别别设计的PCR引物序列，用针对重亚硫酸盐转换后的DNA的热启动taq酶进行PCR扩增(可用常规的r-taq或其它聚合酶扩增)，扩增产物使用2％的琼脂糖进行电泳并将目的条带切下纯化后，即为待测序的文库。PCR扩增优选地使用热启动taq酶。
本发明与现有甲基化高通量测序技术相比的优点有：1、使用PCR扩增效率更高的特殊的针对微量DNA甲基化建库的接头(Minimadapter)替代了常规文库使用的接头，与常规接头相比改变了部分序列，序列长度增加了8bp的碱基(可作为标签序列用于混合多个样品的测序)，对于重亚硫酸盐处理完的DNA增加了后续PCR扩增效率及产物量，相同材料等量起始建库，相同PCR条件下产物浓度由1.67ng/μl提高到了20.04ng/μl(见实施例结果部分图6-8)；2、在使用微量基因组DNA进行甲基化文库构建时，创新性的添加外源载体DNA与目的DNA一起进行重亚硫酸盐高效共处理。在高温和重亚硫酸盐(高盐及低pH值环境)双重作用下变性的单链DNA极易破坏和降解，加入外源DNA对这种破坏作用起到一定的缓冲作用，能够最大限度的降低重亚硫酸盐对微量DNA的破坏，另外也因为DNA量的增多使得后续纯化效率提高，使得纳克级别(30-100ng)基因组整体水平高精度的甲基化检测成为现实。3、改变了Illumina甲基化常规测序在重亚硫酸盐处理之前和之后需要经过片段大小选择然后再进行PCR扩增的流程，摸索出了一个不需要进行片段大小选择，在重亚硫酸盐处理后直接进行PCR扩增的条件，具体见实施例详细参数，主要改变了末端修复酶的用量和接头链接步骤接头的加入量(减少至常规建库用量的1/10)。本发明的方法克服了常规甲基化测序中不能混合样品，PCR扩增效率低及不能对微量DNA样品进行研究的缺点。对于低样本量的样品也可进行全基因组甲基化精确研究。
本发明一方面提供了构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法，所述方法用于微量基因组DNA，优选的是纳克级别的基因组，更优选的是30-100ng的基因组。
在本发明的一个具体实施方式中，所述方法包括如下步骤：
步骤A目的基因组DNA及外源基因组DNA的片段化
目的基因组DNA和作为外源基因组DNA的材料可以为任意物种，其中包括各种植物、动物、微生物，例如人，植物特别是拟南芥，昆虫，特别是哺乳动物包括人、小鼠的基因组DNA；进行片段化的方法包括雾化、超声片段化、HydroShear或酶切处理，从而将基因组DNA打断为大小优选地为100-200bp的片段；片段化方法中优选地采用超声片段化法，外源基因组DNA优选地选择拟南芥基因组DNA；
步骤B基因组DNA的末端修饰
对于经片段化的DNA，首先利用聚合酶包括但不限于Klenow、T4聚合酶和T4多聚核苷酸激酶以及dNTP补平末端，以产生平端化的DNA；然后优选地利用Klenow Frgment(3’-5’exo-)聚合酶及dATP在补平的序列的3’末端加上“A”碱基。
步骤C微量建库接头连接及重亚硫酸盐处理
将所得到的3’末端加上“A”碱基的DNA序列在连接酶包括但不限于T4连接酶的作用下与经甲基化修饰，优选地C位点甲基化修饰的微量建库接头进行连接，优选地在序列两端都连接上微量建库接头；然后在两端加了接头的片段中加入100-500ng，优选的200ng步骤A中片段化了的拟南芥基因组DNA，然后一起用重亚硫酸盐处理，优选地处理2小时，从而使非甲基化胞嘧啶转换为尿嘧啶；
步骤D PCR扩增及文库切胶纯化
以所得到的重亚硫酸盐转换后的DNA为模板，加入针对微量建库接头序列的PCR引物序列，进行PCR扩增；PCR扩增优选地使用热启动taq酶，所述热启动taq酶包括但不限于常规的r-taq或其它聚合酶，扩增产物使用优选地2％的琼脂糖进行电泳并将目的条带切下纯化后，即为待测序的文库。
在本发明的一个具体实施方式中，所述方法步骤C中使用的微量建库接头是表1中所示的Minim_adapter 1和Minim_adapter 2。
在本发明的一个具体实施方式中，所述方法步骤D中使用的PCR引物是表1中所示的Minim_PCR primer 1.1和Minim_PCR primer2.1。
本发明另一方面提供了通过上文所述的方法构建的测序文库，优选地是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库。
本发明另一方面进一步提供了通过上文所述的方法构建的测序文库，优选地是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库用于进行测序的用途，其中所述测序可通过第二代测序平台进行。
本发明另一方面提供了用于微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库的接头，其是表1中所示的Minim_adapter1和Minim_adapter 2。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的接头用于构建微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库的用途。
