CN105506146B - 一种非疾病诊断目的的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种非疾病诊断目的的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法及试剂盒，属于分子生物学技术领域，包括以下步骤：1)提取样品的microRNA，在反转录酶及Poly A聚合酶或Poly U聚合酶的作用下，反转录获取cDNA；2)根据microRNA成熟序列及pre‑microRNA序列，设计只针对microRNA成熟序列的上游引物，然后进行实时定量PCR，特异性检测成熟microRNA表达水平。该方法检测过程简便，检测结果灵敏准确，能够有效用于成熟microRNA(mature microRNA，长度为20‑23个碱基)在细胞或组织内表达水平的检测，检测成熟microRNA的特异性高于目前广泛使用的基于实时定量PCR的其他方法。

Description

一种非疾病诊断目的的特异检测成熟microRNA表达水平的定 量检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种非疾病诊断目的的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法及试剂盒。
背景技术
microRNAs(microRNA)是一类非编码、内源性的、长度约为20～23个核苷酸的单链小分子RNA。microRNAs由基因组DNA编码，在细胞核内最初被转录为几百个核苷酸的pri-microRNA，之后被Drosha剪切成长度约70～90碱基的pre-microRNA，并进一步由胞浆的Dicer加工，最终形成成熟microRNAs。成熟microRNAs对转录后水平的基因调控广泛存在于真核生物的发育和代谢过程，包括胚胎发育，细胞凋亡、增殖、分化、应激应答，机体代谢，免疫调节和疾病的发生与发展等。因此，建立一种快速、特异、灵敏的检测方法对 microRNA的功能研究和临床检测具有重要意义。
pre-microRNA是成熟microRNA的前体。pre-microRNA含有一个茎环结构(Stem-loop)，经过Dicer剪切加工，茎环结构中的茎与环分开，其中部分组成茎的两个RNA单短链即为成熟的microRNA。由一个pre-microRNA得到的两个成熟microRNA通常分别被命名为microRNA-5p和microRNA-3p(在旧的命名法中，也被称为有义链和无义链)。理论上一对microRNA-5p和 microRNA-3p来源于同一个pre-microRNA，其数量应该是相等的。但在实际研究中发现，很大一部分microRNA的5p和3p数量差异非常大。原因在于，经过Dicer剪切加工后，得到的两个成熟microRNA(5p和3p)，往往只有一条具有基因调控功能，另一条则迅速被降解。因此在对microRNA的生物功能的研究中，特异的检测成熟的microRNA-5p或microRNA-3p的在细胞或组织中表达量是非常重要的。
目前为止，常用的microRNA检测方法主要有三大类。其中Northern blotting被看成是检测单个microRNA的金标准，但是Northern blotting方法操作复杂，费时费力，不适合高通量分析。芯片适合高通量的分析，但特异性和可重复性低。实时定量PCR适合高灵敏的检测，方便快捷，可用于microRNA 批量检测。但目前通用的Stem-loop PCR方法因为上游引物序列取自成熟 microRNA的DNA序列，而该序列也同时存在于pre-microRNA中，因此Stem-loop PCR方法无法排除pre-microRNA的非特异扩增。在实际实验中需要反复调整反应条件，以降低对pre-microRNA的非特异扩增，结果并不十分理想。一些公司在Stem-loopPCR方法的基础上引入Taqman探针，以期得到较高的扩增特异性，但Taqman探针价格昂贵，而且并不能完全弥补引物不特异而带来非特异扩增。总之，目前的方法很难做到对成熟microRNA高特异、高灵敏的便利检测。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种非疾病诊断目的的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法及试剂盒，该方法检测过程简便，检测结果灵敏准确。
本发明是通过以下技术方案来实现：
本发明公开的一种非疾病诊断目的的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法，包括以下步骤：
1)提取样品中的包含microRNA组分的总RNA或小RNA(small RNA)，在反转录酶及PolyA聚合酶或Poly U聚合酶的作用下，反转录获取cDNA；
2)根据microRNA成熟序列及pre-microRNA序列，设计只针对microRNA 成熟序列的上游引物，然后进行实时定量PCR，特异性检测成熟microRNA表达水平。
步骤1)所述的反转录采用一步法进行短时反应。短时反应条件为：37℃， 10～15分钟；42℃，10～15分钟；85℃，5分钟。
