CN1763223B - miRNA检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种miRNA的检测方法。其检测方法是提取细胞总RNA或小分子RNA，经多聚核苷酸聚合酶在RNA分子3’端加上Poly(A)，再由oligodT-接头引物进行反转录获得cDNA，以miRNA序列和接头引物的序列为多聚酶链反应(PCR)引物，扩增获得相应的miRNA的DNA片段。本方法可用于miRNA检测分析。

Description

miRNA检测方法

技术领域 本发明涉及一种miRNA的检测方法，本方法可用于miRNA表达的检测分析以及临床标本检验。

背景技术 miRNA(microRNA)是一类具有19～25nt的RNA分子，是由其前体分子在酶的作用下加工生成，其前体序列一般为70～120nt，广泛存在于生物体中。由于miRNA序列在不同的生物中具有一定的保守性，目前普遍认为miRNA的功能是参与生命的一些基本过程，如发育过程中的细胞增殖、细胞死亡、应激反应和脂肪代谢等，越来越多的证据表明miRNA在细胞中起着调控基因表达的重要作用。最近的研究发现miRNA与细胞的癌变有着极为密切的关系，已经发现miRNA与肺癌、结直肠肿瘤、伯基特淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等肿瘤疾病有关，分析结果显示约一半已发现的miRNA定位于染色体肿瘤基因相关区域及染色体的脆性位点。这些研究结果都表明miRNA在细胞癌变中可能发挥着重要的作用。因此，建立一种快速、简便、费用低的检测方法对miRNA的功能研究和临床检测具有重要意义。

由于miRNA分子只有20nt左右大小，检测比较困难。目前采用的方法主要是Northern blot等杂交的方法进行检测，方法繁琐，不易成功。Allawi等建立了InvaderAssay的方法(Allawi HT，DeahlbergJE，Olson S，et al.Quantitation of micro RNAs using a modified ivader assay.RNA，2004，10：1153-1161)，Liu等建立了寡核苷酸芯片方法(Liu C，Calin GA，et al.An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tissues.PNAS，2004，32(4)：e43)，采用随机引物或与miRNA前体互补的引物直接进行反转录，但是该方法不适用于miRNA分子的检测。

发明内容 本发明的目的是建立一种检测miRNA分子的简便、实用的方法，用于miRNA的检测。本发明的miRNA检测方法，其特征在于其检测方法是基于细胞和组织总RNA或小分子RNA的纯化，经多聚核苷酸聚合酶在RNA分子3’端加上Poly(A)，再由oligo(dT)n-接头引物进行反转录获得cDNA，以miRNA相关序列和接头引物的序列为多聚酶链反应(PCR)引物，扩增获得相应的miRNA序列的DNA片段。反转录oligo(dT)n-接头引物一般长度为40～60nt，5’端为20～30nt的接头序列，3’端为12～30nt的dT，还可以在3′末端加上两个碱基的(A，G或C)和(A，G，C或T)，最后两个碱基可以起锚定作用。接头引物序列为反转录oligo(dT)n-接头引物不包括dT部分的5’端序列。作为检测miRNA的PCR扩增引物的miRNA相关DNA序列可以是miRNA分子序列的全长，也可以是miRNA的部分序列，但是长度最好大于18nt。

由于本方法采用了在RNA分子的3’端加上poly(A)的方式，使小分子的RNA片段得以延长，因此适用于小分子RNA的检测。

为了检测使用方便，可依据本方法组装成试剂盒使用，试剂盒由RNA加Poly(A)尾反应系统、反转录系统和PCR扩增系统和对应的引物组成，该试剂盒包括：1)多聚核苷酸聚合酶，及其反应缓冲液；2)反转录酶，及其反应缓冲液；3)Taq酶，及其反应缓冲液；4)反转录oligo(dT)n-接头引物、接头引物和miRNA扩增用引物。

由于miRNA分子较小，因此，PCR反应产物最好用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。电泳结束后，可以用EB染色和银染的方法染色观察。

