CN105200041B - 用于构建单细胞转录组测序文库的试剂盒及文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种单细胞转录组测序文库的构建方法。通过将前期构建的测序用DNA片段文库用RsaI限制性内切酶进行酶切，并对酶切产物进行PCR扩增，能够显著提高对单细胞转录组测序文库进行测序时的有效数据比例。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及单细胞转录组测序文库的构建方法、单细胞转录组测序方法及用于构建单细胞转录组测序文库的试剂盒。
背景技术
全基因组范围内的转录组分析被广泛应用，早期的方法是从大量的组织样品中获取RNA进行测序。但此传统方法依赖于一次性总体分析数百万个细胞的基因表达，往往会掩盖特异组织中某些特化细胞具有生物学意义的基因表达差异。并且，在健康组织或肿瘤等病变组织中，某些细胞的数量稀少，除了单细胞方法没有任何其他的技术能够对它们进行分析。
单细胞基因表达分析则克服了这些局限，可用于在全基因组范围内挖掘基因调节网络，尤其适用于存在高度异质性的干细胞及胚胎发育早期的细胞群体。与活细胞成像系统相结合，单细胞转录组分析更有助于深入理解细胞分化、细胞重编程及转分化等过程及相关的基因调节网络。将此技术应用于临床，理论上可以在生理或病理情况下连续追踪基因表达的动力学变化，从而监测疾病的进展。单细胞转录组分析的另一应用领域是发现亚细胞成分的基因表达谱，例如对在神经元的轴突或树突部分特异表达的基因的转录组的分析，这些基因往往对细胞的生物学功能发挥着重要作用。
1990年，Norman Iscove的课题组首次证实对单细胞进行转录组分析是可行的，他们用PCR技术实现了对cDNA分子的指数级扩增。在20世纪90年代初期，Eberwine等人发明了一种新技术，能够从单个的活神经元细胞中 获得cDNA，并且再以这些cDNA为模板转录生成RNA，实现RNA的线性扩增。随着芯片时代的来临，科学家们用这些线性、和指数级扩增技术对单细胞之间的基因表达差异进行了大量的比较和研究。
2008年时出现了高通量RNA测序技术，不久之后，这种技术与前面发展起来的核酸扩增技术结合起来，对单细胞转录组进行了更加精细的研究。2009年，英国剑桥大学Gurdon研究所Tang通过对单个小鼠卵裂细胞(blastomere)的研究发现，与芯片技术相比，利用单细胞转录组技术可以多发现数千个基因的表达情况(Nat.Methods 6,377–382,2009)。原本用于单细胞芯片研究的流程被用于单细胞mRNA-Seq测序，但是从单细胞中很难得到较好的数据，不能区分生物本身的差异还是由于由低起始量的RNA造成的技术上的差异；而且mRNA-Seq方法优先扩增mRNA的3’端，不能产生全转录组的覆盖度。
2012年，Illumina公司联合Sandberg实验室开发出了用于此类分析的领先技术：Smart-seq。这一新方法提高了转录本的覆盖水平，有较高的灵敏度和定量的准确性，增强了可变转录异构体的分析和分辨SNP现象的能力。虽然用单细胞测定估计的表达量有些误差，但是用较少的细胞可以鉴定出来许多不同表达的基因。
2013年Sandberg实验室于Nature Methods发表Smart-seq2方法(非专利文献1:Simone Picelli,Rickard Sandberg,et al.Smart-seq2for sensitive full-lengthtranscriptome profiling in single cells.nature methods,2013September,doi:10.1038/nmeth.2639.)，此改良技术比Smart-seq产生平均更长的cDNA分子和更高的产量。Smart-seq2转录组文库提高发现能力，增加了覆盖度并且有更低的技术偏差。并且Smart-seq2完全可以采用现有的通用试剂，而非商业化试剂盒，可以很划算地构建测序文库。
Smart-seq2方法使用带有固定序列的oligo-dT、TSO、ISPCR引物进行逆转录扩增，能够有效提高cDNA的扩增效率。但，在采用例如Illumina高 通量测序仪进行测序时，从采用该方法构建的高通量测序文库中获取的有效数据的比例偏低，这会给后续的数据分析带来不利影响。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种能够显著提高有效数据比例(Clean Reads Rate)的单细胞转录组测序文库的构建方法及单细胞转录组测序方法。
本发明的发明人为解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现：通过在传统的单细胞转录组测序文库构建方法的基础上进行巧妙的改进，即可显著地提高有效数据比例，从而完成了本发明。
