JP2022513124A - 標的化された核酸ライブラリー形成のための方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、標的配列を増幅および解析のためのプローブの標的化ハイブリダイゼーションならびに／または近接ライゲーションを提供する。プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションは、直接的会合であるかまたは間接的会合を介したものであり得る。より効率的であり、使用しやすく、高速であり、柔軟であり、実用的な標的核酸捕捉法、および、特にｃｆＤＮＡなどの低インプット試料に対する、バイサルファイト処理された核酸を解析するための改善された方法が必要とされている。本明細書に開示される方法は、非常に低いＤＮＡインプット試料に対する増幅前かつバイサルファイト変換前のハイブリダイゼーションに基づく捕捉のために使用することができる。

Description

相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年１１月２１日出願の米国仮出願第６２／７７０，５８５号の優先権を主張する。

核酸標的捕捉法により、目的の特定の遺伝子、エクソン、および他のゲノム領域を、例えば標的化配列決定のために富化させることを可能にすることができる。しかし、現行の標的捕捉に基づく配列決定方法には、煩わしい非常に長いプロトコールおよび高価なプロセスが伴い得る。現行の標的捕捉に基づく方法はまた、小さな捕捉パネル（例えば、５００未満のプローブ）に対するオンターゲット率が低く、また、例えば、特に分子バーコードを伴うＰＣＲプライマーに関して、プライマー相互作用に起因して、マルチプレックス－ＰＣＲアンプリコンに基づく標的配列決定に対する柔軟性が低い。さらに、現行の核酸標的捕捉方法は、低インプットおよび損傷ＤＮＡに対しては、変換率が低いことが原因で不適当であり得る。

バイサルファイト変換は、核酸分子のメチル化パターンを研究するための有用な技法であり得、配列決定によるメチル化の研究に使用することができる。しかし、バイサルファイト変換は、例えば短縮が創出されることによって核酸に損傷を与える恐れがある。次世代配列決定（ＮＧＳ）ＤＮＡライブラリーをバイサルファイトで処理すると、実質的な量の核酸が損傷を受け、その後の増幅ステップにおいて回収できなくなり、それにより、変換率が低くなる恐れがある。さらに、バイサルファイト変換により一本鎖または断片化ＤＮＡおよび配列の複雑さの低減が生じ得るので、変換されたＤＮＡは、従来のアダプター－ライゲーションに基づくライブラリー構築にインプットすることが難しいものになり得る。バイサルファイト処理された無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または循環腫瘍細胞ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は一般には最初のインプットが小さく、変換率が低いこと（例えば、バイサルファイト処理されたｃｆＤＮＡの５％またはそれ未満）を考慮すると、より大きな難題が伴う。さらに、バイサルファイト変換の際には、あらゆるメチル化されていない「Ｃ」が「Ｕ」に変換され得、次に、「Ｕ」がＰＣＲ増幅後に「Ｔ」に変換され得る。バイサルファイト変換前増幅ではメチル化情報が保存されない可能性があるので、バイサルファイト変換後捕捉がより一般に使用され得る。プローブまたはＰＣＲプライマーの設計または作製は、バイサルファイト変換後の配列に基づくものであり得、それにより、プロセスがより複雑なものになる。バイサルファイト変換前捕捉を使用する場合、既存の市場プロトコールでは、高ＤＮＡインプット（例えば、２５０ｎｇよりも多く）が必要になり得る。そのような制約により、標的化領域を現行のプローブ捕捉または多重化ＰＣＲ手法によって富化することが難しくなり得る。

したがって、より効率的であり、使用しやすく、高速であり、柔軟であり、実用的な標的核酸捕捉法、および、特にｃｆＤＮＡなどの低インプット試料に対する、バイサルファイト処理された核酸を解析するための改善された方法が必要とされている。本明細書に開示される方法は、非常に低いＤＮＡインプット試料に対する増幅前かつバイサルファイト変換前のハイブリダイゼーションに基づく捕捉のために使用することができる。

捕捉プローブの標的特異的領域を鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズさせるステップと、鋳型核酸分子の３’末端を捕捉プローブの５’末端に結合させ、それにより、捕捉プローブに結合した鋳型核酸分子を生成するステップと、第１のアダプタープライマーを捕捉プローブの第１のアダプターにハイブリダイズさせるステップと、第１のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップと、第２のアダプターを第１の伸長産物の３’末端に結合させ、それにより、第２のアダプターに結合した第１の伸長産物を生成するステップとを含む方法が本明細書に開示される。捕捉プローブは、分子バーコードをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターを結合させるステップの前に鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化するステップをさらに含み得る。第２のアダプターは二本鎖アダプターであり得、第２のアダプターの２本の鎖のうちの一方が鋳型核酸分子に結合する。本方法は、第２のアダプタープライマーを第２のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターに結合した第１の伸長産物および第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターに結合した第１の伸長産物および第２の伸長産物を第１のアダプタープライマーおよび第２のアダプタープライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。

捕捉プローブの標的特異的領域を鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズさせるステップと、鋳型核酸分子の３’末端を捕捉プローブの５’末端に結合させ、それにより、捕捉プローブに結合した鋳型核酸分子を生成するステップと、捕捉プローブに結合した鋳型核酸分子をバイサルファイトで処理するステップとを含む方法が本明細書に開示される。本方法は、第１のアダプタープライマーを捕捉プローブの第１のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含み得る。本方法は、第１のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップを含み得る。本方法は、第２のアダプターを第１の伸長産物の３’末端に結合させ、それにより、第２のアダプターに結合した第１の伸長産物を生成するステップをさらに含み得る。捕捉プローブは、分子バーコードをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターを結合させるステップの前に鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化するステップを含み得る。第２のアダプターは二本鎖アダプターであり得、第２のアダプターの２本の鎖のうちの一方が鋳型核酸分子に結合する。本方法は、第２のアダプタープライマーを第２のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターに結合した第１の伸長産物および第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターに結合した第１の伸長産物および第２の伸長産物を第１のアダプタープライマーおよび第２のアダプタープライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、標的特異的プライマーを第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップをさらに含み得る。本方法は、標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターに結合した第１の伸長産物および第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターに結合した第１の伸長産物および第２の伸長産物を第１のアダプタープライマーおよび標的特異的プライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。

