CN109136382B

CN109136382B - 一种对四种人体体液来源进行鉴定的方法和系统

Info

Publication number: CN109136382B
Application number: CN201710452729.6A
Authority: CN
Inventors: 孙启凡; 季安全; 李冉冉; 李彩霞
Original assignee: Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Current assignee: Institute of Forensic Science Ministry of Public Security PRC
Priority date: 2017-06-15
Filing date: 2017-06-15
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2037-06-15
Also published as: CN109136382A

Abstract

本发明提供一种对四种人体体液来源进行鉴定的方法和系统。该方法包括如下步骤：1)提取待鉴定的人体体液样本中的RNA，其中，人体体液样本的可能来源包括外周血、月经血、精液或唾液；2)对RNA中的体液特异性miRNA进行逆转录，并对得到的逆转录产物进行扩增，获得相应的扩增结果，其中，体液特异性miRNA包括miRNA214、miRNA451、miRNA144、miRNA888、miRNA891和miRNA205，同时，对内参基因进行逆转录，并对得到的内参逆转录产物进行扩增，获得内参扩增结果；3)根据扩增结果和内参扩增结果，确定所述人体体液样本的来源。采用上述方法，能够实现对人体体液样本组织属性来源的鉴定，并保证鉴定结果的准确性和可靠性。

Description

一种对四种人体体液来源进行鉴定的方法和系统

技术领域

本发明涉及一种对四种人体体液来源进行鉴定的方法和系统，属于法医学物证鉴定技术领域。

背景技术

在犯罪现场遗留的人源性样本，如外周血、月经血、唾液、精液等，获知其准确的组织属性来源，对于案件定性或重现案发现场意义重大。因此，对犯罪现场生物检材进行组织来源推断一直是法医物证学重要的研究内容。

目前针对人体体液样本组织属性来源的鉴定方法相对较多，包括传统的基于酶促反应或免疫学检测的生化鉴定方法和光谱学鉴定法等。随着分子生物学基础理论及检验技术的迅速发展，研究人员尝试用分子生物学的手段来解决组织来源鉴定问题，以进一步提高检测结果的准确性。目前常用的分子标记物包括信使RNA(messengerRNA，mRNA)、微RNA(MicroRNA，miRNA)、DNA甲基化等。

miRNA是一类广泛存在于真核细胞中、约由18-25个核酸组成的内源性非编码小分子RNA，具有组织特异性高、分子小且不易降解的特点，即便在极端温度、强酸、强碱条件下，其含量和分子结构均无明显变化，满足检测降解检材的需求，成为继mRNA之后的用于解决法医学关注的热点。但是目前采用miRNA作为分子标记物以鉴定人体体液来源的技术还不成熟，特异性较低，影响了检测结果的准确性和可靠性。因此，如何提供一种准确的鉴定方法和系统，以判断人体体液来源成为有待解决的问题。

发明内容

本发明提供一种对四种人体体液来源进行鉴定的方法，通过甄选多种miRNA作为体液异性标记，根据上述体液特异性miRNA在不同人体体液中的相对表达量高低，实现对外周血、月经血、精液和唾液这四种人体体液样本组织属性来源的准确鉴定。

本发明还提供一种对四种人体体液来源进行鉴定的系统，通过该系统能够实现对于人体体液样本组织属性来源的合理准确鉴定。

本发明还提供一种检测体系，该检测体系能够准确获得待鉴定人体体液中体液特异性miRNA经逆转录和扩增后的扩增结果。

本发明还提供一种检测试剂盒，包括上述检测体系。

本发明提供一种对四种人体体液来源进行鉴定的方法，包括以下步骤：

1)提取待鉴定的人体体液样本中的RNA，其中，该人体体液样本的可能来源包括外周血、月经血、精液或唾液；

2)对上述RNA中的体液特异性miRNA进行逆转录，并对得到的逆转录产物进行扩增，获得扩增结果，其中，上述体液特异性miRNA包括miRNA214、miRNA451、miRNA144、miRNA888、miRNA891和miRNA205，

