CN114606322B - 基于Argonaute蛋白和指数扩增一步检测长链RNA的试剂盒及检测方法及应用 - Google Patents

基于Argonaute蛋白和指数扩增一步检测长链RNA的试剂盒及检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于Argonaute蛋白和指数扩增一步检测长链RNA的试剂盒及检测方法及应用，试剂盒包括TtAgo蛋白、特异识别靶标长链RNA的gDNA，指数扩增模板、DNA聚合酶Bst 3.0、切刻内切酶Nb.BtsI、极高热稳定性单链结合蛋白、dNTP和荧光染料；本发明的试剂盒结合了TtAgo的高特异性切割和EXPAR的高效扩增优势，用于单核苷酸突变的lncRNA HOTAIR和KRAS‑G12D mRNA样品证实了该方法具有识别单核苷酸特异性。新型冠状病毒RNA检测也证明了该方法的通用性。由于其优越的敏感性、特异性、简单性、快速性和恒温性，有望成为定量检测RNA的有力工具。

Description

基于Argonaute蛋白和指数扩增一步检测长链RNA的试剂盒及 检测方法及应用
技术领域
本发明涉及用于核酸检测和定量技术领域，具体涉及基于Argonaute蛋白和指数扩增一步检测长链RNA的试剂盒及检测方法及应用。
背景技术
肿瘤相关的长链RNA如长链非编码RNA(lncRNAs)和信使RNA(mRNA)的灵敏和特异检测可能为癌症早期诊断、治疗及预后带来新的机遇。目前，逆转录聚合酶链式反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT PCR)仍然是各领域中使用最广泛的RNA定量检测方法，但由于高能耗特点，其在资源有限场地区和现场快速检验中的应用受到极大限制。近年来，一些设计巧妙的恒温扩增方法已用于RNA检测，如指数扩增反应(exponential amplification reaction，EXPAR)、滚环扩增和纳米探针。然而，由于长链RNA无法充当引物，导致这些方法不适合长链RNA的检测，并且通常对单碱基变异的区分能力较低。因此，仍然迫切需要建立具有阿摩尔灵敏度、单碱基识别特异性和反应方案简单的恒温RNA检测方法。
近年来，通过DNA干扰参与宿主防御的原核生物Argonaute蛋白(prokaryoticArgonaute proteins，pAgos)引起了研究人员的广泛关注。各种pAgos具有结构相似性，包括N(N末端)结构域、PAZ结构域、MID结构域和PIWI结构域。这些特征赋予pAgos利用5′-磷酸化引导核酸靶向切割互补底物的特殊功能。与Cas9和其他CRISPR相关的引导核酸酶类似，这种新的酶切割活性可赋予pAgos执行相关特殊功能，例如作为可编程的限制性内切核酸酶和基因组编辑工具。最近，从嗜热栖热菌(Thermus thermophilus，TtAgo)和激烈热球菌(Pyrococcus furiosus，PfAgo)中提取的pAgos的功能已得到开发，基于pAgo的核酸诊断前景广阔。例如，一种称为NAVIGATER(通过嗜热栖热菌DNA引导的Argonaute进行核酸富集)的基于TtAgo技术可以以单核苷酸的精度特异性切割引导核酸互补的DNA和RNA，从而提高下游检测方法如PCR和测序的灵敏度。然而，迄今为止报道的所有基于pAgo的方法要么将pAgo介导的切割与后续步骤分开，要么需要热循环仪器以实现扩增。因此，仍然有必要建立一步恒温扩增体系，以进一步探索pAgos在诊断领域的潜力。
