CN110241192B - 一种鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血的方法及其使用的miRNA组合 - Google Patents

一种鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血的方法及其使用的miRNA组合 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血的方法及其使用的miRNA组合。该方法为检测miR‑451、miR‑203、miR‑205、miR‑214在待测体液中的相对表达量，然后代入Fisher判别函数，判断待测体液为非血液、月经血还是外周血，准确性可达到100％。本发明为明确案件性质、确定犯罪嫌疑人以及定罪量刑等提供准确的科学依据，具有重要的应用价值。

Description

一种鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血的方法及其 使用的miRNA组合
技术领域
本发明属于法医技术学领域，具体涉及一种鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血的方法及其使用的miRNA组合。
背景技术
通过鉴别案发现场体液斑迹的组织来源，可推断样本来源人及其真实犯罪活动，从而为案件定性及现场重建提供重要信息，为法庭科学提供重要的科学证据。案件现场常见的体液包括外周血、月经血、唾液、精液、阴道分泌液等。血液是案发现场最常见也是最重要的检材之一，血液与非血液类样本最大的不同在于血液中含有大量的血细胞，而外周血与月经血虽然均含有大量红细胞，但与外周血相比，月经血中还含有大量的子宫内膜碎片、子宫颈粘液和阴道分泌物等混合物。现场血液类检材是属于外周血还是月经血是非常重要的法庭科学问题，往往对案件定性及重建案发现场、提供法庭证据具有十分重要的意义；尤其是针对性侵案件、女性失踪案以及某些伤害案中，女性受害者称因受暴力攻击出现血尿，在这种情况下，需要确定尿液中的血细胞来源是否存在月经血污染。
miRNA是一类广泛存在于真核细胞中约由18-25个核酸组成的内源性非编码小分子RNA，在生物体内起基因表达调控作用。由于其具有稳定性高、保守性强和组织特异性好等生物学特性，被国内外法医学者认为有很大的潜能成为法医学体液来源鉴别的有力工具。目前已有大量利用miRNA进行体液组织来源鉴别的研究，然而不同的研究方法和实验平台得出的结论并不完全一致，结果重复性差。月经血与外周血的两种血液类体液间的鉴别区分仍是法医学体液鉴别的重点及难点。
发明内容
本发明的目的是鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血。
本发明首先保护一种鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血的产品(以下称为产品甲)，可包括检测待测体液的miRNA组合甲中各个miRNA的表达量的试剂；
所述miRNA组合甲为a1)或a2)：
a1)由miR-451、miR-214、miR-203和miR-205组成；
a2)包括miR-451、miR-214、miR-203和miR-205；
miR-451的核苷酸序列如序列表中序列1所示；
miR-214的核苷酸序列如序列表中序列2所示；
miR-203的核苷酸序列如序列表中序列3所示；
miR-205的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
所述产品甲还可包括装置1和装置2。
所述装置1包括数据输入设备1、数据记录模块1、数据处理模块1-1、数据处理模块1-2、数据比较模块1和结论输出模块1。
数据输入设备1用于输入所述miR-451的表达量。
数据记录模块1用于存储所述miR-451的表达量数值。
数据处理模块1-1用于以血液与非血液作为因变量，miR-451的表达量作为自变量，根据若干血液样本和若干非血液样本的数据建立血液Fisher判别函数和非血液Fisher判别函数。Fisher判别函数的建立方法记载于如下文献中：Semen-specific miRNAs:Suitable for the distinction of infertile semen in the body fluididentification？.
数据处理模块1-2用于将待测体液的miR-451的表达量分别代入血液Fisher判别函数和非血液Fisher判别函数，依次得到待测体液的血液判别函数值(Z1)和非血液判别函数值(Z2)。
数据比较模块1用于比较Z1和Z2。
结论输出模块1用于显示结论，即如果待测体液的Z1>Z2，则结论输出模块1显示血液；如果待测体液的Z1<Z2，则结论输出模块1显示非血液。
所述装置2包括数据输入设备2、数据记录模块2、数据处理模块2-1、数据处理模块2-2、数据比较模块2和结论输出模块2。
数据输入设备2用于输入miR-214、miR-203和miR-205的表达量。
数据记录模块2用于存储miR-214、miR-203和miR-205的表达量数值。
数据处理模块2-1用于以外周血与月经血作为因变量，miR-203、miR-205和miR-214的表达量作为自变量，根据若干外周血样本和若干月经血样本的数据，建立外周血Fisher判别函数与月经血Fisher判别函数。Fisher判别函数的建立方法记载于如下文献中：Differentiation of five body fluids from forensic samples by expressionanalysis of four microRNAs using quantitative PCR.