在本发明的一个具体实施方式中，使用上文所述的接头构建的微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库。
本发明另一方面还提供了用于微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库的PCR引物，其是表1中所示的Minim_PCR primer 1.1和Minim_PCR primer 2.1。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的PCR引物用于构建微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库的用途。
在本发明的一个具体实施方式中，使用上文所述的PCR引物构建的微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库。
附图说明
图1：常规甲基化测序文库制备流程。
图2：Illumina公司常规DNA标签建库流程图。
图3：本发明的基于Illumina GA的微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库构建流程图。
图4：Illumina公司常规DNA标签建库原理示意图。
图5：本发明的基于Illumina GA的微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库构建原理示意图。
图6：100ng微量DNA起始微量建库，按照本发明方法，PCR扩增产物的安捷伦2100检测结果。
图7：30ng微量DNA起始微量建库，按照本发明的方法，PCR扩增产物的安捷伦2100检测结果。
图8：100ng起始基因组DNA，采用常规Illumina接头，按照本发明方法建库所得PCR扩增产物2100检测结果。
图9：微量建库(100ng DNA)与常规建库(5ug DNA)测序数据对整个基因组各染色体测序深度比较结果。
图10：微量建库(100ng DNA)与常规建库(5ug DNA)测序数据对染色体覆盖度比较结果。
图11：微量建库(100ng D NA)与常规建库(5ug DNA)测序数据甲基化模式比较。
图12：微量建库(100ng DNA)与常规建库(5ug DNA)测序数据甲基化相关性的比较分析。其中Methylation rate of YH_3.5G表示YH_3.5G的甲基化率，Methylation rate of 100ng表示100ng DNA微量建库的甲基化率。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
使用本发明的方法，我们以30ng和100ng人外周血全基因组DNA(一个中国成年男子血液提取的基因组DNA)为起始原料，构建了2个微量全基因组甲基化高通量测序文库，采用sanger测序方法检测了2个文库的质量，并对其中100ng文库进行了高通量全基因组测序(Illumina GA)。同时比较了以100ng人外周血全基因组DNA(一个中国成年男子血液提取的基因组DNA)为起始材料使用本发明的微量建库方法，接头分别采用常规建库接头(Illumina adapter1和Illumina adapter2)和微量接头(Minim_adapter1和Minim_adapter2)后的PCR扩增效率的差异。
1、实验部分：
主要实验仪器列表
Figure BSA00000293360500081
相关试剂列表
Figure BSA00000293360500082
1.1DNA片段化
使用超声仪(covaris S2)将人全血基因组DNA(30ng和100ng)及拟南芥基因组DNA(5μg)按下表参数设置打断成主带(琼脂糖凝胶电泳中显示的主要条带)在100-200bp左右的片段。超声仪(covarisS2)的参数(下表中适当标注中文)设置：
Figure BSA00000293360500092
打断后的DNA直接进行下一步操作。
1.2末端修复
按照下列的配比准备反应混合：
打断后的DNA片段                     100μL
10x Polynucleotide Kinase Buffer    15μL
dNTP Solution Set                   6μL
T4DNA聚合酶                         7.5μL
Klenow DNA聚合酶                    1μL
H2O                        13μL
