CN111979303A - 一种核酸检测试剂盒、方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种核酸检测试剂盒、方法及其应用，方法包括S1，恒温扩增，将待检测核酸进行恒温扩增；S2，二次扩增，将恒温扩增后的产物进行二次扩增，且二次扩增的产物为核酸单链，或其他方式产生单链；S3，探针杂交，将二次扩增后的产物与探针进行杂交；S4，探针降解，将杂交后的产物加入核酸酶降解多余的单链核酸；S5，产物检测，检测步骤S4得到的产物。试剂盒包括恒温扩增引物、二次扩增酶、探针、核酸酶、试纸条；应用包括进行病原微生物核酸检测、病毒核酸检测、转基因核酸检测、遗传病核酸检测、肿瘤核酸检测、DNA甲基化核酸检测等各种核酸检测；本发明提供了一种快速、特异、灵敏、无需复杂仪器设备的核酸检测试剂盒、方法及其应用。

Description

一种核酸检测试剂盒、方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种核酸检测试剂盒、方法及其应用。
背景技术
核酸检测是通过检测病毒、细菌、细胞等样本内是否含有目标核酸物质的方法。现有技术的核酸检测方面，主要分为三种：(1)常规的实时定量荧光PCR检测，这是目前最通用的方法，针对新冠病毒序列设计一对或多对引物，抽提核酸，进行反转录并进行qPCR，检测结果为循环数；(2)不依赖大型仪器的现场检测方法，比如美国研究者开发了基于CRISPR/Cas12的方法DETECTER，该方法采用的样本是鼻拭子或咽拭子中提取的核酸，无法满足病人自取样和自操作的需求；(3)现场或居家检测，即检测者可自取样、自操作、自读取结果的简单的检测方案。
居家型检测不依赖于大型仪器，可自己取样的新冠病毒快速检测方法，将极大提高检测效率和安全性。但是，现有技术还缺少一种快速、特异、灵敏、无需复杂仪器设备的核酸检测试剂盒及其方法。
沙门氏菌是一类常见的食源性致病细菌，误食含有沙门氏菌的食物，会导致人类、家畜以及野生禽兽等中毒，危害生命健康。传统的沙门氏菌鉴定方法主要是根据培养特征、抗原特征、形态学特征、生理生化特征等。通过核酸检测沙门氏菌具有灵敏度高、特异性好的优点。
非洲猪瘟病毒(ASFV,African swine fever virus)属于双链DNA病毒，可感染不同年龄、不同品种的猪只，具有极高的传染性、致病性和死亡率，病死率极高，最高可达100％，被我国列为一类动物疫病。
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一类RNA病毒，人感染了冠状病毒会引起发热、咳嗽、气促和呼吸困难等症状。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。传统的检测主要通过实验室实时荧光定量PCR进行检测。
随着转基因技术快速发展，已被广泛应用于各类动植物的生产，如水稻、大豆、鱼类养殖、牛羊养殖等方面。与此同时，转基因技术也带来一些潜在的安全隐患，非法种植、销售转基因产品如水稻、大豆、牛羊肉等时有发生。对转基因产物进行风险评估与风险管理是转基因技术应用的重要环节。因此，准确进行转基因检测具有重要意义。
食品成分检测是对各类食品进行检测，包括猪肉、鸡肉、牛肉、肉类罐头、冷冻肉类、腌制肉类、进口肉类等。
遗传物质变异是指生命体在生理或病理状态下，发生遗传物质改变的现象，包括突变、重组、缺失、染色体变异等多种类型。在本实施例中，以检测BRAF基因缺失为例，提供一种遗传物质变异核酸检测的新方法。BRAF是一种人类基因，编码B-Raf蛋白。B-Raf蛋白参与细胞生长，涉及多种信号转导途径，影响细胞分裂、分化和分泌等过程。BRAF基因变异被证明与多种肿瘤的发生有密切关系，BRAFV 600E为主要的突变方式。
DNA甲基化参与各个生理与病理进程，与发育、分化、再生、疾病等的关系密切相关。对DNA甲基化变异的检测，可以应用于肿瘤检测、产前诊断、科技研发、疾病诊断等等领域。本实施例中，以Septin9基因甲基化检测为例，提供一种快速甲基化检测方法，Septin9甲基化变异被广泛报道与多种肿瘤的发生发展有密切关系，可用于多种肿瘤的早期检测。
发明内容
本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种快速、特异、灵敏、无需复杂仪器设备的核酸检测试剂盒、方法及其应用。
本发明的第一个方面，提供了一种核酸检测方法，如附图1所示，包括以下步骤：
S1，恒温扩增，将待检测核酸进行恒温扩增；
S2，二次扩增，将恒温扩增后的产物进行二次扩增，且二次扩增的产物为核酸单链；步骤S2可以替换成其他可产生单链的方式，比如体外转录、T7外切酶处理等；
S3，探针杂交，将二次扩增后的产物与探针进行杂交；
S4，探针降解，将杂交后的产物加入核酸酶降解多余的单链核酸；
S5，产物检测，检测步骤S4得到的产物。
优选的，步骤S1中的恒温扩增和步骤S2中的二次扩增方法包括：重组酶聚合酶恒温扩增技术、重组酶辅助的扩增技术、环介导的等温扩增技术、链置换的等温扩增技术、滚环扩增、基于核酸序列的等温扩增技术、解旋酶依赖的等温扩增技术、切刻内切酶扩增反应。
重组酶聚合酶恒温扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)：主要依赖能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶这三种酶，重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程可在室温进行，一般可在10分钟左右获得可检出水平的扩增产物。
重组酶辅助的扩增技术(recombinase-aided amplification，RAA)：是一种在室温下可以快速扩增核酸的方法，RAA使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可以与引物紧密结合，形成聚合体，当引物与模板进行配对后，在单链DNA结合蛋白的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链。