数据处理模块2-2用于将待测体液的miR-214、miR-203和miR-205的表达量分别代入外周血Fisher判别函数和月经血Fisher判别函数，依次得到待测体液的外周血判别函数值(Y1)和月经血判别函数值(Y2)。
数据比较模块2用于比较Y1和Y2。
结论输出模块2用于显示结论，即如果待测体液的Y1>Y2，则结论输出模块1显示外周血；如果待测体液的Y1<Y2，则结论输出模块1显示月经血。
所述产品甲具体可由检测待测体液的miRNA组合甲中各个miRNA的表达量的试剂组成。
所述产品甲具体可由检测待测体液的miRNA组合甲中各个miRNA的表达量的试剂、装置甲和装置乙组成。
本发明还保护一种鉴定待测体液为血液还是非血液的产品(以下称为产品乙)，可包括检测待测体液的miR-451的表达量的试剂；
所述miR-451的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
所述产品乙还可包括所述装置1。
所述产品乙具体可由检测待测体液的miR-451的表达量的试剂组成。
所述产品乙具体可由检测待测体液的miR-451的表达量的试剂和所述装置1组成。
本发明还保护一种鉴定待测血液为月经血还是外周血的产品(以下称为产品丙)，可包括检测待测血液的miRNA组合乙中各个miRNA的表达量的试剂；
所述miRNA组合乙为b1)或b2)：
b1)由所述miR-214、所述miR-203和所述miR-205组成；
b2)包括miR-214、miR-203和miR-205；
所述miR-214的核苷酸序列如序列表中序列2所示；
所述miR-203的核苷酸序列如序列表中序列3所示；
所述miR-205的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
所述产品丙还可包括所述装置2。
所述产品丙具体可由检测待测血液的miRNA组合乙中各个miRNA的表达量的试剂组成。
所述产品丙具体可由检测待测血液的miRNA组合乙中各个miRNA的表达量的试剂和所述装置2组成。
本发明还保护一种鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血的方法，可包括如下步骤：
(e1)以血液与非血液作为因变量，miR-451的表达量作为自变量，根据若干血液样本和若干非血液样本的数据建立血液和非血液的Fisher判别函数；
(e2)检测待测体液的miR-451的表达量并代入步骤(e1)建立的Fisher判别函数，得到待测体液的血液判别函数值和非血液判别函数值；然后进行如下判断：
如果待测体液的血液判别函数值>非血液判别函数值，则待测体液为或疑似为血液；如果待测体液的血液判别函数值<非血液判别函数值，则待测体液为或疑似为非血液；如果待测体液为或疑似为血液，则按照步骤(e3)和(e4)进一步鉴定待测体液为月经血还是外周血：
(e3)以外周血与月经血作为因变量，miR-203、miR-205和miR-214的表达量作为自变量，根据若干外周血样本和若干月经血样本的数据建立外周血和月经血的Fisher判别函数；
(e4)检测待测体液的miR-203、miR-205和miR-214的表达量并代入步骤(e3)建立的Fisher判别函数，得到待测体液的外周血判别函数值和月经血判别函数值；然后进行如下判断：如果待测体液的外周血判别函数值>月经血判别函数值，则待测体液为或疑似为月经血；如果待测体液的外周血判别函数值<月经血判别函数值，则待测体液为或疑似为月经血。
本发明还保护一种鉴定待测体液为血液还是非血液的方法，可包括如下步骤：
(c1)以血液与非血液作为因变量，miR-451的表达量作为自变量，根据若干血液样本和若干非血液样本的数据建立血液和非血液的Fisher判别函数；
(c2)检测待测体液的miR-451的表达量并代入步骤(c1)建立的Fisher判别函数，得到待测体液的血液判别函数值和非血液判别函数值；然后进行如下判断：如果待测体液的血液判别函数值>非血液判别函数值，则待测体液为或疑似为血液；如果待测体液的血液判别函数值<非血液判别函数值，则待测体液为或疑似为非血液。
本发明还保护一种鉴定待测血液为月经血还是外周血的方法，可包括如下步骤：
(d1)以外周血与月经血作为因变量，miR-203、miR-205和miR-214的表达量作为自变量，根据若干外周血样本和若干月经血样本的数据建立外周血和月经血的Fisher判别函数；
(d2)检测待测体液的miR-203、miR-205和miR-214的表达量并代入步骤(d1)建立的Fisher判别函数，得到待测体液的外周血判别函数值和月经血判别函数值；然后进行如下判断：如果待测体液的外周血判别函数值>月经血判别函数值，则待测体液为或疑似为月经血；如果待测体液的外周血判别函数值<月经血判别函数值，则待测体液为或疑似为月经血。