在研究较明确的pAgos中，TtAgo(最适活性温度≥65℃)可能比PfAgo(最适活性温度≥87℃)更适合建立恒温扩增体系，因为大多数恒温扩增方法都是在较温和的恒定温度下进行的。TtAgo利用长度为16-21nt的短5′-磷酸化DNA作为引导核酸(guide DNA，gDNA)与底物靶向杂交，而不受类似CRISPR相关系统中前间区序列邻近基序(protospaceradjacent motif，PAM)的限制。然而，它要求底物以单链形式存在以便结合和随后在引导核酸的第10碱基和11碱基位置之间切割。换句话说，TtAgo可能更适合单链核酸的切割。作为一种多周转酶，单个TtAgo引导核酸结合复合物可以在超过65℃的温度下切割多个底物，这表明它们非常有利于核酸的灵敏检测。与单链DNA识别特异性相比，切割位点近端RNA错配的低耐受性也表明TtAgo可以为RNA的检测提供更高的特异性。因此，需要建立一种与精确切割的TtAgo相结合的恒温扩增技术，用于RNA的一步检测，可以被赋予理想的RNA靶向位点功能，从而增强其特异性和灵敏度。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供基于Argonaute蛋白和指数扩增一步检测长链RNA的试剂盒；本发明的目的之二在于提供利用所述试剂盒检测长链RNA的方法；本发明的目的之三在于提供所述试剂盒在制备检测长链RNA含量或长链RNA突变的试剂中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、基于Argonaute蛋白和指数扩增一步检测长链RNA的试剂盒，所述试剂盒包括TtAgo蛋白、特异识别靶标长链RNA的gDNA，指数扩增模板、DNA聚合酶Bst 3.0、切刻内切酶Nb.BtsI、极高热稳定性单链结合蛋白、dNTP和荧光染料；
所述指数扩增模板由中心的切刻内切酶Nb.BtsI识别位点连接的两端互补于trigger序列的重复序列构成，所述trigger序列为靶标长链RNA被TtAgo蛋白切割后的3’端序列至少10个序列；所述gDNA的长度≥16nt。
优选的，所述gDNA的5’端和3’端进行磷酸化修饰；所述指数扩增模板的3’端进行C3spacer修饰。
优选的，所述靶标长链RNA为LncRNA HOTAIR，所述LncRNA HOTAIR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述gDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述指数扩增模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，扩增产物trigger序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
或，所述靶标RNA为KRAS mRNA G12D，所述指数扩增模板的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示，所述gDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
或，所述靶标RNA为新型冠状病毒SARS-CoV-2，所述指数扩增模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述gDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
2、利用所述试剂盒检测长链RNA的方法，所述方法用于非诊断目的，将TtAgo蛋白、特异识别靶标长链RNA的gDNA，指数扩增模板、DNA聚合酶Bst 3.0、切刻内切酶Nb.BtsI、极高热稳定性单链结合蛋白、dNTP和荧光染料加入含有待测长链RNA的反应体系中，在65℃～68℃之间，充分反应，根据荧光信号计算靶标长链RNA的含量；
反应中核酸gDNA识别并与靶标RNA互补杂交，引导TtAgo蛋白在靶标RNA序列上发生特异性切割并产生含trigger序列的片段，继而在指数扩增模板、DNA聚合酶和内切酶存在下引发指数扩增反应；所述指数扩增模板由中心的切刻内切酶Nb.BtsI识别位点以及两端互补于trigger序列的重复序列构成，与trigger序列杂交，并在DNA聚合酶Bst 3.0作用下延伸形成双链DNA，切刻内切酶Nb.BtsI识别并切割该双链DNA后，再经DNA聚合酶Bst 3.0置换作用产生新的trigger序列，经过不断地延伸、切割、置换循环，产生大量可检测产物，并通过荧光染料指示信号输出，从而实现对目标物的一步快速定量检测。