步骤1)中PolyA聚合酶或Poly U聚合酶的使用，由成熟microRNA序列信息和pre-microRNA序列信息进行选择。
在pre-microRNA序列中，位于待测microRNA的5p或3p序列下游的两个碱基为-NA-时，使用polyU聚合酶；其中，N为A,U,C或G中的一个；
在pre-microRNA序列中，位于待测microRNA的5p或3p序列下游的两个碱基为-NU-时，使用polyA聚合酶；其中，N为A,U,C或G中的一个；
在pre-microRNA序列中，位于待测microRNA的5p或3p序列下游的两个碱基为-NS-时，使用polyA聚合酶或polyU聚合酶中的任意一个，其中，N 为A,U,C或G中的一个；S为C或G中的一个。
步骤1)反转录过程中所用的引物根据所选的PolyA聚合酶或Poly U聚合酶而定。
当使用PolyA聚合酶时，反转录引物序列如SEQ.ID.NO.1所示，且在3’端末尾为VN-；其中，V为A,C或G中的一个；N为A,T,C或G中的一个；
当使用Poly U聚合酶时，反转录引物序列如SEQ.ID.NO.2所示，且在3’端末尾为BN-；其中，B为T,C或G中的一个；N为A,T,C或G中的一个。
检测成熟microRNA的上游引物为成熟microRNA的DNA序列加上末尾两个碱基，该末尾两个碱基是根据反转录过程中所选的PolyA聚合酶或Poly U 聚合酶而定。
当使用PolyA聚合酶时，检测成熟microRNA的上游引物的末尾添加的两个碱基为-AA；
当使用Poly U聚合酶时，检测成熟microRNA的上游引物的末尾添加的两个碱基为-TT。
本发明还公开了实现上述的特异性检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法的试剂盒(如100次检测试剂盒)，包括以下两个部分：a)反转录部分，其构成组分有：M-MLV逆转录酶(20,000U)，PolyA聚合酶(20U)，Poly U 聚合酶(20U)，一步法反应缓冲液(200ul)，反转录引物如SEQ.ID.NO.1 (2.5uM)，反转录引物如SEQ.ID.NO.2(2.5uM)；b)定量PCR部分，其构成组分有：PCR酶(250U)，PCR反应缓冲液(1ml)，PCR反应下游通用引物5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(10uM)，PCR反应microRNA特异上游引物 (10uM)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明公开的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法，首先根据microRNA的成熟序列及其前体序列，使用多聚腺嘌呤核苷酸聚合酶(poly (A)聚合酶)或多聚尿嘧啶核苷酸聚合酶(poly(U)聚合酶)结合反转录酶，将microRNA反转录为cDNA。然后根据microRNA的成熟序列及其前体序列，设计只针对成熟microRNA的上游引物。在实时定量PCR过程中，该引物只扩增成熟microRNA的cDNA，而不会扩增pre-microRNA的cDNA，从而达到高特异、高灵敏的检测成熟microRNA的表达水平的目的。检测过程简便，检测结果灵敏准确。该方法能够有效用于成熟microRNA(mature microRNA，长度为20-23个碱基)在细胞或组织内表达水平的检测。根据PCR反应的特异性主要取决于引物3’端2-3个碱基的正确匹配的特性，设计合成特异引物，该引物只识别成熟microRNA(长度为20-23个碱基)反转录产物cDNA，在实时定量PCR过程中不会与microRNA前体(pre-microRNA，长度为70-90个碱基)的反转录产物cDNA结合，即不存在针对pre-microRNA的非特异扩增。本发明检测成熟microRNA的特异性高于目前广泛使用的基于实时定量PCR 的其他方法。
附图说明
图1为本发明方法的原理图；
图2为具体实施例1中，实时定量PCR的扩增曲线；
图3为具体实施例1中，根据扩增曲线得到的microRNA-124-5p在神经元与Hela细胞内相对表达水平柱状图；
图4为具体实施例1中，microRNA-124-5p实时定量PCR产物的溶解曲线；
图5为具体实施例1中，microRNA-124-5p实时定量PCR产物的电泳图片；
图6为具体实施例2中，采用本发明诉述方法与目前广泛使用的stem-loop PCR方法的扩增产物电泳图片。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
参见图1，为本发明的方法的原理图，实现本发明目的所采用的技术方案为：
1.根据成熟microRNA序列信息和pre-microRNA序列信息来确定选择多聚核苷酸聚合酶：
a.在pre-microRNA的序列中，位于待测microRNA(5p或3p)序列的下游的两个碱基为-NA-(N为A,U,C,G中的一个)时，使用多聚尿嘧啶核苷酸聚合酶(poly(U)聚合酶)；