捕捉プローブの標的特異的領域を鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズさせるステップと、鋳型核酸分子の３’末端を捕捉プローブの５’末端に結合させ、それにより、捕捉プローブに結合した鋳型核酸分子を生成するステップと、捕捉プローブの３’末端を伸長させ、それにより、鋳型核酸分子に結合した第１の伸長産物を生成するステップとを含む方法が本明細書に開示される。本方法は、捕捉プローブに結合した鋳型核酸分子をバイサルファイトで処理するステップをさらに含み得る。捕捉プローブは、第１のアダプターを含み得る。捕捉プローブは、分子バーコードをさらに含み得る。本方法は、鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化するステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターを鋳型核酸分子の５’末端に結合させるステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターを結合させるステップの前に鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化するステップをさらに含み得る。第２のアダプターは二本鎖アダプターであり得る。本方法は、第１のアダプタープライマーを捕捉プローブの第１のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含み得る。本方法は、第１のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプタープライマーを第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第３の伸長産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２の伸長産物および第３の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２の伸長産物および第３の伸長産物を第１のアダプタープライマーおよび第２のアダプタープライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、標的特異的プライマーを第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップをさらに含み得る。本方法は、標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第３の伸長産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２の伸長産物および第３の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２の伸長産物および第３の伸長産物を第１のアダプタープライマーおよび標的特異的プライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。

捕捉プローブの標的特異的領域を鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズさせるステップと、鋳型核酸分子の３’末端を捕捉プローブの５’末端に結合させ、それにより、捕捉プローブに結合した鋳型核酸分子を生成するステップと、標的特異的領域を脱離させるステップとを含む方法が本明細書に開示される。本方法は、標的特異的領域を脱離させるステップの前に捕捉プローブに結合した鋳型核酸分子をバイサルファイトで処理するステップをさらに含み得る。捕捉プローブは、分子バーコードをさらに含み得る。本方法は、第１のアダプタープライマーを捕捉プローブの第１のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含み得る。本方法は、第１のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターを第１の伸長産物の３’末端に結合させ、それにより、第２のアダプターに結合した第１の伸長産物を生成するステップとをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターに結合した第１の伸長産物および第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターに結合した第１の伸長産物および第２の伸長産物を第１のアダプタープライマーおよび第２のアダプタープライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、標的特異的プライマーを第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップをさらに含み得る。本方法は、標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第１の伸長産物および第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第１の伸長産物および第２の伸長産物を第１のアダプタープライマーおよび標的特異的プライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。

第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域を鋳型核酸分子の第１の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列がアダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列に結合する、ステップと、鋳型核酸分子の３’末端をアダプターアンカープローブの５’末端に結合させ、それにより、アダプターアンカープローブに結合した鋳型核酸分子を生成するステップとを含む方法が本明細書に開示される。本方法は、アダプターアンカープローブに結合した鋳型核酸分子をバイサルファイトで処理するステップをさらに含み得る。アダプターアンカープローブは、分子バーコードをさらに含み得る。第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域は、第１の架橋プローブの３’部位に存在し得る。第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域は第１の架橋プローブの５’部位に存在し得る。第１の架橋プローブは、第１の標的特異的領域と第１のアダプターランディング配列との間に第１のリンカーを含み得る。結合させるステップは、鋳型核酸分子の３’末端にアダプターアンカープローブの５’末端をリガーゼを用いてライゲーションすることを含み得る。本方法は、第１のアダプタープライマーをアダプターアンカープローブの第１のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含み得る。本方法は、第１のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターを第１の伸長産物の３’末端に結合させ、それにより、第２のアダプターに結合した第１の伸長産物を生成するステップとをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターを結合させるステップの前に鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化するステップをさらに含み得る。第２のアダプターは二本鎖アダプターであり得、第２のアダプターの２本の鎖のうちの一方が鋳型核酸分子に結合する。本方法は、第２のアダプタープライマーを第２のアダプターに結合した第１の伸長産物内の第２のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターに結合した第１の伸長産物および第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターに結合した第１の伸長産物および第２の伸長産物を第１のアダプタープライマーおよび第２のアダプタープライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、標的特異的プライマーを第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップをさらに含み得る。本方法は、標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第１の伸長産物および第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第１の伸長産物および第２の伸長産物を第１のアダプタープライマーおよび標的特異的プライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。

本方法は、第１の架橋結合配列を脱離させるステップをさらに含み得る。本方法は、第１の架橋プローブの３’末端を伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップをさらに含み得る。アダプターアンカープローブは、第１のアダプターを含み得る。本方法は、第２のアダプターを鋳型核酸分子の５’末端に結合させるステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターを結合させるステップの前に鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化するステップをさらに含み得る。アダプターは二本鎖アダプターであり得る。本方法は、第１のアダプタープライマーをアダプターアンカープローブの第１のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含み得る。本方法は、第１のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプタープライマーを第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第３の伸長産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２の伸長産物および第３の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２の伸長産物および第３の伸長産物を第１のアダプタープライマーおよび第２のアダプタープライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、標的特異的プライマーを第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップをさらに含み得る。本方法は、標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第３の伸長産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２の伸長産物および第３の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２の伸長産物および第３の伸長産物を第１のアダプタープライマーおよび標的特異的プライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第２の架橋プローブの第２の標的配列領域を鋳型核酸分子の第２の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列がアダプターアンカープローブの第２の架橋結合配列に結合する、ステップをさらに含み得る。第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域は、第２の架橋プローブの３’部位に存在し得る。第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域は、第２の架橋プローブの５’部位に存在し得る。第２の架橋プローブは、第２の標的特異的領域と第２のアダプターランディング配列との間に第２のリンカーを含み得る。

第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域は、第１の架橋プローブの３’部位に存在し得、第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域は、第２の架橋プローブの３’部位に存在し得る；第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域は第１の架橋プローブの５’部位に存在し得、第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域は、第２の架橋プローブの５’部位に存在し得る；第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域は、第１の架橋プローブの３’部位に存在し得、第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域は、第２の架橋プローブの５’部位に存在し得る；または第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域は第１の架橋プローブの５’部位に存在し得、第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域は、第２の架橋プローブの３’部位に存在し得る。第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域は、第１の架橋プローブの３’部位に存在し得、第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域は、第２の架橋プローブの５’部位に存在し得、第１の架橋プローブの第１のリンカーと第２の架橋プローブの第２のリンカーとは互いにハイブリダイズし得る。

