CN105177132B - 一种定量检测miRNA的RT-PCR方法 - Google Patents

一种定量检测miRNA的RT-PCR方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种定量检测miRNA的RT‑PCR方法，miRNA加Poly(A)尾和逆转录在同一反应体系中进行,利用S‑Poly(T)引物进行miRNA的逆转录。本发明S‑Poly(T)Plus法中，miRNA的Poly(A)加尾和逆转录将在一个反应体系中同步完成，操作简便，缩短时间，用于合成cDNA的时间至少减少0.5h，具有更高的逆转录效率。本发明结合S/P miRsol RNA法和S‑Poly(T)Plus法，建立了一种非常灵敏、高效、简便、快捷、廉价的从提取到检测的技术体系。该技术体系尤其适合于从miRNA丰度较低的生物体液样本中检测miRNA。

Description

一种定量检测miRNA的RT-PCR方法
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种定量检测miRNA的RT-PCR方法。
背景技术
microRNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸非编码小RNA，广泛存在于动物、植物、线虫等真核生物中。miRNA的主要功能是通过与mRNA的3’端非翻译区(3’-UTR)结合来抑制基因的表达，降解靶mRNA或者阻止其翻译，从而在转录后水平上调控基因的表达。miRNA广泛参与细胞的分化、增殖、凋亡、个体生长发育以及器官形成。生物体内miRNA被精密调控，其表达具有严格的时空特异性。研究表明miRNA的表达与许多癌症或者其他疾病的发生密切相关，而且miRNA可以在血液中以非常稳定的形式存在。循环miRNA可用于癌症等重大疾病的早期诊断和基因药物的作用靶点，是有着巨大潜力的新型生物标记物。
长期以来，基于实时定量PCR(qRT-PCR)的检测技术一直以来都被认为是最灵敏的miRNA检测手段之一，比较常用的有Poly(A)加尾法(Shi R,Biotechnique.2005,39(4):519-525)和茎环引物(Stem loop)法(Chen C,Nucleic Acids Res.2005,33(20):1-9)。Poly(A)加尾法是利用Poly(A)聚合酶使miRNA的3’端带上一段Poly(A)尾巴，然后用含有Oligo(dT)序列引物进行逆转录。由于逆转录的引物的通用性，因此Poly(A)加尾法在降低检测成本的同时，也降低了检测的特异性和灵敏性。茎环引物法中逆转录引物5’端含有一个茎环结构，3’端通常具有6个与miRNA配对的碱基，可以增强miRNA和DNA异质双链的亲合力，并防止引物与pri-或pre-miRNA退火。但是由于茎环引物法使用的是序列特异性探针，在高通量的miRNA分析中成本相对昂贵。
随后，Kang K等发明了一种新型的检测miRNA的方法S-Poly(T)法，分别在其专利申请CN102154505A(在该专利中称为S-Oligo(dT)法，所用引物称为S-Oligo(dT)引物)和文章(Kang,K,PloS one.2012.7,e48536.)中进行了公开。在S-Poly(T)方法中，所用引物从5’端开始依次是14～20个碱基的PCR通用引物序列，14～20个碱基的通用探针序列，8～30个dT及与目的miRNA分子的3’端3～8个核苷酸互补配对的特异性序列。相比于Poly(A)加尾法和茎环引物法，S-Poly(T)方法的特异性和效率都大大提高。但是在S-Poly(T)方法中，miRNA的Poly(A)加尾和逆转录是两步独立的反应，因此在操作简便性和逆转录效率方面，S-Poly(T)技术还有待改进和提高。
发明内容
鉴于以上现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种更为简便、灵敏、高效、廉价的定量检测miRNA的RT-PCR方法。
为了实现上述发明目的，本发明包含以下技术方案：
一种定量检测miRNA的RT-PCR方法，miRNA加Poly(A)尾和逆转录在同一反应体系中进行，利用S-Poly(T)引物进行miRNA的逆转录。
优选地，所述定量检测miRNA的RT-PCR方法，包含以下步骤：
S1、加尾逆转录：miRNA加Poly(A)尾和逆转录在一个反应体系中进行，利用S-Poly(T)引物进行miRNA的逆转录；
S2、PCR：以步骤S1中逆转录获得的第一链cDNA为模板进行real-time PCR定量检测。
优选地，加尾逆转录的反应体系包含多聚腺苷酸聚合酶(PolyA Polymerase)和逆转录酶(reverse transcriptase)。