同时，对内参基因进行逆转录，并对得到的内参逆转录产物进行扩增，获得内参扩增结果；

3)根据上述扩增结果和内参扩增结果，确定人体体液样本的来源。

本发明从多种miRNA中甄选出上述6条体液特异性miRNA作为四种人体体液：外周血、月经血、精液和唾液的特异性标记，以鉴定人体体液样本的组织属性来源。其中：miRNA451和miRN144作为血液的特异性标记，用于推断人体体液样本是否来源于血液；miRNA214作为月经血的特异性标记，以进一步推断来源于血液的人体体液样本是否来源于月经血；miRNA888和miRNA891作为精液特异性标记，miRNA205作为唾液特异性标记，用于进一步推断并非血液来源的人体体液样本是否来源于精液。通过对上述6条体液特异性miRNA进行逆转录及扩增结果的综合判断，实现对人体体液样本组织来源的准确判断。

本发明对于步骤1)中如何提取待鉴定的人体体液样本中的RNA不做特别限定，可采取本领域常规的技术手段进行。在本发明具体实施过程中，首先提取待鉴定的人体体液样本中总的RNA，然后去除基因组以对其进行纯化，最后对其进行完整性检测及定量，比如控制RNA的浓度为100ng/μL以用于逆转录。

可以理解，选用合理的逆转录引物及扩增引物，能够确保miRNA的高表达效率，保证鉴定结果的准确性和可靠性，在本发明优选的实施方式中，在步骤2)中：

采用与上述6条体液特异性miRNA(即miRNA214、miRNA451、miRNA144、miRNA888、miRNA891和miRNA205)一一对应的6个逆转录引物对体液特异性miRNA进行逆转录，并分别得到相应的6个逆转录产物(即cDNA)，其中，逆转录引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQ IDNo.6的核苷酸序列；

采用与上述6个逆转录产物一一对应的6对扩增引物分别对该逆转录产物进行扩增，并获得相应的扩增结果，比如Ct值(Cycle Threshold)，其中，扩增引物为序列表中SEQID No.7至SEQ ID No.18的核苷酸序列。

本发明对于步骤2)中所用的内参基因不做特别限定，可采用本领域常用的内参基因。在本发明具体实施过程中，步骤2)中所采用的内参基因为RNU6b，采用序列表中SEQ IDNo.20的核苷酸序列对内参基因RNU6b进行逆转录，得到内参逆转录产物；采用序列表中SEQID No.19和SEQ ID No.20的核苷酸序列对上述内参逆转录产物进行扩增，得到内参扩增结果。

本发明提供的与6条体液特异性miRNA对应的优选逆转录引物和内参基因RNU6b所对应的内参逆转录引物序列如表1所示。

表1

本发明所提供的与体液特异性miRNA对应的优选扩增引物序列和内参基因RNU6b对应的内参扩增引物序列如下表2所示，其中F代表上游引物，R代表下游引物。

表2

本发明对于上述步骤2)中逆转录及扩增反应的具体工艺不做特别限定，可采用本领域常规的技术进行。在本发明具体实施过程中，逆转录采用去核酸的水替代反转录酶设置阴性对照；扩增反应采用实时荧光定量(Real Time PCR)技术进行，具体采用荧光定量PCR仪，比如在QuantStudio^TM7Flex Real-Time PCR System(Applied Biosystems，美国)进行扩增反应，反应体系为10μL，包括Ct值在内的扩增结果通过QuantStudioTM Real-TimePCR Software v1.3(Thermo Fisher Scientific，美国)输出。

发明人通过对PCR扩增结果进行研究分析，发现：采用上述与体液特异性miRNA对应的逆转录引物和扩增引物，能够使各个体液特异性miRNA具有较高的表达效率，保证了鉴定结果的合理性和有效性。

在本发明具体实施过程中，步骤3)具体是根据扩增结果，即根据各个体液特异性miRNA在待鉴定人体体液样本中的相对表达量，以确定人体体液样本的来源。上述步骤3)可通过人工判断，也可通过计算机程序实现。

在本发明具体实施过程中，还可以联合其它法医学相关的人体体液组织来源鉴定技术，以更精确的获得鉴定结果。

本发明还提供一种对四种人体体液来源进行鉴定的系统，包括：检测体系和推断体系，其中：

检测体系用于对从人体体液样本中提取的RNA中的体液特异性miRNA进行逆转录，以及用于对得到的逆转录产物进行扩增，并获得扩增结果，其中，上述体液特异性miRNA包括miRNA214、miRNA451、miRNA144、miRNA888、miRNA891和miRNA205，