捕捉プローブまたは架橋プローブの標的配列領域は、鋳型核酸分子の標的配列に基づいて設計されたものであり得、鋳型核酸の標的配列は、バイサルファイト処理後にメチル化されていないシトシンを保持し得る。本方法は、核酸分子をバイサルファイトで処理し、それにより、鋳型核酸分子を生成するステップであって、鋳型核酸分子が、バイサルファイト処理の産物であり得る、ステップをさらに含み得る。捕捉プローブまたは架橋プローブの標的配列領域は、バイサルファイト処理後の鋳型核酸分子の標的配列に基づいて設計されたものであり得、ここで、鋳型核酸内のメチル化されていないシトシンはバイサルファイト処理中にウラシルに変換される。本方法は、核酸分子の５’末端を脱リン酸化し、それにより、鋳型核酸分子を生成するステップをさらに含み得る。捕捉プローブまたはアダプターアンカープローブは、標識をさらに含み得る。本方法は、標識によって架橋プローブを捕捉するステップをさらに含み得る。標識は、ビオチンであり得る。標識は、固体支持体上に捕捉され得る。固体支持体はビーズであり得る。ビーズは、標識を標的とする捕捉用部分を含み得る。捕捉用部分はストレプトアビジンであり得る。本方法は、鋳型核酸分子の３’末端を捕捉プローブまたはアダプターアンカープローブの５’末端に結合させた後、核酸分子を３’から５’のエキソヌクレアーゼと接触させるステップであって、核酸分子が、捕捉プローブおよび鋳型核酸分子を含む、ステップをさらに含み得る。本方法は、増幅産物の配列決定を行うステップをさらに含み得る。配列決定は、次世代シーケンシングを含み得る。鋳型核酸分子は、一本鎖ＤＮＡを含み得る。鋳型核酸分子は、ＲＮＡを含み得る。鋳型核酸分子は、損傷ＤＮＡを含み得る。鋳型核酸分子は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料に由来するものであり得る。鋳型核酸分子は、生体試料由来の無細胞核酸を含み得る。無細胞核酸は、無細胞ＤＮＡを含み得る。無細胞ＤＮＡは、循環腫瘍ＤＮＡを含み得る。一部の場合では、鋳型核酸分子に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ修復ステップを実施することができない。

プローブを使用して標的配列を捕捉するステップであって、プローブが標的配列にハイブリダイズし、プローブが標的配列を含む鋳型に結合する、ステップと、プローブに結合した標的配列をバイサルファイトで処理するステップとを含む方法が本明細書に開示される。架橋プローブを使用して標的配列を捕捉するステップであって、架橋プローブにより、アンカープローブの標的配列への結合が容易になる、ステップを含む方法が本明細書に開示される。本方法は、アンカープローブに結合した標的配列をバイサルファイトで処理するステップをさらに含み得る。

鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズする標的特異的領域および鋳型核酸分子の３’末端に結合する５’末端を含む捕捉プローブと、捕捉プローブの第１のアダプターにハイブリダイズする第１のアダプタープライマーであって、それが伸長することにより、第１の伸長産物が生成される、第１のアダプタープライマーと、第１の伸長産物に結合する第２のアダプターと、第２のアダプターにハイブリダイズする第２のアダプタープライマーとを含むキットが本明細書に開示される。鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズする標的特異的領域を含む架橋プローブと、架橋プローブのアダプターランディング配列にハイブリダイズする架橋結合配列および鋳型核酸分子の３’末端に結合する５’末端を含むアダプターアンカープローブとを含むキットが本明細書に開示される。

捕捉プローブの標的特異的領域を鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、捕捉プローブが、標的特異的領域の５’末端に位置する第１のアダプターをさらに含む、ステップと、鋳型核酸分子を、標的特異的領域をハイブリダイズさせた後に、３’から５’のエキソヌクレアーゼと接触させるステップと、鋳型核酸分子の３’末端を第１のアダプターを鋳型として使用して伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップとを含む方法が本明細書に開示される。本方法は、捕捉プローブの３’末端を伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含み得る。本方法は、第１のアダプターを含むプライマーを第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、第１のアダプターを含むプライマーの３’末端を伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップとをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターを第１の伸長産物の５’末端に結合させるステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターを結合させるステップの前に、第１の伸長産物の５’末端をリン酸化するステップをさらに含み得る。第２のアダプターは二本鎖アダプターであり得、第２のアダプターの２本の鎖のうちの一方が第２の伸長産物に結合する。本方法は、第１の伸長産物および第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。

本方法は、標的特異的プライマーを第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップであって、標的特異的プライマーが第２のアダプターに結合する、ステップと、標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第３の伸長産物を生成するステップとをさらに含み得る。本方法は、第２の伸長産物および第３の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。

捕捉プローブは、分子バーコードをさらに含み得る。捕捉プローブは、結合性部分をさらに含み得る。結合性部分は、支持体に結合され得る。支持体はビーズであり得る。ビーズはストレプトアビジンビーズであり得る。結合性部分はビオチンであり得る。

第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域を鋳型核酸分子の第１の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列がアダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列に結合する、ステップと、第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域を鋳型核酸分子の第２の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列がアダプターアンカープローブの第２の架橋結合配列に結合する、ステップと、第１の架橋プローブの３’末端を伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップとを含む方法が本明細書に開示される。第１の架橋プローブは、第１のアダプターを含み得る。本方法は、第２のアダプターを第１の伸長産物の３’末端に結合させるステップをさらに含み得る。第２のアダプターは二本鎖アダプターであり得、第２のアダプターの２本の鎖のうちの一方が鋳型核酸分子に結合する。本方法は、第２のアダプターを結合させるステップの前に（prior to the attaching of the second adaptor）、鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化するステップをさらに含み得る。

本方法は、標的特異的プライマーを第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップとをさらに含み得る。標的特異的プライマーは、第２のアダプターに結合され得る。本方法は、第１のアダプターを含むプライマーを第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、第１のアダプターを含むプライマーの３’末端を伸長させ、それにより、第３の伸長産物を生成するステップとをさらに含み得る。本方法は、第２の伸長産物および第３の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。

第１の架橋プローブは、分子バーコードをさらに含み得る。第１の架橋プローブは、結合性部分をさらに含み得る。結合性部分は、支持体に結合され得る。支持体はビーズであり得る。ビーズはストレプトアビジンビーズであり得る。結合性部分はビオチンであり得る。