进一步优选地，加尾逆转录的反应体系包含：3±1μL体液总RNA或100±20ng细胞总RNA，1±0.2μL的0.5μM RT primer，1±0.2U的PolyA Polymerase，100±20U的MMLV，2.5μL的4×reaction buffer，RNase-free Water补足至10μL。
更进一步优选地，加尾逆转录的反应体系包含：3μL体液总RNA或100ng细胞总RNA，1μL的0.5μM RT primer，1U的PolyA Polymerase，100U的MMLV，2.5μL的4×reactionbuffer，RNase-free Water补足至10μL。
更进一步优选地，所述4×reaction buffer包含200±20mM Tris-HCl，600±50mMNaCl，40±10mM MgCl2，4±0.5mM ATP，2±0.5mM dNTP，pH 8.0。
再进一步优选地，所述4×reaction buffer包含200mM Tris-HCl，600mM NaCl，40mM MgCl2，4mM ATP，2mM dNTP，pH 8.0。
优选地，加尾逆转录的反应条件为：37～42℃保温60±10min，75±1℃保温5±2min。
进一步优选地，加尾逆转录的反应条件为：37℃保温30min，42℃保温30min，75℃保温5min，然后迅速置于冰上，静置2min。
优选地，所述S-Poly(T)引物由四部分组成，其序列从5’端到3’端依次为：14～20个碱基的PCR通用引物序列、14～20个碱基的通用探针序列、11个oligo(dT)和5～7个与miRNA 3’配对的特异性碱基。
优选地，所述总RNA提取自细胞或体液中，所述体液包括血清、血浆、尿液、眼泪、乳汁、唾液、痰液或粪便抽提上清。
优选地，细胞或体液中总RNA的提取方法，进行1～2次抽提提取总RNA。
优选地，细胞或体液中总RNA的提取方法，包括以下步骤：
1)向含1mL的RNAiso-Plus的离心管中加入100μL体液样本或106个细胞，吹打混匀，室温静置5min；加入200μL氯仿，盖紧离心管盖，剧烈振荡20s；室温静置5min；
2)12,000g，4℃离心15min；吸取500μL上清液转移至另一新的离心管中；
3)加入与等体积的异丙醇，上下颠倒充分混匀，-20℃或-80℃静置至少10min；
4)13,500g，4℃离心10min；弃去上清液，向沉淀中加入1mL的75％乙醇，轻轻颠倒清洗沉淀；13,500g，4℃离心5min，完全弃去上清；
5)沉淀在室温下干燥2～3min，加入20μL RNase-free Water溶解。
优选地，所述总RNA的提取方法还包括二次抽提总RNA的步骤：步骤2)中向移除上清液的离心管中加入与移除上清液等体积的RNase-free Water，混匀，12,000g，4℃离心15min；吸取500μL上清液到另一个新的离心管，按照步骤3)-步骤5)进行操作。
优选地，提取体液中总RNA时，使用糖原(glycogen)作为核酸助沉剂。本发明中将使用糖原作为核酸助沉剂的体液总RNA提取方法命名为S/P miRsol法。
进一步优选地，糖原浓度为1.875～120μg/mL。
更进一步优选地，糖原浓度为15μg/mL。
优选地，当提取体液样品的总RNA时，步骤3)中先向上清中加入糖原，再加入等体积的异丙醇，上下颠倒充分混匀，-20℃或-80℃静置至少10min。
优选地，步骤S2中real-time PCR定量检测采用探针法或者SYBR荧光染料法。
更进一步优选地，所用探针为通用探针，其序列来自于S-Poly(T)引物上14～20个碱基的PCR通用引物序列。
本发明将Poly(A)加尾和使用S-Poly(T)引物进行逆转录在同一反应体系中同时进行的RT-PCR定量测定miRNA的方法称为S-Poly(T)Plus法。S-Poly(T)Plus法的原理图如图1所示。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明S-Poly(T)Plus法中，miRNA的Poly(A)加尾和逆转录将在一个反应体系中同步完成，操作简便，缩短时间，用于合成cDNA的时间至少减少0.5h，简便性优于传统方法和S-Poly(T)法。
2、本发明S-Poly(T)Plus法在逆转录这一步实际可以容纳更多的血清RNA，转录效率优于传统方法和S-Poly(T)法。比如10μL的逆转录体系中，S-Poly(T)Plus容纳3μL血清RNA，而S-Poly(T)法只容纳相当于1.5μL的原始血清RNA，根据反应底物浓度越高酶促反应速率越高的规律，S-Poly(T)Plus法具有更高的逆转录效率。
3、本发明使用S-Poly(T)引物由四部分组成，其序列从5’端到3’端依次为：14～20个碱基的PCR通用引物序列、14～20个碱基的通用探针序列、11个oligo(dT)和5～7个与miRNA 3’配对的特异性碱基，可以特异性检测miRNA。