b.在pre-microRNA的序列中，位于待测microRNA(5p或3p)序列的下游的两个碱基为-NU-(N为A,U,C,G中的一个)时，使用多聚腺嘌呤核苷酸聚合酶(poly(A)聚合酶)；
c.在pre-microRNA的序列中，位于待测microRNA(5p或3p)序列的下游的两个碱基为-NS-(N为A,U,C,G中的一个；S为C,G中的一个)时，可使用多聚腺嘌呤核苷酸聚合酶(poly(A)聚合酶)或多聚尿嘧啶核苷酸聚合酶 (poly(U)聚合酶)中的任意一个。
2.使用多聚腺嘌呤核苷酸聚合酶(poly(A)聚合酶)或多聚尿嘧啶核苷酸聚合酶(poly(U)聚合酶)结合反转录酶将microRNA的反转录为cDNA。多聚核苷酸聚合酶与反转录酶同时加至反应体系。反应条件为37℃10-15分钟；42℃，10～15分钟；85℃5分钟。其中反转录引物为：
a.如选择使用多聚腺嘌呤核苷酸聚合酶(poly(A)聚合酶)，则反转录引物为：
5’-GGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCATTTTTT TTTTTTTTTTTTVN-3’。其中，V为A,C,G中的一个；N为A,T,C,G中的一个。
b.如选择使用多聚尿嘧啶核苷酸聚合酶(poly(U)聚合酶),反转录引物为：
5’-GGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAAAAAA AAAAAAAAAAAAABN-3’。其中，B为T,C,G中的一个；N为A,T,C,G中的一个。
3.实时定量PCR检测成熟microRNA的表达水平。其中实时定量PCR引物为：
a.下游引物为通用引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’
b.上游引物检测为待测成熟microRNA的DNA序列加上末尾两个碱基。
1)如果反转录过程中使用多聚腺嘌呤核苷酸聚合酶(poly(A)聚合酶)，则上游引物的末尾添加两个碱基-AA。
2)如果反转录过程中使用多聚尿嘧啶核苷酸聚合酶(poly(U)聚合酶)，则上游引物的末尾添加两个碱基-TT。
参见图1，图中显示pre-microRNA序列中，在成熟micro-RNA序列下游为-NA-(N为A,T,C,G中的一个)或-NU-时，进行反转录和实时定量PCR的技术路线。如果下游序列为-NC-或-NG-时，可采用上述任一技术路线。
实施例1
比较microRNA-124-5p(MIMAT0004591，miRbase数据库)在神经元及Hela细胞中的表达水平。该检验的具体实施步骤如下：
反转录过程：使用购买(如美国Qiagen公司)的microRNA提取试剂盒提取并富集神经元及Hela细胞中的小RNA(small RNA，其中包括成熟 microRNA，pre-microRNA，sncRNA等)。使用购买(如美国Invitrogen公司) 的反转录试剂盒，与购买(如NEB公司)的多聚腺嘌呤核苷酸聚合酶(poly (A)聚合酶)或多聚尿嘧啶核苷酸聚合酶(poly(U)聚合酶)混合将小RNA 反转为cDNA。
其中，多聚核苷酸聚合酶及反转录引物的选择方式如下：
1、microRNA-124-5p的前体pre-microRNA(MI0000443，miRbase数据库) 的序列如下：
AGGCCUCUCUCUCCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAAUGUCCAUACAAUUAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAGAAUGGGGCUG。
其中，下划线部分为microRNA-124-5p的序列，其下游两个碱基为UU，根据具体实施方式中的说明，选择多聚腺嘌呤核苷酸聚合酶(poly(A)聚合酶)；
2、多聚核苷酸聚合酶为多聚腺嘌呤核苷酸聚合酶(poly(A)聚合酶)时，根据具体实施方式中的说明，反转录引物为：
5’-GGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCATTTTTT TTTTTTTTTTTTVN-3’。其中，V为A,C,G中的一个；N为A,T,C,G中的一个。
具体反转录体系如表1所示：
表1
反转录过程为：37℃15min；42℃15min；85℃5min。反转录获得的cDNA保存于–20℃。
实时定量PCR过程：
使用反转录产物为模板检测microRNA-124-5p表达水平。使用购买(如美国Clontech公司)的实时定量PCR试剂盒所提供的SybrGreen染料，PCR酶， dNTP及反应缓冲液。
实时定量PCR引物选择如下：
1、下游引物为通用下游引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；
2、上游引物为microRNA-124-5p的DNA序列加上末端两个碱基：
a、microRNA-124-5p的DNA序列为CGTGTTCACAGCGGACCTTGAT；
b、反转录过程中用的聚合酶为多聚腺嘌呤核苷酸聚合酶(poly(A)聚合酶)，根据具体实施方式中的说明，引物末端加的碱基为-AA；