第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域を鋳型核酸分子の第１の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列がアダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列に結合し、第１の架橋プローブが、標的特異的領域の５’末端に位置する第１のアダプターをさらに含む、ステップと、鋳型核酸分子を、第１の標的特異的領域をハイブリダイズさせた後に、３’から５’のエキソヌクレアーゼと接触させるステップと、鋳型核酸分子の３’末端を第１のアダプターを鋳型として使用して伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップとを含む方法が本明細書に開示される。本方法は、第１のアダプターを含むプライマーを第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、第１のアダプターを含むプライマーの３’末端を伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップとをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターを第１の伸長産物の５’末端に結合させるステップをさらに含み得る。本方法は、第２のアダプターを結合させるステップの前に第１の伸長産物の５’末端をリン酸化するステップをさらに含み得る。第２のアダプターは二本鎖アダプターであり得、第２のアダプターの２本の鎖のうちの一方が第２の伸長産物に結合する。本方法は、標的特異的プライマーを第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第３の伸長産物を生成するステップとをさらに含み得る。標的特異的プライマーは、第２のアダプターに結合され得る。本方法は、第２の伸長産物および第３の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含み得る。鋳型核酸分子を３’から５’のエキソヌクレアーゼと接触させるステップにより、鋳型核酸分子の３’末端において１つまたは複数のヌクレオチドが切断され得る。

第１の架橋プローブは、分子バーコードをさらに含み得る。第１の架橋プローブは、結合性部分をさらに含み得る。結合性部分は、支持体に結合され得る。支持体はビーズであり得る。ビーズはストレプトアビジンビーズであり得る。結合性部分はビオチンであり得る。
参照による組込み

本明細書において言及されている全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたものと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。

本開示の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に記載されている。本開示の原理が利用されている例示的な実施形態が記載されている以下の詳細な説明および以下の付属図を参照することにより、本開示の特徴および利点のよりよい理解が得られよう。

図１Ａ～１Ｃは、捕捉プローブの、鋳型内の標的配列（ＴＳ）との直接ハイブリダイゼーションおよびその後の増幅の一実施形態を例示する図である。図１Ａは、捕捉プローブのＴＳとのハイブリダイゼーションおよび捕捉プローブの鋳型への近接ライゲーションを示す。図１Ｂは、ＡＤ１プライマーを使用した鋳型の相補鎖の合成を示す。図１Ｃは、第２のアダプター（ＡＤ２）の図１Ｂからの伸長産物および鋳型へのライゲーション、ならびにＡＤ２プライマーおよびＡＤ１プライマーを使用したＴＳのさらなる増幅のための、第２のアダプターにアニーリングするプライマーを例示する。

図２Ａ～２Ｃは、捕捉プローブの、鋳型内の標的配列（ＴＳ）との直接ハイブリダイゼーションおよび異なる増幅方法の一実施形態を例示する図である。図２Ａは、捕捉プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションおよび捕捉プローブの鋳型への近接ライゲーションを示す。図２Ｂは、ＡＤ１プライマーを使用した鋳型への相補鎖の合成を示す。図２Ｃは、ＡＤ１プライマーを用いた標的配列のさらなる増幅のための標的特異的領域（ＴＳＲ）プライマーの使用を例示する。

図３Ａ～３Ｃは、捕捉プローブの標的配列（ＴＳ）との直接ハイブリダイゼーションおよび別の増幅方法のある実施形態を示す図である。図３Ａは、捕捉プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションおよび捕捉プローブの鋳型への近接ライゲーションを示す。図３Ｂは、鋳型の５’末端のリン酸化、および捕捉プローブの標的特異的領域（ＴＳＲ）（捕捉プローブの３’末端）をプライマーとして使用した鋳型への相補鎖の合成を示す。図３Ｃは、ＡＤ２アダプターの図３Ｂの産物へのライゲーション、ならびに標的配列のさらなる増幅のためにＡＤ１およびＡＤ２にアニーリングさせるためのプライマーの使用を例示する。

図４Ａ～４Ｃは、標的配列のその後の増幅を容易にするための捕捉プローブの標的特異的領域（ＴＳＲ）の除去を例示する図である。図４Ａは、捕捉プローブの鋳型の標的配列へのハイブリダイゼーションおよび捕捉プローブの鋳型への近接ライゲーションを示す。図４Ｂは、捕捉プローブのＴＳＲの切断を示す。図４Ｃは、捕捉プローブ内のＡＤ１配列にアニーリングしたＡＤ１プライマーの伸長および標的配列の増幅を示す。

図５Ａ～５Ｃは、アダプターアンカープローブの鋳型への間接的会合を示す。図５Ａは、架橋プローブのアダプターアンカープローブおよび鋳型の両方へのハイブリダイゼーションに起因したアダプターアンカープローブの鋳型との会合、ならびにその後のアダプターアンカープローブの鋳型へのライゲーションを示す図である。標的特異的領域（ＴＳＲ）が架橋プローブの３’部位に位置する。図５Ｂは、ＡＤ１プライマーを使用した鋳型の相補鎖の合成を示す。図５Ｃは、ＡＤ２アダプターの図５Ｂの産物とのライゲーションおよびＡＤ１およびＡＤ２プライマーを使用したさらなる増幅を示す。

図６Ａ～６Ｃは、アダプターアンカープローブの間接的会合および異なる増幅方法を示す図である。図６Ａは、架橋プローブのアダプターアンカープローブおよび鋳型の両方へのハイブリダイゼーションに起因したアダプターアンカープローブの鋳型との会合、ならびにその後のアダプターアンカープローブの鋳型へのライゲーションを示す。標的特異的領域（ＴＳＲ）が架橋プローブの３’部位に位置する。図６Ｂは、ＡＤ１プライマーを使用した鋳型の相補鎖の合成を示す。図６Ｃは、標的配列の相補物にアニーリングするプライマーおよびＡＤ１プライマーを使用したさらなる増幅を示す。

図７Ａ～７Ｃは、架橋プローブを使用したアダプターアンカープローブの鋳型への間接的会合を示し、ここで、標的特異的領域（ＴＳＲ）は架橋プローブの５’部位に位置する。図７Ａは、架橋プローブのアダプターアンカープローブおよび鋳型の両方へのハイブリダイゼーションに起因したアダプターアンカープローブの鋳型との会合、ならびにその後のアダプターアンカープローブの鋳型へのライゲーションを示す。図７Ｂは、ＡＤ１プライマーを使用した鋳型の相補鎖の合成を示す。プライマーをＡＤ１配列にアニーリングする前に架橋プローブ、鋳型、およびアダプターアンカープローブの間の結合を変性させることができる。図７Ｃは、ＡＤ２アダプターの図７Ｂへの産物のライゲーション、ならびにＡＤ１およびＡＤ２プライマーを使用したさらなる増幅を示す。