本发明还保护一种鉴定待测血液为月经血还是外周血的方法，可包括如下步骤：
(f1)检测待测体液的miRNA组合乙的各个miRNA的表达量；检测标准体液群中的各个标准体液的miRNA组合乙的各个miRNA的表达量；所述标准体液群由外周血和月经血组成；
(f2)根据待测体液和每个标准体液的miRNA组合乙中的任意两个miRNA的表达量，绘制二维散点图；
如果二维散点图中待测体液与外周血为同一类，该待测体液即为外周血；
如果二维散点图中待测体液与月经血为同一类，该待测体液即为月经血。
本发明还保护上述任一所述miRNA组合甲。
本发明还保护上述任一所述miRNA组合乙。
本发明还保护s1)或s2)或s3)或s4)或s5)或s6)。
上述任一所述miRNA组合甲在鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血中的应用。
上述任一所述miR-451在鉴定待测体液为血液还是非血液中的应用。
上述任一所述miRNA组合乙在鉴定待测血液为月经血还是外周血中的应用。
上述任一所述产品甲在鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血中的应用。
上述任一所述产品乙在鉴定待测体液为血液还是非血液中的应用。
上述任一所述产品丙在鉴定待测血液为月经血还是外周血中的应用。
上述任一所述待测体液可为外周血、月经血、唾液、精液或阴道分泌液。
上述任一所述待测血液可为外周血或月经血。
上述任一所述血液样本可为外周血样本或月经血样本。
上述任一所述非血液样本可为唾液样本、精液样本或阴道分泌液样本。
上文中，检测目的miRNA(miR-451、miR-214、miR-203或miR-205)的表达量具体可为检测目的miRNA的相对表达量。所述检测目的miRNA的相对表达量具体可以RNU6b为内参。
以所述miR451为例，检测miR451的相对表达量步骤如下：
1)以待测体液的Total RNA为模板，以miR451的RT引物：
5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTCA-3’进行逆转录，得到的cDNA；
2)以步骤1)得到cDNA为模板，采用miR451的通用正向扩增引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’和下游引物(R)：5’-CGGAAACCGTTACCATTACTGAG-3’组成的引物对进行实时荧光定量PCR，然后输出待测体液的Ct值(即每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数)，即为CtmiR451；
3)以待测体液的Total RNA为模板，以RNU6b的RT引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’进行逆转录，得到的cDNA；
4)以步骤3)得到cDNA为模板，采用5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’和5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’组成的引物对进行实时荧光定量PCR，然后输出待测体液的Ct值，即为CtRNU6b；
5)计算miR451的ΔCt，ΔCt＝CtmiR451-CtRNU6b，ΔCt即为miR451的相对表达量(以RNU6b为内参)。
各个miRNA的RT引物的核苷酸序列具体见表2。
各个miRNA的下游引物(R)的核苷酸序列具体见表4。
在本发明的一个实施例中，从北京地区、杭州地区的150个志愿者(年龄在23-35周岁)中获得30份外周血样本、30份唾液样本、30份精液样本、30份月经血样本和30份阴道分泌液样本。30份外周血样本和30份月经血样本组成60份血液样本。30份唾液样本、30份精液样本和30份阴道分泌液样本组成90份非血液样本。以血液样本与非血液样本作为因变量，miR-451的ΔCt(即miR451的相对表达量)作为自变量，根据60份血液样本和90份非血液样本的数据建立血液与非血液的Fisher判别函数。血液Fisher判别函数为：Z1＝-1.772ΔCt(miR-451)-8.179。非血液Fisher判别函数为：Z2＝1.319ΔCt(miR-451)-4.842。以外周血与月经血作为因变量，miR-203、miR-205和miR-214的ΔCt作为自变量(即miR-203的相对表达量、miR-205的相对表达量和miR-214的相对表达量)，根据30份外周血样本和30份月经血样本的数据建立外周血与月经血的Fisher判别函数。外周血的Fisher判别函数为：Y1＝3.117ΔCt(miR-205)+9.398ΔCt(miR-214)+2.619ΔCt(miR-203)-93.540。月经血的Fisher判别函数为：Y2＝0.506ΔCt(miR-205)+2.736ΔCt(miR-214)+0.172ΔCt(miR-203)-5.699。