环介导的等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)：LAMP法是针对靶基因上的待检测区域设计4～6条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在60～65℃条件下，15-60分钟内实现扩增，反应能产生大量的扩增产物。
链置换的等温扩增技术：本技术建立的基于缺口酶的链置换等温扩增技术，较之传统方法更加简便、快捷、环保且价格低廉,具有非常强的实际应用潜力,特别适用于现场检测。
滚环扩增：滚环式复制是以一条环状DNA为模板，进行新的DNA环状分子合成。先在一条单链的复制起点上产生一个切口，然后以另一条单链为模板不断地合成新的单链。释放出的新合成的单链或是先复制成双链DNA，被酶切割成单位长度后，再形成环状双链DNA分子；或是释放出的新合成的单链DNA，先被酶切割成单位长度形成单链环状DNA分子后再复制成双链环状DNA分子。
基于核酸序列的等温扩增技术(Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)：依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)是一项以核酸序列中RNA为模板，由两个引物介导的、连续均一的特异性体外等温扩增核苷酸序列的酶促过程。整个反应由非循环相和循环相组成:首先进行非循环相，在AMV逆转录酶的作用下，引物1与模板RNA退火后合成cDNA，形成RNA/DNA杂合体，随即RNaseH降解RNA，引物2与cDNA退火，合成第二条DNA互补链。形成的DNA双链由T7 RNA聚合酶识别启动子序列，催化合成RNA，进入循环相，对模板进行大量扩增。
解旋酶依赖的等温扩增技术(Helicase-dependent isothermal DNAamplification,HDA)：该技术模拟体内DNA复制的自然过程，利用解旋酶在恒温下解开DNA双链，再由DNA单链结合蛋白稳定已解开的单链为引物提供模板，然后在DNA聚合酶的作用下合成互补的双链，继而不断重复上述循环扩增过程，最终实现靶序列的指数式增长。
切刻内切酶扩增反应(nicking endonuclease amplification reaction，NEAR):NEAR是一种链置换放大技术，其原理是在核酸切刻内切酶切刻形成的裂口处，通过聚合酶的作用以dNTPs为原料从裂口处的3’端聚合延伸，置换出等位的DNA链，由此又形成了新的完整的含有切刻酶识别位点的DNA序列。这条双链再次被核酸切刻内切酶识别切割，进而开始“聚合-切刻”的循环，产生大量被置换下来的DNA单链，形成指数级扩增。
优选的，步骤S1中的恒温扩增为重组酶聚合酶恒温扩增技术；步骤S2中的二次扩增为切刻内切酶扩增。
切刻内切酶扩增需要加入切刻内切酶与具有链置换功能的核酸聚合酶进行反应，切刻内切酶会根据引物带有的位点切割单链，形成切刻，具有链置换功能的核酸聚合酶会从切刻位置开始扩增，以没有切刻的链作为模板进行线性扩增，扩增出大量的单链核酸产物。
优选的，切刻内切酶扩增采用的切刻内切酶为Nb.BtsI、Nt.BspQI、Nt.CviPII、Nt.BstNBI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nb.BbvCI、Nt.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BssSI、Nt.BsmAI；切刻内切酶扩增采用的链置换核酸聚合酶为Bst3.0 DNA聚合酶、Bst2.0 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶；更进一步优选的，所述切刻内切酶扩增采用的切刻内切酶为Nb.BtsI，切刻内切酶扩增采用的链置换核酸聚合酶为Bst3.0 DNA聚合酶。
优选的，步骤S3中的探针为修饰寡核苷酸探针；进一步优选的，所述探针修饰的类型包括：生物素修饰(Biotin)、地高辛修饰(Digoxigenin)、异硫氰酸荧光素修饰(FITC)、德克萨斯红修饰(Texas Red-X)、磷酸化修饰(Phosphorylation)、氨基修饰(AminolinkerC6/7/12)、巯基修饰(Thiol C6/Thiol-C6 S-S)、硫代修饰(Phosphorothioate)、荧光基团修饰(FAM/HEX/ROX/CY-3/CY-5/JOE/TET等)、淬灭基团修饰(MGB/BHQ1/BHQ2/TAMRA等)；更进一步优选的，所述探针修饰包括：地高辛(DIGOXIGENIN)修饰，生物素(BIOTIN)修饰。
优选的，步骤S4所述的核酸酶包括：核酸外切酶VII、λ核酸外切酶、T5核酸外切酶、T7核酸外切酶、核酸外切酶V、核酸外切酶III、RecJ1核酸外切酶、核酸外切酶I；更进一步优选的，所述外切酶为核酸外切酶VII。
优选的，步骤S5中产物检测的方法包括胶体金试纸条法、胶体碳试纸条法、荧光染料法、紫外照射法、实时荧光定量PCR法；更进一步优选的，所述检测方法为胶体金试纸条法。
胶体金试纸条法：胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。同时在流式、电镜、免疫、核酸检测、分子生物学以至生物芯片中都可能利用到。
胶体碳试纸条法：在胶体金试纸条原理下，将金颗粒替换为碳颗粒，具有更灵敏的特性。
荧光染料法：荧光染料是指吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光的光波的物质。它们大多是含有苯环或杂环并带有共轭双键的化合物。荧光染料可以单独使用，也可以组合成复合荧光染料使用。可用于核酸检测等分子生物学实验中。
紫外照射法：在加入某些特定核酸染料后，例如溴化乙锭、SYBR等，可以通过紫外灯照射发，对扩增的核酸进行检测。
