CN107723375B - 一种检测立氏立克次体的rpa方法、其专用引物和探针及用途 - Google Patents

一种检测立氏立克次体的rpa方法、其专用引物和探针及用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于检测立氏立克次体的RPA检测方法，其专用引物、探针及其在立氏立克次体检测中的用途。所述检测方法、其专用引物和探针是基于立氏立克次体基因保守序列设计，具有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列。本发明首次将新型恒温扩增技术RPA应用于立氏立克次体的检测中，该方法模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合，包括重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶，对DNA模板进行扩增，可在37℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，扩增产物可通过侧向层析核酸检测试纸条实现可视化判别。本发明建立的检测方法灵敏度可达6拷贝数/μL，特异性高，对硬件设备的要求低，且可在30min内完成检测，无需对样品进行复杂处理、适合现场检测，适于推广应用。

Description

一种检测立氏立克次体的RPA方法、其专用引物和探针及用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及立氏立克次体的分子生物学，涉及一种检测立氏立克次体的方法及其用途，特别涉及一种利用重组酶聚合酶恒温扩增技术（RPA技术）快速检测立氏立克次体的方法、其专用引物和探针及其用途。
背景技术
立氏立克次体（Rickettsia rickettsii，Rr）俗称斑点热，为落基山斑点热的病原体，为专性细胞内寄生的小革兰氏阴性菌，对外界环境抵抗力强、存活时间长，人类和动物普遍易感，且可通过气溶胶广泛传播，是高致死性、已生物战剂化的病原体之一。立氏立克次体主要侵犯动静脉内皮细胞造成血管炎症和通透性增加，严重时凝血系统和激肽系统被激活，引起血栓性阻塞、血管肌层坏死以及中枢神经系统的微栓塞，使心脏、肺脏、肾脏和中枢神经系统等主要器官功能损害。病理变化程度比恙虫病和斑疹伤寒严重。
临床表现为食欲减退、疲倦、四肢无力和畏寒等症状，典型患者突然起病，体温急剧上升到39 - 40℃，严重患者可出现41℃ 以上的超高热伴有寒战、剧烈头痛、全身肌肉和关节疼痛、畏光和眼球后痛肝脾可出现肿大。未经病原治疗，发热不退，热程可达2 - 3周，以后多数患者发热缓慢消退。误诊和漏诊情况严重。目前，对立氏立克次体的检测方法主要包括平板分离培养法、血清学技术、荧光定量PCR法。但是，这些方法存在成本较高、需要特定设备、耗时且需对样品进行复杂处理等缺陷，导致它们的实际应用范围严重受限。建立一种简单、快速、适合现场应用的立氏立克次体的检测方法有重要意义。
近几年来，恒温核酸扩增技术得到了快速发展，其中英国TwistDx Inc公司开发的重组酶聚合酶恒温扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）被誉为是可替代PCR的核酸检测技术，其是基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合（重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶）对DNA模板进行扩增，可在25 - 43℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，且扩增产物可通过侧向层析试纸条实现可视化判别。该技术对硬件设备的要求很低，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理，特别适合用于体外诊断、食品安全、生物安全等领域。
发明内容
本发明检测立氏立克次体的RPA方法，所要解决的技术问题是提供一组用于快速检测立氏立克次体的特异性引物和探针，以及一种能快速、简便、特异的检测立氏立克次体的检测方法。
因此本发明检测立氏立克次体的RPA方法，第一个目的是提供用于检测立氏立克次体的引物，包括正向引物和反向引物，共两条。所述引物是根据立氏立克次体的保守基因设计的，同时经过软件对基因同源序列进行对比分析，进一步确定了立氏立克次体基因的保守区，此区域为立氏立克次体基因组（GenBank: CP018914.1）位于第726782至727469核苷酸位点的一段序列，含有688个碱基的核苷酸片段，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。从SEQ ID NO.1序列内筛选设计特异性引物。筛选的特异性引物包括正向引物rrF53和反向引物rrR379，分别位于基因组第726834至726863核苷酸位点和第727131至727160核苷酸位点，分别具有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的寡核苷酸序列，引物的长度为30bp左右，其中反向引物5’端标记生物素（Biotin）。正向引物和反向引物扩增完成后获得的双链DNA将标记有生物素。