4、S/P miRsol法能从包括血清、血浆、尿液、乳汁、唾液、痰液、粪便抽提上清等生物体液样本中高效回收包括miRNA等小RNA在内的总RNA，miRNA回收效率比传统方法提高4～10倍，从而提高了体液miRNA定量检测的灵敏性和准确性。
5、本发明结合S/P miRsol RNA法和S-Poly(T)Plus法，建立了一种非常灵敏、高效、简便、快捷、廉价的从提取到检测的技术体系。该技术体系尤其适合于从miRNA丰度较低的生物体液样本中检测miRNA。本发明方法的灵敏性显著高于传统方法。比如灵敏性方面，0.38μL的体液样本就可以实现单个miRNA的检测，理论上从100μL体液样本中可以检测266个miRNA。
6、本发明的灵敏性、特异性和简便性使其在疾病早期筛查和预后评估等研究方面有重要应用前景，可广泛用于心血管病或其它重大疾病的早期无创筛查。
附图说明
图1为S-Poly(T)plus法的示意图。在一个反应体系中，RNA被Poly(A)加尾后进行逆转录。S-Poly(T)RT引物包含四个部分，序列从5’端到3’端依次为14～20个碱基的PCR通用引物序列，14～20个碱基的通用探针序列，11个oligo(dT)和5～7个与miRNA 3’配对的特异性碱基。PCR过程是以miRNA的第一链cDNA为模板，用miRNA特异上游引物和下游通用引物进行扩增，定量检测采用的是探针法。
图2为293A细胞总RNA的琼脂糖凝胶电泳图谱。
图3为S-Poly(T)法和S-Poly(T)Plus法检测血清中miRNA灵敏性比较结果。从人健康血清中提取总RNA，然后分别用S-Poly(T)法和S-Poly(T)Plus法检测miR-103a-3p、miR-27b-3p、miR-126-3p、miR-223-3p、miR-150-5p以及外源的cel-miR-54的表达量。
图4为S-Poly(T)法和S-Poly(T)Plus法检测细胞中miRNA灵敏性比较结果。从人293A细胞中提取总RNA，然后分别用S-Poly(T)法和S-Poly(T)Plus法检测miR-103a-3p、miR-27b-3p、miR-126-3p、miR-34b-5p、miR-223-3p、miR-150-5p和SNORD44。
图5为S-Poly(T)法和S-Poly(T)Plus法分别检测293A细胞中miR-92a-3p、miR-16-5p、miR-27b-3p、miR-210-3p、miR-103a-3p、miR-126-3p、SNORD44和SNORD47时RNA与Ct值的线性关系。
图6为S-Poly(T)Plus法检测血清中miR-27b-3p、miR-103a-3p、miR-126-3p、miR-150-5p和cel-miR-54时RNA与Ct值的线性关系。
图7为S-Poly(T)Plus法最佳反应温度测试结果。
图8为多聚腺苷酸聚合酶在S-Poly(T)Plus法中的作用。
图9为S-Poly(T)Plus法分析不同浓度糖原对血清miRNA检测的作用。
图10为S-Poly(T)Plus法分析血清第一次和第二次抽提物中的miRNA。
图11为RNA提取方法S/P miRsol和两种商业化的RNA提取试剂盒miReasy MiniKit(Qiagen)和mirVana PARIS Kit(Ambion)提取效果的的比较。
图12为先天性心脏病伴随的肺动脉高压患者和健康人血清中miR-20a-5p、miR-451a、miR-204-5p、miR-424-5p、miR-126-3p、miR-26a-5p和miR-9-5p的表达水平(内参为cel-miR-54)。
图13为本发明建立的循环miRNA检测方法整体流程图。
具体实施方式
为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施方式做进一步说明。如无特别说明，以下实施例中所采用的各种原料均来源于市场销售，所采用的方法均为常规方法，其中引物、探针来自美国Integrated DNA Technologies(IDT)公司。
本申请中主要材料来源如下：
血液来源于深圳市孙逸仙心血管医院。血液样本在室温条件下放置1h，然后4℃、3,000g离心10min得到血清，血清保存于-80℃备用。
人体293A细胞购买于American Type Culture Collection(ATCC,Manassas,VA)，用Dulbecco’s modified Eagle’s培养基(DMEM)混有10％胎牛血清(FBS)培养，细胞生长条件为37℃、5％CO2。
实施例1、S-Poly(T)Plus法检测循环miRNA
S-Poly(T)Plus法检测循环miRNA的方法如图13所示，包括以下步骤：
(一)、提取血清总RNA
在本实施例中使用S/P miRsol方法提取血清总RNA，具体步骤为：