优选的，所述反应体系中TtAgo与gDNA的摩尔比为1∶1；每10微升反应体系中，Bst3.0DNA聚合酶量为0.2U，NbBtsI切刻内切酶的量为5U。
优选的，所述反应的时间控制在100分钟以内。
3、所述试剂盒在制备检测长链RNA含量或长链RNA突变的试剂中的应用。
优选的，检测长链RNA突变时所述单核苷酸突变位点位于gDNA第五至十三位核苷酸之间。
本发明的有益效果在于：
在本发明中，我们开发了一种简单而巧妙的TtAgo介导EXPAR方法(TtAgo-EXPAR)，其可以用于RNA一步检测。最初的EXPAR仅限于检测短链RNA，但由于TtAgo的引入，TtAgo-EXPAR可以对长链RNA进行检测。简而言之，合理设计的引导核酸DNA(gDNA)指导TtAgo在靶标RNA序列上特异性切割。然后，由切割生成的引物序列启动EXPAR高效扩增反应。由于结合了TtAgo的高特异性切割和EXPAR的高效扩增优势，该方法可以达到阿摩尔的检测灵敏度和单碱基的分辨率。在证实纯化的TtAgo蛋白在恒定温度下的切割活性和单碱基特异性识别后，我们优化并找到了与TtAgo兼容的EXPAR系统。通过对靶标长链RNA lncRNA HOTAIR的特异性扩增，验证了TtAgo-EXPAR的阿摩尔敏感性，并利用一系列携带单核苷酸突变的lncRNAHOTAIR和由野生型KRAS mRNA与KRAS-G12D mRNA混合物组成的样品评估该方法识别单核苷酸特异性。为了证实其潜在的实际应用，我们利用该方法和RT-qPCR分析了来自不同癌细胞系的RNA提取物。新型冠状病毒RNA检测也证明了TtAgo-EXPAR的通用性。由于其优越的敏感性、特异性、简单性、快速性和恒温性，TtAgo-EXPAR有望成为定量检测RNA的有力工具。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1：本发明基于Argonaute蛋白和恒温扩增检测长链RNA方法原理示意图；
图2：(a)TtAgo酶特异性切割功能研究；PAGE电泳显示了65℃-69℃间TtAgo酶对野生型lncRNA HOTAIR(W)片段与单碱基突变型lncRNA HOTAIR(MT HOTAIR 11，M)片段的切割结果，100nt目标物特异性切割产物为53nt的P1与47nt的P2；(b)TtAgo酶特异性切割底物的荧光动力学曲线；(c)聚合酶联合切刻内切酶启动EXPAR研究；黑线为Ct阈值线；检测目标物与空白Ct值间的差异为Diff；(d)各DNA聚合酶与切刻内切酶组合介导的EXPAR反应性能比较；NA：无扩增现象，NS：无典型S型曲线形成，误差磅代表平均标准偏差，n＝3；
图3：(a)TtAgo-EXPAR反应体系的荧光动力学分析；曲线1：ET SSB+1pM lncRNAHOTAIR无TtAgo；曲线2：有ET SSB但无lncRNA HOTAIR与TtAgo；曲线3：TtAgo+1pM lncRNAHOTAIR无ET SSB；曲线4：有TtAgo但无lncRNA HOTAIR与ET SSB；曲线5：TtAgo+ET SSB+1pMlncRNA HOTAIR；曲线6：TtAgo+ET SSB无lncRNA HOTAIR；(b)TtAgo-EXPAR体系的PAGE电泳结果；
图4：(a)TtAgo-EXPAR的温度优化；(b)TtAgo-EXPAR的TtAgo与gDNA比例优化；(c)TtAgo-EXPAR的Bst 3.0 DNA聚合酶用量优化；(d)TtAgo-EXPAR的NbBtsI切刻内切酶用量优化，误差磅代表平均标准偏差，n＝3；
图5：(a)TtAgo-EXPAR检测lncRNA的实时荧光检测图谱；每一浓度lncRNA的反应信号放大曲线经彩色实线显示，曲线1：1×108aM；曲线2：5×107aM；曲线3：1×107aM；曲线4：1×106aM；曲线5：1×105aM；曲线6：1×104aM；曲线7：1×103aM；曲线8：1×102aM；曲线9：5×101aM；曲线10：2×101aM；曲线11：1×101aM；曲线12：1×100aM；曲线13：0aM；(b)与TtAgo-EXPAR荧光动力学图谱对应的各浓度lncRNA的Ct值；(c)TtAgo-EXPAR与RT-qPCR回归分析；(d)TtAgo-EXPAR检测新型冠状病毒RNA的灵敏度分析，误差磅代表平均标准偏差，n＝3；