实时荧光定量PCR法：可通过仪器，例如实时荧光定量PCR(qPCR)仪器对扩增的核酸进行检测。
优选的，步骤S1中待检测核酸包括DNA核酸样本、RNA核酸样本或经RNA反转录的DNA核酸样本。
本发明的第二个方面，提供了核酸检测方法在检测致病菌、病毒、转基因核酸、食品成分、遗传物质变异和DNA甲基化变异中的应用。
优选的，检测致病菌、病毒中检测的种类为沙门氏菌、非洲猪瘟病毒、新型冠状病毒。
优选的，检测转基因核酸、食品成分、遗传物质变异和DNA甲基化变异可分别包括检测检测NOS基因、猪线粒体CYTB基因、BRAF基因和Septin9基因。
优选的，检测沙门氏菌时，步骤S1中恒温扩增的引物的核酸序列为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
优选的，检测沙门氏菌时，步骤S3中所述探针的核酸序列为：SEQ ID NO.3。
优选的，检测非洲猪瘟病毒时，步骤S1中恒温扩增的引物的核酸序列为：SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5。
优选的，检测非洲猪瘟病毒时，步骤S3中所述探针的核酸序列为：SEQ ID NO.6。
优选的，检测NOS基因时，步骤S1中恒温扩增的引物的核酸序列为：SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。
优选的，检测NOS基因时，步骤S3中所述探针的核酸序列为：SEQ ID NO.9。
优选的，检测猪线粒体CYTB基因时，步骤S1中恒温扩增的引物的核酸序列为：SEQID NO.10和SEQ ID NO.11。
优选的，检测猪线粒体CYTB基因时，步骤S3中所述探针的核酸序列为：SEQ IDNO.12。
优选的，检测BRAF基因时，步骤S1中恒温扩增的引物的核酸序列为：SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14。
优选的，检测BRAF基因时，步骤S3中所述探针的核酸序列为：SEQ ID NO.15。
优选的，检测Septin9基因时，步骤S1中恒温扩增的引物的核酸序列为：SEQ IDNO.16和SEQ ID NO.17。
优选的，检测Septin9基因时，步骤S3中所述探针的核酸序列为：SEQ ID NO.18。
优选的，检测新型冠状病毒时，步骤S1中恒温扩增的引物的核酸序列为：SEQ IDNO.20和SEQ ID NO.21。
优选的，检测新型冠状病毒时，步骤S3中所述探针的核酸序列为：SEQ ID NO.19。
上述核酸序列见表1所示
表1
Figure BDA0002628216310000071
Figure BDA0002628216310000081
本发明的第三个方面，提供了一种核酸检测试剂盒，包括恒温扩增引物、二次扩增酶、探针、核酸酶。
优选的，所述探针为修饰寡核苷酸探针；进一步优选的，所述探针修饰的类型包括：生物素修饰(Biotin)、地高辛修饰(Digoxigenin)、异硫氰酸荧光素修饰(FITC)、德克萨斯红修饰(Texas Red-X)、磷酸化修饰(Phosphorylation)、氨基修饰(Aminolinker C6/7/12)、巯基修饰(Thiol C6/Thiol-C6 S-S)、硫代修饰(Phosphorothioate)、荧光基团修饰(FAM/HEX/ROX/CY-3/CY-5/JOE/TET等)、淬灭基团修饰(MGB/BHQ1/BHQ2/TAMRA等)；更进一步优选的，所述探针修饰为：地高辛(DIGOXIGENIN)修饰，生物素(BIOTIN)修饰。
优选的，所述探针的核苷酸序列包括：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19。
优选的，所述恒温扩增引物的核苷酸序列包括：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21。
优选的，所述二次扩增酶包括切刻内切酶Nb.BtsI、Nt.BspQI、Nt.CviPII、Nt.BstNBI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nb.BbvCI、Nt.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BssSI、Nt.BsmAI中的一种或多种，和，链置换核酸聚合酶Bst3.0 DNA聚合酶、Bst2.0 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶中的一种或多种。
优选的，所述核酸酶包括核酸外切酶VII、λ核酸外切酶、T5核酸外切酶、T7核酸外切酶、核酸外切酶V、核酸外切酶III、RecJ1核酸外切酶、核酸外切酶I中的一种或多种。
优选的，所述试剂盒还包括检测试纸，检测试纸条包括胶体金试纸条或胶体碳试纸条。
本发明相对于现有技术具有如下优点：本发明提供了一种全新的核酸快速检测方法，该方法无需依赖实验室复杂设备，在野外、居家、检测现场等即可完成核酸检测，具有操作简单、特异性高、无复杂仪器依赖等优点。利用该方法，可进行病原微生物核酸检测、病毒核酸检测、转基因核酸检测、遗传病核酸检测、肿瘤核酸检测、DNA甲基化核酸检测等各种核酸检测。
附图说明
图1为本发明方法的原理示意图；
图2为本发明一实施例1中沙门氏菌的核酸检测结果；
图3为本发明一实施例2中非洲猪瘟病毒的核酸检测结果；
图4为本发明一实施例3中NOS基因的核酸检测结果；
图5为本发明一实施例4中猪线粒体CYTB基因的核酸检测结果；
图6为本发明一实施例5中BRAF基因的核酸检测结果；
图7为本发明一实施例6中Septin9基因的核酸检测结果；
图8为本发明一实施例7中新型冠状病毒(SARS-CoV-2)探针检测降解试验结果；
图9为本发明一实施例8中用新型冠状病毒(SARS-CoV-2)DNA标准品和RNA标准品检测结果；
图10为本发明一实施例9中通过临床咽拭子样本检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)结果；