1)0.1pM线虫miRNA cel-miR-54作为内参提前加入1mL的RNAiso-Plus(TaKaRa)中，加入100μL血清，吹打混匀，室温静置5min；加入200μL氯仿，盖紧离心管盖，剧烈振荡20s；室温静置5min；
2)12,000g，4℃离心15min；小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液(含miRNA)、中间的白色蛋白层、及有颜色的下层有机相；吸取500μL上清液转移至另一新的1.5mL离心管中；
3)向上清液中加入5μL适当浓度的糖原(Applichem)溶液，使糖原终浓度为15μg/mL，再加入与等体积的异丙醇(505μL)，上下颠倒充分混匀，-20℃或-80℃静置至少10min；
4)13,500g，4℃离心10min；弃去上清液，向沉淀中加入1mL的75％乙醇，轻轻颠倒清洗沉淀；13,500g，4℃离心5min，完全弃去上清，如管壁上沾有残余溶液，应再次离心并弃尽上清；
5)沉淀室温干燥2～3min，加入20μL RNase-free Water溶解，溶解产物置于-80℃储存，或者直接进行miRNA的荧光定量PCR检测。
(二)、S-Poly(T)Plus法检测miRNA
S-Poly(T)Plus法检测miRNA，其过程如图1所示，包括以下步骤：
S1、加尾逆转录：miRNA加Poly(A)尾和逆转录(第一链cDNA的合成)在一个反应体系中进行，利用S-Poly(T)引物进行miRNA的逆转录。
加尾逆转录的反应体系包含：3μL血清总RNA，1μL的0.5μM RT primer(逆转录引物)，1U的PolyA Polymerase(多聚腺苷酸聚合酶)，100U的MMLV(鼠白血病逆转录酶)，2.5μL的4×reaction buffer(反应缓冲液)，RNase-free Water(无RNA酶水)补足至10μL。所述4×reaction buffer包含200mM Tris-HCl，600mM NaCl，40mM MgCl2，4mM ATP，2mM dNTP，pH8.0。加尾逆转录的反应条件为：37℃保温30min，42℃保温30min，75℃保温5min以灭活酶，然后迅速置于冰上，静置2min以终止灭活。
所述S-Poly(T)引物由四部分组成，其序列从5’端到3’端依次为：14～20个碱基的PCR通用引物序列、14～20个碱基的通用探针序列、11个oligo(dT)和5～7个与miRNA 3’配对的特异性碱基。更优选地，所述S-Poly(T)引物序列从5’端到3’端依次为：16个碱基的PCR通用引物序列、17个碱基的通用探针序列、11个oligo(dT)和6个与miRNA 3’配对的特异性碱基。本发明中所检测的miRNA的序列来自于miRBase，根据各自序列设计不同的S-Poly(T)引物、上游引物，检测不同miRNA的S-Poly(T)引物序列如表1所示。
表1、S-Poly(T)Plus方法中所使用的引物和探针
S2、PCR：以步骤S1中逆转录获得的第一链cDNA为模板，用miRNA特异上游引物和下游通用引物进行real-time PCR定量检测。所述miRNA特异上游引物是不含3’端3～8个碱基的miRNA特异序列，所述miRNA的下游通用引物来自于S-Poly(T)引物的14～20个碱基的通用引物序列。
Real-time PCR定量检测采用探针法或者SYBR荧光染料法。本实施例中采用探针法，所用探针为通用探针，其序列来自于S-Poly(T)引物上14～20个碱基的PCR通用引物序列。Real-time PCR的反应体系如下：
PCR运行仪器为ABI StepOne Plus thermal cycler，反应条件为：预变性95℃3min，变性95℃10s，退火60℃30s，40个循环。每个PCR反应三个复孔。本实施例中相对表达量用2-^ΔCt计算。数据分析使用GraphPad Prism 5软件，检验方法为two-tailedStudent’s test。最终结果用平均值±SE(标准误)表示。
对比例1、S-Poly(T)法检测循环miRNA
(一)、提取血清总RNA：与实施例1相同。
(二)、S-Poly(T)法检测miRNA
使用S-Poly(T)法检测miRNA，包括以下步骤：
S21、对miRNA进行Poly(A)加尾获得RNA加尾产物。加尾反应体系如下：
反应条件为：37℃保温30min，65℃保温5min。
S22、逆转录反应获得第一链cDNA。逆转录反应体系如下：
反应条件为：42℃保温60min，70℃保温10min。
S23、PCR：以步骤S22中获得的第一链cDNA为模板，用miRNA特异上游引物和下游通用引物进行real-time PCR定量检测。