図８Ａ～８Ｃは、架橋プローブを介したアダプターアンカープローブの鋳型への間接的会合および架橋プローブの標的特異的領域（ＴＳＲ）の伸長を示す図である。図８Ａは、架橋プローブのアダプターアンカープローブおよび鋳型の両方へのハイブリダイゼーションに起因したアダプターアンカープローブの鋳型との会合、ならびにその後のアダプターアンカープローブの鋳型へのライゲーションを示す。図８Ｂは、ＴＳＲをプライマーとして使用した（架橋プローブの３’末端）、鋳型への相補鎖の合成を示す。図８Ｃは、ＡＤ２アダプターの図８Ｂの産物へのライゲーション、ならびにＡＤ１およびＡＤ２プライマーを使用したさらなる増幅を示す。

図９は、アダプターアンカープローブの鋳型への近接ライゲーションをもたらす、多数の架橋プローブの鋳型へのハイブリダイゼーションおよびアダプターアンカープローブへのハイブリダイゼーションを示す。どちらの架橋プローブも３’部位に標的特異的領域（ＴＳＲ）を含む。

図１０は、別の架橋プローブのセットの鋳型へのハイブリダイゼーションおよびアダプターアンカープローブへのハイブリダイゼーション、ならびにその後のアダプターアンカープローブの鋳型へのライゲーションを示す。どちらの架橋プローブも５’部位に標的特異的領域（ＴＳＲ）を含む。

図１１は、異なる架橋プローブの鋳型へのハイブリダイゼーションおよびアダプターアンカープローブの鋳型へのライゲーションを示す。第１の架橋プローブは、３’部位に標的特異的領域（ＴＳＲ）を含み、第２の架橋プローブは、５’部位にＴＳＲを含み、それにより、両方の架橋プローブのリンカーのハイブリダイゼーションおよび安定なアセンブリがもたらされる。

図１２は、架橋プローブの鋳型へのハイブリダイゼーションおよびアダプターアンカープローブの鋳型へのライゲーションを示す。第１の架橋プローブは、５’部位にＴＳＲを含み、第２の架橋プローブは、３’部位にＴＳＲを含む。

図１３Ａ～Ｂは、標的を含む鋳型へのプローブのライゲーションに関する順序が異なるバイサルファイト処理を伴う標的増幅についての２つの実施形態を例示する図である。図１３Ａは、捕捉プローブまたは架橋プローブへのＤＮＡインプットのハイブリダイゼーションの前にそれをバイサルファイト処理することを示す。図１３Ｂは、捕捉プローブまたは架橋プローブへのＤＮＡインプットのハイブリダイゼーションおよび近接ライゲーション後の、ＤＮＡインプットのバイサルファイト処理を示す。

図１４は、バイサルファイト処理の、ライゲーションした鋳型ＤＮＡに対する効果を示す。バイサルファイト変換ではインタクトな鋳型ＤＮＡの二本鎖部分が残り得、それにより、鋳型ＤＮＡのバイサルファイト変換されていないＴＳの相補物にアニーリングするように設計されたＴＳＲ ＰＣＲプライマーの使用が可能になる。

図１５Ａ～１５Ｂは、エキソヌクレアーゼを使用したオフターゲットライゲーション産物の選択的除去のためのスキームを示す図である。

図１６Ａ～１６Ｂは、適切にライゲーションされた標的鋳型およびアダプターアンカープローブを選択するための固相捕捉法を示す図である。

図１７Ａ～１７Ｃは、ｓｓＤＮＡまたは損傷ｄｓＤＮＡのいずれかを出発材料として使用したライブラリー構築方法を示す図である。

図１８Ａは、架橋プローブを用いた（１）または用いない（２）アダプターアンカープローブの鋳型への結合に関する概略図を例示する図である。図１８Ｂは、架橋プローブを用いた設定（set up）に関するライゲーションした鋳型およびアダプターアンカープローブ産物（１）；架橋プローブを用いない設定に関するライゲーション産物の欠如（２）を伴うアガロースゲルの画像を示す。 図１８Ａは、架橋プローブを用いた（１）または用いない（２）アダプターアンカープローブの鋳型への結合に関する概略図を例示する図である。図１８Ｂは、架橋プローブを用いた設定（set up）に関するライゲーションした鋳型およびアダプターアンカープローブ産物（１）；架橋プローブを用いない設定に関するライゲーション産物の欠如（２）を伴うアガロースゲルの画像を示す。

図１９Ａ～１９Ｃは、捕捉プローブの鋳型核酸への直接ハイブリダイゼーション後のアダプター付加に関する異なる方法を例示する。

図２０Ａ～２０Ｄは、架橋プローブとの相互作用を通じた鋳型核酸のアダプターアンカープローブとの間接的会合後のアダプター付加に関する異なる方法を示す図である。

図２１Ａ～２１Ｅは、架橋プローブとの相互作用を通じた鋳型核酸のアダプターアンカープローブとの間接的会合の種々の立体配置を示す図である。

図２２Ａ～２２Ｇは、鋳型核酸の標的プローブとの直接ハイブリダイゼーションを通じたアダプター付加、および３’から５’のエキソヌクレアーゼによる鋳型核酸の消化についてのステップを例示する図である。

図２３Ａ～２３Ｆは、標的プローブおよび鋳型核酸の間接的会合を通じたアダプター付加、および架橋プローブの伸長についてのステップを例示する図である。

図２４Ａ～２４Ｆは、標的プローブおよび鋳型核酸の間接的会合を通じたアダプター付加、および３’から５’のエキソヌクレアーゼによる鋳型核酸の消化についてのステップを例示する図である。

図２５Ａ～２５Ｄは、アダプターを伴うポリヌクレオチドプライマーの使用を通じたアダプター付加についてのステップを例示する図である。

図２６は、合成ＤＮＡ鋳型を使用した、捕捉プローブによる直接ハイブリダイゼーションによるアダプター付加および鋳型核酸の３’から５’のエキソヌクレアーゼによる消化に関する実験の概略図である。

図２７は、断片化されたゲノムＤＮＡを使用した、捕捉プローブによる直接ハイブリダイゼーションによるアダプター付加および鋳型核酸の３’から５’のエキソヌクレアーゼによる消化に関する別の実験の概略図を示す。

Ｉ．概要
標的化アダプター近接ライゲーションおよび富化（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（ＴＡＬＥ）ならびにその後の配列決定（ＴＡＬＥ－ＳＥＱ）の方法およびキットが本明細書に提示される。ＴＡＬＥは、標的富化およびライブラリー構築を単一のステップで実現することができる。ＴＡＬＥでは一本鎖ＤＮＡをインプットとして利用し、増幅前に標的配列を富化させることもできる。さらに、本明細書に開示される方法およびキットにより、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して低変換率を有し得る損傷ＤＮＡを活用することが可能になる。本明細書に提示される方法およびキットは、プロセスにおけるステップが少ないことに付随してＤＮＡ喪失が少なくなることに起因して、より高い変換率および改善された感度を提供することができる。さらに、多数の架橋プローブ－アダプターアンカーの使用により、捕捉の特異性および効率を増加させることができる。したがって、本明細書に提示される方法およびキットは、ＮＧＳにおける標的富化のための高速な容易かつ柔軟な設計および低費用解決法を提供することができる。