图11为本发明一实施例10通过临床漱口水样本检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域常规方法和条件，或按照商品说明书选择；下述实施例中相关试剂及生物材料均为市售产品；下述实施例中的分子克隆技术为现有技术中在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。下述实施例主要以沙门氏菌检测、非洲猪瘟病毒检测、转基因检测、食品成分检测、遗传变异检测、DNA甲基化检测和新型冠状病毒检测为例进行论述。
实施例1沙门氏菌的核酸检测
沙门氏菌的核酸检测方法主要包括如下步骤：
1.1、检测样本的制备：采用细菌核酸提取试剂盒提取沙门氏菌的核酸，然后制备以下三种样本，含有沙门氏菌核酸片段样本的阳性样本1(样本1)、含有沙门氏菌核酸片段样本的阳性样本2(样本2)、不含沙门氏菌核酸片段样本的阴性样本(样本3)。
1.2、设计引物及探针：针对提取的沙门氏菌的基因组序列，设计恒温扩增引物与检测探针。扩增正向引物序列为SEQ ID NO.01，扩增反向引物序列为SEQ ID NO.02,检测用探针序列为SEQ ID NO.03。
1.3、恒温扩增：采用潍坊安普未来生产的RNA恒温快速扩增试剂盒(货号：WLRN8206KIT)进行扩增，该试剂盒试剂中混有反转录酶，即可用于扩增DNA模板，也可用于扩增RNA模板。恒温扩增的反应体系及条件如下：
反应体系：
Figure BDA0002628216310000101
Figure BDA0002628216310000111
反应条件：37℃反应15分钟。
1.4、二次扩增：在上步骤反应体系中，加入1μl Bst3.0(8U)、1μl Nb.BtsI(10U)、2μl dNTPs(2.5mM each)，混匀，37℃反应15min，95℃反应5min；
1.5、探针杂交：在上述体系中加入2μl(10μM)标记的探针，置于沸水水杯中1min，连同水杯缓慢降温(约15min)。取出20μl，加入0.5μl核酸外切酶VII，37℃ 5min；
1.6、胶体金试纸条检测：加入60μl ddH2O，混匀后点在胶体金试纸条上样孔，5分钟内观察测试线与质控线的变化。
1.7、结果如附图2所示，所有样本在质控线(C)位置均有条带，表示实验结果有效；样本1在检测线(T)位置有条带，为阳性。样本2在检测线(T)位置有条带，为阳性。样本3在检测线(T)位置无条带，为阴性。可见，本发明提供的方法可以准确检验沙门氏菌。
实施例2非洲猪瘟病毒检测
非洲猪瘟病毒的核酸检测方法主要包括如下步骤：
2.1、检测样本的制备：采用病毒核酸提取试剂盒提取非洲猪瘟病毒的核酸，然后制备以下三种样本，含有非洲猪瘟病毒核酸片段的阳性样本1、含有非洲猪瘟病毒核酸片段的阳性样本2、不含非洲猪瘟病毒核酸片段的阴性样本3。
2.2、设计引物及探针：针对提取的非洲猪瘟病毒的基因组序列，设计恒温扩增引物与检测探针。扩增正向引物序列为SEQ ID NO.04，扩增反向引物序列为SEQ ID NO.05,检测用探针序列为SEQ ID NO.06。
2.3、恒温扩增：采用潍坊安普未来生产的RNA恒温快速扩增试剂盒(货号：WLRN8206KIT)进行扩增，该试剂盒试剂中混有反转录酶，即可用于扩增DNA模板，也可用于扩增RNA模板。恒温扩增的反应体系及条件如下：
反应体系：
试剂 体积
粉末 1管
Buffer A 29.4μl
SEQ ID NO.4(10uM) 0.5μl
SEQ ID NO.5(10uM) 0.5μl
模板(阳性样本/阴性样本/NTC) 17.1μl
Buffer B 2.5μl
总体系 50μl
反应条件：37℃反应15分钟。
2.4、二次扩增：在上步骤反应体系中，加入1μl Bst3.0(8U)、1μl Nb.BtsI(10U)、2μl dNTPs(2.5mM each)，混匀，37℃反应15min，95℃反应5min；
2.5、探针杂交：在上述体系中加入2μl(10μM)标记的探针，置于沸水水杯中1min，连同水杯缓慢降温(约15min)。取出20μl，加入0.5μl核酸外切酶VII，37℃ 5min；
2.6、胶体金试纸条检测：加入60μl ddH2O，混匀后点在胶体金试纸条上样孔，5分钟内观察测试线与质控线的变化。
2.7、结果如附图3所示，所有样本在质控线(C)位置均有条带，表示实验成果；样本1在检测线(T)位置有条带，为阳性。样本2在检测线(T)位置有条带，为阳性。样本3在检测线(T)位置无条带，为阴性。可见，本发明提供的方法可以准确检验非洲猪瘟病毒。
实施例3转基因核酸检测
转基因核酸检测以检测NOS基因为例，NOS基因的检测方法主要包括如下步骤：
3.1、检测样本的制备：制备以下三种样本，含有NOS基因的核酸片段的阳性样本1(样本1)、含有NOS基因的核酸片段的阳性样本2(样本2)、不含有NOS基因的核酸片段的阴性样本3(样本3)。
3.2、设计引物及探针：针对提取的NOS基因的核酸序列，设计恒温扩增引物与检测探针。扩增正向引物序列为SEQ ID NO.07，扩增反向引物序列为SEQ ID NO.08,检测用探针序列为SEQ ID NO.09。
3.3、恒温扩增：采用潍坊安普未来生产的RNA恒温快速扩增试剂盒(货号：WLRN8206KIT)进行扩增，该试剂盒试剂中混有反转录酶，即可用于扩增DNA模板，也可用于扩增RNA模板。恒温扩增的反应体系及条件如下：
反应体系：
试剂 体积
粉末 1管
Buffer A 29.4μl
SEQ ID NO.7(10uM) 0.5μl
SEQ ID NO.8(10uM) 0.5μl
模板(阳性样本/阴性样本/NTC) 17.1μl
Buffer B 2.5μl
总体系 50μl
反应条件：37℃反应15分钟。
3.4、二次扩增：在上步骤反应体系中，加入1μl Bst3.0(8U)、1μl Nb.BtsI(10U)、2μl dNTPs(2.5mM each)，混匀，37℃反应15min，95℃反应5min；
