ES2962531T3 - Método y kit de aislamiento de ADN mutante libre de células - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a un kit de aislamiento de ADN libre de células mutantes y a un método de análisis de ADN libre de células mutantes, ambos utilizando un sistema CRISPR/Cas y una exonucleasa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método y kit de aislamiento de ADN mutante libre de células
[Campo técnico]
La presente divulgación se refiere a un kit de aislamiento de ADN mutante libre de células y a un método de análisis de genotipo mutante. Más particularmente, la presente divulgación se refiere a un kit de aislamiento de ADN mutante libre de células y a un método de análisis de genotipo mutante, que usan ambos un sistema de CRISPR-Cas y una exonucleasa, para detectar un ADN mutante en una cantidad traza de una muestra de ADN libre de células.
[Antecedentes de la técnica]
Recientemente, la importancia del diagnóstico precoz de enfermedades cancerosas está emergiendo globalmente. Por lo tanto, están aumentando las investigaciones sobre métodos para el diagnóstico temprano del cáncer. Sin embargo, los métodos de diagnóstico de cáncer actuales son principalmente métodos invasivos tales como extracción de muestras de tejido, endoscopia, etc. Debido a que los métodos existentes implican la extracción de una parte sospechosa de una enfermedad y la observación con un microscopio, no son ventajosos en cuanto a molestias para el paciente, cicatrización y largo tiempo de recuperación.
Como alternativa al diagnóstico invasivo y los métodos de prueba existentes, el diagnóstico molecular usando biopsia líquida está atrayendo la atención. Debido a que la biopsia líquida usa un método no invasivo, el resultado de la prueba se puede adquirirse rápidamente y es posible un análisis múltiple de la enfermedad con un fluido corporal, o una muestra de biopsia líquida, a diferencia de la muestra de tejido que permite solo un análisis parcial. En particular, se espera que la biopsia líquida muestre una eficacia excelente en el diagnóstico del cáncer. También se espera que puedan observarse carcinogénesis, metástasis, etc. en detalle a través del análisis de los ADN derivados de células cancerosas existentes en un fluido corporal tal como sangre, orina, etc.
Recientemente, en el contexto de la biopsia líquida, se estudian activamente ADN libres de células (ADNlc) que se liberan de los tumores al torrente sanguíneo y que existen en la sangre. Con el avance en las tecnologías de aislamiento y detección de ADNlc de diversas muestras biológicas tales como sangre, plasma, orina, etc., la biopsia líquida se convertirá en una herramienta más eficaz y confiable para la monitorización de pacientes que se sospecha que tienen cáncer. Se identificaron ADNlc derivados de cáncer en el 75 % o más de los pacientes con cáncer pancreático progresivo, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de vejiga, cáncer gastroesofágico, cáncer de mama, melanoma, carcinoma hepatocelular y cáncer de cabeza y cuello, y en el 50 % o más de los pacientes con cáncer de riñón, cáncer de próstata o cáncer de tiroides. En el diagnóstico clínico genético para pacientes con cáncer de colon metastásico, el ADNlc mostró un 87,2 % de sensibilidad y un 99,2 % de especificidad de mutaciones de ADN KRAS.
Dado que estas investigaciones muestran la posibilidad de diagnóstico de cáncer a través del análisis de ADNlc, un ADN derivado de cáncer en ADNlc está atrayendo la atención como biomarcador de última generación. Se diagnostica un tumor en fase inicial identificando la mutación de ADN específica de tumor a partir de ADNlc derivado de un paciente con cáncer. Sin embargo, existen muchas limitaciones técnicas en el diagnóstico temprano del cáncer a través de la detección de la mutación del ADN mediante el análisis del ADNlc en una muestra líquida tal como sangre, orina, etc. (documento de patente 1). En particular, existe ADNlc en una muestra de orina, líquido cefalorraquídeo, plasma, sangre o fluido corporal a una concentración muy baja y la mutación del ADN puede producirse de manera natural con el envejecimiento del ADNlc. Debido a que la mayor parte del ADNlc presente en el plasma de un paciente es un ADN de tipo silvestre (wt) derivado de una célula somática normal, es casi imposible diagnosticar con precisión la presencia de un ADN derivado de células cancerosas a partir de ADNlc con la tecnología de secuenciación actual. Por lo tanto, para diagnosticar el cáncer en la fase temprana con una cantidad traza de ADNlc, es necesario eliminar los ADN normales y amplificar específicamente el<a>D<n>derivado de células cancerosas. Por lo tanto, es necesario un método para mejorar la sensibilidad de detección y permitir un diagnóstico temprano preciso del cáncer.
Mientras tanto, la edición genómica desarrollada actualmente basada en una endonucleasa (Cas) asociada a repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR) proporciona una tecnología innovadora para la inactivación de genes diana, la activación transcripcional y la corrección génica. Esta tecnología demuestra capacidad de expansión al dirigirse a numerosas ubicaciones en el ADN. El sistema de CRISPR-Cas está compuesto por un ARN guía (ARNg) que tiene una secuencia complementaria a un ADN o ácido nucleico diana) y la enzima CRISPR, que es una nucleasa capaz de escindir el ADN o ácido nucleico diana. El ARNg y la enzima CRISPR forman el complejo CRISPR-Cas, y el complejo CRISPR-Cas formado escinde o modifica el<a>D<n>o ácido nucleico diana. El sistema de CRISPR se ha estudiado recientemente mucho con respecto a su aplicabilidad como tijeras de ADN, como sistema inmunitario de procariotas y arqueas (documento no de patente 1, documento no de patente 2). Sin embargo, no se ha intentado usarlo para la captura de la secuencias de bases usada en la secuenciación del genoma y el diagnóstico de una enfermedad.
El documento EP 3 150 718 se refiere a un método para analizar un genotipo usando una nucleasa específica de diana y, específicamente, a un método para diagnosticar cáncer o analizar un genotipo eliminando<a>D<n>de tipo silvestre o ADN de genotipo particular usando una nucleasa específica de diana o una variante de la misma para amplificar o concentrar solo una pequeña cantidad de ADN que tiene una diferencia en variación, tal como una mutación, o genotipo, y a un método para separar ADN diana usando una nucleasa específica de diana o una variante de la misma.
S H Leeet al.,“CUT-PCR: CRISPR-mediated, ultrasensitive detection of target DNA using PCR” Oncogene volumen 36, páginas 6823-6829 (2017) da a conocer el método de CUT-PCR para la detección de cantidades muy pequeñas de ADN mutante en muestras de ADN tumoral circulante usando agotamiento mediado por proteína Cas del ADN de tipo silvestre.
