CN102154505A - 一种检测miRNA的方法及引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测miRNA的方法及引物及其应用，使用由特异碱基和Oligo(dT)组成的反转录引物对样品中miRNA进行反转录，然后用特异上游引物、通用下游引物和通用探针对miRNA进行real-time PCR定量检测。本发明的特点是灵敏性和特异性显著高于传统方法，可高通量分析，操作简单、快速，成本低，可广泛应用于肿瘤等重大疾病的早期诊断和预启。

Description

一种检测miRNA的方法及引物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种检测miRNA的方法及引物及其在肿瘤等重大疾病早期诊断和预后中的应用。
背景技术
microRNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸的非编码单链小分子RNA，广泛存在于动物，植物，线虫等真核生物中。miRNA通过与靶mRNA3’非编码区(3’UTR)的特异性结合，降解靶mRNA或阻遏其转录后翻译，最终导致靶基因的蛋白质合成减少。miRNAs参与了生命活动各个层次的调节，包括胚胎发育，器官形成，细胞增殖，细胞凋亡，细胞应激应答，干细胞分化，内分泌调控，免疫调节和疾病的发生与发展。大量的研究结果表明，恶性肿瘤等重大疾病的发生和发展与人体内miRNAs的异常表达有密切关系，这就意味着miRNAs将有巨大的潜力成为新的生物标志物用于癌症等重大疾病的早期诊断并可作为新的基因药物作用靶点。显然，要想把miRNA用于癌症等疾病的早期诊断，需要一种能够快速、灵敏、特异地定量检测miRNAs表达的方法。
成熟miRNA由于片段小，没有poly(A)尾巴，不同miRNA之间序列差异小(有些只有1个核苷酸的差别)，并且在细胞中的表达水平普遍较低，这些都给miRNA的定量检测工作带来了困难和挑战。尽管如此，科学家还是研究出了多种miRNA检测方法，大体可以归为两类：一类是不需要样本扩增的探针直接杂交法；另一类是基于PCR扩增的miRNA检测方法。
基于探针杂交技术的miRNA检测方法是一种直接检测法，不需要对样本RNA进行预扩增，主要有如下几种：Northern blot技术、生物芯片技术和基于微球的流式细胞术。这些技术的基本原理是将探针与RNA样品进行杂交，然后进行信号检测。Northern blot技术作为检测RNA的经典方法，常用来评价其它方法的可靠性；但这种技术对样品要求量大，操作相对费时费力，不适合高通量分析。生物芯片技术能实现miRNA的高通量分析，即在一块芯片上同时检测多个miRNA；但缺点是结果准确性低，重复性差，实验价格昂贵。基于微球的流式细胞术技术将探针固定于微球上并置于液相中，更有利于捕获miRNA序列，因此提高了准确性；但该技术须使用特殊的流式细胞仪和微球，实验成本高，同样不利于推广。
相比探针直接杂交法而言，基于real-time RT-PCR技术检测miRNA的表达是当前miRNA研究中最为常用的技术手段之一，几乎所有依据高通量芯片技术筛选出差异表达的miRNA都需要用real-time RT-PCR做进一步的鉴定。基于real-time RT-PCR的miRNA检测方法，主要包括poly(A)聚合酶加尾法(Shi R，Chiang V.Biotechnique.2005，39(4)：519-525)和茎环引物(Stem loop)法(Chen C，Ridzon D.Nucleic Acids Res.2005，33(20)：1-9)两种。poly(A)聚合酶加尾法是先用poly(A)聚合酶使miRNA的3’端带上一段poly(A)尾巴，然后用5’端含有接头序列的Oligo(dT)引物进行反转录，使第一链cDNA加上一段接头，为随后的PCR扩增提供反向通用引物序列，然后再利用一条miRNA序列特异的正向引物就可实现PCR扩增。该方法的优点是简便、快速，反转录引物对miRNA具有通用性，因此检测成本较低；但通用反转录引物的使用降低了检测的特异性和灵敏性。茎环引物法使用3，端有6个碱基与miRNA互补配对的引物来进行miRNA的反转录，同时反转录引物的5’端含有一个茎环结构，能增强miRNA和DNA异质双链的亲合力，并防止引物与pri-或pre-miRNA退火，因此一般来讲茎环引物法的特异性比poly(A)聚合酶加尾法要好；但由于该法使用的是序列特异探针，对于高通量的miRNA分析来说过于昂贵。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测miRNA的方法及引物及其应用，旨在解决现有技术中所存在的问题。