3.5、探针杂交：在上述体系中加入2μl(10μM)标记的探针，置于沸水水杯中1min，连同水杯缓慢降温(约15min)。取出20μl，加入0.5μl核酸外切酶VII，37℃ 5min；
3.6、胶体金试纸条检测：加入60μl ddH2O，混匀后点在胶体金试纸条上样孔，5分钟内观察测试线与质控线的变化。
3.7、结果如附图4所示，所有样本在质控线(C)位置均有条带，表示实验成果；样本1在检测线(T)位置有条带，为阳性。样本2在检测线(T)位置有条带，为阳性。样本3在检测线(T)位置无条带，为阴性。可见，本发明提供的方法可以准确检验NOS基因。
实施例4食品成分检测
食品成分检测以猪肉成分检测为例，检测猪线粒体CYTB基因，检测方法主要包括如下步骤：
4.1、检测样本的制备：制备以下三种样本，含有猪线粒体CYTB基因核酸片段的阳性样本1(样本1)、含有猪线粒体CYTB基因核酸片段的阳性样本2(样本2)、不含有猪线粒体CYTB基因核酸片段的阴性样本3(样本3)。
4.2、设计引物及探针：针对提取的猪线粒体CYTB基因的核酸序列，设计恒温扩增引物与检测探针。扩增正向引物序列为SEQ ID NO.10，扩增反向引物序列为SEQ ID NO.11,检测用探针序列为SEQ ID NO.12。
4.3、恒温扩增：采用潍坊安普未来生产的RNA恒温快速扩增试剂盒(货号：WLRN8206KIT)进行扩增，该试剂盒试剂中混有反转录酶，即可用于扩增DNA模板，也可用于扩增RNA模板。恒温扩增的反应体系及条件如下：
反应体系：
试剂 体积
粉末 1管
Buffer A 29.4μl
SEQ ID NO.10(10uM) 0.5μl
SEQ ID NO.11(10uM) 0.5μl
模板(阳性样本/阴性样本/NTC) 17.1μl
Buffer B 2.5μl
总体系 50μl
反应条件：37℃反应15分钟。
4.4、二次扩增：在上步骤反应体系中，加入1μl Bst3.0(8U)、1μl Nb.BtsI(10U)、2μl dNTPs(2.5mM each)，混匀，37℃反应15min，95℃反应5min；
4.5、探针杂交：在上述体系中加入2μl(10μM)标记的探针，置于沸水水杯中1min，连同水杯缓慢降温(约15min)。取出20μl，加入0.5μl核酸外切酶VII，37℃ 5min；
4.6、胶体金试纸条检测：加入60μl ddH2O，混匀后点在胶体金试纸条上样孔，5分钟内观察测试线与质控线的变化。
4.7、结果如附图5所示，所有样本在质控线(C)位置均有条带，表示实验成果；样本1在检测线(T)位置有条带，为阳性。样本2在检测线(T)位置有条带，为阳性。样本3在检测线(T)位置无条带，为阴性。可见，本发明提供的方法可以准确检验猪线粒体CYTB基因，具有食品成分检测的潜能。
实施例5遗传物质变异检测
遗传物质变异检测以检测BRAF基因为例，BRAF基因的检测方法主要包括如下步骤：
5.1、检测样本的制备：制备以下三种样本，含有BRAF基因变异核酸片段的阳性样本(样本1)、含有BRAF基因变异核酸片段的阳性样本(样本2)、不含有BRAF基因变异核酸片段的阴性样本(样本3)。
5.2、设计引物及探针：针对提取的BRAF基因的核酸序列，设计恒温扩增引物与检测探针。扩增正向引物序列为SEQ ID NO.13，扩增反向引物序列为SEQ ID NO.14,检测用探针序列为SEQ ID NO.15。
5.3、恒温扩增：采用潍坊安普未来生产的RNA恒温快速扩增试剂盒(货号：WLRN8206KIT)进行扩增，该试剂盒试剂中混有反转录酶，即可用于扩增DNA模板，也可用于扩增RNA模板。恒温扩增的反应体系及条件如下：
反应体系：
Figure BDA0002628216310000151
Figure BDA0002628216310000161
反应条件：37℃反应15分钟。
5.4、二次扩增：在上步骤反应体系中，加入1μl Bst3.0(8U)、1μl Nb.BtsI(10U)、2μl dNTPs(2.5mM each)，混匀，37℃反应15min，95℃反应5min；
5.5、探针杂交：在上述体系中加入2μl(10μM)标记的探针，置于沸水水杯中1min，连同水杯缓慢降温(约15min)。取出20μl，加入0.5μl核酸外切酶VII，37℃ 5min；
5.6、胶体金试纸条检测：加入60μl ddH2O，混匀后点在胶体金试纸条上样孔，5分钟内观察测试线与质控线的变化。
5.7、结果如附图6所示，所有样本在质控线(C)位置均有条带，表示实验成果；样本1在检测线(T)位置有条带，为阳性。样本2在检测线(T)位置有条带，为阳性。样本3在检测线(T)位置无条带，为阴性。可见，本发明提供的方法可以准确检验BRAF基因，具有遗传物质变异检测的潜能。
实施例6 DNA甲基化变异检测
以检测Septin9基因为例，检测方法主要包括如下步骤：
6.1、检测样本的制备：制备以下三种样本，Septin9基因高甲基化核酸片段阳性样本1(样本1)、Septin9基因高甲基化核酸片段阳性样本2(样本2)、Septin9基因低甲基化核酸片段阴性样本3(样本3)。
6.2、设计引物及探针：针对提取的Septin9基因的核酸序列，设计恒温扩增引物与检测探针。扩增正向引物序列为SEQ ID NO.16，扩增反向引物序列为SEQ ID NO.17,检测用探针序列为SEQ ID NO.18。
6.3、恒温扩增：采用潍坊安普未来生产的RNA恒温快速扩增试剂盒(货号：WLRN8206KIT)进行扩增，该试剂盒试剂中混有反转录酶，即可用于扩增DNA模板，也可用于扩增RNA模板。恒温扩增的反应体系及条件如下：
反应体系：
试剂 体积
粉末 1管
Buffer A 29.4μl
SEQ ID NO.16(10uM) 0.5μl
SEQ ID NO.17(10uM) 0.5μl
模板(阳性样本/阴性样本/NTC) 17.1μl
Buffer B 2.5μl
总体系 50μl
反应条件：37℃反应15分钟。
6.4、二次扩增：在上步骤反应体系中，加入1μl Bst3.0(8U)、1μl Nb.BtsI(10U)、2μl dNTPs(2.5mM each)，混匀，37℃反应15min，95℃反应5min；