SEQ ID NO.1：
AAGATAATTAATCGCTTATTATTAAAAATTTTCATTTTTTTATTATTTATTACTAGCAATAATCTGTGTTATTTGATAAAATTAAATCTAAAAGAAAGGGAAAGTGTATGAGTAATATTAACGCTAAGTTTTACATACCATTGGTGTCACTACTTGGTGTATTCATTTATTTACTAAATTGTTTTAATAAAATATCTCAGTGTTCTTTAGTATTTGTGTTTTTAGCTATAACTACCAATATTATATCTGAGCTATATGGTAGAAAGAGAGCTTTGATTGCTGTGGCGTTATGTATAATAGTAAGTTTTGGTTTGTTATGGAACTTCAATTATTATATTCATGGTCGTGTTATTAAAGGAGTTGTTTTTGCATCTTTTGTATCTGTATTATTATCAACATATTGTAGTACAAGTATATTTTCACAACTTAAGCCAAGATGTTCTTTGAATACAAGAAATTTTGCTAGTTTAATAATGTGTGCGGTCGTAGATGGTATTGTGATGTCAGGATTTTTTGTAAATGTATTCTCTACAAGTAAAGTTTTGTCGATATTTTATAAAGAAGTATTATATAAATGTGCATATTCATTAACAGTTTATATCTGTATATTTTTAGTTCAAAAAGTATATGGCAATAATGGGAGTGTCCGCGCACTGAAAAATTTTTGAATAAAAAATATAGCTAACCT
SEQ ID NO.2：5’ CTAGCAATAATCTGTGTTATTTGATAAAAT 3’
SEQ ID NO.3：5’ ACAAAAGATGCAAAAACAACTCCTTT 3’
本发明检测立氏立克次体的RPA方法，第二个目的是提供用于检测立氏立克次体的探针。所述探针是根据立氏立克次体的保守基因，同时经过软件对基因同源序列进行对比分析，进一步确定了立氏立克次体基因的保守区，此区域含有688个碱基的核苷酸片段，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。从SEQ ID NO.1序列内筛选设计特异性探针，设计探针位于基因组第726913至726958核苷酸位点，具有SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列，，且5’端标记荧光素FAM，3’端添加延伸阻断基团（如磷酸基团），在第30-31位碱基之间插有一个四氢呋喃（THF）。
SEQ ID NO.4：
5’ TACATACCATTGGTGTCACTACTTGGTGTA[THF]TCATTTATTTACTAA 3’
所述探针的长度为45bp，其中5’端30bp，3’端15bp。
所述探针由荧光素（羧基荧光素FAM）、5’端序列、四氢呋喃（THF）、3’端序列及3’端延伸阻断基团（磷酸基团）组成。
所述探针与扩增后的标记有生物素的DNA退火，RPA系统中的nfo酶将在THF部位切断探针，使探针能在聚合酶作用下在3’端继续延伸，最终获得FAM和Biotin双标记的扩增产物。
本发明检测立氏立克次体的RPA方法，第三个目的是提供了用于立氏立克次体快速检测的RPA检测方法，所述方法采用上述的RPA引物和探针进行扩增，并结合侧向层析核酸检测试纸条( Hybridetect 2T，Milenia Biotec GmbH ,Germany )进行可视化判断。
本发明所述的检测立氏立克次体的RPA方法，包括以下步骤：
（1）以待测样品基因组DNA为模板，在所述引物组和探针的标记下进行RPA反应；
（2）结果判断：用上述侧向层析核酸检测试纸条对回收后的RPA产物进行检测，检测线和质控线均显出，判断结果为阳性结果；检测线未显出，质控线显出，判断结果为阴性结果；质控线未显出，不管检测线是否显出，均判定结果无效。
优选地，本发明所述的方法，具体步骤如下：
（1）扩增试剂准备和加样：将10μmol/L正向引物2.1μL、10μmol/L反向引物2.1μL、5μmol/L探针0.6μL、1μL样品、12.2μL无DNase 和RNase 水和29.5μL缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAmp nfo反应管中。然后将2.5μL的280mM醋酸镁溶液加到反应管的盖子上。