本发明的技术方案如下：
一种用于定量检测miRNA的S-Oligo(dT)引物，其中，所述S-Oligo(dT)引物从5’端开始由PCR通用引物序列、通用探针序列、Oligo(dT)及与目的miRNA分子的3’端核苷酸互补配对的特异性序列4部分组成。
所述的用于定量检测miRNA的S-Oligo(dT)引物，其中，所述S-Oligo(dT)引物从5’端开始依次是14～20个碱基的PCR通用引物序列，14～20个碱基的通用探针序列，8～30个dT及与目的miRNA分子的3’端3～8个核苷酸互补配对的特异性序列。
所述的用于定量检测miRNA的S-Oligo(dT)引物，其中，所述引物从5’端开始依次是16个碱基的PCR通用引物序列，17个碱基的通用探针序列，11个dT及与目的miRNA分子的3’端6个核苷酸互补配对的特异性序列。
一种使用上述的用于定量检测miRNA的引物定量检测特定miRNA的方法，其中，包括以下步骤：
S100、S-Oligo(dT)引物和miRNA的特异上游引物的设计：根据目的miRNA的序列信息，设计S-Oligo(dT)引物和miRNA的特异上游引物；
S200、总RNA提取：将细胞裂解，提取总RNA，并鉴定RNA纯度和完整性、测定RNA的浓度；
S300、RNA加尾：用PolyA polymerase对总RNA进行加尾，得到RNA-PolyA；
S400、第一链cDNA的合成：以RNA-PolyA为模板，用S-Oligo(dT)引物进行miRNA的反转录；
S500、miRNA的real-time PCR定量检测：以miRNA的第一链cDNA为模板，用miRNA特异上游引物和下游通用引物进行real-time PCR定量检测，然后对PCR结果进行数据分析。
所述的定量检测miRNA的方法，其中，所述miRNA特异上游引物是不含3，端3～8个碱基的miRNA特异序列，所述miRNA的下游通用引物来自于S-Oligo(dT)引物的14～20个碱基的通用引物序列。
所述的定量检测miRNA的方法，其中，步骤S500中进行real-time PCR定量检测采用的是探针法或SYBR荧光染料法；所述探针法所用探针为通用探针，其序列来自于S-Oligo(dT)引物上的14～20个碱基的通用探针序列。
一种使用上述的用于定量检测miRNA的引物定量检测不同的miRNA的方法，其中，包括以下步骤：
S100、S-Oligo(dT)引物和miRNA的特异上游引物的设计：根据不同的目的miRNA的序列信息，设计不同的S-Oligo(dT)引物和miRNA的特异上游引物；
S200、总RNA提取：将细胞裂解，提取总RNA，并鉴定RNA纯度和完整性鉴定和测定RNA的浓度；
S300、RNA加尾：用PolyA polymerase对总RNA进行加尾，得到RNA-PolyA；
S400、第一链cDNA的合成：以RNA-PolyA为模板，将不同的S-Oligo(dT)引物组合起来进行miRNA的反转录；
S500、miRNA的real-time PCR定量检测：以miRNA的第一链cDNA为模板，用各个miRNA特异上游引物和下游通用引物进行real-time PCR定量检测，然后对PCR结果进行数据分析。
所述的定量检测miRNA的方法，其中，所述miRNA特异上游引物是不含3’端3～8个碱基的miRNA特异序列，所述miRNA的下游通用引物来自于S-Oligo(dT)引物的14～20个碱基的通用引物序列。
所述的定量检测miRNA的方法，其中，步骤S500中进行real-time PCR定量检测采用的是探针法或SYBR荧光染料法；所述探针法所用探针为通用探针，其序列来自于S-Oligo(dT)引物上的14～20个碱基的通用探针序列。
上述的定量检测miRNA的方法的应用，其中，将所述的定量检测miRNA的方法应用在肿瘤等重大疾病的早期诊断和预后中。
有益效果：本方法的特点是灵敏性和特异性显著高于传统方法，可高通量分析，操作简单、快速，成本低，可广泛应用于肿瘤等重大疾病的早期诊断和预后。
附图说明
图1为本发明用于miRNA定量检测的S-Oligo(dT)法示意图。
图2为本发明S-Oligo(dT)法对女性宫颈癌Hela细胞hsa-miR-21miRNA的扩增曲线图。
图3为本发明S-Oligo(dT)法对女性宫颈癌Hela细胞hsa-miR-21miRNA的扩增的标准曲线图。