图6：(a)目标物lncRNA不同突变位置示意图；(b)目标物lncRNA不同突变位置对TtAgo-EXPAR检测影响研究；特异性指数指(Specificity index)的是TtAgo-EXPAR对lncRNA HOTAIR片段检测Diff值与各单碱基突变lncRNA HOTAIR片段检测Diff值的比值；(c)TtAgo-EXPAR对混合样本中KRAS-G12D mRNA检测原理示意图；(d)通过TtAgo-EXPAR研究循环阈值(Ct)和不同浓度KRAS G12D mRNA样本的相关性，误差磅代表平均标准偏差，n＝3。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
在本发明中，从目标RNA中获取引物trigger序列。100nt的lncRNA HOTAIR(HOXantisense intergenic RNA)片段用作检测目标模型。为了启动gDNA的引导活性，同时避免其在后续EXPAR反应中的非特异性延伸，标准16nt的5’端磷酸化gDNA的3’端也进行了磷酸化修饰(gDNA HTR)。在TtAgo酶的工作温度下，16nt的gDNA HTR准确地识别并与lncRNAHOTAIR互补杂交，启动TtAgo介导的特异性切割并产生trigger序列。随后是经EXPAR模板发生的指数扩增反应。EXPAR模板由中心的切刻内切酶识别位点以及两端互补于trigger序列3’端的长达22nt重复序列构成。在EXPAR模板的3’端进行了C3spacer修饰以进一步降低发生非特异性扩增反应的可能性。Trigger序列与EXPAR模板杂交，并在DNA聚合酶作用下延伸形成双链DNA，内切酶识别并切割该双链DNA后，再经DNA聚合酶置换作用产生新的trigger序列。经过不断地延伸、切割、置换循环，产生大量可检测产物。由此，在恒温条件下，目标RNA经TtAgo特异性切割后引发后续的EXPAR反应，并通过荧光染料指示信号输出，从而实现对目标物的一步快速定量检测。本发明基于Argonaute蛋白和恒温扩增检测长链RNA方法原理示意图如图1所示。
本发明提供了一种基于Argonaute蛋白和指数扩增一步检测长链RNA的试剂盒：所述试剂盒包括TtAgo蛋白、特异识别靶标长链RNA的gDNA，指数扩增模板、DNA聚合酶Bst3.0、切刻内切酶Nb.BtsI、极高热稳定性单链结合蛋白、dNTP和荧光染料；所述指数扩增模板由中心的切刻内切酶Nb.BtsI识别位点连接的两端互补于trigger序列的重复序列构成，所述trigger序列为靶标长链RNA被TtAgo蛋白切割后的3’端序列至少10个序列；所述gDNA的长度≥16nt。
实验中所用到的核酸序列(购自上海生工生物技术有限公司)如表1、表2所示。
表1本发明中涉及的核酸序列
注：下划线代表与gDNA杂交互补序列；灰色字母代表突变碱基；灰色斜体代表各酶切位点识别序列
表2 lncRNA HOTAIR的单碱基突变序列
注：下划线代表与gDNA杂交互补序列；灰色字母代表突变碱基
实施例1、TtAgo酶功能研究
为了证明TtAgo酶在工作温度下确实能特异性识别目标物，但同时也考虑到后续EXPAR反应的聚合酶与内切酶不耐受高温(很难在高于70℃条件下进行EXPAR反应)，由此我们应用PAGE电泳对合成的TtAgo酶在65℃至69℃的切刻能力进行了研究。如图2，a所示，在各反应温度下泳道2、4、6、8、10均产生了lncRNA HOTAIR(W)片段的特异性切割产物，而在泳道3、5、7、9、11中无法观察到单碱基突变的lncRNA HOTAIR(MT HOTAIR 11，M)切割产物条带。因此，TtAgo酶可以在65℃至69℃间发挥其特异性切割功能。