（2）扩增：将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃ 扩增20min，在反应第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。
（3）结果判断：取5μL的RPA扩增产物用PBST稀释至100μL，用上述侧向层析核酸检测试纸条对回收后的RPA产物进行检测，检测线和质控线均显出，判断结果为阳性结果；检测线未显出，质控线显出，判断结果为阴性结果；质控线未显出，不管检测线是否显出，均判定结果无效。
本发明检测立氏立克次体的原理是采用RPA技术，对立氏立克次体的特异性保守靶序列，即立氏立克次体外膜蛋白B的保守序列进行检测，该序列可作为立氏立克次体的标志基因之一。
本发明检测立氏立克次体的RPA方法，节约了立氏立克次体的检测时间，检测可在37℃ 下20min内完成扩增，整个检测过程可在1小时内完成，与常规PCR和实时荧光定量PCR需要数小时相比极大地缩短了检测时间。
本发明检测立氏立克次体的RPA方法，降低了反应温度，RPA只需要恒温37℃ 即可完成实验，该温度远远低于荧光定量PCR的60 - 95℃ 以及LAMP的63℃ 。
本发明检测立氏立克次体的RPA方法，更加简单、便于携带：扩增所需的酶和一些其他必要的东西可冻干保存，能够在常温下长时间放置，扩增时只需要加入水解缓冲液、引物、探针和模板，并加入镁离子起始反应即可，且样品不需要进行复杂反应。
本发明检测立氏立克次体的RPA方法，灵敏性高，特异性强。可用于现场或床旁检测，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为确定检测立氏立克次体RPA检测方法的最佳反向引物和探针组合浓度。设定反向引物的浓度梯度为10μmol/L，探针的浓度为10μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L，将反向引物浓度分别与三种浓度的探针进行组合，组合成3组组合,组合编号见表3，每组组合均设置一组阴性对照，试验结果如图所示。
图2为确定检测立氏立克次体RPA检测方法的最佳扩增时间。设定扩增时间为10min、15min、20min，且分别为每一组扩增时间的样品设置了一个阴性对照，试验结果如图所示，NC代表阴性对照。
图3为检测立氏立克次体 RPA方法的灵敏度，将合成的阳性质粒进行定量，并以十倍倍比稀释的方式稀释出浓度为104 - 100 copies/μL的质粒DNA作为模板进行试验，试验条件为上述的最佳试验条件，试验结果如图所示，NC代表阴性对照。
图4为检测立氏立克次体RPA方法的的特异性，分别用立式立克次体、贝氏柯克斯体、恙虫病东方体、黑龙江立克次体、西伯利亚立克次体、金黄色葡萄球菌、猪链球菌的基因组DNA和人全血DNA作为模板进行试验，试验结果如图所示。
图5为检测立氏立克次体基因组DNA的RPA方法的灵敏度，试验结果如图所示，样品顺序：阴性对照NC，1-5号样品；1-5分别含6.4 copies/μL、50.5 copies/μL、627.7 copies/μL、7328.5 copies/μL、87651.1 copies/μL的检测立式立克次体基因组DNA，1-5的样品由荧光定量PCR法定量。
具体实施方式
下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook 等人所编《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
所用RPA引物和探针由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，qPCR引物和探针上海生工生物技术有限公司合成，所有序列测定工作均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1、立氏立克次体引物和探针的设计及筛选
（1）引物和探针的设计
发明人通过文件检索，分析确定本发明使用立氏立克次体的特异性序列为目标基因。从NCBI数据库中获得已知的模板基因序列，即SEQ ID NO.：1所示的核苷酸序列，并由南京金斯瑞生物科技有限公司对上述序列进行合成，作为阳性质粒，在后续引物探针筛选、反应体系的优化等过程中作为模板使用。根据RPA引物及探针设计原则，使用Prime 5软件设计3组上游引物和5组下游引物及1条探针，如表1所示。
表1引物及探针
引物/探针 序列（5’→3’）
rrf53 CTAGCAATAATCTGTGTTATTTGATAAAAT
rrf84 AAATCTAAAAGAAAGGGAAAGTGTATGAGT
rrf120 AACGCTAAGTTTTACATACCATTGGTGTCA