图4为本发明实施例中不同real-time RT-PCR法扩增hsa-miR-21的灵敏性比较曲线图。
具体实施方式
本发明提供一种检测miRNA的方法及引物及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所提供的用于检测miRNA的miRNA反转录引物——S-Oligo(dT)引物，从5’端开始由PCR通用引物序列(Universal primer)、通用探针序列(Universal probe)、Oligo(dT)及与目的miRNA分子的3’端核苷酸互补配对的特异性序列(specific bases)4部分组成。
所述用于定量检测miRNA的S-Oligo(dT)引物，从5’端开始依次是14～20个碱基的PCR通用引物序列，14～20个碱基的通用探针序列，8～30个dT及与目的miRNA分子的3’端3～8个核苷酸互补配对的特异性序列。
本发明还提供miRNA定量检测的一种新方法——S-Oligo(dT)法。S-Oligo(dT)法运用S-Oligo(dT)引物进行特定miRNA的反转录，或者将不同S-Oligo(dT)引物组合起来对不同的miRNA样品同时进行反转录，然后用各个miRNA的特异上游引物和通用下游引物对相应的miRNA进行real-timePCR定量检测。miRNA特异上游引物是不含3’端3～8个碱基的miRNA特异序列，miRNA的下游通用引物来自于S-Oligo(dT)引物的14～20个碱基的通用引物序列。PCR产物的检测既可用荧光染料法也可用探针法。探针法使用通用探针，其序列来自于S-Oligo(dT)引物上14～20个碱基的通用探针序列。
本发明实施例中所提供的S-Oligo(dT)引物，其组成为：从引物5’端开始依次是16个碱基的PCR通用引物序列，17个碱基的通用探针序列，11个dT(Oligo(dT))及与目的miRNA分子的3’端6个核苷酸互补配对的特异性序列。miRNA特异上游引物是不含3’端6个碱基的miRNA特异序列，miRNA的下游通用引物来自于S-Oligo(dT)引物的16个碱基的通用引物序列。所使用的通用探针，其序列来自于S-Oligo(dT)引物上17个碱基的通用探针序列。
本发明所提供的miRNA定量检测方法——S-Oligo(dT)法可以应用在肿瘤等重大疾病的早期诊断和预测。
本发明miRNA定量检测方法的具体步骤为：
S100、S-Oligo(dT)引物和miRNA的特异上游引物的设计：根据目的miRNA的序列信息，设计S-Oligo(dT)引物和miRNA的特异上游引物；
S200、总RNA提取：将细胞裂解，提取总RNA，并鉴定RNA纯度和完整性、测定RNA的浓度；
S300、RNA加尾：用PolyA polymerase对总RNA进行加尾，得到RNA-PolyA；
S400、第一链cDNA的合成：以RNA-PolyA为模板，用S-Oligo(dT)引物进行miRNA的反转录；
S500、miRNA的real-time PCR定量检测：以miRNA的第一链cDNA为模板，用miRNA特异上游引物和下游通用引物进行real-time PCR定量检测，然后对PCR结果进行数据分析。
使用本发明的检测miRNA的方法，具有以下几大优点：
1.S-Oligo(dT)法检测miRNA的特异性显著提高：
S-Oligo(dT)引物与靶miRNA互补的碱基数为17个碱基(6个特异碱基和11个dT)，在与靶miRNA锚定力度上明显优于poly(A)聚合酶加尾法(只有Oligo(dT))和茎环引物法(只有6个特异碱基)。同时，只有包含“6个特异碱基-11个dT”序列的miRNA才能与S-Oligo(dT)引物互补配对，因此S-Oligo(dT)法能很好地区分成熟miRNA与pri-miRNA和pre-miRNA。
2.S-Oligo(dT)法检测miRNA的灵敏性高：
S-Oligo(dT)法扩增miRNA的最低模板量为1pg总RNA；扩增线性范围宽，能覆盖6个数量级(1pg-100ng总RNA)，相关系数R值高于0.99。S-Oligo(dT)法与茎环引物法和poly(A)聚合酶加尾法相比灵敏性能提高6-10倍。
3.操作简单，能进行高通量分析：
S-Oligo(dT)法在cDNA合成过程中，能同时将不同miRNA的反转录引物混合后进行多个miRNA的cDNA合成，这样不仅能有效降低因加样所导致的误差，而且有利于高通量分析。
4.检测成本低：
S-Oligo(dT)法使用通用探针，大大降低了检测成本，因此更加适合推广。
实施例1女性宫颈癌Hela细胞hsa-miR-21miRNA的定量检测
(一)材料