本实施例中的逆转录引物、miRNA特异上游引物、miRNA的下游通用引物、通用探针与实施例1相同。Real-time PCR的反应体系与实施例1基本相同。为了更好的比较S-Poly(T)法和S-Poly(T)Plus法的定量检测结果，实施例1和对比例1中加入的初始cDNA的含量相同。所以，对比例1中Real-time PCR的反应体系如下：
PCR运行仪器为ABI StepOne Plus thermal cycler，反应条件为：预变性95℃3min，变性95℃10s，退火60℃30s，40个循环。每个PCR反应三个复孔。
效果例1、S-Poly(T)Plus法和S-Poly(T)法检测循环miRNA的灵敏性
为了深入评估S-Poly(T)Plus法的灵敏性，我们对S-Poly(T)法和S-Poly(T)Plus法进行了系统比较。使用实施例1所述的S-Poly(T)Plus法和对比例1所述的S-Poly(T)法检测人血清中5个miRNA(miR-103a-3p、miR-27b-3p、miR-126-3p、miR-223-3p和miR-150-5p)和1个外源的线虫miRNA cel-miR-54。结果如图3所示，相对不同miRNA，S-Poly(T)Plus的灵敏性是S-Poly(T)方法的2.2～4.0倍。
实施例2、S-Poly(T)Plus法检测细胞中miRNA
(一)、提取细胞中总RNA
在本实施例中提取细胞总RNA的具体步骤为：
1)向含1mL的RNAiso-Plus(TaKaRa)的离心管中加入106个人293A细胞，吹打混匀，室温静置5min；加入200μL氯仿，盖紧离心管盖，剧烈振荡20s；室温静置5min；
2)12,000g，4℃离心15min；小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液(含miRNA)、中间的白色蛋白层、及有颜色的下层有机相；吸取500μL上清液转移至另一新的1.5mL离心管中；
3)向上清液中加入与等体积的异丙醇(500μL)，上下颠倒充分混匀，-20℃或-80℃静置至少10min；
4)13,500g，4℃离心10min；弃去上清液，向沉淀中加入1mL的75％乙醇，轻轻颠倒清洗沉淀；13,500g，4℃离心5min，完全弃去上清，如管壁上沾有残余溶液，应再次离心并弃尽上清；
5)沉淀室温干燥2～3min，加入20μL RNase-free water溶解。经检测，得到的RNAA260/A280＝1.95～2.0，表明纯度较高；RNA浓度为500～700ng/μL。经琼脂糖电泳检测，完整性良好(图2)。溶解产物置于-80℃储存，或者直接进行miRNA的荧光定量PCR检测。
(二)、S-Poly(T)Plus法检测miRNA
S-Poly(T)Plus法检测miRNA，包括以下步骤：
S11、加尾逆转录：miRNA加Poly(A)尾和逆转录在一个反应体系中进行，利用S-Poly(T)引物进行miRNA的逆转录。
加尾逆转录的反应体系包含：100ng细胞总RNA，1μL的0.5μM RT primer，1U的PolyA Polymerase，100U的MMLV，2.5μL的4×reaction buffer，RNase-free Water补足至10μL。所述4×reaction buffer包含200mM Tris-HCl，600mM NaCl，40mM MgCl2，4mM ATP，2mM dNTP，pH 8.0。加尾逆转录的反应条件为：37℃保温30min，42℃保温30min，75℃保温5min，迅速置于冰上，静置2min。
S12、PCR：以步骤S11中获得的第一链cDNA为模板，用miRNA特异上游引物和下游通用引物进行real-time PCR定量检测。
本实施例中逆转录引物、miRNA特异上游引物、miRNA的下游通用引物和探针与实施例1相同。Real-time PCR的反应体系如下：
PCR运行仪器为ABI StepOnePlus thermal cycler，反应条件为：预变性95℃3min，变性95℃10s，退火60℃30s，40个循环。每个PCR反应三个复孔。本实施例中相对表达量用2-^ΔCt计算。数据分析使用GraphPad Prism 5软件，检验方法为two-tailedStudent’s test。最终结果用平均值±SE(标准误)表示。
对比例2、S-Poly(T)法检测细胞中miRNA
(一)、提细胞中总RNA：与实施例2相同。
(二)、S-Poly(T)法检测miRNA
使用S-Poly(T)法检测miRNA，包括以下步骤：
S21、对miRNA进行Poly(A)加尾获得RNA加尾产物。加尾反应体系如下：
反应条件为：37℃保温30min，65℃保温5min。
S22、逆转录反应获得第一链cDNA。逆转录反应体系如下：
反应条件为：42℃保温60min，70℃保温10min。
S23、PCR：以步骤S22中获得的第一链cDNA为模板，用miRNA特异上游引物和下游通用引物进行real-time PCR定量检测。