在PCR反应体系中还可以加入内对照引物进行半定量PCR反应，或对PCR引物进行荧光分子标记进行实时定量PCR反应。

本方法可用于miRNA的表达分析，以及临床标本的检验。

本发明用下列实施例进行解释，这些实施例的目的只是为了解释而不是以任何方式限制本发明。

结合附图说明本发明的具体实施方法：

图1：检测组织及细胞中成熟miRNA的表达电泳图

实施例

实施例一

检测组织及细胞中成熟miRNA的表达

以检测HepG2、HeLa细胞及人胎肝标本的miR-26a、miR-27a、miR-30b及miR-30c为例。

1.相关引物设计

(1)反转录oligo(dT)n-接头引物为：5′ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG(T)₃₀(A，G或C)(A，G，C或T)；

(2)接头引物为：5′ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG，为3′PCR引物；

(3)miR-26a、miR-27a、miR-30b及miR-30c的序列为5′PCR引物，分别为：

miR-26a：TTCAAGTAATCCAGGATAGGCT

miR-27a：TTCACAGTGGCTAAGTTCCGCC

miR-30b：TGTAAACATCCTACACTCAGC

miR-30c：TGTAAACATCCTACACTCTCAGC

2.cDNA的制备

以HepG2、HeLa细胞及人胎肝标本为材料，用Ambion公司mirVana^TM miRNA Isolation Kit提取其小分子RNA(≤200nt)(操作方法见其说明书)。各取1μg RNA用多聚核苷酸聚合酶(Poly(A)聚合酶)在3′端加上Poly(A)，反应条件如下：

RNA                        1μg

10×缓冲液                 5μl

MnCl₂                      5μl

DTT                        5μl

0.1％BSA                   10μl

ATP                        1mmol/L

Poly(A)聚合酶              3U

DEPC处理的H₂O              加到50μl

于37℃反应30分钟。之后加入50μl DEPC处理水，再加入100μl(等量)的苯酚/氯仿(1∶1)，充分混匀。12000rpm离心5分钟，取上清移至另一微量离心管中，再加入100μl(等量)氯仿，充分混匀后以12000rpm离心5分钟。取上清移至另一微量离心管中，加入2μl糖原(10mg/ml)、10μl(1/10量)的3mol/L NaAc(pH5.2)混匀。再加入250μl的冷无水乙醇，一20℃放置1小时。于4℃，以12000rpm离心20分钟，用75％的乙醇漂洗沉淀，室温晾干后溶于适量DEPC处理的水中。

以上述处理的RNA为模板，以反转录oligo(dT)n-接头引物ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG(T)₃₀(A，G或C)(A，G，C或T)为引物进行反转录反应(反应条件参考逆转录酶的说明书)，合成的cDNA即为PCR反应的模板。

3.PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

于20μl PCR反应体系中分别加入5′及3′PCR引物各0.5μg，0.25μl cDNA，再加入dNTP、PCR缓冲液及Taq酶。按下列条件进行PCR扩增：94℃30秒、61℃30秒、72℃30秒，25个循环。取10μl PCR产物行12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色后进行结果分析。

图1中a为miR-26a，b为miR-27a，c为miR-30b，d为miR-30c；1为HepG2细胞，2为HeLa细胞，3为人胎肝组织。M为DL2000Marker，C为无模板对照。结果表明此方法可扩增miRNA，特异性较好。

回收扩增获得的含miRNA的DNA片段，克隆至测序载体，测序结果证明所扩增序列正确。

Claims (4)

1.一种miRNA检测方法，其特征在于其检测方法是基于细胞和组织总RNA或小分子RNA的纯化，经多核苷酸聚合酶在RNA分子3’端加上Poly(A)，再由oligo(dT)12-30-接头引物进行反转录获得cDNA，以miRNA和接头引物的序列为多聚酶链反应(PCR)引物，扩增获得相应的miRNA的DNA片段。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于反转录oligo(dT)12-30-接头引物长度为40～60nt，5’端为20～30nt的接头序列，3’端为12～30nt的dT，在3’末端加上两个碱基的(A、G或C)/(A、G、C或T)，最后两个碱基起锚定作用。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于PCR扩增使用的接头引物为反转录oligo(dT)12-30-接头引物不包括dT部分的5’端序列。

4.权利要求1～3所述的任一检测方法在miRNA检测分析中的应用。