JP7006873B2 - 突然変異細胞遊離遺伝子分離キット及びそれを用いた突然変異細胞遊離遺伝子分離方法 - Google Patents
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Description
5’末端が保護されたプライマーを含む野生型細胞遊離遺伝子(wild type cell free DNA)及び突然変異細胞遊離遺伝子増幅用組成物;前記野生型細胞遊離遺伝子特異的ガイドRNA;前記野生型細胞遊離遺伝子を切断するためのCasタンパク質;及び前記野生型細胞遊離遺伝子を除去するためのエキソヌクレアーゼ。
i)少なくとも1つの野生型細胞遊離遺伝子及び少なくとも1つの突然変異細胞遊離遺伝子が含まれた分離された試料内の前記野生型細胞遊離遺伝子と突然変異細胞遊離遺伝子とを5’末端が保護されたプライマーを用いて増幅する段階;ii)前記野生型細胞遊離遺伝子に特異的に結合するガイドRNA及びCasタンパク質を処理して、前記増幅された野生型細胞遊離遺伝子のみを切断する段階;iii)前記突然変異細胞遊離遺伝子と、前記切断された細胞遊離遺伝子と、が存在する試料にエキソヌクレアーゼを処理して、前記切断された野生型細胞遊離遺伝子のみを除去する段階;iv)前記試料内に残っている突然変異細胞遊離遺伝子を増幅する段階;及びv)前記増幅された突然変異細胞遊離遺伝子を分析する段階。
前記突然変異細胞遊離遺伝子は、癌特異的な突然変異を含むDNAでもある。
前記突然変異細胞遊離遺伝子分析は、癌の診断のための情報を提供するためのものである。
前記癌は、初期癌でもある。
前記癌は、例えば、扁平細胞癌(squamous cell cancer、例えば、上皮の扁平細胞癌)、小型細胞肺癌、非小型細胞肺癌、肺癌、腹膜癌、結腸癌、胆道腫瘍、鼻咽頭癌、喉頭癌、気管支癌、口腔癌、骨肉腫、胆嚢癌、腎臓癌、白血病、膀胱癌、黒色腫、脳癌、神経膠腫、脳腫瘍、皮膚癌、膵臓癌、乳癌、肝癌、骨髓癌、食道癌、大腸癌、胃癌、子宮頸部癌、前立腺癌、卵巣癌、頭頸部癌、及び直腸癌からなる群から選択された1種以上であり得るが、これに限定されるものではない。
N末端にHisx6標識(tag)を含んでいる組換え化膿性連鎖球菌Cas9(streptococcus pyogenes Cas9、spCas9)のタンパク質発現のために、spCas9遺伝情報(Hisx6を含んだタンパク質の全体配列、配列番号1)を有しているプラスミド(plasmid)を感応細胞(Competent cell)であるBL21-DE3種に形質転換を実施した。前記形質転換されたBL21-DE3が増殖している液体培地にIPTG(Isopropyl b-D-ThioGalactoside)を処理した後、18℃で16時間培養した。細胞を5000xgで15分間遠心分離した後、NaH2PO4 50mM(pH8)、NaCl 400mM、イミダゾール(imidazole)10mM、PMSF 1mM、DTT 1mM、トリトンX-100(Triton X-100)1%、リゾチーム(lysozyme)1mg/mlを含んだ溶解緩衝液(lysis buffer)で細胞を融解させた。超音波粉砕機を用いて細胞を粉砕した後、15000xg 30分間遠心分離して、上澄み液と細胞滓とを分離した。上澄み液にニッケル-ニトリロ三酢酸レジン(Ni-NTA resin、Invitrogen、Carlsbad、CA)を添加して、4℃で1時間反応させた後、NaH2PO4 50mM(pH8)、NaCl 400mM、イミダゾール20mMの洗浄緩衝液(wash buffer)でNi-NTAレジンを2回繰り返して洗浄した。最後に、当該レジンにNaH2PO4 50mM(pH8)、NaCl 400mM、イミダゾール250mMの溶出緩衝液(elution buffer)を添加することにより、spCas9をNi-NTAレジンから分離した。spCas9が含まれた緩衝液をamicon ultra centrifugal filterを用いてHEPES 20mM(pH7.5)、NaCl 400mM、DTT 1mM、グリセロール(glycerol)40%を含む緩衝液に置き換えた。