T4Polynucleotide Kinase    7.5μL
                                                  
总体积                     100μL
将Thermomixer(Eppendrf)调至20℃，反应30min，然后用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)进行纯化，最后将样品溶于32μL Elution Buffer(EB)。
1.3DNA片段3′末端加“A”碱基
按照下列的配比准备反应混合物：
末端修复后的DNA              32μL
10x blue buffer              5μL
dATP(1mM)                    10μL
Klenow exo-(3′to 5′exo-)   3μL
                                                 
总体积                       50μL
将Thermomixer(Eppendrf)调至37℃，反应30min，然后用MiniElute PCR Purification Kit(Qiagen)进行纯化，最后将样品溶于10μL Elution Buffer。
1.4Minim_adapter连接
将合成好的100μM的Minim_adapter 1和Minim_adapter 2分别取10μL进行混合，94℃，5分钟，65℃水浴放置15分钟后自然冷却，得到50μM Minim_adapter产物，将50μM Minim_adapter产物稀释10倍为5μM Minim_adapter工作液。
Minim_adapter连接按照下列的配比准备反应混合物：
上述步骤中得到的DNA    10μL
T4DNA ligase buffer    25μL
Minim_adapter(5μM)    1μL
DNA ligase             5μL
ddH2O                  9μL
                                             
总体积                 50μL
将Thermomixer(Eppendrf)调至20℃，反应15min，然后用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)进行纯化，最后将样品溶于30μL EB。
1.5连接产物加入外源DNA重亚硫酸盐共处理
连接产物中加入200ng片段化的外源拟南芥基因组DNA，然后加入重亚硫酸盐处理2h。重亚硫酸盐处理采用ZYMO EZ DNAMethylation-Gold KitTM，具体步骤如下：A)CT Conversion Reagent的制备：从试剂盒试剂盒中取出CT Conversion Reagent(固体混合物)，然后添加900μl的水、50μl的M-Dissolving Buffer和300μl的M-Dilution Buffer到一管的CT Conversion Reagent中。在室温下溶解并且震荡10分钟或在摇床上摇动10分钟.
B)M-WASH BUFFER的制备：添加24ml 100％的乙醇到M-Wash Buffer中来制备最终可以使用的M-Wash Buffer。
C)将待转换的DNA按照分装到PCR管中，补水至20ul。
D)PCR管中添加130μl的CT Conversion Reagent，通过轻弹试管或移液器操作来混合样品。
E)将样品管放到PCR仪上按以下步骤操作：
98℃放置10分钟
64℃放置2.5小时
立刻进行下一步操作或者在4℃下存储(最多20小时).
F)添加600μl的M-Binding Buffer到Zymo-Spin ICTM Column中，并将柱放如试剂盒所提供的Collection Tube中。
G)装填样品到Zymo-Spin ICTM Column含有M-Binding Buffer。盖上盖将柱颠倒数次来混合样品。
H)全速(＞10,000xg)离心30秒，去除流出液。
I)添加200μl的M-Wash Buffer到柱中，全速离心30秒。
J)添加200μl的M-Desulphonation Buffer到柱中并且在室温(20℃一30℃)下放置15分钟，在培养后，全速离心30秒。
K)添加200μl的M-Wash Buffer到柱中，全速离心30秒；再添加200μl的M-Wash Buffer并且离心30秒。
L)直接添加10μl的M-Elution Buffer到柱基质中。将柱放置在1.5ml的管中，全速离心来洗脱DNA。
1.6PCR扩增及文库大小选择
下列的反应体系准备反应混合物，将试剂放置于冰上。
重亚硫酸盐处理的DNA             20μl
Minim_PCR primer 1.1            1μl