本发明的发明人使用四种miRNA(miR-451、miR-205、miR-214和miR-203)，收集五种法医学常见体液(包括两种血液类体液(外周血和月经血)和三种非血液类体液(唾液、精液、阴道分泌液))，采用SYBRGreen荧光实时定量PCR技术检测目标分子在样本中的相对表达量。通过对检测结果统计分析，建立了基于Fisher判别函数的月经血外周血鉴别策略，即通过检测miR-451、miR-203、miR-205、miR-214在待测体液中的相对表达量数值，判别待测体液为非血液、月经血还是外周血，准确性可达到100％。本发明为明确案件性质、确定犯罪嫌疑人以及定罪量刑等提供准确的科学依据，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为根据不同体液4种miRNA的ΔCt平均值，采用GraphPad Prism 7软件绘制的柱状图。
图2为以4种miRNA为横坐标，样本编号为纵坐标，采用GraphPad Prism 7软件绘制的热图。
图3为根据miRNA的ΔCt，采用GraphPad Prism 7软件绘制的二维散点图。
图4为鉴定待测体液是否为月经血或外周血的方法的技术路线图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中，所有引物均有sangon公司合成。miRNeasy Mini Kit为德国Qiagen公司的产品。Nanodrop2000c为美国Thermo Scientific公司的产品。QuantStudioTM7FlexReal-Time PCR System为美国Applied Biosystems公司的产品。Power SYBR GreenPCRMaster Mix(2×)为Applied Biosystems公司的产品。5×First-Strand Buffer、DTT(0.1M)和M-MLV Reverse Transcriptase(200U/μL)均为invitrogen公司的产品。dNTPMixture(10mM)和Nuclease-Free Water为TaKaRa公司的产品。Recombinant
Figure BDA0002126339790000071
RNaseInhibitor(40U/μL)为Promega公司的产品。
下述实施例中，4种miRNA的名称和核苷酸序列如表1中第2行至第5行所示，RNU6b的核苷酸序列如表1中第6行所示。
表1
目的miRNA 核苷酸序列(5’-3’) 在序列表中的位置
miR-451 AAACCGUUACCAUUACUGAGUU 序列1
miR-214 ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU 序列2
miR-203 GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG 序列3
miR-205 UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG 序列4
RNU6b CTGCGCAAGGATGACACGCAAATTCGTAAGCGTTCCATATTTTT 无
实施例、
一、样本采集
200份样本来自北京地区、杭州地区的200个志愿者(年龄在23-35周岁)。200个志愿者为无关个体，且均知情同意。
样本编号为PB1-PB40的40份样本均为外周血样本。外周血样本为抽取部分志愿者手臂处静脉血获得，-80℃保存。
样本编号为MB1-MB40的40份样本均为月经血样本。40份月经血样本为部分志愿者用卫生棉条在月经周期前4天采集，室温晾干1天后-80℃保存。
样本编号为SA1-SA40的40份样本均为唾液样本。40份唾液样本为将部分志愿者唾液收集在无菌塑料管中获得(收集前志愿者禁食1h)，-80℃保存。
样本编号为SE1-SE40的40份样本均为精液样本。40份精液样本为将部分志愿者新鲜精液收集在无菌广口塑料杯中获得(收集前志愿者禁欲2天)，-80℃保存。
样本编号为VA1-VA40的40份样本均为阴道分泌液样本。40份阴道分泌液样本为部分志愿者用卫生棉条在在非月经期采集，室温晾干1天后-80℃保存。
二、cDNA的获得
1、采用miRNeasy Mini Kit分别提取200份样本的Total RNA，得到200份样本的Total RNA。
2、完成步骤1后，分别取(少量)200份样本的Total RNA进行琼脂糖凝胶电泳(目的为检测200份样本的Total RNA的完整性)。
3、完成步骤2后，取200份样本的Total RNA，使用Nanodrop2000c进行定量。