El documento WO 2017 218512 da a conocer métodos para enriquecer ácidos nucleicos mutados libres de células para la detección y diagnóstico de cáncer, así como métodos que usan un sistema de CRISPR-Cas para seleccionar como diana y agotar secuencias de ácido nucleico no deseadas más abundantes y libres de células, enriqueciéndose así en secuencias menos abundantes.
W. Guet al.,“Depletion of Abundant Sequences by Hybridization (DASH): using Cas9 to remove unwanted highabundance species in sequencing libraries and molecular counting applications” Genome Biology volumen 17, número de artículo: 41 (2016) dan a conocer un método para eliminar especies de alta abundancia no deseadas antes de la secuenciación por la proteína Cas9 recombinante complejada con una biblioteca de ARN guía que seleccionan como diana especies no deseadas para la escisión, evitando así que consuman espacio de secuenciación.
Chenqiang Jiaet al.,“New applications of CRISPR/Cas9 system on mutant DNA detection”, Gene vol. 641, páginas 55-62 (2017) dan a conocer un sistema de detección de mutaciones de ADN basado en CRISPR/Cas9 que puede detectar la mutación génica de manera eficiente incluso en una condición de baja frecuencia.
Los documentos anteriores de la técnica anterior no comprenden una amplificación inicial del ADN de tipo silvestre y mutante con un cebador protegido en el extremo 5' con un enlace fosfotioato, y una etapa de eliminación del ADN de tipo silvestre escindido por exonucleasa con exonlucleasa T7 y exonucleasa T.
El documento WO2016/100955 da a conocer un método para enriquecer una muestra en secuencias de interés, que comprende: a. proporcionar una muestra que comprende secuencias de interés y secuencias seleccionadas como diana para el agotamiento, en donde las secuencias de interés comprenden menos del 30 % de la muestra; b. poner en contacto la muestra con una pluralidad de complejos de proteína-ARNg del sistema de CRISPR/Cas, en donde los ARNg son complementarios a las secuencias seleccionadas como diana, y por lo cual las secuencias diana se escinden, que comprende además tratar el producto de la etapa (b) con una enzima que tiene actividad exonucleasa. Este documento enseña el uso de exonucleasa 3'-5' y el método divulgado en el presente documento implica el uso de adaptadores 3' que son resistentes a la actividad exonucleasa.
El documento WO 2017/155416 da a conocer un método de selección de ácido nucleico que comprende una etapa de tratamiento con exonucleasa T7, en el que la muestra de ácido nucleico se amplifica previamente con cebadores protegidos con 5'-fosforotioato.
Los inventores de la presente divulgación han hecho esfuerzos para encontrar un método para aislar un ADN mutante del ADNlc. Como resultado, han completado la presente divulgación usando una tecnología para escindir específicamente un ADN normal de una cantidad traza de ADNlc usando el sistema de CRISPR-Cas y una tecnología para amplificar específicamente un ADN mutante.
(Documento de patente 1) Publicación de patente coreana n.° 10-2016-0129523.
(Documento no de patente 1) Jineket al. Science,2012, 337, 816-821.
(Documento no de patente 2) Zalatanet al. Cell,2015, 160, 339-350.
(Documento no de patente 3) Tian J, Ma K, Saaem I.,Mol Biosyst,2009, 5(7), 714-722.
(Documento no de patente 4) Michael, L. Metzker,Nature Reviews Genetics,2010, 11, 31-46.
[Divulgación]
[Problema técnico]
La presente divulgación está dirigida a proporcionar un kit de aislamiento de ADN mutante libre de células.
La presente divulgación también está dirigida a proporcionar un método de análisis de genotipo mutante.
[Solución técnica]
La presente divulgación proporciona un método de análisis de genotipo mutante según la reivindicación 1 y las reivindicaciones dependientes 2-7.
La presente divulgación también proporciona un kit de aislamiento de ADN mutante libre de células según la reivindicación 8.
El ADN mutante libre de células puede ser un ADN que incluye una mutación específica de cáncer.
Como se usa en el presente documento, el término “ADN libre de células (ADNlc)” se refiere a un ADN derivado de células cancerosas que se origina a partir de una célula tumoral y puede encontrarse en una muestra biológica tal como sangre, plasma, orina, etc. derivado de un paciente con cáncer. Se activa en células normales y/o cancerosas necróticas o apoptóticas y se libera en la orina, sangre, etc. a través de diversos procesos citofisiológicos. Debido a que la orina, el líquido cefalorraquídeo (LCR), el plasma, la sangre o el fluido corporal son muestras fácilmente disponibles, puede recogerse en grandes cantidades por medio de un método simple, no invasivo a través de muestreo repetido.
Como se usa en el presente documento, el “sistema de CRISPR-Cas” está compuesto por un ARN guía (ARNg) que tiene una secuencia complementaria a un ADN o ácido nucleico diana y la enzima<c>R<i>SPR, que es una nucleasa capaz de escindir el ADN o ácido nucleico diana. El ARNg y la enzima CRISPR forman el complejo CRISPR-Cas, y el complejo CRISPR-Cas formado escinde o modifica el ADN o ácido nucleico diana.
La proteína Cas es un componente proteico esencial del sistema de CRISPR-Cas. Cuando dos ARN denominados ARN de CRISPR (ARNcr) y el ARNcr transactivador (ARNtracr) forman un complejo, se forma una endonucleasa activada. La información del gen Cas y la proteína está disponible en el GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI), aunque no se limita a los mismos.
Como se usa en el presente documento, el término “ARN guía” se refiere a un ARN específico para un ADN diana, que se sintetiza a través de la transcripción de un ADN bicatenario lineal o síntesis química, es capaz de reconocer una secuencia de ADN diana y formar un complejo con la proteína Cas, y guía la proteína Cas al ADN diana. La “secuencia de ADN diana” es una secuencia de nucleótidos presente en el ADN o ácido nucleico diana. Específicamente, es una porción de una secuencia de nucleótidos en una región diana del ADN o ácido nucleico diana. La “región diana” es una región en el ADN o ácido nucleico diana que puede modificarse mediante un complejo proteico de ácido nucleico guía-editor.
Como se usa en el presente documento, el término “PAM (PAM; motivo adyacente al protoespaciador)” se refiere a una secuencia con un tamaño de aproximadamente 3-6 pb, adyacente a una secuencia diana. Es un componente esencial reconocido por la proteína Cas. El complejo CRISPR-Cas reconoce la secuencia diana y de PAM y escinde una ubicación específica.
El kit puede ser para aislar un ADN mutante libre de células de un ADN de tipo silvestre libre de células y un ADN mutante libre de células contenido en una muestra líquida (sangre, plasma, orina, etc.) aislada de un individuo sospechoso de cáncer.