6.5、探针杂交：在上述体系中加入2μl(10μM)标记的探针，置于沸水水杯中1min，连同水杯缓慢降温(约15min)。取出20μl，加入0.5μl核酸外切酶VII，37℃ 5min；
6.6、胶体金试纸条检测：加入60μl ddH2O，混匀后点在胶体金试纸条上样孔，5分钟内观察测试线与质控线的变化。
6.7、结果如附图7所示，所有样本在质控线(C)位置均有条带，表示实验成果；样本1在检测线(T)位置有条带，为阳性。样本2在检测线(T)位置有条带，为阳性。样本3在检测线(T)位置无条带，为阴性。可见，本发明提供的方法可以准确检验Septin9基因，具有DNA甲基化变异检测的潜能。
实施例7新型冠状病毒(SARS-CoV-2)探针检测降解试验
7.1、制备探针，设计并修饰探针，探针核酸序列为：SEQ ID NO.19，其中5’端标记有地高辛修饰，3’端标记有生物素修饰。
7.2、阴性对照组(样本1)为水，实验组分别为：1pmol带有修饰的探针(样本2)，10pmol带有修饰的探针(样本3)，10pmol带有修饰的探针被单链外切酶Exo VII酶切后(样本4)。
7.3、取50μl 2.2中的产物，将胶体金试纸条插入产物中静置层析，5分钟内读取结果。
7.4、结果如附图8所示，在质控线(C)位置均有条带显示，说明实验成功；在检测线(T)位置，样本1没有条带为阴性，样本2有条带为阳性，样本3有条带为阳性，样本4没有条带为阴性。说明探针可直接检出，探针经外切酶切割后不可检出。
实施例8用新型冠状病毒(SARS-CoV-2)DNA标准品和RNA标准品检测
8.1、制备检测样本：其中采用水作为阴性对照组(样本1)，实验组分别采用1000拷贝的SARS-CoV-2DNA片段(样本2)、10000拷贝的SARS-CoV-2RNA标准品(样本3)和1000拷贝的SARS-CoV-2RNA标准品(样本4)。
8.2、第一次恒温扩增：以步骤1得到的检测样本为模板，使用RNA恒温快速扩增试剂盒(安普未来，WLRN8206KIT)进行恒温扩增，恒温扩增步骤参考试剂盒说明书。
反应体系如下：
试剂 体积
粉末 1管
Buffer A 29.4μl
SEQ ID NO.20(10μM) 0.5μl
SEQ ID NO.21(10μM) 0.5μl
模板(H<sub>2</sub>O/DNA/RNA) 17.1μl
Buffer B 2.5μl
反应条件：37℃，12min。
其中，正向应物F为：SEQ ID NO.20，反向引物R为：SEQ ID NO.21。
8.3、二次扩增：加入1μl Nb.BtsI、1μl Bst3.0、4μl dNTPs、37℃反应15min，95℃5min。
8.4、探针杂交：加入10μM标记的探针(SEQ ID NO.19)2μl，95℃ 1min进行杂交，后缓慢降至室温(约15min)。
8.5、多余探针降解：取20μl杂交后产物，加入0.5μl Exo VII，37℃ 5min。
8.6、胶体金试纸条检测：加入60μl ddH2O，混匀后把胶体金试纸条插入到液体中，5分钟内读取结果。
8.7、结果如附图9所示，在质控线(C)位置均有条带显示，说明实验成功；在检测线(T)位置，样本1没有条带为阴性，样本2有条带为阳性，样本3有条带为阳性，样本4有条带为阳性。说明采用本发明提供的方法可以检测出SARS-CoV-2DNA和SARS-CoV-2RNA，且检测准确率100％。
实施例9通过临床咽拭子样本检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)
9.1、采集5例新型冠状病毒肺炎疑似患者的咽拭子样本，临床核酸诊断结果为：样本1，阳性；样本2，阴性；样本3，阴性性；样本4，阳性；样本5，阴性。
9.2、提取咽拭子样本中的核酸。
9.3、以水为阴性对照组、1000拷贝的SARS-CoV-2DNA片段为阳性对照组、步骤9.2获得的5例患者核酸为实验组，采用实施例8的方法进行检测。9.4、结果如附图10所示，在质控线(C)位置均有条带显示，说明实验成功；在检测线(T)位置，阴性对照品没有条带为阴性，阳性对照品有条带为阳性，样本1有条带为阳性，样本2有没有条带为阴性，样本3没有条带为阴性，样本4有条带为阳性，样本5没有条带为阴性。本发明提供的方法的检测疑似患者的结果与临床检测结果完全吻合，说明本发明具有检测新型冠状病毒的推广应用的潜能。
实施例10通过临床漱口水样本检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)
10.1、采集4例新型冠状病毒肺炎疑似患者的咽拭子样本，临床核酸诊断结果为：样本1，阳性；样本2，阳性；样本3，阳性；样本4，阳性。
10.2、提取咽拭子样本中的核酸。
10.3、以水为无模板阴性对照组、1000拷贝的SARS-CoV-2DNA片段为阳性对照组、步骤10.2获得的4例患者核酸为实验组，采用实施例8的方法进行检测。
10.4、结果如附图11所示，在质控线(C)位置均有条带显示，说明实验成功；在检测线(T)位置，阴性对照品没有条带为阴性，阳性对照品有条带为阳性，样本1有条带为阳性，样本2有条带为阳性，样本3有条带为阳性，样本4有条带为阳性。本发明提供的方法能够100％的检测出确诊患者，检测结果与临床检测结果完全吻合，说明本发明具有检测新型冠状病毒的推广应用的潜能。
综合实施例1-10可以看出，本发明提供的核酸检测方法操作简单，且无需依赖实验室复杂设备，在野外、居家、现场检测等。并且，该方法对病原微生物核酸检测、病毒核酸检测、转基因核酸检测、遗传病核酸检测、肿瘤核酸检测、DNA甲基化核酸检测等各种核酸检测均具有准确的检测结果。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海奕谱生物科技有限公司
<120> 一种核酸检测试剂盒、方法及其应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctacaactt gtgctaatgc actgccgctt ccagttggtc cagcatatgt tttgtttc 58