4、完成步骤3后，分别以200份样本的Total RNA为模板(含100ng RNA)，以表2中相应的RT引物进行逆转录，得到相应的cDNA。
以Nuclease-Free Water为模板，分别以表2中的RT引物进行逆转录，作为阴性对照。
表2
目的miRNA RT引物的核苷酸序列(5’-3’)
miR-451 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTCA
miR-214 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTGCC
miR-203 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTAGTG
miR-205 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGACT
RNU6b AACGCTTCACGAATTTGCGT
逆转录的反应体系见表3。
表3
Figure BDA0002126339790000081
Figure BDA0002126339790000091
逆转录的反应条件：16℃30min，37℃30min，65℃5min，4℃保存。
三、基于4种miRNA的相对表达量鉴定待测体液是否为月经血或外周血的方法
1、实时荧光定量PCR检测
分别以步骤二得到的cDNA为模板，采用通用正向扩增引物和相应的目的miRNA的特异性反向扩增引物组成的引物对进行实时荧光定量PCR(每个模板做三个平行样)。通过实时荧光定量PCR检测目的miRNA(miR-451、miR-214、miR-203或miR-205)的相对表达量(以RNU6b为内参)。实时荧光定量PCR在QuantStudioTM7Flex Real-Time PCR System上进行。通用正向扩增引物和特异性反向扩增引物的核苷酸序列见表4。检测RNU6b的引物为：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’和5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。
表4
核苷酸序列(5’-3’)
通用正向扩增引物 GTGCAGGGTCCGAGGT
miR-451的特异性反向扩增引物 CGGAAACCGTTACCATTACTGAG
miR-214的特异性反向扩增引物 TGATGACAGCAGGCACAGACA
miR-203的特异性反向扩增引物 CCCGTGAAATGTTTAGGACCA
miR-205的特异性反向扩增引物 AGATCTCCTTCATTCCACCGG
实时荧光定量PCR的反应体系见表5。
表5
组分 体积
Power SYBR GreenPCR Master Mix(2×) 5μL
通用正向扩增引物(浓度为10μM) 0.25μL
特异性反向扩增引物(浓度为10μM) 0.25μL
Nuclease-free water 4μL
模板 0.5μL
实时荧光定量PCR的反应条件：95℃10min；95℃15s，60℃1min，共40个循环；95℃15s；60℃1min条件下分析熔解曲线。
将步骤二得到的cDNA替换为Nuclease-free water，其它步骤均不变，作为阴性对照。
结果表明，目的miRNA(miR-451、miR-214、miR-203或miR-205)的熔解曲线呈现单一峰。
2、将步骤1得到的实时荧光定量PCR的结果通过QuantStudioTM Real-Time PCRSoftware V1.3(美国Thermo Fisher Scientific公司的产品)输出，即每个样本的Ct值。Ct值越小，目的miRNA的表达量越高(经统计分析，将Ct值大于35视作不表达)。同时计算目的miRNA的ΔCt，ΔCt＝Ct目的miRNA-CtRNU6b。ΔCt即为目的miRNA(miR-451、miR-214、miR-203或miR-205)的相对表达量(以RNU6b为内参)。
200份样本的目的miRNA的ΔCt见表6。
表6
Figure BDA0002126339790000101
Figure BDA0002126339790000111
Figure BDA0002126339790000121
Figure BDA0002126339790000131
Figure BDA0002126339790000141
Figure BDA0002126339790000151