检测体系还用于对内参基因进行逆转录，以及用于对得到的内参逆转录产物进行扩增，并获得内参扩增结果；

推断体系用于根据上述扩增结果和内参扩增结果，确定人体体液样本的来源。

上述检测体系具体用于：

采用与上述6条体液特异性miRNA一一对应的6个逆转录引物对该体液特异性miRNA进行逆转录，分别得到相应的6个逆转录产物(即cDNA)，以及采用与上述6个逆转录产物一一对应的6对扩增引物对该逆转录产物进行扩增，并获得相应的Ct值，

采用内参逆转录引物对内参基因进行逆转录，得到内参逆转录产物，以及采用内参扩增引物对内参逆转录产物进行扩增，并获得内参扩增结果，比如内参Ct值。

其中，逆转录引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.6的核苷酸序列；扩增引物为序列表中SEQ ID No.7至SEQ ID No.18的核苷酸序列。

上述推断体系的具体形态可以为存储器以及处理器等可实现该功能的物理设备。其中存储器用于存储包括Ct值在内的扩增结果，处理器等物理设备用于根据上述扩增结果和内参扩增结果，推断人体体液样本的来源。

本发明还提供一种检测体系，包括：待鉴定的人体体液样本中的RNA、内参基因、内参逆转录引物、内参扩增引物、逆转录引物和扩增引物，其中：

所述检测体系用于分别对人体体液样本中的RNA中的体液特异性miRNA进行逆转录，并对得到的逆转录产物进行扩增，获得相应的扩增结果，

所述检测体系还用于对内参基因进行逆转录，并对得到的内参逆转录产物进行扩增，获得内参扩增结果，

其中，上述体液特异性miRNA包括miRNA214、miRNA451、miRNA144、miRNA888、miRNA891和miRNA205；

逆转录引物与上述体液特异性miRNA一一对应，逆转录引物为序列表中SEQ IDNo.1至SEQ ID No.6的核苷酸序列；

扩增引物与上述逆转录产物一一对应，扩增引物为序列表中SEQ ID No.7至SEQID No.18的核苷酸序列。

本发明对于检测体系中所使用的内参基因、内参逆转录引物和内参扩增引物不做特别限定，可采用本领域常规的内参基因以及与其配套的内参逆转录引物和内参扩增引物。在本发明具体实施过程中，内参基因为RNU6b，内参逆转录引物为序列表中SEQ IDNo.20的核苷酸序列，内参扩增引物为序列表中SEQ ID No.19和SEQ ID No.20的核苷酸序列，具体可参见表2。

本发明最后提供一种检测试剂盒，包括上述检测体系。

本发明建立了一种对四种人体体液来源进行鉴定的方法和系统，甄选miRNA214、miRNA451、miRNA144、miRNA888、miRNA891和miRNA205这六种体液特异性miRNA作为特异性标记，通过对其进行逆转录和扩增，根据上述体液特异性miRNA在外周血、月经血、精液和唾液中相对表达量的高低，实现了对人体体液样本组织属性来源的准确、可靠、快速鉴定。该方法合理有效，能够应用于法医实践中，对于案件定性或重现案发现场具有重大的意义。

并且，本发明提供的上述方法和系统，克服了因miRNA在细胞中含量较低而提取难度较大的困难，有效防止了因提取技术可能带来的不确定因素，因此，进一步保证了该方法和系统的合理性和有效性。

附图说明

图1为本发明实验例1中的扩增试验结果(A：扩增曲线；B：标准曲线)；

图2为本发明实验例2中的扩增产物琼脂糖电泳检测图；

图3为本发明实验例3中体液特异性miRNA在不同人体体液样本中的相对表达比例。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1验证本发明提供的对四种人体体液来源进行鉴定的方法和系统的准确性

根据知情同意原则，采集18个无关汉族个体的体液样本(年龄在23-25周岁)，其中10份新鲜外周血样本、10份新鲜唾液、10份新鲜月经血、8份新鲜精液。所有体液样本保存于-80℃。

在本实施例中，所有人体体液样本的来源已知，但在本实施例的实施过程中设定其来源未知。采用本发明的方法和系统对上述人体体液样本进行鉴定，包括：

1、提取上述待鉴定的人体体液样本中的RNA。2、利用本发明的系统中的检测体系对上述RNA中的特异性miRNA进行逆转录，然后对得到的逆转录产物进行扩增，并获得相应的扩增结果；同时，对内参基因进行逆转录，并对得到的内参逆转录产物进行扩增，获得内参扩增结果。3、利用本发明的系统中的推断体系，根据扩增结果以及内参扩增结果，确定上述人体体液样本的来源。