rrr220 Biotin-AACACAAATACTAAAGAACACTGAGATATT
rrr252 Biotin-GCTCAGATATAATATTGGTAGTTATAGCTA
rrr277 Biotin-ATCAAAGCTCTCTTTCTACCATATAGCTCA
rrr307 Biotin-AAACTTACTATTATACATAACGCCACAGCA
rrr379 Biotin-ACAAAAGATGCAAAAACAACTCCTTT
rrprobe FAM-TACATACCATTGGTGTCACTACTTGGTGTA[THF]TCATTTATTTACTAA-PO<sub>4</sub>
（2）引物筛选
人工合成含立氏立克次体的质粒SEQ ID NO.1所示的序列，以此质粒为模板，将引物与探针进行全面组合成13组引物组合，组合编号如表2所示。13组引物组合分别进行在37℃ 条件下进行RPA扩增，以侧向层析核酸检测试纸条检测线显出情况为指标，筛选出在37℃ 条件下，扩增效率最高的引物探针组合，用于后续RPA检测的评价和应用。
筛选用的50μL的RPA反应体系如下：将10μmol/L正向引物2.1μL、10μmol/L反向引物2.1μL、5μmol/L探针0.6μL、2.72×10９copies/μL模板1μL、12.2μL无DNase 和RNase 水和29.5μL缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAmp® nfo反应管中。然后将2.5μL的280mM醋酸镁溶液加到反应管的盖子上，考虑到RPA反应灵敏度较高，易出现假阳性的情况，发明者为每一组引物探针组合均设置了一组阴性对照，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。发明者还设置了一组阳性对照，阳性对照由TwistAmp® RPA nfo试剂盒内提供，同时还为阳性对照设置了一组阴性对照，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。扩增：将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃ 扩增20min，在反正第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。结果判断：取5μL的RPA扩增产物用PBST稀释至100μL，再用上述侧向层析核酸检测试纸条对RPA产物进行检测。每个反应设置一个复孔。
表2正反引物探针组合编号
编号 组合 编号 组合
1 rrf53+rrr220 8 rrf84+rrr307
2 rrf53+rrr252 9 rrf120+rrr220
3 rrf53+rrr277 10 rrf120+rrr252
4 rrf53+rrr307 11 rrf120+rrr277
5 rrf84+rrr220 12 rrf120+rrr307
6 rrf84+rrr252 13 rrf53+rrr379
7 rrf84+rrr277
将3组上游引物和5组下游引物组成13组（表2），阳性对照及其相对应的阴性对照的侧向层析核酸检测试纸条的检测线和质控线的显示情况。
本发明检测立氏立克次体的RPA方法，确定的引物组合包括：正向引物rrF53和反向引物rrR379，共两条，分别具有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的寡核苷酸序列。
（3）探针的确定
表1列出的rrprobe探针为本发明优选，探针的长度为45bp，其中5’端30bp，3’端15bp。
探针由荧光素（羧基荧光素FAM）、5’端序列、四氢呋喃（THF）、3’端序列及3’端延伸阻断基团（磷酸基团）几部分组成。探针具有SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列，且5’端标记荧光素FAM，3’端添加延伸阻断基团（如磷酸基团），在第30-31位碱基之间插入一个四氢呋喃（THF）。所述探针与扩增后的标记有生物素的DNA退火，RPA系统中的nfo酶将在THF部位切断探针，使探针能在聚合酶作用下在3’端继续延伸，最终获得FAM和Biotin双标记的扩增产物。
实施例2：RPA反应体系、扩增和检测条件的优化
在引物筛选的过程中，侧向层析核酸检测试纸条在检测时仍存在假阳性的情况，因此需对RPA反应体系、扩增和检测条件进行优化
（1）引物探针浓度
设定反向引物的浓度为10μmol/L，探针的浓度梯度为10μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L，将一种浓度的反向引物分别与三种浓度的探针进行组合，组合成3组组合，每组组合均设置一组阴性对照。分别在37℃ 条件下进行RPA扩增，扩增完毕使用侧向层析核酸检测试纸条对产物进行检测，筛选出扩增效果最好，且不出现假阳性的组合。