3、完成步骤2后，从40份外周血样本中随机选择30份，计算目的miRNA(miR-451、miR-214、miR-203或miR-205)的ΔCt平均值。从40份唾液样本中随机选择30份，计算目的miRNA(miR-451、miR-214、miR-203或miR-205)的ΔCt平均值。从40份精液样本中随机选择30份，计算目的miRNA(miR-451、miR-214、miR-203或miR-205)的ΔCt平均值。从40份月经血样本中随机选择30份，计算目的miRNA(miR-451、miR-214、miR-203或miR-205)的ΔCt平均值。从40份阴道分泌液样本中随机选择30份，计算目的miRNA(miR-451、miR-214、miR-203或miR-205)的ΔCt平均值。
4、根据步骤3计算的结果，采用GraphPad Prism 7软件绘制不同体液的目的miRNA的ΔCt平均值的柱状图。以目的miRNA为横坐标，样本编号为纵坐标，采用GraphPad Prism7软件绘制热图。
柱状图见图1(PB为外周血，SA为唾液，MB为月经血，SE为精液，VA为阴道分泌液)。
热图见图2(PB为外周血，SA为唾液，MB为月经血，SE为精液，VA为阴道分泌液)。
结果表明，miR-451、miR-214、miR-203和miR-205在五种体液间的表达存在不同程度的差异。miR451在血液(即外周血和月经血)中高表达，在非血液(即唾液、精液和阴道分泌液中)低表达或几乎不表达。miR-214、miR-203和miR-205在月经血中的表达水平显著高于在外周血中的表达水平。
5、完成步骤3后，对血液(即外周血和月经血)中miR-214、miR-203和miR-205的ΔCt进行进一步分析，具体为将外周血和月经血中miR-214的ΔCt、miR-203的ΔCt和miR-205的ΔCt两两组合，采用GraphPad Prism 7软件绘制二维散点图。
二维散点图见图3(A为miR-203的ΔCt和miR-205的ΔCt构成的二维散点图，B为miR-203的ΔCt和miR-214的ΔCt构成的二维散点图，C为miR-205的ΔCt和miR-214的ΔCt构成的二维散点图，实心三角形为月经血，空心三角形为外周血)。结果表明，通过miR-214、miR-203和miR-205的ΔCt均可区分月经血与外周血。
6、基于4种miRNA的相对表达量鉴定待测体液是否为月经血或外周血的方法
本发明的发明人经过大量实验，建立了基于4种miRNA的相对表达量鉴定待测体液是否为月经血或外周血的方法。该方法的技术路线图见图4。
(1)训练集样本和测试集样本的获得
训练集样本共150份，由30份外周血样本、30份唾液样本、30份精液样本、30份月经血样本和30份阴道分泌液样本组成。各个样本均从步骤一中采集的样本中随机选取。30份外周血样本和30份月经血样本组成60份血液样本。30份唾液样本、30份精液样本和30份阴道分泌液样本组成90份非血液样本。
测试集样本共50份，由10份外周血样本、10份唾液样本、10份精液样本、10份月经血样本和10份阴道分泌液样本组成。各个样本均从步骤一中采集的样本中随机选取。
(2)建立鉴定待测体液为血液还是非血液的方法
(2-1)以“血液样本”与“非血液样本”作为因变量，miR-451的ΔCt作为自变量，以步骤(1)中的60份血液样本和90份非血液样本的数据作为训练集，建立血液与非血液的Fisher判别函数(Fisher判别函数的建立方法记载于如下文献中：Semen-specificmiRNAs:Suitable for the distinction of infertile semen in the body fluididentification？)。
血液的Fisher判别函数为：Z1＝-1.772ΔCt(miR-451)-8.179。
非血液的Fisher判别函数为：Z2＝1.319ΔCt(miR-451)-4.842。
(2-2)完成步骤(2-1)后，将待测体液的miR-451的ΔCt分别代入血液的Fisher判别函数和非血液的Fisher判别函数，得到Z1和Z2，然后进行如下判断：如果Z1>Z2，则待测体液为血液；如果Z1<Z2，则待测体液为非血液。
(3)步骤(2)建立的方法的准确度验证
将步骤(2-2)中的“待测体液的miR-451的ΔCt”分别替换为50份测试集样本的miR-451的ΔCt，其它步骤均不变，根据结果验证步骤(2)建立的方法的准确度。
结果见表7。10份外周血样本和10份月经血样本均被鉴定为血液样本，10份唾液样本、10份精液样本和10份阴道分泌液样本均被鉴定为非血液样本。由此可见，步骤(2)建立的鉴定待测体液为血液还是非血液的方法准确率高，准确率达到100％。
表7
Figure BDA0002126339790000161
注：n表示样本数
(4)建立鉴定待测血液为外周血还是月经血的方法