即，本发明包括：
1.一种单细胞转录组测序文库的构建方法，其包括：
步骤A：采用Smart-Seq2方法对单细胞转录组进行扩增，得到cDNA；
步骤B：以所述cDNA作为希望进行测序的DNA片段，构建测序用DNA片段文库；
步骤C：将所述测序用DNA片段文库用RsaI限制性内切酶进行酶切，得到酶切产物；以及
步骤D：将所述酶切产物进行PCR扩增，得到单细胞转录组测序文库。
2.根据项1所述的单细胞转录组测序文库的构建方法，其中，所述步骤B包括：
步骤B-1：将所述cDNA片段化，得到片段化的cDNA；
步骤B-2：对所述片段化的cDNA进行末端修复，得到平末端DNA片段；
步骤B-3：将所述平末端DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；
步骤B-4：将所述3'端加A的DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；以及
步骤B-5：将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物。
3.根据项2所述的单细胞转录组测序文库的构建方法，其中，所述步骤B还包括：
在所述步骤B-5之后进行的步骤B-6：从所述扩增产物中纯化回收具有目的大小的片段。
4.根据项2所述的单细胞转录组测序文库的构建方法，其中，在所述步骤B-1与所述步骤B-2之间、所述步骤B-2与所述步骤B-3之间、所述步骤B-3与所述步骤B-4之间、所述步骤B-4与所述步骤B-5之间、和/或所述步骤B-5之后，还包括纯化步骤。
5.根据项1所述的单细胞转录组测序文库的构建方法，其中，在所述步骤A与所述步骤B之间、所述步骤C与所述步骤D之间、和/或所述步骤D的PCR扩增之后，还包括纯化步骤。
6.一种单细胞转录组测序方法，其包括：
采用项1～5中任一项所述的单细胞转录组测序文库的构建方法构建单细胞转录组测序文库；以及
以所述单细胞转录组测序文库作为对象进行测序。
7.根据项6所述的单细胞转录组测序方法，其中，所述测序为双端测序。
8.根据项6或7所述的单细胞转录组测序方法，其中，所述测序利用Illumina平台进行。
9.一种用于采用项1的方法构建单细胞转录组测序文库的试剂盒，其包括：
用于采用Smart-Seq2方法对单细胞转录组进行扩增的试剂，
用于构建测序用DNA片段文库的试剂，
RsaI限制性内切酶，以及
用于对所述RsaI限制性内切酶的酶切产物进行PCR扩增的试剂。
发明效果
根据本发明，通过将前期构建的测序用DNA片段文库用RsaI限制性内切酶进行酶切，并对酶切产物进行PCR扩增，能够显著提高对单细胞转录组测序文库进行测序时的有效数据比例。
发明的具体实施方式
本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。
在本说明书中，有效数据比例是指：经过数据过滤，除去不合格reads之后剩余的reads为有效数据，其占总reads的比例即为有效数据比例(clean reads rate)。
首先，在一个方面中，本发明提供一种单细胞转录组测序文库的构建方法(本发明的文库构建方法)，其包括：
步骤A：采用Smart-Seq2方法对单细胞转录组进行扩增，得到cDNA；
步骤B：以所述cDNA作为希望进行测序的DNA片段，构建测序用DNA片段文库；
步骤C：将所述测序用DNA片段文库用RsaI限制性内切酶进行酶切，得到酶切产物；以及
步骤D：将所述酶切产物进行PCR扩增，得到单细胞转录组测序文库。
Smart-Seq2方法是本领域技术人员已知的，其标准流程及操作可以参见例如非专利文献1。该Smart-seq2方法使用带有固定序列的oligo-dT、TSO、ISPCR引物进行逆转录扩增，能够有效提高cDNA的扩增效率。但，在采用例如Illumina高通量测序仪进行测序时，从采用该方法构建的高通量测序文库中获取的有效数据的比例偏低，这会给后续的数据分析带来不利影响。本 发明是在传统的基于Smart-Seq2方法的单细胞转录组测序文库构建方法的基础上，增加了RsaI限制性内切酶酶切步骤以及额外的PCR步骤，来构建新的单细胞转录组测序文库，结果使得以该单细胞转录组测序文库作为对象进行测序时的有效数据比例显著提高。
在一些实施方式中，所述步骤B包括：
步骤B-1：将所述cDNA片段化，得到片段化的cDNA；
步骤B-2：对所述片段化的cDNA进行末端修复，得到平末端DNA片段；
步骤B-3：将所述平末端DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；