捕捉プローブの鋳型への標的化ハイブリダイゼーションおよび捕捉プローブの末端の鋳型の末端への近接結合、ならびにその後の、例えば、結合させたアダプターを利用した鋳型内の標的配列の増幅を含む方法が本明細書に開示される。本方法により、核酸パネル設計の柔軟性および実用性を多重化ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）次世代シーケンシングアッセイと比較して改善することができ、有意な時間および費用の節約をもたらすことができる。本方法ではまた、核酸試料の高度な複雑さも保存され、例えば、損傷ＤＮＡをインプットとして使用して高変換率に起因した低い偏りの提示を特徴付けることができる。

さらに、本明細書に開示される局在標的捕捉法では、二本鎖ＤＮＡ修復ステップおよび冗長なプローブハイブリダイゼーション／富化を排除することができる。開示されている方法は、一本鎖ＤＮＡ、損傷ＤＮＡ、例えばホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料に由来する断片化ＤＮＡ、バイサルファイト処理されたＤＮＡ、およびＲＮＡに使用することができる。
ａ．直接ハイブリダイゼーションによる標的化プローブ付加の概要

捕捉プローブを、標的配列を有する鋳型核酸分子に直接ハイブリダイゼーションおよび結合によって選択的に結合させることを含む方法が本明細書に開示される。捕捉プローブは、鋳型核酸分子内の特定の標的配列にハイブリダイズすることができ、それにより、標的鋳型にハイブリダイズさせることができる標的特異的領域を含むように設計することができる。ハイブリダイゼーションによってもたらされる近接により、捕捉プローブの５’末端の鋳型核酸分子の３’末端への結合を容易にすることができる。捕捉プローブの５’末端を鋳型の３’末端にリガーゼを使用したライゲーションによって結合させることができる。捕捉プローブの５’末端の鋳型核酸分子へのライゲーションを容易にするために、捕捉プローブの５’末端をリン酸化することができる。自己ライゲーションを低減するために、例えば、捕捉プローブの標的特異的領域の、鋳型内の標的配列へのハイブリダイゼーション前に、鋳型核酸分子の５’末端を脱リン酸化することができる。

捕捉プローブは、増幅のためのプライマーアニーリングの部位として作用し得るアダプターを含み得る。捕捉プローブは、鋳型核酸分子の後の配列決定、検出、同定、測定、および／または解析のために、結合した鋳型核酸分子を独自に同定するための分子バーコード（ＭＢ）をさらに含み得る。
ｂ．間接的会合による標的化プローブ付加の概要

開示されている方法は、アダプターアンカープローブを、標的配列を有する鋳型核酸分子に間接的会合および結合によって選択的に結合させることを含むある特定の実施形態も含む。架橋プローブは、鋳型核酸分子内の特定の標的配列にハイブリダイズし、それにより、標的鋳型にハイブリダイズすることができるように設計することができる。次に、アダプターアンカープローブを、架橋プローブにハイブリダイズし、架橋プローブにハイブリダイズすることができるように設計することができ、それにより、３つのハイブリダイズした核酸分子のアセンブリが創出される。３つの核酸分子の間にハイブリダイゼーションによってもたらされる近接により、アダプターアンカープローブの５’末端の鋳型核酸分子の３’末端への結合を容易にすることができる。アダプターアンカープローブの５’末端を鋳型の３’末端にリガーゼを使用したライゲーションによって結合させることができる。アダプターアンカープローブの５’末端の鋳型へのライゲーションを容易にするために、アダプターアンカープローブの５’末端をリン酸化することができる。自己ライゲーションを低減するために、鋳型核酸分子の５’末端を脱リン酸化することができる。

アダプターアンカープローブは、増幅のためのプライマーアニーリングの部位として作用し得るアダプターを含み得る。アダプターアンカープローブは、鋳型核酸分子の後の配列決定、検出、同定、測定、および／または解析のために、結合した鋳型を独自に同定するための分子バーコードをさらに含み得る。
ｃ．直接ハイブリダイゼーションによるアダプター付加の概要

捕捉プローブを、標的配列を有する鋳型核酸分子に直接ハイブリダイゼーションによって選択的にハイブリダイズさせることを含む方法が本明細書に開示される。開示されている方法は、標的プローブの鋳型核酸への結合もライゲーションも伴わずに、標的プローブの１つまたは複数のアダプターを伸長産物に付加するまたは組み入れることを含むある特定の実施形態を含む。捕捉プローブは、鋳型核酸分子内の特定の標的配列にハイブリダイズすることができ、それにより、標的鋳型にハイブリダイズさせることができる標的特異的領域を含むように設計することができる。捕捉プローブは、増幅のためのプライマーアニーリングの部位として作用し得るアダプターをさらに含み得る。アダプターは、標的特異的領域の５’末端に位置し得る。

捕捉プローブとハイブリダイズさせたら、鋳型核酸分子を３’から５’のエキソヌクレアーゼと接触させて、鋳型核酸のあらゆる３’突出を消化することができる。消化後、鋳型核酸分子の３’末端を伸長させて、アダプターと相補的な配列を含む伸長産物を生成することができる。

一部の場合では、捕捉プローブおよび鋳型核酸がハイブリダイズしたら、捕捉プローブの３’末端を伸長させて、アダプターを含む伸長産物を生成することができる。

捕捉プローブは、鋳型核酸分子の後の配列決定、検出、同定、測定、および／または解析のために、結合した鋳型核酸分子を独自に同定するための分子バーコード（ＭＢ）をさらに含み得る。
ｄ．間接的会合によるアダプター付加の概要

開示されている方法は、架橋プローブを鋳型核酸に選択的にハイブリダイズさせることを含むある特定の実施形態も含む。開示されている方法は、標的化プローブの鋳型核酸への結合もライゲーションも伴わずに、架橋プローブの１つまたは複数のアダプターを伸長産物に付加するまたは組み入れることを含むある特定の実施形態を含む。架橋プローブは、鋳型核酸分子内の特定の標的配列にハイブリダイズし、それにより、標的鋳型にハイブリダイズすることができるように設計することができる。次に、アダプターアンカープローブを架橋プローブにハイブリダイズすることができるように設計することができ、そして、アダプターアンカープローブを架橋プローブにハイブリダイズさせ、それにより、３つのハイブリダイズした核酸分子のアセンブリを創出することができる。多数のハイブリダイゼーションアセンブリにより、複合体に対してより大きな安定性を相乗的にもたらすことができる。架橋プローブは、増幅のためのプライマーアニーリングの部位として作用し得るアダプターをさらに含み得る。アダプターは、標的特異的領域の５’末端に位置し得る。