本实施例中，检测体系包括待鉴定的人体体液样本中的RNA、内参基因RNU6b、内参逆转录引物、内参扩增引物、逆转录引物和扩增引物，该检测体系用于分别对RNA中的特异性miRNA进行逆转录，以及用于对得到的逆转录产物进行扩增，并获得相应的扩增结果，该检测体系还用于对内参基因进行逆转录，以及用于对得到的内参逆转录引物进行扩增，并获得内参扩增结果。

其中，上述体液特异性miRNA包括miRNA214、miRNA451、miRNA144-3P、miRNA888、miRNA891a和miRNA205-5P，上述所有体液特异性miRNA的序列参见表3；逆转录引物与体液特异性miRNA一一对应，逆转录引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.6的核苷酸序列；扩增引物与逆转录产物一一对应，扩增引物为序列表中SEQ ID No.7至SEQ ID No.18的核苷酸序列，内参逆转录引物为序列表中SEQ ID No.20的核苷酸序列，内参扩增引物为序列表中SEQ ID No.19和SEQ ID No.20的核苷酸序列，具体参见表1和表2。

表3

miRNA	SEQ ID No.	序列
			miRNA451	21	AAACCGUUACCAUUACUGAGUU
miRNA144-3P	22	UACAGUAUAGAUGAUGUACU
			miRNA214	23	ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU
miRNA888	24	UACUCAAAAAGCUGUCAGUCA
			miRNA891a	25	UGCAACGAACCUGAGCCACUGA
miRNA205-5P	26	UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG

1、提取待鉴定的人体体液样本中的RNA

按照miRNeasy Mini Kit说明书(Qiagen，德国)提取人体体液样本中的总RNA，然后按照Turbo DNA-freeTM kit说明书(Ambion，美国)去除基因组DNA，进行纯化。纯化后的所有样本经琼脂糖变性凝胶检测所提取样本的完整性，并且用Nanodrop2000c(ThermoFisher Scientific，美国)定量后，用去核酸酶的水(Nuclease-Free Water)稀释至100ng/μL，得到模板RNA。

2、对所述模板RNA中的体液特异性miRNA以及内参基因RNU6b进行逆转录，然后对分别得到的逆转录产物以及内参逆转录产物进行扩增，并获得相应的扩增结果以及内参扩增结果

2.1、根据表1中的逆转录引物，对上述RNA中的miRNA214、miRNA451、miRNA144-3P、miRNA888、miRNA891a和miRNA205-5P进行逆转录，得到对应的逆转录产物cDNA，同时，对内参基因RNU6b进行逆转录，得到内参逆转录产物。

逆转录过程中的反应体系和反应条件参见表4，采用去核酸酶的水替代反转录酶设置阴性对照组。

表4

2.2、采用表2中的扩增引物，分别对上述逆转录产物cDNA和内参逆转录产物进行扩增。扩增反应在QuantStudio^TM7Flex Real-Time PCR System(Applied Biosystems，美国)上进行，反应体系为10μL，具体反应条件参见表5。

包括Ct值在内的扩增结果通过QuantStudio^TM Real-Time PCR Software v1.3(Thermo Fisher Scientific，美国)输出。

表5

3、根据扩增结果和内参扩增结果，确定人体体液样本的来源。

本实施例采用各体液特异性miRNA在不同人体体液样本中的相对表达量高低，以确定人体体液样本的组织来源。

为方便说明，本实施例中，miRNA214、miRNA451、miRNA144-3P、miRNA888、miRNA891a和miRNA205-5P经逆转录和扩增后得到的6个Ct值相应记为Ct214、Ct451、Ct144、Ct888、Ct891、Ct205，内参基因RNU6b经逆转录和扩增后得到的内参Ct值记为Ct RNU6b。上述6个Ct值与Ct RNU6b之间的差值分别记为ΔCt₂₁₄、ΔCt₄₅₁、ΔCt₁₄₄、ΔCt₈₈₈、ΔCt₈₉₁、ΔCt₂₀₅，比如ΔCt₂₁₄＝Ct214-Ct RNU6b。