步骤B-4：将所述3'端加A的DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；以及
步骤B-5：将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物。
优选地，所述步骤B还包括在所述步骤B-5之后进行的步骤B-6：从所述扩增产物中纯化回收具有目的大小的片段。该步骤例如可以通过对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、切取包含目的条带的凝胶、并回收其中的DNA来进行。
优选地，在所述步骤A与所述步骤B之间、所述步骤C与所述步骤D之间、和/或所述步骤D的PCR扩增之后，还包括纯化步骤。优选地，在所述步骤B1～B5的两两之间、以及所述步骤B5之后，还包括纯化步骤。该纯化步骤可以采用本技术领域的常规方法来进行，例如可以通过使用纯化磁珠来进行。
RsaI限制性内切酶是一种识别四碱基序列的限制性内切酶，其识别位点为：
5′-GT↓AC-3′
3′-CA↑TG-5′。
该RsaI限制性内切酶可以例如使用携带源于Rhodopseudomonas sphaeroides的RsaI基因的E.coli工程菌生产，其已经实现商品化，可购自例如NEB公司。
使用RsaI限制性内切酶对DNA进行消化的方法是本领域技术人员已知的，例如可以将RsaI限制性内切酶与待消化的DNA在适于RsaI限制性内切酶的反应缓冲液中于0～50℃(优选30～40℃)保温一定时间(例如10秒～100小时，再例如30秒～1小时，再例如5分钟～30分钟)。
上述步骤B-1的cDNA片段化可以采用本技术领域通常采用的那些方法，例如超声波打断法。
上述步骤B2～B5均可采用本技术领域通常采用的那些方法来进行。在上述步骤B5中，使用包含特定标签的引物对所述加接头DNA片段进行PCR扩增，使得在后续的测序中能够通过这些特定标签来区分所测定的序列来源于哪一个样本。
上述步骤D的PCR扩增中，可以使用与上述步骤B5中使用的包含特定标签的引物相同的引物来进行。
PCR(聚合酶链反应)扩增是本领域技术人员熟知的，其一般通过一定的PCR反应程序(温度循环)来实现。所述PCR反应程序一般变性、退火、延伸等步骤。在使用上述引物对作为PCR扩增引物的情况下，变性步骤可以在93-98℃(优选94-96℃)进行0.1～10分钟(优选0.5～2分钟)；退火步骤可以在52-62℃(优选54-56℃)进行0.1～10分钟(优选0.5～2分钟)；延伸步骤可以在72℃进行0.1～10分钟(优选1～5分钟)；由上述变性、退火、延伸步骤组成的循环可以进行10-50个(优选25-35个)。优选地，经历上述温度循环前的模板可以在93-98℃(优选94-96℃)进行1～60分钟(优选5～20分钟)的热处理，经历上述温度循环后的扩增产物可以于4℃保温0-12小时。
对于“希望进行测序的DNA片段”没有特殊限制，从测序仪可接受的角度来看，优选是10～1000bp左右、更优选是20～800bp左右、更优选是 30～750bp左右、更优选是40～700bp左右、更优选是50～650bp左右、更优选是100～600bp左右、更优选是150～550bp左右的DNA片段。
此外，在另一个方面中，本发明提供一种单细胞转录组测序方法(本发明的单细胞转录组测序方法)，其中，以采用本发明的文库构建方法构建的单细胞转录组测序文库作为对象进行测序。
除了以采用本发明的文库构建方法构建的单细胞转录组测序文库作为对象之外，本发明的单细胞转录组测序方法可以采用本技术领域的常规方法来进行。优选地，本发明的测序方法可以采用双端测序，例如利用Illumina平台(例如HiSeq2500或NextSeq500)进行的双端测序。
此外，在另一个方面中，本发明提供一种用于构建单细胞转录组测序文库的试剂盒(本发明的试剂盒)，其可例如用于实施本发明的文库构建方法，其包括：用于采用Smart-Seq2方法对单细胞转录组进行扩增的试剂，用于构建测序用DNA片段文库的试剂，RsaI限制性内切酶，以及用于对所述RsaI限制性内切酶的酶切产物进行PCR扩增的试剂。本发明的试剂盒中的上述试剂可以使用本领域技术人员通常使用的那些。例如，作为用于采用Smart-Seq2方法对单细胞转录组进行扩增的试剂包括但不限于：裂解缓冲液例如Triton X-100(Sigma)、RNase inhibitor(Enzymatics)；oligo-dT引物；dNTP mix；Superscript IIFirst-Strand Buffer；betaine；TSO；MgCl2；DTT；RNAse inhibitor；SuperScript IIreverse transcriptase；KAPA HiFi Hot Start Ready Mix(KAPA)；ISPCR primer；nuclease-free water。