CN109971843B - 一种单细胞转录组的测序方法 - Google Patents
一种单细胞转录组的测序方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种单细胞转录组的测序方法。本发明使用了PAP/PGP在RNA链的尾部加入多聚A/G，使RNA稳定性增加，同时产一条可以用于逆转录和cDNA合成的延伸链。本发明在下游进行有效RNA富集时，采用标记核糖体DNA探针的磁珠纯化小片段PCR非特异性产物，使用半退火夹板杂交，去除5s，5.8s，18s和28s大小的cDNA形式存在的rRNA，并在测序时减少大量无效的Reads数。本发明可以对单个真核细胞进行一站式non‑coding RNA、microRNA和mRNA的总转录组测序并产生该转录组的表达矩阵，摆脱了一个细胞只能进行一种测序的应用局限。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种单细胞转录组的测序方法，尤其针对单细胞总RNA或单细胞长链非编码RNA的测序方法。
背景技术
测序是对基因的序列进行判断的一种方法。每个物种的基因控制生物性状的表达，而测序是指对基因的序列进行判断。第一代DNA测序技术(又称Sanger测序)在1975年，由Sanger等人开创，并在1977年完成第一个基因组序列(噬菌体X174)，全长5375个碱基。研究人员经过30年的实践并对技术及测序策略的不断改进(如使用了不同策略的作图法、鸟枪法)，2001年完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。Sanger测序虽读长较长、准确性高，但其测序成本高通量低等缺点，使得denovo测序、转录组测序等应用难以普及。经过数据不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术，ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生。
第二代测序技术的核心思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。当前在二代测序领域(Next Generation Sequencing)，RNA测序因其可分析体内转录组的表达水平、基因融合和选择性剪切等细胞生物学过程而广受研究者使用。
传统的RNAseq在进行细胞研究时，通常需要数十万到数百万细胞当量的RNA作为模板进行测序(100ng-5ug)。另一方面，由于细胞普遍存在个体差异，而一群细胞的基因表达水平，并无法确定和鉴别每个细胞的自身转录的异质性。
单细胞中的RNA含量较低，通常仅10～20pg，大约合105～106个RNA分子，建库方法的技术难度也较传统组织样本的RNA建库要大得多。
单细胞RNA-Seq(转录组测序)是通过对单个细胞的mRNA进行逆转录和PCR扩增，使用高通量测序手段，对单细胞中mRNA进行基因表达定量、功能富集、代谢通路等分析。它可以解决传统RNA定量技术在早期胚胎发育、干细胞、癌症、免疫等研究领域中存在的样品量极低或细胞异质性的问题，是在单细胞水平研究基因表达强有力的工具，极大地拓展了RNA-Seq的应用范围。
2009年，Tang等人首次使用单细胞RNA测序技术(single cell RNA-Seq,scRNA-Seq)，成功对单个哺乳动物细胞转录组进行精确测序。2012年，
等人利用Template Switching技术，建立了SMARTer-Seq单细胞RNA测序技术，针对3’端偏倚现象进行了矫正，保留了较高的5’读长，并成功测序循环肿瘤细胞。同年，Tamar等人利用IVT(invitro transcription)技术进行cDNA扩增，并建立Cel-seq方法，该方法能够较好地还原细胞中各基因的表达水平之间的比例。2013年，Picelli针对SMARTer-Seq进行技术改良，并建立SMART-Seq2技术，将基因检出数从原本的8000种基因/细胞，提高到了12000种/细胞。同年，Pan等人利用RCA(rolling circle amplification)进行cDNA扩增，可以从K562细胞中检测出大约5000个基因[8]。2014年，Islam等人采用UMI(Unique Molecule Identifier)技术进行RNA标记，并可以减少测序造成的背景噪音和PCR造成的扩增偏倚，并提高不同RNA转录本的检出灵敏度。2014年，Pollen等人在SMART-Seq2方法的基础上，利用微流控(microfluidics)设备FluidigmC1进行了301个样本的高通量同步浅深度测序，实现了大样本。2015年，Fan等人采用细胞捕获磁珠和polyA抓取磁珠方法，建立了同步可以检测10000-100000个细胞的高通量单细胞测序方法。同年，Fan等人建立了随机引物方法针对circRNA进行测序，并可以在受精卵胚胎细胞中检测出2891个CircRNA。表明目前的RNA单细胞测序方法不仅可以进行蛋白编码RNA的测序，还可以针对circRNA进行测序。