此外，在合成的lncRNA HOTAIR与MT HOTAIR 11短片段两端分别修饰上了荧光基团FAM与猝灭基团BHQ1(分别记为FQ lncRNA HOTAIR与FQ MT HOTAIR 11)，并利用荧光动力学证实了TtAgo酶的特异性切割功能。如图2，b所示，FQ lncRNA HOTAIR经TtAgo酶特异性切割导致FAM与BHQ1分离，产生明显的荧光信号，而单碱基突变的FQ MT HOTAIR 11几乎无法检测到荧光信号。
实施例2、聚合酶联合切刻内切酶启动EXPAR研究
常规的Vent exo-聚合酶或Bst聚合酶(大片段)与Nt.BstNBI切刻内切酶构成的EXPAR体系无法在超过65℃的中高温条件下工作。为了寻找合适的DNA聚合酶与内切酶候选者，我们首先筛选出了一批能耐高温的3种DNA聚合酶(Bst 2.0聚合酶，Bst 3.0聚合酶以及Vent exo-聚合酶)与3种切刻内切酶(Nb.BsrDI，Nb.BtsI以及Nb.BsmI)。根据切刻内切酶的识别位点，我们设计了三种针对lncRNA HOTAIR trigger序列的EXPAR模板，分别为Temp-HTR 1(用于Nb.BsrDI)、Temp-HTR2(用于Nb.BtsI)、Temp-HTR3(用于Nb.BsmI)。令人惊喜的是，Bst 2.0聚合酶与Bst 3.0聚合酶同各自的切刻内切酶组合在66℃条件下均成功地启动了EXPAR反应。为了便于评价各种组合的检测性能，引入了目标信号ct值与空白信号ct值间的差异(Diff)作为评价指标。图2，c显示了Bst 2.0聚合酶同切刻内切酶Nb.BsrDI组合时引发的EXPAR反应，此时1pM的trigger目标物与空白有明显区分(Diff＝22.365±2.172min)。如图2，d所示，Bst 2.0聚合酶组合相较于Bst 3.0聚合酶组合的Diff更大，说明Bst2.0聚合酶组合引发的EXPAR反应性能更为优越。而Vent exo-聚合酶与三种耐高温的切刻内切酶均不兼容，未能引发正常的EXPAR扩增。
实施例3、TtAgo-EXPAR可行性研究
基于前期TtAgo蛋白酶切活性与EXPAR可行性研究的基础上。然而，当我们将TtAgo蛋白与EXPAR体系整合时，Bst 2.0聚合酶组却无法进行EXPAR扩增(数据未显示)，这或许是由于TtAgo蛋白与Bst 2.0聚合酶不兼容。令人惊讶的是，在TtAgo-EXPAR体系中，Bst3.0聚合酶虽与Nb.BsrDI以及Nb.BsmI切刻内切酶未能成功引发EXPAR扩增，但却与Nb.BtsI兼容并展现出强大的检测性能。如图3，a示，1pM lncRNA HOTAIR(曲线5)与空白背景(曲线6)的Diff值为65.798±0.993min。据我们所知，其区分能力是目前已报道的EXPAR体系中检测同目标物浓度最高的。而无TtAgo时，该EXPAR体系几乎无法检测1pM的目标物(曲线1与曲线2，trigger代替lncRNA HOTAIR片段用于检测)，说明TtAgo酶在TtAgo-EXPAR体系中除了起特异性切割目标RNA的作用外还具有抑制EXPAR非特异性扩增的能力。由于TtAgo-EXPAR体系中存在极高热稳定性单链结合蛋白(ET SSB)，而已有文献报道ET SSB同样具有抑制EXPAR非特异性扩增的能力，因此我们将其从TtAgo-EXPAR体系中去除以更好了解TtAgo在该反应体系中的作用。图3，a的曲线3与曲线4间的Diff值为15.695±0.233min，表明去除ET SSB会降低TtAgo-EXPAR的检测性能。因此TtAgo-EXPAR的非特异性背景滞后现象是TtAgo蛋白与ET SSB共同作用的结果，这种滞后现象除了增加目标物的识别能力外还可提高体系的检测灵敏度。
值得注意的是，TtAgo-EXPAR的背景(曲线6)与目标物动力学曲线(曲线5)明显存在着一高一低之分(平衡时信号强度差异近6倍)，而TtAgo或ET SSB单独存在时并不存在这种特殊的EXPAR扩增现象。通过三组曲线的对比(曲线1与曲线2均平衡信号强度较高，曲线3与曲线4均平衡信号强度较低，而曲线5与曲线6平衡信号强度一低一高)，我们推测这种现象可能是由于TtAgo的参与引起的。综上，当TtAgo与Bst 3.0聚合酶和Nb.BtsI切刻内切酶构成的TtAgo-EXPAR检测体系对目标RNA检测时，TtAgo特异性切割目标物产生trigger序列并引发后续的EXPAR反应在较低信号强度处平衡，而TtAgo与ET SSB共同协同抑制了EXPAR的非特异性扩增，使背景滞后并在较高信号强度处平衡。