本实施例中，Ct214、Ct451、Ct144、Ct888、Ct891、Ct205的值均小于35，说明本实施例的逆转录和扩增反应成功(Ct值≥35视为不表达)。

比较ΔCt₄₅₁和ΔCt₁₄₄与其余4个ΔCt之间的大小，若ΔCt₄₅₁同时小于ΔCt₂₁₄、ΔCt₈₈₈、ΔCt₈₉₁和ΔCt₂₀₅，并且ΔCt₁₄₄也同时小于ΔCt₂₁₄、ΔCt₈₈₈、ΔCt₈₉₁和ΔCt₂₀₅，或者说，Ct451和Ct144同时小于Ct214、Ct888、Ct891和Ct205，则可推断人体体液样本来源于血液，否则推断人体体液样本并非来源于血液；

在推断了人体体液样本来源于血液的基础上，进一步比较ΔCt₂₁₄与ΔCt₈₈₈、ΔCt₈₉₁和ΔCt₂₀₅的大小，若ΔCt₂₁₄同时小于ΔCt₈₈₈、ΔCt₈₉₁和ΔCt₂₀₅，或者说，Ct214同时小于Ct888、Ct891和Ct205，则可推断人体体液样本来源于月经血，否则推断人体体液样本来源于外周血。

在推断了人体体液样本并非来源于血液的基础上，比较ΔCt₈₈₈和ΔCt₈₉₁与其余4个ΔCt之间的大小，若ΔCt₈₈₈和ΔCt₈₉₁分别小于ΔCt₂₁₄、ΔCt₄₅₁、ΔCt₁₄₄和ΔCt₂₀₅，也即，Ct888和Ct891分别同时小于Ct214、Ct451、Ct 144和Ct205，则推断人体体液样本来源于精液，否则人体体液样本来源于唾液。

采用本实施例的方法和系统获得的所有的人体体液来源鉴定结果与实际人体体液来源均一致，一致性达到100％，证实了本发明的对四种人体体液来源进行鉴定的方法和系统的准确性。

实验例1

以miRNA451为例，按照实施例1中的条件及程序对其进行逆转录，然后对得到的逆转录产物(cDNA)进行扩增，具体逆转录和扩增反应条件参见表4和表5。扩增结果分析在QuantStudio^TM Real-Time PCR Software v1.3(Thermo Fisher Scientific，美国)上完成，包括扩增曲线(A)和标准曲线(B)，具体参见图1，其中a：cDNA稀释1,000倍；b：cDNA稀释10,000倍；c：cDNA稀释100,000倍；d：cDNA稀释1,000,000倍；e：cDNA稀释10,000,000倍。

根据图1可知，miRNA451扩增曲线梯度重复性好；根据连续梯度稀释方法生成的标准曲线指标R²＞0.99，Eff％(Efficiency)＞0.9，说明miRNA表达效率高，重复性好，引物的特异性良好。

实验例2

使用变性琼脂糖凝胶，对实施例1中所有体液特异性miRNA经逆转录和扩增后得到的扩增产物进行检测确认，其中，每种miRNA平行测试两次，得到的电泳检测图谱参见图2。

其中：miR451代表miRNA451，miR144代表miRNA144-3P，miR888代表miRNA888，miR891代表miRNA891a，miR205代表miRNA205-5P，miR214代表miRNA214，U6代表内参基因RNU6b。

根据图2可知，每种体液特异性miRNA及内参基因的条带单一，可见纯度良好。

实验例3

首先采用与实施例1中完全一致的方法采集体液样本并提取人体体液样本中的RNA。测试各个miRNA在不同人体体液样本中的相对表达量，如图3所示。

根据图3可知，不同的miRNA在不同的人体体液样本中均展现了不同的表达模式。其中，miRNA451和miRNA144在外周血和月经血的相对表达量明显高于在唾液和精液中的表达量，所以可以利用miRNA451和miRNA144区分血液和非血液。miRNA214在月经血中的相对表达量明显高于在其它人体体液中的相对表达量，因此用于区分血液来源的人体体液样本是否来源于月经血。miRNA888和miRNA891在精液中的相对表达量高于在其他人体体液中的相对表达量，因此可用于区分非血液来源的人体体液是否来源于精液。miRNA205在月经血中的相对表达量略高于在其在唾液中的相对表达量，并显著高于其在精液及外周血中的相对表达量。