然而目前所有的单细胞RNA-Seq方法都采用了含有oligo(dT)方法针对带polyA尾的RNA进行逆转录，这个方法可以有效摆脱核糖体RNA(rRNA)的干扰，但无法检测那些不带polyA尾的RNA(上述针对环状circRNA测序除外)，例如无A尾的长链非编码RNA等，尚无总RNA或长链非编码RNA的单细胞RNA的测序方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷提供一种单细胞转录组的测序方法，尤其针对单细胞总RNA或单细胞长链非编码RNA的测序方法，可以一站式检测non-coding RNA、microRNA和mRNA的总转录组。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种单细胞转录组的测序方法，包括以下步骤：
1)细胞系经酶解消化后获得单细胞，裂解获得RNA；
2)进行PolyA和PolyG聚合酶反应使得RNA链的尾部加入多聚A/G；
3)TSO逆转录和PCR前扩增；
4)利用标记核糖体DNA探针的磁珠纯化小片段PCR非特异性产物；
5)Tn5随机片段化反应，掺入分选标签和扩大PCR，控制浓度、片段长度，pooling和上机测序。
作为优选，所述PolyA聚合酶反应具体为先将CLB与H2O、DTT、MnCl2、ATP混合37℃反应3min，然后加入Poly(A)Polymerase和0.5％BSA 37℃反应15min或30min，随后与dNTPs混合物、oligo dT、ERCC spike-ins和H2O混合72℃反应3分钟。
作为优选，所述PolyG聚合酶反应具体为先将CLB与H2O、DTT、MnCl2、ATP混合37℃反应3min，然后加入Poly(G)Polymerase和0.5％BSA 37℃反应5min或15min，随后与dNTPs混合物、oligo dC、ERCC spike-ins和H2O混合72℃反应3分钟。
作为优选，所述逆转录的反应体系为
反应程序为：90分钟42℃，10次循环(50℃2分钟+42℃2分钟)，70℃15分钟，4℃终止反应。
作为优选，所述PCR前扩增反应体系为：
反应程序为：98℃3分钟，16次循环(98℃20秒+67℃5秒+72℃6分钟)，72℃5分钟，4℃终止反应。
作为优选，所述标记核糖体DNA探针分别为SEQ ID NO:1-4所示5sDNA、SEQ ID NO:5-8所示5.8sDNA、SEQ ID NO:9-14所示18sDNA、SEQ ID NO:15-21所示28sDNA。
作为优选，所述扩大PCR的反应体系为：
反应程序为：72℃3分钟，95℃30秒，12次循环(95℃10秒+55℃30秒+72℃30秒)，72℃5分钟，10℃终止反应。
作为优选，所述测序深度为10M reads/样本，读长50SE。
由上述技术方案可知，本发明公开了一种单细胞转录组的测序方法。本发明使用了PAP(PolyA Polymerase)/PGP(PolyG Polymerase)在RNA链的尾部加入多聚A/G，使RNA稳定性增加，同时产一条可以用于逆转录和cDNA合成的延伸链。由于本发明对所有RNA都进行扩增的技术，导致rRNA也随之线性扩增，在测序过程中会产生了大量无效的Reads数，本发明在下游进行有效RNA富集时，采用标记核糖体DNA探针的磁珠纯化小片段PCR非特异性产物，使用半退火夹板杂交，去除5s，5.8s，18s和28s大小的cDNA形式存在的rRNA，有效去除cDNA形式的rRNA，并在测序时减少大量无效的Reads数。本发明可以对单个真核细胞进行一站式non-coding RNA、microRNA和mRNA的总转录组测序并产生该转录组的表达矩阵，摆脱了一个细胞只能进行一种测序的应用局限。
具体实施方式
本发明公开了一种单细胞转录组的测序方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1、
对5种常见的细胞系单细胞总RNA测序，具体实施步骤如下。
1、采用1％的Trypsin消化LNCaP、T24、PC3、HEK293t、C2C12细胞10～15分钟，至单个细胞状态，分别重悬于PBS，并用毛细管吸取每种细胞各6个后分别裂解于CLB。
2、PolyA聚合酶反应:按照表1配置细胞裂解体系，先CLB与H2O、DTT、MnCl2、ATP混合37℃反应3min，然后加入Poly(A)Polymerase和0.5％BSA 37℃反应5min或15min。按照表2配制PolyA Polymerase反应液，并于72℃反应3分钟后置于冰上。
表1 细胞裂解体系
表2 PolyA Polymerase反应液配方
| SINGLE-CELL CUSTOM SMARTER | 1T |
| PAP反应缓冲液 | 5μl |
| dNTPs混合物(10mM) | 1.00μl |
| oligo dT(10μM) | 1.00μl |
| ERCC spike-ins(2.5×10<sup>5</sup>稀释) | 0.10μl |
| H<sub>2</sub>0 | 0 |
| 反应体系总量(μl) | 7.10 |
3、按照步骤2进行PolyG聚合酶反应，其中上述表1中PolyA替换为PolyG，按照表2中oligo dT替换为oligo dC，并于72℃反应3分钟后置于冰上。
4、TSO逆转录：
在Biorad CFX96 PCR仪上进行RT-PCR反应。反应体系如表3。
表3 RT-PCR反应体系