捕捉プローブとハイブリダイズさせたら、鋳型核酸分子を３’から５’のエキソヌクレアーゼと接触させて、鋳型核酸のあらゆる３’突出を消化することができる。消化後、鋳型核酸分子の３’末端を伸長させて、アダプターと相補的な配列を含む伸長産物を生成することができる。架橋プローブと鋳型とがハイブリダイズしたら架橋プローブの３’末端を伸長させて、アダプターを含む伸長産物を生成することもできる。

架橋プローブは、鋳型核酸分子の後の配列決定、検出、同定、測定、および／または解析のために、結合した鋳型核酸分子を独自に同定するための分子バーコード（ＭＢ）をさらに含み得る。
ＩＩ．直接ハイブリダイゼーションによるプローブ付加

本明細書に開示される方法は、捕捉プローブの鋳型への直接ハイブリダイゼーションおよびライゲーションを含み得る。捕捉プローブは、プライマーをハイブリダイズさせることができるアダプターを含み得る。配列決定および／またはライブラリー構築のためにプライマーを使用して増幅を実施することができる。
ａ．アダプターを使用した標的化プローブの近接ライゲーションおよび増幅

捕捉プローブの標的特異的領域を鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズさせるステップと、鋳型核酸分子の３’末端を捕捉プローブの５’末端に結合させ、それにより、捕捉プローブに結合した鋳型核酸分子を生成するステップと、第１のアダプタープライマーを捕捉プローブの第１のアダプターにハイブリダイズさせるステップと、第１のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップと、第２のアダプターを第１の伸長産物の３’末端に結合させ、それにより、第２のアダプターに結合した第１の伸長産物を生成するステップとを含む方法が本明細書に開示される。

捕捉プローブは、鋳型を独自に同定するため、および／または捕捉プローブの鋳型核酸分子に対する特異性を保証するための独自の同定用配列を有する分子バーコード（ＭＢ）を含み得る。アダプター、例えば、二本鎖である第２のアダプターの一方の鎖の鋳型核酸分子へのライゲーションを容易にするために、鋳型核酸分子は、その５’末端をリン酸化することができる。鋳型核酸分子を増幅するために、第２のアダプターにハイブリダイズする第２のアダプタープライマーを第１のアダプタープライマーと一緒に使用することができる。鋳型核酸分子を増幅するために、鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズするプライマーを第１のアダプタープライマーと一緒に使用することができる。

図１Ａは、捕捉プローブの鋳型核酸分子への直接ハイブリダイゼーションおよび捕捉プローブの鋳型へのライゲーションの方法を例示する。核酸、例えば、標的配列（ハッシュマーク、ＴＳ）を含有する二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを鋳型として使用することができる。鎖の一方は損傷（例えば、ニック）を有し得る。捕捉プローブは、鋳型のＴＳに相補的な標的特異的領域（ＴＳＲ）および第１のアダプター（ＡＤ１）を含み得る。捕捉プローブの５’末端をリン酸化することができる。鋳型は、その５’末端で脱リン酸化され得る。捕捉プローブのＴＳＲを鋳型のＴＳにハイブリダイズさせることができ、ハイブリダイゼーション後に極めて近接になることに起因して、捕捉プローブのリン酸化された５’末端を鋳型の３’末端にライゲーションすることができる。図１Ｂに示されている通り、第１のアダプタープライマー（ＡＤ１プライマー）を捕捉プローブの第１のアダプター（ＡＤ１）にハイブリダイズさせ、例えば鎖置換機構を用いて伸長させて、相補鎖を合成することができる。図１Ｃは、ＴＳをさらに増幅するための、ライゲーションした第２のアダプター（ＡＤ２）の使用を例示する。二本鎖ＡＤ２を鋳型およびその伸長産物にライゲーションすることができ、各末端においてＡＤ１およびＡＤ２にアニーリングするプライマーを使用してＰＣＲを実施し、それにより、ＴＳを増幅し、ライブラリーを生成することができる。一部の場合では、一本鎖ＡＤ２アダプターを伸長産物の３’とライゲーションする。捕捉プローブは、その後の解析において鋳型を独自に同定するための独自の分子バーコード（ＭＢ）を含み得る。

捕捉プローブが鋳型に結合したら、増幅のために異なるプライマーを用いることができる。図２Ｃに示されている通り、ＡＤ１にハイブリダイズするプライマーおよびＴＳの相補物にハイブリダイズするプライマーを使用して標的配列（ＴＳ）を増幅することができる。別の実施形態では、プライマーを、ＴＳの相補物に隣接する領域（例えば、ＴＳの相補物の５’または３’のいずれか）にアニーリングするように設計することができる。

捕捉プローブを鋳型にライゲーションした後にＴＳＲを捕捉プローブから脱離させるまたは切断することができる。切断により、ヘアピンループを除去することができる。元の鋳型鎖は、ＴＳＲとＴＳとのハイブリダイゼーションおよび捕捉プローブの鋳型へのライゲーションによって形成されたヘアピンループがＡＤ１へのプライマーアニーリングおよびその後の伸長に干渉する可能性があるので、ＰＣＲ反応に望ましい鋳型ではない場合がある。例えば図４Ａおよび４Ｂに示されている通り、ＴＳＲを、例えば、ＴＳＲの５’末端とＡＤ１の３’末端との間で、例えば、捕捉プローブの鋳型への近接ライゲーション後に制限酵素によって切断することができる。切断されたＴＳＲを鋳型から除去することができ、ＴＳＲの除去後に伸長反応においてＡＤ１プライマーを使用して鋳型を増幅することができる（例えば、図４Ｃを参照されたい）。
ｂ．ＴＳＲを使用した標的化プローブの近接ライゲーションおよび増幅