此外，我们应用PAGE电泳对TtAgo-EXPAR体系反应1h后的可行性进行了验证。如图3，b所示，当目标物存在且TtAgo-EXPAR各成分完整时，泳道7观察到大量的约22nt的指数扩增产物，同时部分产物与EXPAR模板互补形成双链，导致模板所在条带消失。而无目标物时，除了模板所在条带，泳道6无任何扩增产物，表明TtAgo-EXPAR反应体系能对目标物的有无进行明显区分。当仅缺少TtAgo时仍会启动EXPAR的非特异性扩增，其扩增产物不均一，呈梯度状条带(泳道5)。引导核酸gDNA直接影响着TtAgo-gDNA复合物的形成及靶向切割。因此当其缺少时，TtAgo酶无法切割目标物产生trigger序列，从而无法启动EXPAR反应。值得注意的是，此状态下无法观察到由EXPAR非特异性扩增产生的梯度条带(泳道4)，表明非特性扩增的抑制无需TtAgo形成TtAgo-gDNA复合物。当同时缺少TtAgo与gDNA HTR时，剩余成分恰好构成单纯的EXPAR体系。由于非特异性扩增情况的存在，泳道3观察到梯度条带，这进一步证明TtAgo蛋白具有抑制非特异性反应的能力。当EXPAR的反应核心蛋白DNA聚合酶与切刻内切酶缺少时，自然也无法启动TtAgo-EXPAR反应，因此无法观察到任何扩增条带(泳道2)。PAGE电泳的结果进一步有力地证实了TtAgo-EXPAR设计的可行性。
实施例4、TtAgo-EXPAR反应条件优化
我们对TtAgo-EXPAR的重要实验参数进行了优化，包括反应温度、TtAgo与gDNA的比例、聚合酶以及切口酶用量。结果如图4所示，TtAgo-EXPAR反应优化条件分别为：反应体系最佳温度为66℃；TtAgo与gDNA的是摩尔比为1∶1；每10微升反应体系中，Bst 3.0 DNA聚合酶量为0.2U；NbBtsI切刻内切酶最优量是5U。
实施例5、TtAgo-EXPAR介导的RNA超灵敏一步检测
HOTAIR是最近发现的一种长链非编码RNA，参与基因调控、染色质动力学并在多种肿瘤中过量表达，为一种潜在的肿瘤早期诊断标志物。在优化的实验条件下，通过检测不同浓度的lncRNA HOTAIR片段评估了TtAgo-EXPAR的分析性能。图5，a为TtAgo-EXPAR对lncRNAHOTAIR片段检测的一系列实时荧光曲线。样品稀释浓度范围为1aM至100pM。从图中可得出，TtAgo-EXPAR能够于100min内，在10μL的反应体系中重复地检测到低至20aM的lncRNAHOTAIR(图5，a)。值得注意的是，TtAgo-EXPAR的检测限与实时定量的逆转录PCR类似。TtAgo-EXPAR的这种超灵敏检测能力应该归功于TtAgo的周转酶性质、EXPAR的高扩增效率以及TtAgo与ET SSB的协同抑制非特异性扩增综合作用结果。
实施例6、TtAgo-EXPAR对不同细胞内lncRNA HOTAIR定量检测
此外，我们也研究了该RNA检测方法对实际lncRNA样品检测的适用性。lncRNA样本提取于人乳腺癌细胞(MCF-7)、宫颈癌细胞(HeLa)、胰腺癌细胞(AsPC-1)以及前列腺癌细胞(22Rv1)。分别使用TtAgo-EXPAR以及实时定量逆转录PCR进行4种lncRNA样本的lncRNAHOTAIR定量检测。如图5，c所示，回归分析显示TtAgo-EXPAR检测结果同实时定量逆转录PCR检测结果有很好地一致性，表明所提出的TtAgo-EXPAR方法具有准确检测实际样本中lncRNA的能力。
实施例7、TtAgo-EXPAR对SARS-CoV-2N基因RNA定量检测
目前，新型冠状病毒SARS-CoV-2仍然呈世界流行。为了降低新冠肺炎(COVID-19)的传播速度，准确而高效的病毒检测策略势在必行。这里，TtAgo-EXPAR为新型冠状病毒的超灵敏准确检测提供了新的方法。