因此，采用本发明中所选择的上述6条体液特异性miRNA对人体体液来源进行鉴定，具有较高的合理性和可靠性。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 公安部物证鉴定中心

<120> 一种对四种人体体液来源进行鉴定的方法和系统

<130> 171630GF

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 1

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacactgcc 50

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacaactca 50

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacagtaca 50

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactgactg 50

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactcagtg 50

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccagact 50

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

gtgcagggtc cgaggt 16

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

tgatgacagc aggcacagac a 21

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

gtgcagggtc cgaggt 16

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

cggaaaccgt taccattact gag 23

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

gtgcagggtc cgaggt 16

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

cgcgccttac agtatagatg atg 23

<210> 13

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

gtgcagggtc cgaggt 16

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

cgtctcatac tcaaaaagct gtcag 25

<210> 15

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

gtgcagggtc cgaggt 16

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

acaactgcaa cgaacctgag c 21

<210> 17

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

gtgcagggtc cgaggt 16

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

agatctcctt cattccaccg g 21

<210> 19

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

aacgcttcac gaatttgcgt 20

<210> 21

<211> 22

<212> RNA

<213> 人

<400> 21

aaaccguuac cauuacugag uu 22

<210> 22

<211> 20

<212> RNA

<213> 人

<400> 22

uacaguauag augauguacu 20

<210> 23

<211> 22

<212> RNA

<213> 人

<400> 23

acagcaggca cagacaggca gu 22

<210> 24

<211> 21

<212> RNA

<213> 人

<400> 24

uacucaaaaa gcugucaguc a 21

<210> 25

<211> 22

<212> RNA

<213> 人

<400> 25

ugcaacgaac cugagccacu ga 22

<210> 26

<211> 22

<212> RNA

<213> 人

<400> 26

uccuucauuc caccggaguc ug 22

Claims

1.一种对四种人体体液来源进行鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取待鉴定的人体体液样本中的RNA，其中，所述人体体液样本的可能来源包括外周血、月经血、精液或唾液；

2）对所述RNA中的体液特异性miRNA进行逆转录，并对得到的逆转录产物进行扩增，获得相应的扩增结果，其中，所述体液特异性miRNA包括miRNA214、miRNA451、miRNA144、miRNA888、miRNA891和miRNA205，

3）根据上述扩增结果和内参扩增结果，确定所述人体体液样本的来源；

在步骤2）中，采用与所述体液特异性miRNA一一对应的逆转录引物对其进行逆转录，分别得到相应的逆转录产物，其中，所述逆转录引物为序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.6的核苷酸序列；

采用与所述逆转录产物一一对应的扩增引物对其进行扩增，并获得相应的Ct值，其中，所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.7至SEQ ID No.18的核苷酸序列；

所述内参基因为RNU6b，采用序列表中SEQ ID No.20的核苷酸序列对所述内参基因进行逆转录，得到所述内参逆转录产物；

采用序列表中SEQ ID No.19和SEQ ID No.20的核苷酸序列对所述内参逆转录产物进行扩增，得到所述内参扩增结果；

其中，miRNA451和miRN144作为血液的特异性标记；miRNA214作为月经血的特异性标记；miRNA888和miRNA891作为精液特异性标记，miRNA205作为唾液特异性标记。

2.一种用于实施权利要求1所述的对四种人体体液来源进行鉴定的方法的检测体系，其特征在于，包括：待鉴定的人体体液样本中的RNA、内参基因、内参逆转录引物、内参扩增引物、逆转录引物和扩增引物，其中：

所述检测体系用于对所述RNA中的体液特异性miRNA进行逆转录，并对得到的逆转录产物进行扩增，获得相应的扩增结果，

其中，所述体液特异性miRNA包括miRNA214、miRNA451、miRNA144、miRNA888、miRNA891和miRNA205；

所述逆转录引物与所述体液特异性miRNA一一对应，所述逆转录引物为序列表中SEQID No.1至SEQ ID No.6的核苷酸序列；

所述扩增引物与所述逆转录产物一一对应，所述扩增引物为序列表中SEQ ID No.7至SEQ ID No.18的核苷酸序列；

所述内参基因为RNU6b，所述内参逆转录引物为序列表中SEQ ID No.20的核苷酸序列，所述内参扩增引物为序列表中SEQ ID No.19和SEQ ID No.20的核苷酸序列。

3.一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的检测体系。