1.材料：
体外培养的女性宫颈癌Hela细胞。
2.试剂：
RNAiso plus(TaKaRa)，PolyA Polymerase(EPICENTRE)，PrimeScript RTreagent Kit(TaKaRa)，SYBR Premix Ex Taq(Peffect Real Time)(TaKaRa)，Premix Ex Taq(Perfect Real Time)(TaKaRa)。
3.引物和探针：
Figure BSA00000479359400071
4.仪器：
GeneQuant pro RNA/DNA定量分析仪，ABI PCR仪(2720)，ABIreal-time PCR仪(PRISM 7300)。
(二)方法
1.RNA提取
将体外培养的Hela细胞，用RNAiso plus试剂进行RNA提取。提取的Hela细胞总RNA用分光光度计测定OD260/280及RNA浓度，用琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性。
2.RNA加尾反应
用PolyA Polymerase对总RNA进行加尾反应，加样如下：
Figure BSA00000479359400081
加完样后，37℃保温30min，冰上保存。
3.第一链cDNA的合成
用PrimeScript RT reagent Kit对miRNA进行反转录反应，加样如下：
加完样后，65℃保温5min，迅速置于冰上，静置2min。加入如下试剂：
Figure BSA00000479359400083
然后，42℃保温15min，85℃保温5min，冰上放置；再加入纯水34μl，混匀。
4.Hsa-miR-21miRNA的real-time PCR定量检测
用Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)进行hsa-miR-21miRNA的real-time PCR定量检测，加样如下：
Figure BSA00000479359400091
*通用探针可以选择TaqMan UnivP-1，2，3三种中任意一种，TaqManUnivP-1，2为LNA修饰的探针引物。本例选用TaqMan UnivP-3。
将PCR样品置于ABI PRISM 7300PCR仪，按如下条件进行real-timePCR：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃延伸31秒；40个循环。
本方案采用通用探针进行PCR产物的检测，其序列来自S-Oligo(dT)引物上17个碱基的通用探针序列；也可以使用SYBR荧光染料法对进行PCR产物的检测，即用SYBR Green I荧光染料代替通用探针(TaqMan universal probe)。使用SYBR Green I荧光染料时，可进行熔解曲线分析，以鉴定PCR产物的特异性。
(三)结果
1.S-Oligo(dT)法对hsa-miR-21miRNA进行定量检测
从女性宫颈癌Hela细胞提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定表明完整性良好；OD260/280＝1.9，表明RNA纯度较高。于是用S-Oligo(dT)法对hsa-miR-21miRNA进行定量检测，S-Oligo(dT)法示意图如图1所示。结果表明，hsa-miR-21miRNA在模板为1pg-100ng的总RNA范围内都得到了较好的扩增，如图2所示；标准曲线的线性关系良好，如图3所示。
2.不同real-time RT-PCR方法的灵敏性比较
本实施例还比较了不同real-time RT-PCR方法(包括S-Oligo(dT)法、poly(A)聚合酶加尾法和茎环引物法)扩增hsa-miR-21的灵敏性。以2ng总RNA为模板，用上述三种方法进行real-time RT-PCR检测，结果见图4，S-dT曲线表示S-Oligo(dT)法的结果曲线，PolyA表示poly(A)聚合酶加尾法的结果曲线，SL表示茎环引物法的结果曲线。从图4荧光强度与Ct值关系曲线看，S-Oligo(dT)法的平均Ct值为21.8，poly(A)聚合酶加尾法的平均Ct值为24.2，茎环引物法的平均Ct值为26.1，因此S-Oligo(dT)法的灵敏性明显高于poly(A)聚合酶加尾法和茎环引物法。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Figure ISA00000479359600011