作为用于构建测序用DNA片段文库的试剂包括但不限于：10×PNKbuffer；dNTP mix；T4DNA Polymerase；T4 Polynucleotide Kinase；Klenow Fragment；10×blue buffer；dATP；Klenow(3’-5’exo-)；2×Rapid Ligation Buffer；PE IndexAdapter；T4DNA Ligase；index引物；KAPA HiFi Hot Start Ready Mix；Ann公共引物。作为用于对所 述RsaI限制性内切酶的酶切产物进行PCR扩增的试剂包括但不限于：CutSmartBuffer(NEB)；RsaI限制性内切酶(可购自NEB)。
实施例
以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例是用于解释本发明，并非对本发明的限定。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一采用本发明的文库构建方法构建单细胞转录组测序文库
1、逆转录扩增cDNA
1.1单细胞以0.5μL以内体积收集到0.2mL薄壁PCR管中，其中包含2μL轻度低渗的裂解缓冲液。裂解液成分如下：
| Triton X-100 | 0.2％ | Sigma |
| RNase inhibitor | 2U/μL | Enzymatics |
1.2细胞裂解液和1μL oligo-dT引物，1μL dNTP mix混合，在72℃3min进行变性并立刻放于冰上。之后加入7μL的一链反应体系，反应体系包含如下：
oligo-dT引物：
(10μM,5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′)
TSO：
(10μM,5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACrGrG+G-3′)
加入后进行反转录反应程序如下：
42℃90min,(50℃2min,42℃2min)×10cycles,70℃15min,4℃保存。
1.3不纯化一链cDNA，直接加入二链合成的PCR反应体系，把一链合成反应体系考虑成11μL，据此调节水的体积。PCR反应体系如下：
ISPCR引物：(10μM,5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)
反应程序如下：
98℃3min,(98℃15s,67℃20s,72℃6min)×18cycles,72℃5min,4℃保存。
1.4用1×AMPure XP磁珠(Beckman Coulter)纯化，最后洗脱于15μL洗脱缓冲液EB。使用Qubit HS检测cDNA浓度。
1.5不用稀释直接用Agilent 2100bioanalyzer高灵敏DNA芯片检测cDNA峰图，期望片段大小在1.5～2.0kb。
2、DNA小片段文库构建
2.1取20ng扩增产物cDNA起始，置于0.5mL低吸附离心管中，加入10mM Tris-EDTA缓冲液补充体积至75μL。在提前预冷4℃循环水的Bioruptor超声打断仪上进行200bp小片段超声打断，程序设置为：打断30s，冷却30s，进行22个循环。
2.2配制末端修复反应体系，单个样本反应体系如下：
将样本置于PCR仪中20℃温浴30min，使用1.8倍体积Ampure XP磁珠纯化，溶于32μL洗脱缓冲液EB中回收DNA。
2.3配制加A反应体系，单个样本反应体系如下：
将样本置于PCR仪中37℃温浴30min，使用1.8倍体积Ampure XP磁珠纯化，溶于18μL洗脱缓冲液EB中回收DNA。
2.4配制加Adapter反应体系，单个样本反应体系如下：
将样本置于PCR仪中20℃温浴15min，使用1.8倍体积Ampure XP磁珠纯化，溶于25μL洗脱缓冲液EB中回收DNA。
2.5配制PCR反应Mix，单个样本反应体系如下：
其中，对于样本Chengmmz2，使用Index-67；对于样本Chengmmz4，使用Index-69；对于样本Chengmrt1，使用Index-66；对于样本Chumrt1，使用Index-68。
Index-66：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTTAACCTGTGACTGGAGTTC-3′Index-67：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTTGCAACGTGACTGGAGTTC-3′