<210> 2
<211> 33
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcttgatgag ctttaccact gtctggcggt gac 33
<210> 3
<211> 35
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggcacgcaa cgtcaatgaa tatttcggta ttcag 35
<210> 4
<211> 58
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctacaactt gtgctaatgc actgcagctc ttacataccc ttccactacg gaggcagt 58
<210> 5
<211> 33
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
actgggttga tattcctccc gtggcttcaa agc 33
<210> 6
<211> 35
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
catcatcgca ccaggatcgt caggggtttt aatcg 35
<210> 7
<211> 57
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cctacaactt gtgctaatgc actgggtgat aactccttca ctggccttga ttgctga 57
<210> 8
<211> 33
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agcggcttgg ttcgcctccc ggcacgttcc cac 33
<210> 9
<211> 35
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgctgtgggc accagcagat catccaggat cgatc 35
<210> 10
<211> 58
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cctacaactt gtgctaatgc actgcaccgt tatagcaaca gccttcatag gctacgtc 58
<210> 11
<211> 33
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
taagggatag ctgatagtag atttgtgatg acc 33
<210> 12
<211> 35
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtagctcctc agaatgatat ttgtcctcag ggcag 35
<210> 13
<211> 59
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cctacaactt gtgctaatgc actgcatatt tcttcatgaa gacctcacag taaaaatag 59
<210> 14
<211> 34
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccacaaaatg gatccagaca actgttcaaa ctga 34
<210> 15
<211> 31
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gacccactcc atcgagaagc tagaccaaaa t 31
<210> 16
<211> 60
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cctacaactt gtgctaatgc actgcccccg ccgggggcgc ttcctcgccg ctgccctccg 60
<210> 17
<211> 34
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cctctccagc acgtccgcgg ccgcagcagc cagc 34
<210> 18
<211> 33
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agctgcgcgt tgaccgcggg gtccgacatg atg 33
<210> 19
<211> 30
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cagccataac ctttccacat accgcagacg 30
<210> 20
<211> 60
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cctacaactt gtgctaatgc actgccctac aacttgtgct aatgaccctg tgggttttac 60
<210> 21
<211> 31
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cccgtttaaa aacgattgtg catcagctga c 31

Claims (21)

1.一种核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，恒温扩增，将待检测核酸进行恒温扩增；
S2，二次扩增，将恒温扩增后的产物进行二次扩增，且二次扩增的产物为核酸单链；
S3，探针杂交，将二次扩增后的产物与探针进行杂交；