c、综合上述，上游引物为5’-CGTGTTCACAGCGGACCTTGATAA-3’。
具体实时定量PCR反应体系如表2所示：
表2
SYBRTaqⅡ(2X) 10ul
microRNA-124-5p上游引物(10uM) 0.8ul
通用下游引物(10uM) 0.8ul
cDNA 0.5ul
去离子水 补足20ul
实时定量PCR反应采用(如美国罗氏公司的)实时定量PCR仪，反应过程为：
Stage1：95℃ 3min
Stage2：95℃ 10second
60℃ 30second 40cycles。
结果分析：
扩增曲线结果如图2所示，从图中可以显示microRNA-124-5p在神经元 (a)，hela细胞(d)的扩增效果；内参RNU6-1(ID：26827，Genebank数据库)在神经元(b)，Hela细胞(c)的扩增效果。其中microRNA-124-5p的扩增曲线在不同复孔中重复性较好，并且在高表达细胞和低表达细胞中扩增曲线形态相似。说明本发明所用的microRNA特异引物可以在表达丰度较高和较低的体系内稳定的扩增目的序列。
根据扩增曲线计算Ct值及microRNA-124-5p在不同细胞中的相对表达量，结果显示如图3所示。该结果与已有文献报道的microRNA-124在神经元内高表达，在其他组织细胞内低表达的结论是相符的。
根据microRNA-124-5p在神经元(a)，hela细胞(d)扩增产物的溶解曲线，如图4所示，分析可以看出，microRNA-124-5p引物对microRNA表达量高或表达量低的样品的扩增特异性都很好。
如图5所示，通过核酸电泳，进一步分析扩增特异性。由本发明所设计的引物针对microRNA-124-5p的扩增产物大小为72bp，其具体序列为：CGTGTTCACAGCGGACCTTGATAAAAAAAAAAAAAAAAAATGGCTCTGG TGCGAATACCTCGGACCCTGCAC。假设本发明所用引物也存在针对 pre-microRNA的非特异扩增，则其扩增产物大小应为122bp，其具体序列应为 CGTGTTCACAGCGGACCTTGATTTAAATGTCCATACAATTAAGGCACGCGGTGAATGCCAAGAATGGGGCTGAAAAAAAAAAAAAAAAAATGGCTCTG GTGCGAATACCTCGGACCCTGCAC。电泳结果显示扩增产物小于100bp，大约为70bp-80bp。即不存在针对pre-microRNA的非特异扩增。通过将扩增产物连入T载体(购自美国Clontech公司)进行基因测序，结果也显示PCR的扩增是特异的针对成熟microRNA-124-5p。
实施例2
对成熟microRNA扩增特异性的比较。利用在使用本发明所介绍的方法检验microRNA-124-5p表达水平的同时，采用目前常用的Stem-loop PCR方法作对照。用两种方法检测microRNA-124-5p在神经元内的表达水平，得到的PCR 产物同时电泳，以检验两种方法的特异性。使用本发明所介绍的检验步骤如具体实施例1。使用stem-loop PCR检测的步骤如下：
反转录过程：
使用购买的microRNA stem-loop反转录及PCR试剂盒，按使用说明，反转录富集的小RNA。具体反应体系如表3所示：
表3
小RNA 小于2ug
2x反应缓冲液(试剂盒自带) 10ul
反转录引物(试剂盒自带) 2ul(2.5uM)
酶(试剂盒自带) 1.2ul
去离子水 补足20ul
具体反应过程为：37℃60min；85℃5min。反转录获得的cDNA保存于–20℃。
实时定量PCR过程：
实时定量PCR中，采用的引物，按试剂盒说明书准备：上游为 microRNA-124-5p的DNA序列：5’-CGTGTTCACAGCGGACCTTGAT-3’；下游引物为microRNAstem-loop PCR试剂盒所带通用下游引物。
具体反应体系如表4所示：
表4
SYBRTaqⅡ(2X) 10ul
microRNA-124-5p上游引物(10uM) 0.8ul
通用下游引物(试剂盒自带) 0.8ul
cDNA 0.5ul
去离子水 补足20ul
实时定量PCR反应采用(如美国罗氏公司的)实时定量PCR仪，反应过程为：
Stage1：95℃ 3min
Stage2：95℃ 10second
60℃ 30second 40cycles
结果分析：如(图6)所示，采用本发明所介绍的方法得到的PCR扩增产物条带为单一条带，小于100bp，大约为70bp-80bp，为特异扩增成熟 microRNA-124-5p的条带。采用目前常用的Stem-loop PCR方法得到的PCR扩增产物条带为三条带，说明采用Stem-loop PCR的方法无法针对成熟 microRNA-124-5p做特异性扩增。

Claims (9)

1.一种非疾病诊断目的的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取样品中包含microRNA组分的总RNA或小RNA，在反转录酶及聚合酶的作用下，反转录获取cDNA；所述聚合酶为Poly A聚合酶或Poly U聚合酶；
2)根据microRNA成熟序列及pre-microRNA序列，设计只针对microRNA成熟序列的上游引物，然后进行实时定量PCR，特异性检测成熟microRNA表达水平；