La proteína Cas puede ser Cas9 deStreptococcus pyogenes(SpCas9), Cas9 deStreptococcus thermophilus(StCas9),Streptococcus pasteurianus(SpaCas9), Cas9 deCampylobacter jejuni(CjCas9),Staphylococcus aureus(SaCas9), Cas9 deFrancisella novicida(FnCas9), Cas9 deNeisseria cinerea(NcCas9), Cas9 deNeisseria meningitis(NmCas9) o endonucleasa asociada a CRISPR enPrevotellayFrancisella1 (Cpf1), aunque no se limita necesariamente a las mismas.
La información sobre la proteína o gen Cas puede obtenerse de una base de datos disponible públicamente tal como GenBank del NCBI (National Center for Biotechnology Information), aunque no se limita a los mismos.
El ARN guía puede ser un ARN doble (ARN doble) o un ARNsg (ARN monocatenario) que incluye un ARNcr (ARN de CRISPR) y un ARNtracr (ARNcr transactivador).
El ARN guía puede incluir dos o más ARN guía específicos para una pluralidad de ADN de tipo silvestre libres de células. Es decir, el kit de la presente divulgación es un kit capaz de multiplexar.
En la técnica se conoce ampliamente un método para preparar el ARN guía.
El cebador protegido en el extremo 5' puede tener el extremo 5' del cebador protegido con un enlace fosfotioato.
La composición para amplificar ADN puede ser una composición de PCR.
En la presente divulgación, el término “reacción de amplificación” se refiere a una reacción mediante la cual se amplifica una secuencia de ácido nucleico diana y puede llevarse a cabo mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa). La PCR incluye reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), PCR multiplexada, PCR en tiempo real, PCR de ensamblaje, PCR de fusión y reacción en cadena de la ligasa (LCR), aunque no se limita a las mismas.
Como se usa en el presente documento, el término “cebador” se refiere a un oligonucleótido monocatenario y también puede incluir un ribonucleótido. Específicamente, puede ser un desoxirribonucleótido. El cebador se hibrida o se aparea con una región de un molde para formar una estructura bicatenaria. En la presente divulgación, el cebador puede hibridarse o aparearse con una secuencia de adaptador de secuenciación NGS. El apareamiento se refiere a la aposición de un oligonucleótido o un ácido nucleico a un ácido nucleico molde. La aposición permite que una polimerasa polimerice un nucleótido, formando así una molécula de ácido nucleico complementaria al ácido nucleico molde o una porción del mismo. La hibridación se refiere a la formación de una estructura de dúplex a través del emparejamiento de dos ácidos nucleicos monocatenarios con secuencias de bases complementarias. El cebador puede servir como punto de partida de la síntesis en una condición en la que se induce la síntesis de un producto de extensión del cebador complementario al molde.
La composición de PCR puede contener, además del cebador protegido en el extremo 5' específico para el ADN de tipo silvestre libre de células y el ADN mutante libre de células, componentes ampliamente conocidos en la técnica. Específicamente, puede contener un tampón de PCR, un dNTP, una ADN polimerasa, etc.
Como se usa en el presente documento, el término “exonucleasa” se refiere a una enzima que escinde un nucleótido secuencialmente desde el extremo 3' o el extremo 5' de una cadena polinucleotídica. La exonucleasa 3' a 5' es una enzima que escinde un enlace fosfodiéster en el extremo 3', y exonucleasa 5' a 3' es una enzima que escinde un enlace fosfodiéster en el extremo 5'.
La exonucleasa puede ser cualquier exonucleasa conocida en la técnica. Específicamente, la exonucleasa puede incluir exonucleasa 3' ^ 5' y/o exonucleasa 5' ^ 3'. Específicamente, puede ser exonucleasa III, exonucleasa I, exonucleasa T5, exonucleasa T7, exonucleasa T, exonucleasa V, exonucleasa lambda, exonucleasa VII, etc. Más específicamente, puede ser exonucleasa T7 o exonucleasa T (nucleasa específica monocatenaria), aunque no se limita necesariamente a las mismas.
Cuando una muestra que contiene un ADN de tipo silvestre libre de células y un ADN mutante libre de células se hace reaccionar con la composición para amplificar el ADN que contiene el cebador protegido en el extremo 5', los extremos del ADN de tipo silvestre libre de células y el ADN mutante libre de células están protegidos con un enlace fosfotioato. Los ADN protegidos no se escinden por una exonucleasa debido al enlace fosfotioato.
Cuando un ADN de tipo silvestre libre de células se escinde por un ARN guía y una proteína Cas específica para el ADN de tipo silvestre libre de células, el extremo no protegido del ácido nucleico se expone a una exonucleasa. A través de esto, se elimina el ADN de tipo silvestre libre de células y solo se aísla el ADN mutante libre de células (figura 1).
En un ejemplo de la presente divulgación, cuando se usó un ARN guía dirigido al gen KRAS, solo el KRAS wt que satisface la secuencia de PAM 5'-NGG-3' se escindió selectivamente por Cas9. Se confirmó a través de electroforesis que el ADN de KRAS wt escindido por Cas9 se eliminó completamente mediante tratamiento con exonucleasa T7 y exonucleasa T.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método de análisis de genotipo mutante que incluye:
i) una etapa de amplificación de un ADN de tipo silvestre libre de células y un ADN mutante libre de células en una muestra aislada que contiene al menos un ADN de tipo silvestre libre de células y al menos un ADN mutante libre de células usando un cebador protegido en el extremo 5';
ii) una etapa de escisión de solo el ADN de tipo silvestre libre de células amplificado mediante el tratamiento con una proteína Cas y un ARN guía que se une específicamente al ADN de tipo silvestre libre de células;
iii) una etapa de eliminar solo el ADN de tipo silvestre libre de células escindido tratando la muestra que contiene el ADN mutante libre de células y el ADN libre de células escindido con una exonucleasa;
iv) una etapa de amplificación del ADN mutante libre de células que queda en la muestra; y
v) una etapa de análisis del ADN mutante libre de células amplificado.
La muestra aislada que contiene al menos un ADN de tipo silvestre libre de células y al menos un ADN mutante libre de células puede ser una muestra de sangre, plasma u orina aislada de un individuo sospechoso de cáncer.
El ADN mutante libre de células puede ser un ADN que incluye una mutación específica de cáncer.
El análisis del ADN mutante libre de células puede ser para proporcionar información para el diagnóstico de cáncer. Como se usa en el presente documento, el término “diagnóstico” incluye la decisión de la susceptibilidad de un sujeto a una enfermedad o trastorno específico, decisión de la presencia de una enfermedad o trastorno específico en un sujeto, decisión del pronóstico de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno específico, o terametría (por ejemplo, monitorización del estado de un sujeto para proporcionar información sobre los efectos terapéuticos).