Minim_PCR primer 2.1            1μl
dNTP Solution Set               4μl
10X PCR Buffer                  5μl
JumpStartTM Taq DNA Polymerase  0.5μl
ddH2O                           18.5μl
                                                    
总体积                          50μl
PCR反应条件
98℃    30s
Figure BSA00000293360500121
(注：30ng 12个循环，100ng 10个循环)
72℃    2min
4℃     保存
用PCR Purification Kit(Qiagen)对扩增产物进行纯化，然后用2％的琼脂糖胶进行电泳，然后对目的大小文库进行切胶选择，采用MiniElute PCR Purification Kit(Qiagen)进行胶纯化回收，最后将文库溶于20ul EB中。
1.7文库检测
1)使用安捷伦2100Bioanalyzer检测文库产量[4]。
2)使用QPCR定量检测文库产量[4]。
2、结果部分：
2.1PCR产物的安捷伦2100Bioanalyzer检测结果
图6和图7的PCR产物安捷伦2100Bioanalyzer检测结果表明从起始基因组DNA 30ng和100ng即可构建利用高通量新一代测序仪器进行高通量测序的甲基化文库，结合下文所述实际测序数据分析结果表明该发明方法切实可行，可应用与实际研究中。
图8是采用常规Illumina接头按照本发明的微量建库方法，所得PCR扩增产物的安捷伦2100Bioanalyzer检测结果，对比图6和图7发现PCR产物虽有目的条带，但条带不明显，浓度达不到高通量测序要求。比较可以看出本发明方法切实提高了PCR扩增效率，为后续测序提供了可能。
2.2文库质量检测结果(Sanger测序法)
表230ng DNA与100ng DNA微量建库文库质量检测结果
Figure BSA00000293360500131
2个文库分别挑选76和78个克隆进行质量检测，结果转换效率都在99％以上，说明重亚硫酸盐处理实现了高效的转换。100ng文库比对率(也称为map rate)高于30ng，说明起始量对建库结果有较大影响，但30ng起始比对率在40％以上，考虑到起始的DNA量，这样的结果在可接受范围。另外从序列重复率来看，都没有重复序列，说明PCR扩增随机性很好，没有产生偏向性。
3、测序(Illumina GA)结果信息高级分析部分
取上述构建的100ng文库进行高通量测序并与常规建库(常规建库方法：使用5ug与上述实施例中相同的人的全血基因组相同的DNA，使用常规甲基化测序文库制备流程进行文库制备，见图1)测序结果进行高级比对分析，将100ng文库测序数据2.52G的原始数据和正常全基因组测序1.99G数据比较，常规建库数据以YH_3.4G表示。
3.1与全基因组比对率比较
表3微量建库(100ng DNA)与常规建库(5ug DNA)测序数据结果基本比对结果
  样品   原碱基数量(Gb)   比对的碱基数量(Gb)   比对率(％)
  100ng   2.52   1.33   52.65
  YH_3.5G   1.99   1.19   59.74
3.2对全基因组覆盖度比较
表4微量建库(100ng DNA)与常规建库(5ug DNA)测序数据对全基因组覆盖度比较
  样品   全部位点的覆盖率(％)   CG的覆盖率(％)
  100ng   32.13   19.16％
  YH_3.5G   26.97   16.08％
3.3对每条染色体的覆盖度比较(参加以下表5和图9)
表5微量建库(100ng DNA)与常规建库(5ug DNA)测序数据在每条染色体上的覆盖度比较结果
Figure BSA00000293360500151
比较结果来看微量建库和常规建库数据在每条染色体上的覆盖度趋势基本一致。
3.4全基因组甲基化模式比例比较(参见表6、表7和图11、图12)
表6微量建库(100ng DNA)与常规建库(5ug DNA)测序数据甲基化模式整体分析比较结果
  模式   C   CG   CHG   CHH
  100ng   4.05   71.46   0.8   0.89
  YH_3.5G   4.49   77.5   0.28   0.36
表7微量建库(100ng DNA)与常规建库(5ug DNA)测序数据甲基化模式在每条染色体上的分析比较结果
比较结果表明微量建库和常规建库数据无论在整体还是每条染色体上的甲基化模式分布上基本一致。
3.5数据相关性比较
100ng文库测序数据和正常建库相应测序数据进行甲基化相关性的比较分析，结果来看相关性很好(相关系数0.9258572)。