将含有SARS-CoV-2N基因的质粒线性化后利用T7 RNA聚合酶产生了大量的SARS-CoV-2N基因RNA(1260nt)，并以其作为检测目标物。设计了一条引导核酸gDNA SCN以及EXPAR模板Temp-SCN用于特异性靶向扩增检测SARS-CoV-2RNA。如图5，d所示，TtAgo-EXPAR可以检测到至少50aM的SARS-CoV-2RNA。该检测限与lncRNA HOTAIR检测限略有差异，这可能是由于不同EXPAR模板扩增性能差异引起的。TtAgo-EXPAR对新型冠状病毒RNA的超灵敏检测，进一步证明了该技术优越的通用性。
实施例8、TtAgo-EXPAR对RNA单核苷酸变异特异性检测
鉴于TtAgo蛋白在识别靶RNA中的低错配耐受性，尤其是在切刻位点附近的序列中更为明显，因此研究了TtAgo-EXPAR对单核苷酸错配的区分能力。随之，我们制备了一系列携带有单碱基突变的lncRNA HOTAIR片段(表2)。靶向并扩增野生型lncRNA HOTAIR片段的gDNA HTR与Temp-HTR2用于TtAgo-EXPAR反应。特异性指数(Specificity index)是TtAgo-EXPAR对lncRNA HOTAIR片段检测Diff值与单碱基突变lncRNA HOTAIR片段检测Diff值的比值。图6，a，b显示的是TtAgo-EXPAR检测不同突变位置lncRNA HOTAIR片段的特异性指数，位于第五至第十三核苷酸之间的单核苷酸突变均呈现出较好的区分效果并且第十一个核苷酸位置的特异性最高。与CRISPR相关核酸酶相比(更容易识别PAM位点及其附近的几个碱基突变)，这种较宽范围单核苷酸区分能力与TtAgo蛋白自身的高RNA单碱基区分特性息息相关。值得注意的是，单独TtAgo蛋白几乎可以阻止第四至第十一之间任意位置单个错配的RNA切割，而TtAgo-EXPAR的区分位置相比之下略向右偏移，这或许与EXPAR对TtAgo的切割产物trigger序列(尤其是3端突变的trigger)也存在一定的特异性识别有关。基于TtAgo-EXPAR的单核苷酸识别检测结果，我们建议，为了充分发挥该方法的特异性识别能力，核苷酸突变位置应选定为gDNA第十一个碱基识别位点，再设计对应的gDNA与EXPAR模板序列。
实施例9、TtAgo-EXPAR对致癌基因KRAS mRNA G12D突变检测
基于TtAgo-EXPAR区分单核苷酸差异的优势，应用TtAgo-EXPAR进一步检测常见致癌基因KRAS mRNA G12D突变。该突变发生于第2外显子的12号密码子：野生型GGT(编码甘氨酸)突变为GAT(天冬氨酸；G12D–c.35G>A)。野生型KRAS mRNA(WT KRAS mRNA)与突变型KRASG12D mRNA提取于人前列腺癌细胞(22Rv1)和人胰腺癌细胞(AsPC-1)。两细胞的KRAS基因经PCR放大后利用一代测序证实其基因型。KRAS-G12DmRNA与WT KRAS mRNA样本以一定比例混合，得到一系列含不同浓度的突变型KRAS-G12D mRNA样本(0％至5％)。
根据上述TtAgo-EXPAR特异性识别设计的建议，我们将KRAS-G12D mRNA的突变A碱基作为gDNA的第十一位识别位点，并随之设计了针对该突变mRNA的引导核酸gDNA KRAS-G12D与模板Temp-KRAS-G12D。TtAgo-EXPAR对混合样本中KRAS-G12D mRNA检测原理如图6，C所示；如图6，d所示，TtAgo-EXPAR能够在大量的野生型WT KRAS mRNA中检测低至0.1％的KRAS-G12D mRNA，这一结果表明TtAgo-EXPAR的特异性识别性能优于一些已报道方法，如RNA直接测序，RT-qPCR以及基于CRISPR的高灵敏酶性报告解锁SHERLOCKv2技术。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院
<120> 基于Argonaute蛋白和指数扩增一步检测长链RNA的试剂盒及检测方法及应用
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Claims (7)