表3 反向引物浓度和探针浓度组合编号
编号 组合
1 10μM Rrr379 + 10μM rrprobe
2 10μM Rrr379 + 5μM rrprobe
3 10μM Rrr379 + 2.5μM rrprobe
通过对侧向层析核酸检测试试纸条检测结果分析，本发明确定的反向引物的浓度为10μmol/L、探针的浓度为5μmol/L。
（2）扩增时间
50μL的RPA反应体系如下：将10μmol/L正向引物2.1μL、5μmol/L反向引物2.1μL、5μmol/L探针0.6μL、1×104 copies/μL模板1μL、12.2μL无DNase 和RNase 水和29.5μL缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAmp® nfo反应管中。然后将2.5μL的280mM醋酸镁溶液加到反应管的盖子上。扩增：将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃ 扩增10min，15min，20min，均在反应第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。发明者为每一组分别设置了一组阴性对照，阴性对照不加模板，模板体积用水补足。结果判断：取5μL的RPA扩增产物用PBST稀释至100μL，再用上述侧向层析核酸检测试试纸条对RPA产物进行检测。
通过对侧向层析核酸检测试试纸条检测结果分析，10min和15min的扩增时间样品检测线条带较浅，考虑到后续灵敏度试验，本发明确定的扩增时间为20min。
综上，通过RPA反应体系、扩增和检测条件进行优化，本发现确定在使用5μM浓度的下游引物和5μM浓度的探针扩增20min，试纸条显色时间控制在3 - 5min时，检测效果最好。
实施例3：RPA检测的灵敏度评价
将阳性质粒按倍比稀释成104 - 100个/μL等一系列不同浓度，各取1μL分别加入实施例2所确定的反应体系，利用筛选出的引物组合，采用实施例2确定的扩增和检测条件对上述不同拷贝数的模板进行RPA检测，观察RPA检测的灵敏度。
结果，从10个/μL拷贝数开始以上样品均呈阳性，说明本发明RPA检测方法的灵敏度达到10个拷贝/μL。
实施例4：RPA检测的特异性评价
特异性评价以立氏立克次体、贝氏柯克斯体、恙虫病东方体、黑龙江立克次体、西伯利亚立克次体、金黄色葡萄球菌、猪链球菌的基因组DNA和人血浆DNA为对照，以确定本发明RPA检测方法的特异性。
分别以立氏立克次体、贝氏柯克斯体、恙虫病东方体、黑龙江立克次体、西伯利亚立克次体、金黄色葡萄球菌、猪链球菌的基因组DNA和人血浆DNA为模板，采用如下反应体系：将10μmol/L正向引物2.1μL、10μmol/L反向引物2.1μL、5μmol/L探针0.6μL、1μL样品、12.2μL无DNase 和RNase 水和29.5μL缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAmp nfo反应管中。然后将2.5μL的280mM醋酸镁溶液加到反应管的盖子上。扩增：将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃ 扩增20min，在反应第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增。结果判断：取5μL的RPA扩增产物用PBST稀释至100μL，用上述侧向层析核酸检测试纸条对回收后的RPA产物进行检测，检测线和质控线均显出，判断结果为阳性结果；检测线未显出，质控线显出，判断结果为阴性结果；质控线未显出，不管检测线是否显出，均判定结果无效。
结果贝氏柯克斯体、恙虫病东方体、黑龙江立克次体、西伯利亚立克次体、金黄色葡萄球菌、猪链球菌的基因组DNA和人血浆DNA样品检测线均没有出现条带，呈阴性，只有立氏立克次体样品检测线出现清晰条带，呈阳性，说明本发明RPA检测方法对立氏立克次体有很强的特异性。
实施例5：RPA检测立氏立克次体基因组DNA的灵敏度评价
本发明采用荧光定量PCR对不同释稀度的立氏立克次体基因组DNA进行定量，各取1μL做为模板分别加入实施例2所确定的反应体系，利用筛选出的引物组合，采用实施例2确定的扩增和检测条件对上述不同拷贝数的模板进行RPA检测，观察RPA检测立氏立克次体基因组DNA的灵敏度，同时将不同浓度的立氏立克次体基因组DNA分别进行荧光定量PCR确定基因拷贝数。所用荧光定量PCR方法参考牛东升等[1]方法。
（1）荧光定量PCR的引物探针
引物Fp 5’-TGAAGATACTACCTTAGGGTTCATCACTA-3’
引物Rp 5’-ACCGGCATTAAGCGTAAGGTT-3’
探针TaqMan MGB-probe (6-Fam)-TGTTGTTCATAACGCTCAC-(MGB)