S4，探针降解，将杂交后的产物加入核酸酶降解多余的单链核酸；
S5，产物检测，检测步骤S4得到的产物。
2.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，步骤S1中的恒温扩增和步骤S2中的二次扩增方法包括：重组酶聚合酶恒温扩增技术、重组酶辅助的扩增技术、环介导的等温扩增技术、链置换的等温扩增技术、滚环扩增、基于核酸序列的等温扩增技术、解旋酶依赖的等温扩增技术、切刻内切酶扩增反应。
3.根据权利要求2所述的核酸检测方法，其特征在于，步骤S1中的恒温扩增为重组酶聚合酶恒温扩增技术；步骤S2中的二次扩增为切刻内切酶扩增。
4.根据权利要求3所述的核酸检测方法，其特征在于，切刻内切酶扩增采用的切刻内切酶为Nb.BtsI、Nt.BspQI、Nt.CviPII、Nt.BstNBI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nb.BbvCI、Nt.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BssSI、Nt.BsmAI；切刻内切酶扩增采用的链置换核酸聚合酶为Bst3.0 DNA聚合酶、Bst2.0 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶。
5.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，步骤S3中的探针为修饰寡核苷酸探针。
6.根据权利要求5所述的核酸检测方法，其特征在于，所述探针修饰的类型包括：生物素修饰、地高辛修饰、异硫氰酸荧光素修饰、德克萨斯红修饰、磷酸化修饰、氨基修饰、巯基修饰、硫代修饰、荧光基团修饰、淬灭基团修饰。
7.根据权利要求6所述的核酸检测方法，其特征在于，所述探针修饰包括：地高辛修饰与生物素修饰。
8.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，步骤S4所述的核酸酶包括：核酸外切酶VII、λ核酸外切酶、T5核酸外切酶、T7核酸外切酶、核酸外切酶V、核酸外切酶III、RecJ1核酸外切酶、核酸外切酶I。
9.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，步骤S5中产物检测的方法包括胶体金试纸条法、胶体碳试纸条法、荧光染料法、紫外照射法、实时荧光定量PCR法。
10.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，步骤S1中待检测核酸包括DNA核酸样本、RNA核酸样本和经RNA反转录的cDNA核酸样本。
11.权利要求1-10任意一项所述的方法在检测致病菌、病毒、转基因核酸、食品成分、遗传物质变异和DNA甲基化变异中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述病菌包括沙门氏菌，所述病毒包括非洲猪瘟病毒、新型冠状病毒。
13.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，检测转基因核酸、食品成分、遗传物质变异和DNA甲基化变异可分别包括检测检测NOS基因、猪线粒体CYTB基因、BRAF基因和Septin9基因。
14.一种核酸检测试剂盒，其特征在于，包括恒温扩增引物、二次扩增酶、探针、核酸酶。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述探针为修饰寡核苷酸探针。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述探针修饰的类型包括：生物素修饰、地高辛修饰、异硫氰酸荧光素修饰、德克萨斯红修饰、磷酸化修饰、氨基修饰、巯基修饰、硫代修饰、荧光基团修饰、淬灭基团修饰。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的核苷酸序列包括：SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18和SEQ IDNO.19。
18.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述恒温扩增引物的核苷酸序列包括：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.17、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21。
19.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述二次扩增酶包括切刻内切酶Nb.BtsI、Nt.BspQI、Nt.CviPII、Nt.BstNBI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nb.BbvCI、Nt.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BssSI、Nt.BsmAI中的一种或多种，和，链置换核酸聚合酶Bst3.0DNA聚合酶、Bst2.0 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶中的一种或多种。
20.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸酶包括核酸外切酶VII、λ核酸外切酶、T5核酸外切酶、T7核酸外切酶、核酸外切酶V、核酸外切酶III、RecJ1核酸外切酶、核酸外切酶I。
21.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，还包括检测试纸条，所述检测试纸条包括胶体金试纸条或胶体碳试纸条。
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