T7プロモーター及びガイドRNA情報が含まれているDNA鋳型とT7 RNA重合酵素とを40mM Tris-HCl(pH7.9)、6mM MgCl2、10mM DTT、10mM NaCl、2mM スペルミジン(spermidine)、NTP、そして、Rnase阻害剤が含まれた緩衝液で37℃で18時間反応させることにより、インビトロ(in vitro)でガイドRNAを合成した(配列番号2及び配列番号3)。合成されたガイドRNAは、RNA精製キットを使用して精製した。
前記実施例1によって分離精製された500ng SpCas9(以下、Cas9と表示)と前記実施例2によって製造された100ng ガイドRNAとを37℃で5分間結合させ、酢酸カリウム(Potassium acetate)50mM(pH7.9)、トリス-酢酸(Tris-acetate)20mM、酢酸マグネシウム(Magnesium acetate)10mM、DTT 1mMで構成された緩衝液で150ng 二本鎖DNA(dsDNA)である野生型KRAS遺伝子(配列番号4)及び突然変異KRAS遺伝子(KRAS D12V、配列番号6)と37℃で60分間反応させた。KRAS遺伝子及びアミノ酸配列情報は、次の表1のようである。
野生型細胞遊離遺伝子が選択的に切断され、このような選択的切断がエキソヌクレアーゼによって選択的に進行することを確認するための実験を実施した。
標的DNAのみを選択的に除去した時、微量で存在する遺伝子をシーケンシングの結果で確認した。この際、微量遺伝子に対する検出限界を確認するために、wtDNAとmtDNAとを互いに異なる比率で混ぜて、実験を進行した。両先端がホスホロチオエート結合で保護されたwtKRAS DNAとmtKRAS DNAとを90:10(wtDNA ratio 90%;mtDNA ratio 10%)、99:1(wtDNA ratio 99%;mtDNA ratio 1%)、99.9:0.1(wtDNA ratio 99.9%;mtDNA ratio 0.1%)、99.99:0.01(wtDNA ratio 99.99%;mtDNA ratio 0.01%)、99.999:0.001(wtDNA ratio 99.999%;mtDNA ratio 0.001%)の比率で混ぜ、Casとエキソヌクレアーゼとを処理した後、最終的に得たサンプルに対するシーケンシングを実施した(図4参照)。
下記の方法によって、マルチプレックスシステムを利用した多様な標的DNAの除去を確認した。EGFR配列は、次の表3のようである。
KRAS遺伝子とEGFR遺伝子とに該当するwtDNAとmtDNAとを互いに異なる比率で混ぜたDNAサンプルを用いてマルチプレクシングシステムの検出限界をNGS分析を通じて確認した。両先端がホスホロチオエート結合で保護されたwtKRAS DNA、wtEGFR DNAとmtKRAS DNA、mtEGFR DNAとを90:10(KRAS mtDNA ratio:10%、EGFR mtDNA ratio:10%、wtKRAS DNA ratio及びwtEGFR DNA ratioは、それぞれ90%)、99:1(KRAS mtDNA ratio:1%、EGFR mtDNA ratio:1%、wtKRAS DNA ratio及びwtEGFR DNA ratioは、それぞれ99%)、99.9:0.1(KRAS mtDNA ratio:0.1%、EGFR mtDNA ration:0.1%、wtKRAS DNA ratio及びwtEGFR DNA ratioは、それぞれ99.9%)、99.99:0.01(KRAS mtDNA ratio:0.01%、EGFR mtDNA ratio:0.01%、wtKRAS DNA ratio及びwtEGFR DNA ratioは、それぞれ99.99%)、99.999:0.001(KRAS mtDNA ratio:0.001%、EGFR mtDNA ratio:0.001%、wtKRAS DNA ratio及びwtEGFR DNA ratioは、それぞれ99.999%)の比率で混ぜ、Cas9とエキソヌクレアーゼとを処理した後、最終的に得たサンプルをシーケンシングした。