本实施例中的逆转录引物、miRNA特异上游引物、miRNA的下游通用引物、通用探针与实施例1相同。Real-time PCR的反应体系与实施例1基本相同。为了更好的比较S-Poly(T)法和S-Poly(T)Plus法的定量检测结果，实施例1和对比例1中加入的初始cDNA的含量相同。所以，对比例1中Real-time PCR的反应体系为：
PCR运行仪器为ABI StepOnePlus thermal cycler，反应条件为：预变性95℃3min，变性95℃10s，退火60℃30s，40个循环。每个PCR反应三个复孔。
效果例2、S-Poly(T)Plus法和S-Poly(T)法检测细胞中miRNA的灵敏性
为了深入评估S-Poly(T)Plus法的灵敏性，我们对S-Poly(T)法和S-Poly(T)Plus法进行了系统比较。分别使用上述两种方法对来自人293A细胞中的6个miRNAs(miR-103a-3p、miR-27b-3p、miR-126-3p、miR-34b-5p、miR-223-3p和miR-150-5p)和一个内参snoRNA(SNORD44)进行检测。结果表明，S-Poly(T)Plus法检测miRNA的Ct值都小于S-Poly(T)法。其中，当用两种方法检测miR-223-3p时，Ct值的差距最大，为3.07；最小的Ct值差距为0.52(SNORD44)。这些数据表明，相对不同miRNA，S-Poly(T)Plus比S-Poly(T)法灵敏度增加了1.4～8.4倍(图4)。
实施例3、S-Poly(T)Plus法检测细胞中miRNA的线性梯度范围
本实施例对S-Poly(T)Plus法检测细胞中miRNA的线性梯度范围进行了分析。将人293细胞RNA进行5倍的梯度稀释(2.5ng～0.8pg)，然后检测6个miRNA(miR-92a-3p、miR-16-5p、miR-27b-3p、miR-210-3p、miR-103a-3p和miR-126-3p)和两个内参snoRNA(SNORD44和SNORD7)。从图5中看出，S-Poly(T)Plus检测不同miRNA的线性相关系数R2(0.9933～0.9991)都比S-Poly(T)法检测相应miRNA的值(0.9745～0.9968)要大。因此，S-Poly(T)Plus法检测细胞miRNA具有良好的线性关系和较宽的动态范围。
实施例4、S-Poly(T)Plus法检测血清miRNA的线性梯度范围
本实施例对S-Poly(T)Plus法检测血清miRNA的线性梯度范围进行了分析。将血清RNA进行4倍梯度稀释(总血清RNA使用量为0.075μL～0.3nL，对应的初始血清的用量为0.38μL～1.5nL)，然后进行检测。从图6中看出，S-Poly(T)Plus法检测血清miRNA(miR-27-3p、miR-103a-3p、miR-126-3p和miR-150-5p)和外源cel-miR-54都具有较好的线性相关系数R2(0.9536～0.9972)。因此，S-Poly(T)Plus法检测血清miRNA具有良好的线性关系和较宽的动态范围。
实施例5、不同加尾逆转录条件对S-Poly(T)Plus法的影响
为了探索不同加尾逆转录条件对S-Poly(T)Plus法的影响，设置如下3个实验组：实验组51的条件与实施例1完全相同；实验组52的条件与实施例1基本相同，不同之处在于，加尾逆转录的反应条件为：37℃保温60min，75℃保温5min，迅速置于冰上，静置2min；实验组53的条件与实施例1基本相同，不同之处在于，加尾逆转录的反应条件为：42℃保温60min，75℃保温5min，迅速置于冰上，静置2min。
按照实验组51-53的条件分别对miR-27b-3p、miR-126-3p和miR-150-5p进行S-Poly(T)Plus法检测，结果如图2所示。由图7可知，在S-Poly(T)Plus法的加尾逆转录步骤中，多聚腺苷酸聚合酶和逆转录酶在37℃或者42℃的条件下酶活力基本不受影响，3个实验组的Ct值基本相同，实验组51仅略优于实验组2～3。
实施例6、miRNA是否加Poly(A)尾对S-Poly(T)Plus法的影响
为了探索miRNA是否加Poly(A)尾对S-Poly(T)Plus法的影响，设置如下2个实验组：实验组61的条件与实施例1完全相同；实验组62的条件与实施例1基本相同，不同之处在于，加尾逆转录的反应体系中不加PolyA Polymerase，不进行Poly(A)加尾。
按照实验组61～62的条件分别对miR-103a-3p、miR-34b-3p和SNORD44进行S-Poly(T)Plus法检测。结果如图8所示，S-Poly(T)Plus法中，miRNA的Poly(A)加尾步骤是非常重要的；如果缺少PolyA Polymerase，qRT-PCR的结果中的Ct值将增加3～8个单位，即灵敏性要减少8～256倍。