En la presente divulgación, el diagnóstico puede incluir la identificación de la aparición del cáncer y/o el pronóstico del cáncer.
El cáncer puede ser cáncer en estadio temprano.
El cáncer puede ser, por ejemplo, uno o más seleccionados de un grupo que consiste en carcinoma de células escamosas (por ejemplo, carcinoma de células escamosas del epitelio), carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón, cáncer peritoneal, cáncer de colon, tumor del conducto biliar, cáncer nasofaríngeo, cáncer laríngeo, cáncer broncogénico, cáncer oral, osteosarcoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer de riñón, leucemia, cáncer de vejiga, melanoma, cáncer cerebral, glioma, tumor cerebral, cáncer de piel, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de médula ósea, cáncer esofágico, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de cuello uterino, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cabeza y cuello, y cáncer rectal, aunque no se limita a los mismos.
El cebador protegido en el extremo 5' puede tener el extremo 5' del cebador protegido con un enlace fosfotioato. La proteína Cas podrá ser Cas9 deStreptococcus pyogenes(SpCas9), Cas9 deStreptococcus thermophilus(StCas9),Streptococcus pasteurianus(SpaCas9), Cas9 deCampylobacter jejuni(CjCas9),Staphylococcus aureus(SaCas9), Cas9 deFrancisella novicida(FnCas9), Cas9 deNeisseria cinerea(NcCas9), Cas9 deNeisseria meningitis(NmCas9) o endonucleasa asociada a CRISPR enPrevotellayFrancisella1 (Cpf1), aunque no se limita necesariamente a los mismos.
El ARN guía puede ser un ARN doble (ARN doble) o un ARNsg (ARN monocatenario) que incluye un ARNcr (ARN CRISPR) y un ARNtracr (ARNcr transactivador).
La amplificación puede realizarse por PCR y la condición de PCR puede determinarse basándose en métodos ampliamente conocidos en la técnica.
[Efectos ventajosos]
Un kit de aislamiento de ADN mutante libre de células y un método de aislamiento de ADN mutante libre de células de la presente divulgación usan el sistema de CRISPR-Cas y una exonucleasa, y permiten la eliminación selectiva de ADN derivados de células somáticas normales, que representan la mayor parte del ADNlc (> 99,9 %) en la sangre. Como resultado, debido a que solo puede analizarse ADN mutante libre de células (ADN derivado de células cancerosas) en el ADNlc, puede usarse útilmente para el diagnóstico temprano del cáncer.
Además, el kit de aislamiento de ADN mutante libre de células y el método de aislamiento de ADN mutante libre de células de la presente divulgación proporcionan un efecto de permitir el análisis de una cantidad traza de ADN mutantes libres de células (ADN derivados de células cancerosas) existentes en el ADNlc mediante la eliminación de los ADN normales derivados de células de la muestra.
Además, la presente divulgación permite la detección simultánea de dos o más oncogenes por medio de un sistema de multiplexación debido a un ARN guía específico para una pluralidad de ADN de tipo silvestre.
[Breve descripción de los dibujos]
La figura 1 muestra esquemáticamente un procedimiento de amplificación de ADNmt (ADN mutante) solo eliminando selectivamente ADNwt (ADN de tipo silvestre) de una muestra según la presente divulgación.
Las figuras 2a y 2b muestran el resultado de escindir selectivamente ADNwt en una muestra usando un sistema de CRISPR-Cas según la presente divulgación.
Las figuras 3a y 3b muestran el resultado de que un ADN escindido por el sistema de CRISPR-Cas según la presente divulgación se degrade selectivamente por una exonucleasa.
La figura 4 muestra el resultado del análisis de una muestra con ADNwt de KRAS eliminado mediante tratamiento con un CRISPR-Cas y una exonucleasa según la presente divulgación a través de secuenciación de bases de última generación.
La figura 5 muestra el resultado del análisis de una muestra con ADNwt de KRAS eliminado mediante tratamiento con un CRISPR-Cas y una exonucleasa según la presente divulgación a través de secuenciación de Sanger.
La figura 6 muestra esquemáticamente un procedimiento de amplificación de múltiples ADN derivados de cáncer a la vez mediante la eliminación de múltiples<a>D<n>diana a través de multiplexación mediante el tratamiento con CRISPR-Cas y una exonucleasa según la presente divulgación.
Las figuras 7a y 7b muestran el resultado de confirmar que solo un ADN diana (ADNwt) puede eliminarse selectivamente usando un sistema de multiplexación mediante el tratamiento con un CRISPR-Cas y una exonucleasa según la presente divulgación a través de electroforesis en gel de agarosa.
La figura 8 muestra el resultado del análisis de una muestra con ADNwt de KRAS y ADNwt de EGFR eliminado usando un sistema de multiplexación mediante tratamiento con un CRISPR-Cas y una exonucleasa según la presente divulgación a través de secuenciación de bases de última generación.
La figura 9 muestra esquemáticamente un método de eliminación de ADN usando un sistema de multiplexación y un ortólogo de Cas9 según la presente divulgación.
[Mejor modo]
El sistema de CRISPR-Cas es una endonucleasa con una precisión muy alta, que es capaz de escindir selectivamente un ADN diana. Los ortólogos de Cas9 tienen diferentes secuencias del sitio de PAM. La secuencia de PAM es una secuencia de ADN esencial para el reconocimiento del ADN diana por la proteína Cas9. Incluso cuando se une a un ARN guía perfectamente complementario al ADN diana, el sistema de CRISPR-Cas no funciona a menos que se satisfaga la secuencia de PAM. Y, si el ARN guía tiene muchas secuencias de ADN no complementarias al ADN diana, el CRISPR-Cas no puede reconocer el ADN diana normalmente. Con el fin de identificar un gen de cáncer generado por sustitución de nucleótidos, se diseñó un ARN guía complementario a un ADN de tipo silvestre. El diseño de la diana del ARN guía se basó en gran medida en dos criterios. Si la secuencia de bases antes de la aparición de la sustitución corresponde al sitio de PAM, el ARN guía se diseñó basándose en el sitio de PAM. De lo contrario, si no corresponde al sitio de PAM, se añadió un apareamiento erróneo a la región semilla. La región semilla de Cas9 es una región que responde de manera muy sensible al apareamiento erróneo entre el ARN guía y el ADN diana durante el reconocimiento del ADN diana. Si hay un apareamiento erróneo de 1-2 nt en la región semilla, el ADN diana no se reconoce claramente.
El ARN guía usado en la presente divulgación está diseñado para reconocer el ADN de tipo silvestre selectivamente.