<1>5’末端が保護されたプライマーを含む野生型細胞遊離遺伝子及び突然変異細胞遊離遺伝子増幅用組成物と、
前記野生型細胞遊離遺伝子特異的ガイドRNAと、
前記野生型細胞遊離遺伝子を切断するためのCasタンパク質と、
前記野生型細胞遊離遺伝子を除去するためのエキソヌクレアーゼと、
を含む、突然変異細胞遊離遺伝子分離用キット。
<2>前記突然変異細胞遊離遺伝子は、癌特異的な突然変異を含むDNAであり、
前記キットは、癌の疑い個体から分離された血液、血しょうまたは尿試料に含まれた野生型細胞遊離遺伝子及び突然変異細胞遊離遺伝子から突然変異細胞遊離遺伝子を分離する、前記<1>に記載の突然変異細胞遊離遺伝子分離用キット。
<3>前記Casタンパク質は、Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)、Streptococcus thermophilus Cas9(StCas9)、Streptococcus pasteurianus(SpaCas9)、Campylobacter jejuni Cas9(CjCas9)、Staphylococcus aureus(SaCas9)、Francisella novicida Cas9(FnCas9)、Neisseria cinerea Cas9(NcCas9)、Neisseria meningitis Cas9(NmCas9)Prevotella とFrancisella 1(Cpf1)である、前記<1>に記載の突然変異細胞遊離遺伝子分離用キット。
<4>前記ガイドRNAは、crRNA及びtracrRNAを含む二重RNAまたはsgRNAである、前記<1>に記載の突然変異細胞遊離遺伝子分離用キット。
<5>前記ガイドRNAは、複数個の野生型細胞遊離遺伝子特異的な2種類以上のガイドRNAを含む、前記<1>に記載の突然変異細胞遊離遺伝子分離用キット。
<6>前記5’末端が保護されたプライマーは、前記プライマーの5’末端がホスホロチオエート結合で保護されたものであり、前記遺伝子増幅用組成物は、PCR組成物である、前記<1>に記載の突然変異細胞遊離遺伝子分離用キット。
<7>i)少なくとも1つの野生型細胞遊離遺伝子及び少なくとも1つの突然変異細胞遊離遺伝子が含まれた分離された試料内の前記野生型細胞遊離遺伝子と突然変異細胞遊離遺伝子とを5’末端が保護されたプライマーを用いて増幅する段階と、
ii)前記野生型細胞遊離遺伝子に特異的に結合するガイドRNA及びCasタンパク質を処理して、前記増幅された野生型細胞遊離遺伝子のみを切断する段階と、
iii)前記突然変異細胞遊離遺伝子と、前記切断された細胞遊離遺伝子と、が存在する試料にエキソヌクレアーゼを処理して、前記切断された野生型細胞遊離遺伝子のみを除去する段階と、
iv)前記試料内に残っている突然変異細胞遊離遺伝子を増幅する段階と、
v)前記増幅された突然変異細胞遊離遺伝子を分析する段階と、
を含む、突然変異遺伝子型分析方法。
<8>前記i)少なくとも1つの野生型細胞遊離遺伝子及び少なくとも1つの突然変異細胞遊離遺伝子が含まれた分離された試料は、癌の疑い個体から分離された血液、血しょうまたは尿試料である、前記<7>に記載の突然変異遺伝子型分析方法。
<9>前記突然変異細胞遊離遺伝子は、癌特異的な突然変異を含むDNAであり、
前記突然変異細胞遊離遺伝子分析は、癌の診断のための情報を提供する、前記<7>に記載の突然変異遺伝子型分析方法。
<10>前記5’末端が保護されたプライマーは、前記プライマーの5’末端がホスホロチオエート結合で保護された、前記<7>に記載の突然変異遺伝子型分析方法。