实施例7、助沉剂的使用及浓度对提取血清总RNA的影响
对于血清/血浆等生物体液样本中miRNA的检测，因为样本中RNA浓度较低，因此RNA的提取效率对检测结果灵敏性和准确性非常重要。本发明从血清/血浆等生物体液样本中提取总RNA时，使用糖原作为助沉淀剂来提高RNA的沉淀及回收效率。本实施例中摸索了不同糖原浓度对血清总RNA提取的影响。
本实施例中血清RNA的提取方法与实施例1中所述的方法相同，但使用的糖原终浓度在1.875～240μg/mL范围内。各实验组及对照组设置如下：
实验组71～78：各提取100μL血清中的总RNA，分别添加5μL糖原溶液，糖原终浓度为240μg/mL、120μg/mL、60μg/mL、30μg/mL、15μg/mL、7.5μg/mL、3.75μg/mL和1.875μg/mL。
对照组1：提取100μL血清中的总RNA，不添加糖原。对照组2：以100μL水代替血清提取其中的总RNA，添加5μL糖原溶液，使糖原终浓度为7.5μg/mL。对照组3：提取100μL血清中的总RNA，添加5μL糖原溶液，糖原终浓度为3.75μg/mL；不添加逆转录酶，进行逆转录反应。
使用各实验组和对照组的条件提取总RNA，并用S-Poly(T)Plus法检测miR-126-3p、miR-27b-3p和miR-150-5p。结果如图9所示，糖原终浓度在1.875～120μg/mL范围内，都能有效地促进血清RNA的回收，其中最适糖原终浓度为15μg/mL。
实施例8、不同血清抽提次数对提取血清总RNA的影响
由于血清/血浆等生物体液样本中RNA浓度较低；当只收集到微量样本时，可以采取二次抽提的方法来提高RNA的得率。本实施例中通过以下方法提取血清中的总RNA：
1)0.1pM线虫miRNA cel-miR-54作为内参提前加入1mL的RNAiso-Plus(TaKaRa)中，加入100μL血清，吹打混匀，室温静置5min；加入200μL氯仿，盖紧离心管盖，剧烈振荡20s；室温静置5min；
2)12,000g，4℃离心15min；小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液(含miRNA)、中间的白色蛋白层、及有颜色的下层有机相；吸取500μL上清液(第一次抽提)转移至另一新的1.5mL离心管中；
向移除上清液的离心管中加入与移除上清液等体积的RNase-free Water，混匀，12,000g，4℃离心15min；吸取500μL上清液(第二次抽提)到另一个新的离心管；
3)分别向上述2份上清液中加入5μL糖原溶液，使糖原终浓度为15μg/mL，再加入与上清液等体积的异丙醇(505μL)，上下颠倒充分混匀，-20℃或-80℃静置至少10min；
4)13,500g，4℃离心10min；弃去上清液，向沉淀中加入1mL的75％乙醇，轻轻颠倒清洗沉淀；13,500g，4℃离心5min，完全弃去上清，如管壁上沾有残余溶液，应再次离心并弃尽上清；
5)沉淀室温干燥2～3min，加入20μL RNase-free Water溶解。
对两次抽提得到的总RNA分别用qRT-PCR检测miR-223-3p、miR-126-3p、miR-27b-3p、miR-150-5p和cel-miR-54。结果如图10所示，第二次抽提的RNA用qRT-PCR进行检测时，miRNA的Ct值仅比第一次抽提检测结果的Ct值大0.5～1.5个单位，即第二次抽提物中含有第一次抽提物中RNA的35～70％。因此，对于血清/血浆等RNA浓度较低的生物体液样本，可以进行两次抽提提高RNA的得率。
实施例9、不同RNA提取方法对提取血清总RNA的影响
在实施例中，使用实施例1所述的S/P miRsol法(一次抽提)与两种商品化RNA提取试剂盒miReasy Mini Kit(Qiagen)和mirVana PARIS Kit(Ambion)进行血清总RNA提取比较。获得的血清总RNA用qRT-PCR检测miR-16-5p、miR-223-3p、miR-126-3p、miR-103a-3p、miR-92a-3p、miR-27b-3p、miR-150-5p、miR-210-3p和cel-miR-54。结果如图11所示，S/PmiRsol法提取RNA的qRT-PCR检测结果的Ct值比miReasy Mini Kit和mirVana PARIS Kit低1.23～2.92，说明S/P miRsol法从血清/血浆等生物体液样本中回收RNA的效率更高。
实施例10、CHD-PAH病人miRNA表达谱分析