En la presente divulgación, cuando el ADN diana se escindió por Cas9 y luego se amplificó por PCR, la cantidad amplificada fue menor para el ADN de tipo silvestre libre de células escindido por Cas9 que para el ADN mutante libre de células. Sin embargo, el límite de detección para identificar una cantidad traza de<a>D<n>mutante no pudo lograrse con un método simple para escindir el ADN de tipo silvestre con Cas9 y realizar la PCR para el ADN mutante. Debido a que el fragmento del ADN de tipo silvestre escindido por Cas9 puede servir como cebador durante la PCR, puede incluirse una secuencia de ADN derivada del ADN de tipo silvestre en el producto de PCR finalmente amplificado. Los fragmentos de ADN escindidos intensifican la señal de fondo y hacen imposible lograr el límite de detección para identificar la cantidad traza del ADN derivado de cáncer (véase el recuadro del lado izquierdo en la parte inferior de la figura 1).
Sin embargo, en la presente divulgación, los fragmentos escindidos del ADN de tipo silvestre, que generan señales de fondo durante la PCR, se eliminan para proporcionar suficiente capacidad de detección para una cantidad traza del ADN diana. Cuando el ADN diana se amplifica por PCR en el proceso final de análisis de la cantidad traza de ADNlc, se usa un cebador con el extremo 5' protegido con un enlace fosfotioato, o se liga un adaptador que contiene un enlace fosfotioato en ambos extremos de un amplicón de PCR amplificado. Si el enlace fosfodiéster que conecta los nucleótidos se reemplaza con el enlace fosfotioato, una nucleasa no puede escindir los nucleótidos que tienen el enlace.
Si el ADN diana con ambos extremos protegido con el enlace fosfotioato se trata con una exonucleasa, el ADN diana no se degrada por la exonucleasa. Sin embargo, si el ADN diana se escinde por Cas9, se exponen nuevos extremos de ADN no protegidos con fosfotioato a la exonucleasa, y los ADN escindidos por Cas9 se eliminan por la exonucleasa.
Es decir, las tecnologías de escisión y eliminación de ADN en la presente divulgación desempeñan un papel complementario, permitiendo la detección precisa de un ADN derivado de cáncer en una pequeña cantidad de ADNlc, lo que antes no era posible.
En un aspecto de la presente divulgación, se confirmó que un complejo de la proteína SpCas9 y el ARN guía permite la escisión precisa del ADN diana que satisface la secuencia de<p>A<m>de 5'-NGG-3'.
En la presente divulgación, la mutación del gen KRAS es una mutación importante del gen del cáncer, y es un biomarcador importante para el ADNlc. La mutación que se produce con frecuencia de KRAS es el cambio del 12° aminoácido de aspartato a valina debido a la sustitución del 35° ácido nucleico en el ADNc de G a T. Para el ADNmt con el 35° ácido nucleico sustituido de guanosina a timidina, la secuencia de bases correspondiente a PAM de Cas9 en el ADN diana sustituido se cambia a NGT. SpCas9, que reconoce específicamente NGG como secuencia de PAM, reconoce específicamente KRAS wt solo de KRAS wt y KRAS mt (35G>T) y escinde el ADN (figura 2).
A continuación en el presente documento, la presente divulgación se describirá en detalle a través de ejemplos. Sin embargo, los siguientes ejemplos son solo para fines ilustrativos y será evidente para los expertos habituales en la técnica que el alcance de la presente divulgación no está limitado por los ejemplos.
Ejemplo 1: Aislamiento y purificación de SpCas9
Para la expresión de la proteína Cas9 deStreptococcus pyogenesrecombinante (spCas9) que contiene una etiqueta de His x 6 en el extremo terminal N, se transformó un plásmido que tiene la información genética de spCas9 (secuencia completa de la proteína que incluye la etiqueta de His x 6, SEQ ID NO 1) en células competentes BL21-DE3. Después del tratamiento con IPTG (P-D-tiogalactósido de isopropilo), las BL21-DE3 se cultivaron a 18 °C durante 16 horas. Las células se centrifugaron a 5000 x g durante 15 minutos y después se lisaron con un tampón de lisis que contenía NaH<2>PO<4>50 mM (pH 8), NaCl 400 mM, imidazol 10 mM, PMSF 1 mM, DTT 1 mM, Triton X-100 al 1% y lisozima 1 mg/ml. Después de sonicar usando un ultrasonicador, las células se centrifugaron a 15000 x g durante 30 minutos y el sobrenadante se separó de los residuos celulares. Después de añadir una resina de níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) (Invitrogen, Carlsbad, CA) al sobrenadante e incubar a 4 °C durante 1 hora, la resina de Ni-NTA se lavó repetidamente dos veces con un tampón de lavado (NaH<2>PO<4>50 mM (pH 8), NaCl 400 mM, imidazol 20 mM). Finalmente, se separó spCas9 de la resina de Ni-NTA mediante la adición de un tampón de elución (NaH<2>PO<4>50 mM (pH 8), NaCl 400 mM, 250 mM imidazol) a la resina. El tampón que contenía spCas9 se reemplazó con un tampón que contenía HEPES 20 mM (pH 7,5), NaCl 400 mM, DTT 1 mM y glicerol al 40% usando un filtro centrífugo Amicon Ultra.
Ejemplo 2. Síntesis de ARN guía mediante transcripción in vitro
Se sintetizó un ARN guíain vitrohaciendo reaccionar un molde de ADN que contenía información de ARN guía y una ARN polimerasa T7 en un tampón que contenía Tris-HCl 40 mM (pH 7,9), MgCh 6 mM, DTT 10 mM, NaCl 10 mM, espermidina 2 mM, NTP e inhibidor de ARNasa a 37 °C durante 18 horas (SEQ ID NO 2 y 3). El ARN guía sintetizado se purificó usando un kit de purificación de ARN.
Ejemplo 3. Escisión in vitro
500 ng de la SpCas9 (a continuación en el presente documento, denotada como Cas9) aislada y purificada según el ejemplo 1 y 100 ng del ARN guía preparado según el ejemplo 2 se unieron a 37 °C durante 5 minutos, y luego se hicieron reaccionar con 150 ng del gen KRAS de tipo silvestre (SEQ ID NO 4) y el gen KRAS mutante (KRAS D12V, SEQ ID NO 6), que son ADN bicatenarios (ADNbc), en un tampón acetato de potasio (50 mM (pH 7,9), Tris-acetato 20 mM, acetato de magnesio 10 mM, DTT 1 mM) a 37 °C durante 60 minutos. La información del gen KRAS y su secuencia de aminoácidos se proporciona en la tabla 1.