(4-1)以“外周血”与“月经血”作为因变量，miR-203、miR-205和miR-214的ΔCt作为自变量，以步骤(1)中30份外周血样本和30份月经血样本的数据作为训练集，建立外周血与月经血的Fisher判别函数(Fisher判别函数的建立方法记载于如下文献中：Differentiation of five body fluids from forensic samples by expressionanalysis of four microRNAs using quantitative PCR)。
外周血的Fisher判别函数为：Y1＝3.117ΔCt(miR-205)+9.398ΔCt(miR-214)+2.619ΔCt(miR-203)-93.540。
月经血的Fisher判别函数为：Y2＝0.506ΔCt(miR-205)+2.736ΔCt(miR-214)+0.172ΔCt(miR-203)-5.699。
(4-2)完成步骤(4-1)后，将待测血液的miR-203、miR-205和miR-214的ΔCt分别代入外周血的Fisher判别函数和月经血的Fisher判别函数，得到Y1和Y2，然后进行如下判断：如果Y1>Y2，则待测血液为外周血；如果Y1<Y2，则待测血液为月经血。
(5)步骤(4)建立的方法的准确度验证
将步骤(4-2)中的“待测血液的miR-203、miR-205和miR-214的ΔCt”分别替换为10份外周血样本的miR-451的ΔCt和10份月经血样本的miR-451的ΔCt，其它步骤均不变，根据结果验证步骤(4)建立的方法的准确度。
结果见表8。10份外周血样本均被鉴定为外周血，10份月经血样本均被鉴定为月经血。由此可见，步骤(4)建立的鉴定待测血液为外周血还是月经血的方法准确率高，准确率达到100％。
表8
Figure BDA0002126339790000171
注：n表示样本数。
<110> 公安部物证鉴定中心
<120> 一种鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血的方法及其使用的miRNA组合
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
aaaccguuac cauuacugag uu 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
acagcaggca cagacaggca gu 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
gugaaauguu uaggaccacu ag 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
uccuucauuc caccggaguc ug 22

Claims (2)

1.一种鉴定待测体液为非血液、月经血还是外周血的方法，包括如下步骤：
(e1)以血液与非血液作为因变量，miR-451的表达量作为自变量，根据若干血液样本和若干非血液样本的数据建立血液和非血液的Fisher判别函数；
(e2)检测待测体液的miR-451的表达量并代入步骤(e1)建立的Fisher判别函数，得到待测体液的血液判别函数值和非血液判别函数值；然后进行如下判断：
如果待测体液的血液判别函数值>非血液判别函数值，则待测体液为或疑似为血液；
如果待测体液的血液判别函数值<非血液判别函数值，则待测体液为或疑似为非血液；
如果待测体液为或疑似为血液，则按照步骤(e3)和(e4)进一步鉴定待测体液为月经血还是外周血：
(e3)以外周血与月经血作为因变量，miR-203、miR-205和miR-214的表达量作为自变量，根据若干外周血样本和若干月经血样本的数据建立外周血和月经血的Fisher判别函数；
(e4)检测待测体液的miR-203、miR-205和miR-214的表达量并代入步骤(e3)建立的Fisher判别函数，得到待测体液的外周血判别函数值和月经血判别函数值；然后进行如下判断：
如果待测体液的外周血判别函数值>月经血判别函数值，则待测体液为或疑似为外周血；
如果待测体液的外周血判别函数值<月经血判别函数值，则待测体液为或疑似为月经血。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述(e1)中，
血液的Fisher判别函数为：Z1＝-1.772ΔCt(miR-451)-8.179；
非血液的Fisher判别函数为：Z2＝1.319ΔCt(miR-451)-4.842；
所述(e3)中，
外周血的Fisher判别函数为：Y1＝3.117ΔCt(miR-205)+9.398ΔCt(miR-214)+2.619ΔCt(miR-203)-93.540；
月经血的Fisher判别函数为：Y2＝0.506ΔCt(miR-205)+2.736ΔCt(miR-214)+0.172ΔCt(miR-203)-5.699。
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