<11>前記Casタンパク質は、Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)、Streptococcus thermophilus Cas9(StCas9)、Streptococcus pasteurianus(SpaCas9)、Campylobacter jejuni Cas9(CjCas9)、Staphylococcus aureus(SaCas9)、Francisella novicida Cas9(FnCas9)、Neisseria cinerea Cas9(NcCas9)、Neisseria meningitis Cas9(NmCas9)Prevotella とFrancisella 1(Cpf1)である、前記<7>に記載の突然変異遺伝子型分析方法。
<12>前記ガイドRNAは、crRNA及びtracrRNAを含む二重RNAまたはsgRNAである、前記<7>に記載の突然変異遺伝子型分析方法。
<13>前記増幅は、PCRで行われる、前記<7>に記載の突然変異遺伝子型分析方法。
Claims (8)
- i)少なくとも1つの野生型細胞遊離遺伝子及び少なくとも1つの突然変異細胞遊離遺伝子が含まれた分離された試料内の前記野生型細胞遊離遺伝子と突然変異細胞遊離遺伝子とを、予めホスホロチオエート結合で保護された5’末端を有する5’末端が保護されたプライマーを用いて最初に増幅する段階と、
ii)前記野生型細胞遊離遺伝子に特異的に結合するガイドRNA及びCasタンパク質を処理して、前記増幅された野生型細胞遊離遺伝子のみを切断する段階と、
iii)前記突然変異細胞遊離遺伝子と、前記切断された細胞遊離遺伝子と、が存在する試料をエキソヌクレアーゼT7及びエキソヌクレアーゼTで処理して、前記切断された野生型細胞遊離遺伝子のみを除去する段階と、
iv)前記試料内に残っている突然変異細胞遊離遺伝子をさらに増幅する段階と、
v)前記増幅された突然変異細胞遊離遺伝子を分析する段階と、
を含む、突然変異遺伝子型分析方法。 - 前記i)少なくとも1つの野生型細胞遊離遺伝子及び少なくとも1つの突然変異細胞遊離遺伝子が含まれた分離された試料は、癌の疑い個体から分離された血液、血しょうまたは尿試料である、請求項1に記載の突然変異遺伝子型分析方法。
- 前記突然変異細胞遊離遺伝子は、癌特異的な突然変異を含むDNAであり、
前記突然変異細胞遊離遺伝子の分析は、癌の診断のための情報を提供する、請求項1に記載の突然変異遺伝子型分析方法。 - 前記Casタンパク質は、Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)、Streptococcus thermophilus Cas9(StCas9)、Streptococcus pasteurianus(SpaCas9)、Campylobacter jejuni Cas9(CjCas9)、Staphylococcus aureus(SaCas9)、Francisella novicida Cas9(FnCas9)、Neisseria cinerea Cas9(NcCas9)、Neisseria meningitis Cas9(NmCas9)Prevotella とFrancisella 1(Cpf1)である、請求項1に記載の突然変異遺伝子型分析方法。
- 前記ガイドRNAは、crRNA及びtracrRNAを含む二重RNAまたはsgRNAである、請求項1に記載の突然変異遺伝子型分析方法。
- 前記増幅は、PCRで行われる、請求項1に記載の突然変異遺伝子型分析方法。
- 前記ガイドRNAが、複数の野生型細胞遊離遺伝子に特異的な2以上のガイドRNAを含む、請求項1に記載の突然変異遺伝子型分析方法。
- 予めホスホロチオエート結合で保護された5’末端を有する5’末端が保護されたプライマーを含む野生型細胞遊離遺伝子及び突然変異細胞遊離遺伝子増幅用組成物と、
前記野生型細胞遊離遺伝子に特異的なガイドRNAと、
前記野生型細胞遊離遺伝子を切断するためのCasタンパク質と、
前記野生型細胞遊離遺伝子を除去するためのエキソヌクレアーゼT7及びエキソヌクレアーゼTと、
を含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の突然変異遺伝子型分析方法に使用するための、突然変異細胞遊離遺伝子分離用キット。
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