（2）荧光定量PCR反应体系
采用25μL反应体系：每个反应中含12.5μL通用PCR反应混合物TaqMan UniversalPCR Master Mix；5μL引物和探针混合物，100μL混合物中含50μM引物Fp和Rp各3μL，50μM探针2μL，去离子水92μL， 5.5μL去离子水，2μLDNA模板。反应条件为50℃ 2min，95℃ 10min，后进行40次循环，循环参数为95℃ 15s，60℃ 1min。
（3）荧光定量PCR标准曲线的建立
稀释的立氏立克次体标准DNA，使其拷贝数分别为104、103、102、101和1 copies/μL，将其分别加到反应体系中做荧光定量PCR。同时定量立氏立克次体基因组DNA。定量出5个立氏立克次体基因组DNA拷贝数分别为8.7×104 copies/μL、7.3×103 copies/μL、5.5×102 copies/μL、5×101 copies/μL、6 copies/μL。
结果本发明RPA检测方法检测立氏立克次体基因组DNA的检测限为6拷贝数/μL，与已有的荧光定量PCR的检测方法的检测限一致，说明本发明方法具有良好的灵敏度。
序列表
<110> 齐永
<120> 一种检测立氏立克次体的RPA方法、其专用引物和探针及其用途
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 688
<212> DNA
<213> 立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(688)
<400> 1
aagataatta atcgcttatt attaaaaatt ttcatttttt tattatttat tactagcaat 60
aatctgtgtt atttgataaa attaaatcta aaagaaaggg aaagtgtatg agtaatatta 120
acgctaagtt ttacatacca ttggtgtcac tacttggtgt attcatttat ttactaaatt 180
gttttaataa aatatctcag tgttctttag tatttgtgtt tttagctata actaccaata 240
ttatatctga gctatatggt agaaagagag ctttgattgc tgtggcgtta tgtataatag 300
taagttttgg tttgttatgg aacttcaatt attatattca tggtcgtctt attaaaggag 360
ttgtttttgc atcttttgta tctgtattat tatcaacata ttgtagtaca agtatatttt 420
cacaacttaa gccaagatgt tctttgaata caagaaattt tgctagttta ataatgtgtg 480
cggtcgtaga tggtattgtg atgtcaggat tttttgtaaa tgtattctct acaagtaaag 540
ttttgtcgat attttataaa gaagtattat ataaatgtgc atattcatta acagtttata 600
tctgtatatt tttagttcaa aaagtatatg gcaataatgg gagtgtccgc gcactgaaaa 660
atttttgaat aaaaaatata gctaacct 688
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<400> 2
ctagcaataa tctgtgttat ttgataaaat 30
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> 5’端标记生物素
<400> 3
acaaaagatg caaaaacaac tccttt 26
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(45)
<223> 5’端标记荧光素FAM，3’端添加延伸阻断基团（如磷酸基团），在第726943-726944位碱基之间插入一个四氢呋喃（THF）
<300>
<301> 牛东升，杨晓，陈梅玲，王锡乐，温博海
<302> 实时荧光定量PCR检测斑点热立克次体的方法建立
<303> 解放军医学杂志
<304> 2008,33(11)
<306> 1297-1299
<400> 4
tacataccat tggtgtcact acttggtgta tcatttattt actaa 45

Claims (6)

1.一种用于检测立氏立克次体的RPA专用引物和探针，是根据立氏立克次体特异性保守序列设计的，所述立氏立克次体特异性保守序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，