[Tabla 1]
Sustrato de ADN in vitro Secuencia
Los fragmentos de ADN escindidos por Cas9 se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % y después se identificaron mediante tinción con EtBr. Como resultado, se confirmó que un complejo de la proteína Cas9 aislada y purificada y el ARN guía escinde con precisión solo el sitio diana del ADN que satisface la secuencia de PAM de 5’-NGG-3’ (véanse las figuras 2a y 2b).
La mutación del gen KRAS, que es una de las principales mutaciones de los genes del cáncer, es un biomarcador importante que puede detectarse en el ADNlc. En particular, en la mutación de KRAS, la mutación mediante la cual el 35° ácido nucleico del ADNc se cambia de G a T, de modo que el 12° aminoácido de la proteína KRAS se reemplaza de glicina (G) a valina (V) es importante (SEQ ID NO 5 y<s>E<q>ID NO 7). Para el ADNmt en donde la 35a guanosina está sustituida con timidina, la secuencia de bases correspondiente al PAM de Cas9 en el ADN diana se cambia a NGT. Cas9, que reconoce específicamente NGG como secuencia de PAM, reconoce solo KRAS wt específicamente de KRAS wt y KRAS mt (35G>T) y escinde el ADN (SEQ ID NO 8).
El ARN guía tiene una secuencia diana correspondiente a la posición de 1572 nt en el ADN de 2787 nt que incluye el gen KRAS de tipo silvestre (SEQ ID NO 4). Se confirmó mediante electroforesis que Cas9 complejada con ARN guía produce un fragmento largo de 1572 nt y un fragmento corto de 1215 nt escindiendo el gen KrAs en el ADN de 2787 nt (véase la parte superior de la figura 2b y la parte superior de la figura 3b). Sin embargo, incluso cuando se usó el ARN guía, el gen mtKRAS en el que la secuencia de PAM se cambia a 5’-NGT-3’ no se escindió por Cas9 (véase la parte inferior de la figura 2b y la parte inferior de la figura 3b).
Ejemplo 4. Eliminación selectiva de ADN de tipo silvestre libre de células solamente
Se realizó un experimento para investigar si el ADN de tipo silvestre libre de células se degrada selectivamente por una proteína Cas y exonucleasa.
Los ADN diana (ADN de tipo silvestre libre de células y ADN de tipo mutante libre de células aislados de la sangre de un paciente con cáncer) se amplificaron por PCR usando un cebador protegido en el extremo 5’ con un enlace fosfotioato (tabla 2) y una polimerasa Phusion. Después de purificar el ADN de tipo silvestre (ADNwt) y el ADN mutante (ADNmt) usando un kit de purificación por PCR (ID de cat. de Qiagen: 28104), se preparó una muestra de ADN mezclando el ADNwt y el ADNmt en una proporción de 90:10 (proporción de ADNwt del 90 %; proporción del ADNmt del 10 %), 99:1 (proporción del ADNwt del 99 %; proporción del ADNmt del 1 %), 99,9:0,1 (proporción del ADNwt del 99,9 %; proporción del ADNmt del 0,1 %), 99,99:0,01 (proporción del ADNwt del 99,99 %; proporción del ADNmt del 0,01 %) o 99,999:0,001 (proporción del ADNwt del 99,999 %; proporción del ADNmt del 0,001 %). Se unieron 500 ng de SpCas9 y 100 ng de un ARN guía a 37 °C durante 5 minutos, y el producto resultante se hizo reaccionar con 100 ng del ADN bicatenario purificado (ADNbc) a 37 °C durante 60 minutos en un tampón que consistía en acetato de potasio 50 mM (pH 7,9), Tris-acetato 20 mM, acetato de magnesio 10 mM y DTT 1 mM (ditiotreitol, agente reductor).
[Tabla 2]
Después de la reacción, la reacción se realizó adicionalmente a 37 °C durante 60 minutos añadiendo exonucleasa T7 y exonucleasa T. Los fragmentos de ADN tratados con Cas9 y la exonucleasa se identificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % o mediante secuenciación de Sanger y secuenciación de última generación después de la amplificación por PCR.
El ADN de 2787 nt que incluye el gen KRAS tiene ambos extremos protegidos con enlaces fosfotioato (véase la etapa 1 en la figura 3a). El ADN con ambos extremos protegidos con enlaces fosfotioato no se degradó incluso después de tratarse con la exonucleasa. Sin embargo, cuando el ADN se escindió por Cas9, el extremo no protegido del ácido nucleico se expuso a la exonucleasa y el ADN se degradó (véanse las etapas 2 y 3 en la figura 3a). Cuando se usó el ARN guía que selecciona como diana el gen KRAS, solo el gen KRAS wt que satisface la secuencia de PAM de 5’-NGG-3’ se escindió selectivamente por Cas9. Se confirmó a través de electroforesis que el ADN de KRAS wt escindido por Cas9 se eliminó completamente mediante el tratamiento con exonucleasa T7 y exonucleasa T (véase la línea superior más a la derecha en la figura 3b). Sin embargo, el ADN de KRAS mt no escindido por Cas9 no se degradó incluso después del tratamiento con la exonucleasa porque ambos extremos estaban protegidos con enlaces fosfotioato (la línea inferior más a la derecha en la figura 3b).
Ejemplo 5. Investigación del límite de detección para el ADN diana
El ADN que quedaba en cantidades traza cuando el ADN diana se eliminó selectivamente se identificó mediante secuenciación. El experimento se realizó mezclando el ADNwt y el ADNmt en diferentes proporciones para investigar el límite de detección para el ADN en cantidades traza. Después de mezclar el ADN de KrAs wt y el ADN de KRAS mt con ambos extremos protegidos con enlaces fosfotioato en una proporción de 90:10 (proporción del ADNwt del 90 %; proporción del ADNmt del 10 %), 99:1 (proporción del ADNwt del 99 %; proporción del ADNmt del 1 %), 99,9:0,1 (proporción del ADNwt del 99,9 %; proporción del ADNmt del 0,1 %), 99,99:0,01 (proporción del ADNwt del 99,99 %; proporción del ADNmt del 0,01 %) o 99,999:0,001 (proporción del ADNwt del 99,999 %; proporción del ADNmt del 0,001 %) y luego tratar con Cas y una exonucleasa, la muestra finalmente obtenida se sometió a secuenciación (véase la figura 4).
Como se ve en la figura 4, se confirmó a través de secuenciación NGS que la proporción del ADNmt aumentó incluso en la muestra tratada solo con Cas9. Sin embargo, cuando la proporción inicial del ADNmt en la muestra fue del 1 % o inferior, la proporción del ADNmt finalmente detectado disminuyó notablemente. Considerando que la proporción del ADNmt en ADNlc es del 0,01 % o inferior en general, no es fácil identificar la presencia del ADNmt cuando el ADN diana se elimina solo con Cas9. Por lo tanto, el experimento se realizó de la siguiente manera para investigar el límite de detección para el ADN diana.