反应程序为：90分钟42℃，10次循环(50℃2分钟+42℃2分钟)，70℃15分钟，4℃终止反应。
5、PCR前扩增：PCR master mix体系配置如表4。
表4 PCR master mix体系
| 反应物 | 1T |
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix(2×) | 12.50μl |
| ISPCR引物(10μM) | 0.20μl |
| H<sub>2</sub>O | 2.30μl |
| 第一链cDNA生物 | 10.00μl |
| 反应体系总量(μl) | 25.00μl |
反应程序：98℃3分钟，16次循环(98℃20秒+67℃5秒+72℃6分钟)，72℃5分钟，4℃终止反应，最终得到大约100ng的总cDNA量。
6、磁珠纯化小片段PCR非特异性产物:19％PEG8000+分别标记SEQ ID NO:1-4所示5sDNA、SEQ ID NO:5-8所示5.8sDNA、SEQ ID NO:9-14所示18sDNA、SEQ ID NO:15-21所示28s的DNA探针的BD磁珠，用80％乙醇清洗两遍后晾干，并用17μl EB(1mMTris-HCl)洗脱。将cDNA的样品放置热循环仪，95℃30秒，60℃30秒，加入Ribozero A Beads，取出磁珠，加入PBS洗两次，获得去除5s、5.8s、18s、28s核糖体cDNA的cDNA样品。
7、Tn5随机片段化反应：取1ng步骤6获得的cDNA样品，按照试剂盒说明(Illmina公司)进行Tn5Tagmentation反应，55℃反应5分钟，后加入5μl 0.2％SDS，室温反应5分钟。
8、掺入分选标签和扩大PCR：在Biorad CFX96PCR仪上进行RT-PCR反应，反应体系如表5。
表5 RT-PCR反应体系
反应程序为：72℃3分钟，95℃30秒，12次循环(95℃10秒+55℃30秒+72℃30秒)，72℃5分钟，10℃终止反应。
9、控制浓度、片段长度，pooling和上机测序：测序深度为10M reads/样本，读长50SE。
结果显示，在极低浓度RNA的模拟样本LNCaP细胞，经过15分钟和30分钟总转录组建库后，可以匹配在mRNA、lincRNA、microRNA和rRNA，以及其他区域的未知RNA的reads总数都有非常高的提升。尤其是在15分钟后，lincRNA提升了300％～500％，microRNA提升了10000％～30000％。
T24、PC3、HEK293t、C2C12细胞单细胞转录组测序结果与上述结果相似。
序列表
<110> 复旦大学泰州健康科学研究院
<120> 一种单细胞转录组的测序方法
<130> MP1726582
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Claims (6)
1.一种单细胞转录组的测序方法，包括以下步骤：
1)细胞系经酶解消化后获得单细胞，裂解获得RNA；
2)进行PolyA和PolyG聚合酶反应使得RNA链的尾部加入多聚A/G；
3)TSO逆转录和PCR前扩增；
4)利用标记核糖体DNA探针的磁珠纯化小片段PCR非特异性产物；所述标记核糖体DNA探针分别为SEQ ID NO:1-4所示5sDNA、SEQ ID NO:5-8所示5.8sDNA、SEQ ID NO:9-14所示18sDNA、SEQ ID NO:15-21所示28sDNA；
5)Tn5随机片段化反应，掺入分选标签和扩大PCR，控制浓度、片段长度，pooling和上机测序；
所述扩大PCR的反应体系为：
反应程序为：72℃3分钟，95℃30秒，12次循环：95℃10秒+55℃30秒+72℃30秒，72℃5分钟，10℃终止反应。
2.根据权利要求1所述的测序方法，所述PolyA聚合酶反应具体为先将CLB与H2O、DTT、MnCl2、ATP混合37℃反应3min，然后加入Poly-A-Polymerase和0.5％BSA 37℃反应15min或30min，随后与dNTPs混合物、oligo dT、ERCC spike-ins和H2O混合72℃反应3分钟。
3.根据权利要求1或2所述的测序方法，所述PolyG聚合酶反应具体为先将CLB与H2O、DTT、MnCl2、ATP混合37℃反应3min，然后加入Poly-G-Polymerase和0.5％BSA 37℃反应5min或15min，随后与dNTPs混合物、oligo dC、ERCC spike-ins和H2O混合72℃反应3分钟。
4.根据权利要求1-2任意一项所述的测序方法，所述TSO逆转录的反应体系为
反应程序为：90分钟42℃，10次循环：50℃2分钟+42℃2分钟，70℃15分钟，4℃终止反应。
5.根据权利要求1-2任意一项所述的测序方法，所述PCR前扩增反应体系为：
反应程序为：98℃3分钟，16次循环：98℃20秒+67℃5秒+72℃6分钟，72℃5分钟，4℃终止反应。
6.根据权利要求1-2任意一项所述的测序方法，所述测序深度为10Mreads/样本，读长50SE。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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