SEQ ID NO.1：
AAGATAATTAATCGCTTATTATTAAAAATTTTCATTTTTTTATTATTTATTACTAGCAATAATCTGTGTTATTTGATAAAATTAAATCTAAAAGAAAGGGAAAGTGTATGAGTAATATTAACGCTAAGTTTTACATACCATTGGTGTCACTACTTGGTGTATTCATTTATTTACTAAATTGTTTTAATAAAATATCTCAGTGTTCTTTAGTATTTGTGTTTTTAGCTATAACTACCAATATTATATCTGAGCTATATGGTAGAAAGAGAGCTTTGATTGCTGTGGCGTTATGTATAATAGTAAGTTTTGGTTTGTTATGGAACTTCAATTATTATATTCATGGTCGTGTTATTAAAGGAGTTGTTTTTGCATCTTTTGTATCTGTATTATTATCAACATATTGTAGTACAAGTATATTTTCACAACTTAAGCCAAGATGTTCTTTGAATACAAGAAATTTTGCTAGTTTAATAATGTGTGCGGTCGTAGATGGTATTGTGATGTCAGGATTTTTTGTAAATGTATTCTCTACAAGTAAAGTTTTGTCGATATTTTATAAAGAAGTATTATATAAATGTGCATATTCATTAACAGTTTATATCTGTATATTTTTAGTTCAAAAAGTATATGGCAATAATGGGAGTGTCCGCGCACTGAAAAATTTTTGAATAAAAAATATAGCTAACCT；
所述引物中的正向引物如SEQ ID NO.2所示的寡核苷酸序列，反向引物如SEQ ID NO.3所示的寡核苷酸序列，且5’端标记生物素（Biotin）,
SEQ ID NO.2：5’ CTAGCAATAATCTGTGTTATTTGATAAAAT 3’，
SEQ ID NO.3：5’ ACAAAAGATGCAAAAACAACTCCTTT 3’，该探针如SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列，且5’端标记荧光素，3’端添加延伸阻断基团，在第30-31位碱基之间增加一个四氢呋喃（THF）；
SEQ ID NO.4：
5’ TACATACCATTGGTGTCACTACTTGGTGTA[THF]TCATTTATTTACTAA 3’ 。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述探针由荧光素、5’端序列、四氢呋喃（THF）、3’端序列及3’端延伸阻断基团组成。
3.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述的荧光素为羧基荧光素FAM或FITC等其他荧光素，所述的延伸阻断基团为磷酸基团或其他阻断基团。
4.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述探针的长度为45bp，其中5’端30bp，3’端15bp。
5.权利要求1-4中任一项所述的引物和探针在制备立氏立克次体RPA检测试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述应用中用于50μL的RPA反应体系的试剂，所述的正向引物的浓度为10μmol/L，反向引物的浓度为10μmol/L，所述的探针的浓度为5μmol/L、镁离子浓度280μmol/L，模板加样量为1μL；将2.1μL正向引物、2.1μL反向引物、0.6μL探针、1μL样品、12.2μL无DNase 和RNase 水和29.5μL缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAmp nfo反应管中，然后将2.5μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上；将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃ 扩增20min，在反应4min，将反应管取出充分混匀，放回反应装置中继续扩增；检测时加样量为5μL，试纸条显色时间控制在3 -5min。
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立氏立克次体外膜蛋白B基因的应用研究;牛东升;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20071015(第4期);第1.5-1.6节 *

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