通过将100ng文库测序数据与常规文库测序相应数据进行高级信息分析比较结果来看，从比对效率、覆盖度、每条染色体的甲基化率及相关性来看，100ng测序数据比对情况更理想，各方面覆盖率都相对好一些，但从甲基化变化趋势上仍是很一致的，在甲基化率上，也有很好的一致性。这些都说明了采用微量DNA进行甲基化全基因组高通量测序研究室切实可行的，为甲基化研究样品少，不易获得的瓶颈提供了很好的解决方案。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
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Figure ISA00000293360700021

Claims (11)

1.构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法，所述方法用于微量基因组DNA，优选的是纳克级别的基因组，更优选的是30-100ng的基因组，所述方法包括如下步骤：
步骤A目的基因组DNA及外源基因组DNA的片段化
目的基因组DNA和作为外源基因组DNA的材料可以为任意物种，其中包括各种植物、动物、微生物，例如人，植物特别是拟南芥，昆虫，特别是哺乳动物包括人、小鼠的基因组DNA；进行片段化的方法包括雾化、超声片段化、HydroShear或酶切处理，从而将基因组DNA打断为大小优选地为100-200bp的片段；片段化方法中优选地采用超声片段化法，外源基因组DNA优选地选择拟南芥基因组DNA；
步骤B基因组DNA的末端修饰
对于经片段化的DNA，首先利用聚合酶包括但不限于Klenow、T4聚合酶和T4多聚核苷酸激酶以及dNTP补平末端，以产生平端化的DNA；然后优选地利用Klenow Frgment(3’-5’exo-)聚合酶及dATP在补平的序列的3’末端加上“A”碱基；
步骤C微量建库接头连接及重亚硫酸盐处理将步骤B所得到的3’末端加上“A”碱基的DNA序列在连接酶包括但不限于T4连接酶的作用下与经甲基化修饰，优选地C位点甲基化修饰的微量建库接头进行连接，优选地在序列两端都连接上微量建库接头；然后在两端加了接头的片段中加入100-500ng，优选的200ng步骤 A中片段化了的拟南芥基因组DNA，然后一起用重亚硫酸盐处理，优选地处理2小时，从而使非甲基化胞嘧啶转换为尿嘧啶；
步骤D PCR扩增及文库切胶纯化
以步骤C所得到的重亚硫酸盐转换后的DNA为模板，加入针对微量建库接头序列的PCR引物序列，进行PCR扩增；PCR扩增优选地使用热启动taq酶，所述热启动taq酶包括但不限于常规的r-taq或其它聚合酶，扩增产物使用优选地2％的琼脂糖进行电泳并将目的条带切下纯化后，即为待测序的文库。
2.权利要求1所述的方法，其中步骤C中使用的微量建库接头是表1中所示的Minim_adapter 1和Minim_adapter 2。
3.权利要求1所述的方法，其中步骤D中使用的PCR引物是表1中所示的Minim_PCR primer 1.1和Minim_PCR primer 2.1。
4.通过权利要求1-3中任一项所述的方法构建的测序文库，优选地是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库。
5.通过权利要求1-3中任一项所述的方法构建的测序文库，优选地是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库用于进行测序的用途，其中所述测序可通过第二代测序平台进行。
6.用于微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库的接头，其是表1中所示的Minim_adapter 1和Minim_adapter2。
7.权利要求6所述的接头用于构建微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库的用途。
8.使用权利要求6所述的接头构建的微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库。
9.用于微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库的PCR引物，其是表1中所示的Minim_PCR primer 1.1和Minim_PCR primer 2.1。
10.权利要求9所述的PCR引物用于构建微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库的用途。
11.使用权利要求9所述的PCR引物构建的微量测序文库，特别是微量DNA全基因组甲基化高通量测序文库。
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