Figure ISA00000479359600021
Figure ISA00000479359600031
Figure ISA00000479359600041

Claims (10)

1.一种用于定量检测miRNA的S-Oligo(dT)引物，其特征在于，所述S-Oligo(dT)引物从5’端开始由PCR通用引物序列、通用探针序列、Oligo(dT)及与目的miRNA分子的3’端核苷酸互补配对的特异性序列4部分组成。
2.根据权利要求1所述的用于定量检测miRNA的S-Oligo(dT)引物，其特征在于，所述S-Oligo(dT)引物从5’端开始依次是14～20个碱基的PCR通用引物序列，14～20个碱基的通用探针序列，8～30个dT及与目的miRNA分子的3’端3～8个核苷酸互补配对的特异性序列。
3.根据权利要求1所述的用于定量检测miRNA的S-Oligo(dT)引物，其特征在于，所述引物从5’端开始依次是16个碱基的PCR通用引物序列，17个碱基的通用探针序列，11个dT及与目的miRNA分子的3’端6个核苷酸互补配对的特异性序列。
4.一种使用权利要求1所述的用于定量检测miRNA的引物定量检测特定miRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S100、S-Oligo(dT)引物和miRNA的特异上游引物的设计：根据目的miRNA的序列信息，设计S-Oligo(dT)引物和miRNA的特异上游引物；
S200、总RNA提取：将细胞裂解，提取总RNA，并鉴定RNA纯度和完整性、测定RNA的浓度；
S300、RNA加尾：用PolyA polymerase对总RNA进行加尾，得到RNA-PolyA；
S400、第一链cDNA的合成：以RNA-PolyA为模板，用S-Oligo(dT)引物进行miRNA的反转录；
S500、miRNA的real-time PCR定量检测：以miRNA的第一链cDNA为模板，用miRNA特异上游引物和下游通用引物进行real-time PCR定量检测，然后对PCR结果进行数据分析。
5.根据权利要求4所述的定量检测miRNA的方法，其特征在于，所述miRNA特异上游引物是不含3’端3～8个碱基的miRNA特异序列，所述miRNA的下游通用引物来自于S-Oligo(dT)引物的14～20个碱基的通用引物序列。
6.根据权利要求4所述的定量检测miRNA的方法，其特征在于，步骤S500中进行real-time PCR定量检测采用的是探针法或SYBR荧光染料法；所述探针法所用探针为通用探针，其序列来自于S-Oligo(dT)引物上的14～20个碱基的通用探针序列。
7.一种使用权利要求1所述的用于定量检测miRNA的引物定量检测不同的miRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S100、S-Oligo(dT)引物和miRNA的特异上游引物的设计：根据不同的目的miRNA的序列信息，设计不同的S-Oligo(dT)引物和miRNA的特异上游引物；
S200、总RNA提取：将细胞裂解，提取总RNA，并鉴定RNA纯度和完整性鉴定和测定RNA的浓度；
S300、RNA加尾：用PolyA polymerase对总RNA进行加尾，得到RNA-PolyA；
S400、第一链cDNA的合成：以RNA-PolyA为模板，将不同的S-Oligo(dT)引物组合起来进行miRNA的反转录；
S500、miRNA的real-time PCR定量检测：以miRNA的第一链eDNA为模板，用各个miRNA特异上游引物和下游通用引物进行real-time PCR定量检测，然后对PCR结果进行数据分析。
8.根据权利要求7所述的定量检测miRNA的方法，其特征在于，所述miRNA特异上游引物是不含3’端3～8个碱基的miRNA特异序列，所述miRNA的下游通用引物来自于S-Oligo(dT)引物的14～20个碱基的通用引物序列。
9.根据权利要求7所述的定量检测miRNA的方法，其特征在于，步骤S500中进行real-time PCR定量检测采用的是探针法或SYBR荧光染料法；所述探针法所用探针为通用探针，其序列来自于S-Oligo(dT)引物上的14～20个碱基的通用探针序列。
10.一种权利要求4或7所述的定量检测miRNA的方法的应用，其特征在于，将所述的定量检测miRNA的方法应用在肿瘤等重大疾病的早期诊断和预后中。
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