Cuando la muestra tratada con Cas9 y la exonucleasa se analizó mediante secuenciación de Sanger, se descubrió que la región de KRAS c.35 guanosina se leyó como timidina. Cuando se trata solo con Cas9, los histogramas de guanosina y timidina se observaron al mismo tiempo en la región correspondiente al 35° ácido nucleico en la muestra donde la proporción inicial de ADNmt fue del 1 % (resultado de NGS de ADNmt: 44 %), y la secuencia de ADNmt no pudo observarse en la muestra donde la proporción inicial de ADNmt fue del 1 % o inferior (véase tratamiento con Cas en el lado izquierdo de la figura 5). Sin embargo, cuando se trata con Cas9, exonucleasa T y exonucleasa T7, la secuencia mutante pudo observarse mediante secuenciación de Sanger incluso en la muestra donde la proporción inicial de ADNmt fue del 0,01 % (véase tratamiento con Cas+ExoT+ExoT7 en el lado derecho de la figura 5).
Como se observa en la figura 5, se confirmó que la presencia de ADNmt pudo identificarse claramente a través de NGS para la muestra tratada con Cas9, exonucleasa T y exonucleasa T7 incluso cuando la proporción inicial de ADNmt en la muestra fue del 0,01% o menos (el límite de detección de ADNmt solo cuando se usa Cas9 fue del 1 %). En consecuencia, en la presente divulgación, el límite de detección aumenta en al menos 100 veces en comparación con el método de escisión del ADN diana usando solo el sistema de Cas9.
Ejemplo 6. Eliminación de diversos ADN diana usando el sistema multiplex
Se eliminaron varios ADN diana usando un sistema multiplex como se describe a continuación. La secuencia de EGFR se muestra en la tabla 3.
[Tabla 3]
Varios ADN diana se amplificaron por PCR usando un cebador protegido en el extremo 5' con un enlace fosfotioato (tabla 2) y una polimerasa Phusion. Se preparó una muestra de<a>D<n>diana mezclando ADN de KRAS y ADN de EGFR, que se separaron y purificaron usando un kit de purificación por PCR, en una proporción de 1:1. Se unieron 500 ng de Cas9 y 50 ng de ARN guía que selecciona como diana KRAS y EGFR (SEQ ID NO 3) mezclando durante 5 minutos. El producto resultante se hizo reaccionar con 100 ng de la muestra de ADN diana purificado a 37 °C durante 60 minutos en un tampón que consistía en acetato de potasio 50 mM (pH 7,9), Tris-acetato 20 mM, acetato de magnesio 10 mM y DTT 1 mM.
Después de la reacción con Cas9, la reacción se realizó adicionalmente a 37 °C durante 60 minutos añadiendo exonucleasa T7 y exonucleasa T. Los fragmentos de ADN tratados con Cas9 y la exonucleasa se identificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % o mediante secuenciación de Sanger y secuenciación de última generación después de la amplificación por PCR.
Cuando el ARN guía que selecciona como diana el ADN de KRAS y el ARN guía que selecciona como diana el ADN de EGFR se mezclaron y se unieron a Cas9, se confirmó que cada ADN diana de una mezcla de ADN de KRAS wt (2787 nt) y ADN de EGFR wt (2813 nt) en una proporción de 1:1 se escindió por cada ARN guía, y que solo los ADN escindidos se eliminaron completamente por la exonucleasa a través de electroforesis (véase el medio de la figura 7b). Por el contrario, la muestra de ADN en la que se mezclaron KRAS mt y EGFR mt en una proporción de 1:1 no se escindió por Cas9 y no se degradó por la exonucleasa (véase la parte inferior de la figura 7b).
Como se describió anteriormente, se confirmó mediante electroforesis que varios ADN diana pueden eliminarse simultáneamente usando un sistema de multiplexación usando ARN guía que seleccionan como diana diferentes ADN. Además, se confirmó que varios ADN en cantidades traza pueden identificarse por NGS.
Ejemplo 7. Investigación del límite de detección para diversos ADN diana usando el sistema de multiplexación
El límite de detección de un sistema de multiplexación se investigó mediante análisis de NGS usando muestras de ADN obtenidas mezclando ADNwt y ADNmt para el gen KRAS y el gen EGFR en diferentes proporciones. Después de mezclar ADN de KRAS wt, ADN de EGFR wt, ADN de KRAS mt y ADN de EGFR mt con ambos extremos protegidos con enlaces fosfotioato en proporciones de 90:10 (proporción del ADNmt de KRAS: 10 %, proporción del ADNmt de EGFR: 10 %, proporción del ADN de KRAS wt: 90 %, proporción del ADN de EGFR wt: 90 %), 99:1 (proporción del ADNmt de K<r>A<s>: 1 %, proporción del ADNmt de EGFR: 1 %, proporción del ADN de KRAS en peso: 99 %, proporción del ADN de EGFR wt: 99%), 99,9:0,1 (proporción del ADNmt de K<r>AS: 0,1 %, proporción del ADNmt de EGFR: 0,1 %, proporción del ADN de KrAs wt: 99,9 %, proporción del ADN de EGFR wt: 99,9 %), 99,99:0,01 (proporción del ADNmt de KRAS: 0,01 %, proporción del ADNmt de EGFR: 0,01 %, proporción del ADN de KRAS wt: 99,99 %, proporción del ADN de EGFR wt: 99,99 %), 99,999:0,001 (proporción del ADNmt de KRAS: 0,001 %, proporción del ADNmt de EGFR: 0,001 %, proporción del<a>D<n>de KRAS wt: 99,999 %, proporción del ADN de EGFR wt: 99,999 %) y tratar con Cas9 y una exonucleasa, la muestra finalmente obtenida se sometió a secuenciación.
Como en el experimento que usa el ARN guía para KRAS solo (experimento para un único ADN diana), la secuencia mutante no pudo detectarse normalmente con el sistema de multiplexación en la muestra en donde estaba presente un 1 % o menos de ADNmt cuando solo se usó Cas9. Sin embargo, cuando se trata con Cas9 y la exonucleasa juntas, el ADNmt pudo detectarse eficazmente con el sistema de multiplexación (véanse la figura 8 y figura 9).