在本实施例中，24个血清样本来自于健康志愿者，24个血清样本来自先天性心脏病伴随肺动脉高压(CHD-PAH)患者。两组样本各自混匀，分析比较健康组和患者血液之间的候选miRNA表达差异情况。根据文献报道，本实施例选取了31个可能与CHD-PAH相关的候选miRNA(表2)，包括miR-150-5p、miR-23b-3p、miR-130a-3p、miR-191-5p、miR-30b-5p、miR-133b、miR-208b-3p、miR-1、miR-26a-5p、miR-29c-3p、miR-34b-3p、miR-34b-5p、miR-451a、miR-1246、miR-19a-3p、miR-21-5p、miR-204-5p、miR-138-5p、miR-367-3p、miR-27b-3p、miR-302b-3p、miR-145-5p、miR-20a-5p、miR-34a-5p、miR-328-3p、miR-126-3p、miR-424-5p、miR-503-5p、miR-124-3p、miR-9-5p和miR-223-3p。本实施例中以线虫miRNAcel-miR-54作为标准化内参，相对表达量用2-^ΔCt计算。数据分析使用GraphPad Prism 5软件，检验方法为two-tailed Student’s test。健康组和患者组中，表达差异倍数超过1.5倍的miRNA被首先挑选出来。这些变化倍数比较明显的miRNA在24个健康或患者样本一一验证。结果表明，在患者样本中，miR-204-5p、miR-424-5p、miR-126-3p、miR-26a-5p和miR-9-5p的表达水平显著下调，而miR-20a-5p和miR-451a的表达水平显著上调(图12)。
表2、与肺动脉高压相关的31个miRNA S-Poly(T)Plus检测结果
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.一种定量检测miRNA的RT-PCR方法，其特征在于，miRNA加Poly(A)尾和逆转录在同一反应体系中进行，利用S-Poly(T)引物进行miRNA的逆转录；
包含以下步骤：
S1、加尾逆转录：miRNA加Poly(A)尾和逆转录在一个反应体系中完成，利用S-Poly(T)引物进行miRNA的逆转录；
S2、PCR：以步骤S1中逆转录获得的第一链cDNA为模板进行real-time PCR定量检测；
加尾逆转录的反应体系包含：3±1μL体液总RNA或100±20ng细胞总RNA，1±0.2μL的0.5 μM逆转录引物，1±0.2U的多聚腺苷酸聚合酶，100±20U的鼠白血病逆转录酶，2.5μL的4×反应缓冲液，无RNA酶水补足至10 μL；
所述4×反应缓冲液包含200±20mM Tris-HCl，600±50mM NaCl，40±10mM MgCl2，4±0.5mM ATP，2 ±0.5mM dNTP，pH 8.0；
加尾逆转录的反应条件为：37~42℃保温60 min，75℃保温5 min，迅速置于冰上，静置2min；
所述细胞或体液总RNA的提取方法如下：
1) 向含1 mL的RNAiso-Plus的离心管中加入100 μL体液样本或106个细胞，吹打混匀，室温静置5 min；加入200 μL氯仿，盖紧离心管盖，剧烈振荡20 s；室温静置5 min；
2)12,000 g，4℃离心15 min；吸取500 μL上清液转移至另一新的离心管中；向移除上清液的离心管中加入与移除上清液等体积的无RNA酶水，混匀，12,000 g，4℃离心15 min；吸取500 μL上清液到另一个新的离心管；
3)分别向上述2份上清液中加入糖原溶液，使糖原终浓度为1.875~120 μg/mL，再加入与等体积的异丙醇，上下颠倒充分混匀，-20℃或-80℃静置至少10 min；
4)13,500 g，4℃离心10 min；弃去上清液，向沉淀中加入1 mL的75%乙醇，轻轻颠倒清洗沉淀；13,500 g，4℃离心5 min，完全弃去上清；
5) 沉淀在室温下干燥2~3 min，加入20 μL无RNA酶水溶解。
2.根据权利要求1所述的定量检测miRNA的RT-PCR方法，其特征在于，加尾逆转录的反应体系包含：3μL体液总RNA或100ng细胞总RNA，1μL的0.5 μM 逆转录引物，1U的多聚腺苷酸聚合酶，100U的鼠白血病逆转录酶，2.5μL的4×反应缓冲液，无RNA酶水补足至10 μL。
3.根据权利要求1所述的定量检测miRNA的RT-PCR方法，其特征在于，所述4×反应缓冲液包含200 mM Tris-HCl，600 mM NaCl，40mM MgCl2，4 mM ATP，2 mM dNTP，pH 8.0。
4.根据权利要求1所述的定量检测miRNA的RT-PCR方法，其特征在于，加尾逆转录的反应条件为：37℃保温30 min，42℃保温30 min，75℃保温5 min，迅速置于冰上，静置2 min。
5.根据权利要求1所述的定量检测miRNA的RT-PCR方法，其特征在于，糖原浓度为15μg/mL。
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