Index-68：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAATTGAGGTGACTGGAGTTC-3′Index-69：
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGACTTGGTGACTGGAGTTC-3′反应程序如下：
94℃2min,(94℃15s,62℃30s,72℃30s)×10cycles,72℃10min,4℃保存。2.6配制2％Bio-Rad Low Range Ultra琼脂糖凝胶，切胶回收PCR产物中320-370bp范围条带，使用康为世纪快速琼脂糖凝胶回收试剂盒进行DNA回收，最终溶于44μL EB solution。
3、RsaI限制性内切酶处理
3.1使用RsaI限制性内切酶处理回收的DNA文库。
RsaI酶切反应体系如下：
将样本置于PCR仪中37℃温浴15min，使用1.8倍体积Ampure XP磁珠纯化，溶于25μL缓冲液EB中回收DNA。
3.2使用与2.5中PCR相同的反应体系和Index，PCR扩增5个循环，使用1.8倍体积Ampure XP磁珠纯化，溶于20μL缓冲液EB中回收DNA。
所得即为最终文库。文库构建完成后，使用Agilent 2100bioanalyzer对文库进行检测，insert size检测合格后，使用Bio-RAD CFX 96荧光定量PCR仪，Bio-RAD KIT iQSYBR GRN进行Q-PCR，对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞2nM)，以保证文库质量。之后在HiSeq 2500测序平台上运行双端测序程序(PE100)，得到100bp的双端测序reads。
对于4个样本，所构建的文库信息如表1所示。
表1
对比例一
像实施例一那样进行，不同的是：进行到步骤2.6为止，且步骤2.5中的循环数为15个。对于实施例一中的4个样本，采用对比例一的方法构建的文库信息如表2所示。
表2
由上述表1与表2的对比可知：采用传统Smart-seq2方法构建的4个文库的有效数据比例均较低，为约50％～68％，数据质量不佳，造成了大量测序数据的浪费。与此相对，对于相同样本，采用本发明的方法构建的4个文库的有效数据比例显著提高至约73％～85％。
工业实用性
根据本发明，提供了一种能够显著提高对单细胞转录组测序文库进行测序时的有效数据比例的单细胞转录组测序文库的构建方法以及单细胞转录组测序方法。
Claims (7)
1.一种单细胞转录组测序文库的构建方法，其包括：
步骤A：采用Smart-Seq2方法对单细胞转录组进行扩增，得到cDNA；
步骤B：以所述cDNA作为希望进行测序的DNA片段，构建测序用DNA片段文库；
步骤C：将所述测序用DNA片段文库用RsaI限制性内切酶进行酶切，得到酶切产物；以及
步骤D：将所述酶切产物进行PCR扩增，得到单细胞转录组测序文库；
其中，所述步骤B包括：
步骤B-1：将所述cDNA片段化，得到片段化的cDNA；
步骤B-2：对所述片段化的cDNA进行末端修复，得到平末端DNA片段；
步骤B-3：将所述平末端DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；
步骤B-4：将所述3'端加A的DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；以及
步骤B-5：将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物。
2.根据权利要求1所述的单细胞转录组测序文库的构建方法，其中，所述步骤B还包括：
在所述步骤B-5之后进行的步骤B-6：从所述扩增产物中纯化回收具有目的大小的片段。
3.根据权利要求1所述的单细胞转录组测序文库的构建方法，其中，在所述步骤B-1与所述步骤B-2之间、所述步骤B-2与所述步骤B-3之间、所述步骤B-3与所述步骤B-4之间、所述步骤B-4与所述步骤B-5之间、和/或所述步骤B-5之后，还包括纯化步骤。
4.根据权利要求1所述的单细胞转录组测序文库的构建方法，其中，在所述步骤A与所述步骤B之间、所述步骤C与所述步骤D之间、和/或所述步骤D的PCR扩增之后，还包括纯化步骤。
5.一种单细胞转录组测序方法，其包括：
采用权利要求1～4中任一项所述的单细胞转录组测序文库的构建方法构建单细胞转录组测序文库；以及
以所述单细胞转录组测序文库作为对象进行测序。
6.根据权利要求5所述的单细胞转录组测序方法，其中，所述测序为双端测序。
7.根据权利要求5或6所述的单细胞转录组测序方法，其中，所述测序利用Illumina平台进行。
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