Con referencia a la figura 9, los ortólogos de Cas9 reconocen PAM de diferentes secuencias. spCas9 puede escindir solo el ADN diana que tiene la secuencia 5'-NGG-3' cerca del extremo 3'. La secuencia de bases NGG en el ADN se denomina secuencia de PAM de spCas9. Las secuencias de PAM de nmCas9, saCas9, cjCas9, AsCpf1 y FnCpf1 se reconocen respectivamente como 5'-NNNGMTT-3', 5'-NNGRRT-3', 5'-NNNVRYAC-3', 5'-TTTN-3' y 5'-KYTV-3'. Los diferentes ortólogos de Cas9 pueden funcionar normalmente solo cuando se satisface la secuencia de PAM. Si se usa el ortólogo de Cas9 para la multiplexación, puede superarse la limitación de la variedad de ADN dirigibles debido a la limitación de la secuencia de PAM. Como se muestra en la figura, pueden detectarse diversas mutaciones de cáncer más allá de la limitación de los genes que pueden seleccionarse como diana con spCsa9 mediante el uso de diversos ortólogos de Cas9.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un método de análisis de genotipo mutante que comprende:
i) una etapa de amplificación inicial de un ADN de tipo silvestre libre de células y un ADN mutante libre de células en una muestra aislada que comprende al menos un ADN de tipo silvestre libre de células y al menos un ADN mutante libre de células usando un cebador protegido en el extremo 5' que tiene el extremo 5' protegido con un enlace fosfotioato;
ii) una etapa de escisión de solo el ADN de tipo silvestre libre de células amplificado mediante el tratamiento con una proteína Cas y un ARN guía que reconoce específicamente el ADN de tipo silvestre libre de células; iii) una etapa de eliminación solo del ADN de tipo silvestre libre de células escindido mediante tratamiento de la muestra que comprende el ADN mutante libre de células y el ADN libre de células escindido con exonucleasa T7 y exonucleasa T;
iv) una etapa de amplificación del ADN mutante libre de células que queda en la muestra y
v) una etapa de análisis del ADN mutante libre de células amplificado.
2. El método de análisis de genotipo mutante según la reivindicación 1, en el que la muestra aislada que comprende al menos un ADN de tipo silvestre libre de células y al menos un ADN mutante libre de células es una muestra de sangre, plasma u orina aislada de un individuo sospechoso de cáncer.
3. El método de análisis de genotipo mutante según la reivindicación 1, en el que el ADN mutante libre de células es un ADN que comprende una mutación específica de cáncer, y el análisis del ADN mutante libre de células es para proporcionar información para el diagnóstico de cáncer.
4. El método de análisis de genotipo mutante según la reivindicación 1, en el que la proteína Cas es Cas9 deStreptococcus pyogenes(SpCas9), Cas9 deStreptococcus thermophilus(StCas9),Streptococcus pasteurianus(SpaCas9), Cas9 deCampylobacter jejuni(CjCas9),Staphylococcus aureus(SaCas9), Cas9 deFrancisella novicida(FnCas9), Cas9 deNeisseria cinerea(NcCas9), Cas9 deNeisseria meningitis(NmCas9) o endonucleasa asociada a CRISPR enPrevotellayFrancisella1 (Cpf1).
5. El método de análisis de genotipo mutante según la reivindicación 1, en el que el ARN guía es un ARN doble (ARN doble) o un ARNsg (ARN monocatenario) que comprende un ARNcr (ARN de CRISPR) y un ARNtracr (ARNcr transactivador).
6. El método de análisis de genotipo mutante según la reivindicación 1, en el que la amplificación se realiza por PCR.
7. El método de análisis de genotipo mutante según la reivindicación 1, en el que el ARN guía comprende dos o más ARN guía específicos para una pluralidad de ADN de tipo silvestre libres de células.
8. Un kit de aislamiento de ADN mutante libre de células para su uso en el método de análisis de genotipo mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende:
una composición para amplificar un ADN de tipo silvestre libre de células y un ADN mutante libre de células, que comprende un cebador protegido en el extremo 5' que tiene el extremo 5' protegido con un enlace fosfotioato;
un ARN guía específico para el ADN de tipo silvestre libre de células;
una proteína Cas para escindir el ADN de tipo silvestre libre de células; y
exonucleasa T7 y exonucleasa T para eliminar el ADN de tipo silvestre libre de células.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110358753B (zh) * 2019-07-29 2021-04-06 南方医科大学 基于CjCas9和VPR核心结构域的融合蛋白、相应的DNA靶向激活系统及其应用
KR102616916B1 (ko) * 2021-05-11 2023-12-21 주식회사 애이마 발암성 돌연변이 유전자 검출용 가이드 rna 내지 이의 용도
KR20230117058A (ko) * 2022-01-28 2023-08-07 주식회사 페로카 Egfr 돌연변이를 특이적으로 검출할 수 있는 형광 신호 기반 핵산 검출 조성물 및 방법
KR20230117057A (ko) * 2022-01-28 2023-08-07 주식회사 페로카 EGFR 돌연변이 DNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 CRISPR/Cas시스템 및 이의 용도

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116064533A (zh) * 2012-10-23 2023-05-05 基因工具股份有限公司 用于切割靶dna的组合物及其用途
EP3004349B1 (en) * 2013-05-29 2018-03-28 Cellectis S.A. A method for producing precise dna cleavage using cas9 nickase activity
WO2015183025A1 (ko) * 2014-05-28 2015-12-03 주식회사 툴젠 표적 특이적 뉴클레아제를 이용한 표적 dna의 민감한 검출 방법
EP3234133B1 (en) 2014-12-18 2020-11-11 Integrated DNA Technologies, Inc. Crispr-based compositions and methods of use
CN114438169A (zh) 2014-12-20 2022-05-06 阿克生物公司 使用CRISPR/Cas系统蛋白靶向消减、富集、和分割核酸的组合物及方法
KR101751962B1 (ko) 2015-04-30 2017-06-30 주식회사 넥스바이오 세포-유리형 dna의 위암 진단 용도
EP3294879A4 (en) 2015-05-14 2019-02-20 University of Southern California OPTIMIZED GENETIZATION WITH A RECOMBINANT ENDONUCLEASE SYSTEM
US11725230B2 (en) * 2015-06-24 2023-08-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Selective degradation of wild-type DNA and enrichment of mutant alleles using nuclease
CN109153980B (zh) * 2015-10-22 2023-04-14 布罗德研究所有限公司 Vi-b型crispr酶和系统
KR102578032B1 (ko) 2016-03-07 2023-09-13 엘지전자 주식회사 전기변색 나노입자
WO2017155416A1 (en) * 2016-03-08 2017-09-14 Otago Innovation Limited Genotyping method
CN109415727A (zh) * 2016-06-13 2019-03-01 格里尔公司 富集突变的无细胞核酸以供癌症检测的方法
EP3638812A4 (en) * 2017-06-13 2021-04-28 Genetics Research, LLC, D/B/A ZS Genetics, Inc. DETECTION OF RARE NUCLEIC ACIDS

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