检测成熟microRNA的上游引物为成熟microRNA的DNA序列加上末尾两个碱基，该末尾两个碱基是根据反转录过程中所选的Poly A聚合酶或Poly U聚合酶而定。
2.根据权利要求1所述的非疾病诊断目的的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法，其特征在于，步骤1)所述的反转录采用一步法进行短时反应。
3.根据权利要求2所述的非疾病诊断目的的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法，其特征在于，短时反应条件为：37℃，10～15分钟；42℃，10～15分钟；85℃，5分钟。
4.根据权利要求1所述的非疾病诊断目的的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法，其特征在于，步骤1)中Poly A聚合酶或Poly U聚合酶的使用，由成熟microRNA序列信息和pre-microRNA序列信息进行选择。
5.根据权利要求4所述的非疾病诊断目的的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法，其特征在于：
在pre-microRNA序列中，位于待测microRNA的5p或3p序列下游的两个碱基为-NA-时，使用poly U聚合酶；其中，N为A,U,C或G中的一个；
在pre-microRNA序列中，位于待测microRNA的5p或3p序列下游的两个碱基为-NU-时，使用poly A聚合酶；其中，N为A,U,C或G中的一个；
在pre-microRNA序列中，位于待测microRNA的5p或3p序列下游的两个碱基为-NS-时，使用poly A聚合酶或poly U聚合酶中的任意一个，其中，N为A,U,C或G中的一个；S为C或G中的一个。
6.根据权利要求1或5所述的非疾病诊断目的的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法，其特征在于，步骤1)反转录过程中所用的引物根据所选的Poly A聚合酶或Poly U聚合酶而定。
7.根据权利要求1所述的非疾病诊断目的的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法，其特征在于：
当使用Poly A聚合酶时，反转录引物序列如SEQ.ID.NO.1所示，且在3’端末尾为VN-；其中，V为A,C或G中的一个；N为A,T,C或G中的一个；
当使用Poly U聚合酶时，反转录引物序列如SEQ.ID.NO.2所示，且在3’端末尾为BN-；其中，B为T,C或G中的一个；N为A,T,C或G中的一个。
8.根据权利要求1所述的非疾病诊断目的的特异检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法，其特征在于：
当使用Poly A聚合酶时，检测成熟microRNA的上游引物的末尾添加的两个碱基为-AA；
当使用Poly U聚合酶时，检测成熟microRNA的上游引物的末尾添加的两个碱基为-TT。
9.实现权利要求1～8中任意一项所述的非疾病诊断目的的特异性检测成熟microRNA表达水平的定量检测方法的试剂盒，其特征在于，能够完成100次反应的试剂盒，包括以下两个部分：
a)反转录部分，构成组分为：M-MLV逆转录酶50μ l，Poly A聚合酶50μ l，Poly U聚合酶50μ l，一步法反应缓冲液200μ l，如SEQ.ID.NO.1所示的反转录引物200μ l，如SEQ.ID.NO.2所示的反转录引物200μ l；
所述一步法反应缓冲液包括25mM Tris-HCl，50mM KCl，5mM MgCl2，10mM DTT，120mMNaCl，1mmol dNTP，pH值为7.6；
b)定量PCR部分，构成组分为：PCR反应混合液1ml，PCR反应下游通用引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’80μ l，PCR反应microRNA特异上游引物80μ l；
所述PCR反应混合液包括250U PCR酶，20mM(NH4)2SO4，4mM MgSO4，1mM dNTPs，1％Glycerol，0.02％20，10X Sybr green，pH值为9.1。
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PolyU tail of rho-independent terminator of bacterial small RNAs is essential for Hfq action;Hironori Otaka et al.;《PNAS》;20110809;第108卷(第32期);第13059–13064页
基于PCR技术的miRNA定量检测方法;陈新 等;《中国生物工程杂志》;20101231;第30卷(第11期);第88-93页

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