1.基于Argonaute蛋白和指数扩增的试剂盒在一步检测长链RNA含量或长链RNA突变位点中的应用，所述应用用于非诊断目的，其特征在于：所述试剂盒包括TtAgo蛋白、特异识别靶标长链RNA的gDNA，指数扩增模板、DNA聚合酶Bst 3.0、切刻内切酶Nb.BtsI、极高热稳定性单链结合蛋白、dNTP和荧光染料；
所述指数扩增模板由中心的切刻内切酶Nb.BtsI识别位点连接的两端互补于trigger序列的重复序列构成，所述trigger序列为靶标长链RNA被TtAgo蛋白切割后的3’端序列至少10个序列；所述gDNA的长度≥16 nt。
2.根据权利要求1所述基于Argonaute蛋白和指数扩增的试剂盒在一步检测长链RNA含量或长链RNA突变位点中的应用，其特征在于：所述gDNA的5’端和3’端进行磷酸化修饰；所述指数扩增模板的3’端进行C3spacer修饰。
3.根据权利要求1所述基于Argonaute蛋白和指数扩增的试剂盒在一步检测长链RNA含量或长链RNA突变位点中的应用，其特征在于：
所述靶标长链RNA为LncRNA HOTAIR，所述LncRNA HOTAIR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述gDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述指数扩增模板的核苷酸序列如SEQID NO.6所示，扩增产物trigger序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
或，所述靶标RNA为KRAS mRNA G12D，所述指数扩增模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述gDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
或，所述靶标RNA为新型冠状病毒SARS-CoV-2，所述指数扩增模板的核苷酸序列如SEQID NO.11所示，所述gDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
4.根据权利要求1所述基于Argonaute蛋白和指数扩增的试剂盒在一步检测长链RNA含量或长链RNA突变位点中的应用，其特征在于：所述长链RNA突变位点为单核苷酸突变位点，位于gDNA第五至十三位核苷酸之间。
5.一种检测长链RNA的方法，所述方法用于非诊断目的，其特征在于：将TtAgo蛋白、特异识别靶标长链RNA的gDNA，指数扩增模板、DNA聚合酶Bst 3.0、切刻内切酶Nb.BtsI、极高热稳定性单链结合蛋白、dNTP和荧光染料加入含有待测长链RNA的反应体系中，在65℃~68℃之间，充分反应，根据荧光信号计算靶标长链RNA的含量；
反应中核酸gDNA识别并与靶标RNA互补杂交，引导TtAgo蛋白在靶标RNA序列上发生特异性切割并产生含trigger序列的片段，继而在指数扩增模板、DNA聚合酶和内切酶存在下引发指数扩增反应；所述指数扩增模板由中心的切刻内切酶Nb.BtsI识别位点以及两端互补于trigger序列的重复序列构成，与trigger序列杂交，并在DNA聚合酶Bst 3.0作用下延伸形成双链DNA，切刻内切酶Nb.BtsI识别并切割该双链DNA后，再经DNA聚合酶Bst 3.0置换作用产生新的trigger序列，经过不断地延伸、切割、置换循环，产生大量可检测产物，并通过荧光染料指示信号输出，从而实现对目标物的一步快速定量检测。
6.根据权利要求5所述检测长链RNA的方法，其特征在于：所述反应体系中TtAgo与gDNA的摩尔比为1：1；每10微升反应体系中，Bst 3.0 DNA聚合酶量为0.2 U，NbBtsI切刻内切酶的量为5 U。
7.根据权利要求5所述检测长链RNA的方法，其特征在于：所述反应的时间控制在100分钟以内。
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