捕捉プローブの３’末端は、別々の伸長プライマーを必要とせずに鋳型の核酸分子に相補的な鎖を合成するための伸長プライマーとしての機能を果し得る。図３Ａ～３Ｃは、捕捉プローブの鋳型への近接ライゲーション後に鋳型を増幅するための、捕捉プローブのＴＳＲ領域の可能性のある使用を例示する。ハイブリダイズした捕捉プローブは、その５’末端が鋳型の３’末端にライゲーションすると、ヘアピンループを形成し得る（例えば、図３Ａおよび図３Ｂを参照されたい）。ＴＳＲ（捕捉プローブの３’末端における）をプライマーと同様に鋳型の５’末端に向かって伸長させ、それにより、鋳型にハイブリダイズする相補配列を形成することができる（例えば、図３Ｂ～３Ｃを参照されたい）。二本鎖ＡＤ２を、ループ形成し、伸長した鋳型の末端にライゲーションすることができる（例えば、図３Ｃを参照されたい）。一部の場合では、一本鎖ＡＤ２アダプターを鋳型の５’末端にライゲーションすることができる。ＡＤ２の鎖が鋳型にライゲーションすることを確実にするために、鋳型の５’末端をリン酸化することができる。次いで、鋳型鎖を、ＡＤ１へのプライマーアニーリングおよびＡＤ２配列を使用してさらに増幅することができる（例えば、図３Ｃを参照されたい）。
ＩＩＩ．間接的会合によるプローブ付加

プローブを鋳型と間接的に会合させ、鋳型に近接ライゲーションすることができる。この方法により、捕捉プローブパネルの設計に柔軟性をもたらすことができ、ライゲーション後にＴＳＲを鋳型から脱離させることを可能にすることができる。架橋プローブは、鋳型のＴＳにハイブリダイズするＴＳＲおよびアダプターアンカープローブの架橋結合配列（ＢＢＳ）にハイブリダイズするアダプターランディング配列（ＡＬＳ）を含み得る。鋳型と架橋プローブとの間のハイブリダイゼーションおよび架橋プローブとアダプターアンカープローブとの間のハイブリダイゼーションにより、アダプターアンカープローブが鋳型に近づき、それにより、アダプターアンカープローブの鋳型へのライゲーションが容易になる。アダプターアンカープローブは、ＡＤ１、独自の識別子、ＭＢ、および５’リン酸をさらに含み得る。
ａ．アダプターを使用した標的化プローブの近接ライゲーションおよび増幅

第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域（ＴＳＲ）を鋳型核酸分子の第１の標的配列（ＴＳ）にハイブリダイズさせるステップであって、第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列（ＡＬＳ）が第１のアダプターアンカープローブの架橋結合配列（ＢＢＳ）に結合する、ステップと、鋳型核酸分子の３’末端にアダプターアンカープローブの５’末端に結合させ（例えば、ライゲーション）、それにより、アダプターアンカープローブに結合した鋳型核酸分子を生成するステップとを含む方法が本明細書に開示される（例えば、図５Ａおよび図６Ａを参照されたい）。第１の架橋プローブは、標的特異的領域（ＴＳＲ）とＡＬＳとを接続するリンカーをさらに含み得る（例えば、図５Ａおよび図６Ａを参照されたい）。

アダプターアンカープローブは、その後の解析において鋳型を独自に同定するため（例えば、図５Ａおよび図６Ａを参照されたい）および／または捕捉プローブの鋳型核酸分子に対する特異性を保証するための独自の同定用配列を有するＭＢを含み得る。第２のアダプター（例えば、一本鎖または二本鎖アダプター）の１つの鎖の鋳型核酸分子へのライゲーションを容易にするために、鋳型核酸分子をその５’末端でリン酸化することができる（例えば、図５Ａおよび図６Ａを参照されたい）。鋳型核酸分子を増幅するために、第２のアダプターにハイブリダイズする第２のアダプタープライマーを第１のアダプタープライマーと一緒に使用することができる。一部の場合では、鋳型核酸分子を増幅するために、鋳型核酸分子の標的配列（ＴＳ）の相補物にハイブリダイズするプライマーを第１のアダプタープライマーと一緒に使用することができる（例えば、図６Ｃを参照されたい）。第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域（ＴＳＲ）は、第１の架橋プローブの３’部位に存在し得る（例えば、図５Ａおよび６Ａを参照されたい）。第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域（ＴＳＲ）は第１の架橋プローブの５’部位に存在し得る（例えば、図７Ａを参照されたい）。アダプターアンカープローブを架橋プローブを通じて鋳型と会合させることができ、アダプターアンカープローブのリン酸化された５’末端を鋳型の３’末端にライゲーションすることができ、それにより、アダプターアンカープローブのＡＤ１およびＭＢを鋳型に結合させることができる（例えば、図５Ａ、６Ａ、７Ａ、および８Ａを参照されたい）。ライゲーションした鋳型を、ＡＤ１にアニーリングするプライマーおよびＡＤ２にアニーリングするプライマーのいずれかを使用して（例えば、図５Ｃおよび７Ｃを参照されたい）またはＡＤ１にアニーリングするプライマーおよびＴＳの相補物にアニーリングするプライマーを使用して（例えば、図６Ｃを参照されたい）増幅することができる。アダプターアンカープローブはＴＳＲを欠き得る；アダプターアンカープローブがＴＳＲを欠く場合、アダプターアンカープローブは鋳型と二本鎖を形成しない。一部の場合では、アダプターアンカープローブと鋳型との間の直接ハイブリダイゼーションは、プライマーアニーリング、例えば、ＡＤ１プライマーのアダプターアンカープローブ内のＡＤ１アダプターへのアニーリングに干渉し得る。
ｂ．ＴＳＲを使用した標的化プローブの近接ライゲーションおよび増幅

第１の架橋プローブの３’末端のＴＳＲをプライマーと同様に伸長させて、第１の伸長産物を生成することができる（例えば、図８Ｂを参照されたい）。第２のアダプター（ＡＤ２）を第１の伸長産物に結合させることができ、ＡＤ２プライマーをＡＤ１プライマーと共に使用して鋳型を増幅することができる（例えば、図８Ｃを参照されたい）。ＡＤ２は二本鎖であり得、鋳型および第１の伸長産物に結合し得、これは、鋳型の５’末端のリン酸化によって容易になる（例えば、図８Ｃを参照されたい）。一部の場合では、ＡＤ２は一本鎖であり、鋳型の５’末端にライゲーションする。他の実施形態では、ＡＤ１およびＴＳの相補物にアニーリングするプライマーを使用して標的配列を増幅することができる。

図８Ａ～８Ｃは、ＴＳＲ（架橋プローブの３’末端）を使用した伸長反応の例を例示する。架橋プローブの３’末端のＴＳＲは、鋳型と相補的な配列を有する第１の伸長産物を合成するための伸長プライマーとしての機能を果し得る（例えば、図８Ｂを参照されたい）。二本鎖ＡＤ２のライゲーションを容易にするために、鋳型の５’末端をリン酸化することができる（例えば、図８Ｃを参照されたい）。一部の場合では、一本鎖ＡＤ２を鋳型の５’末端にライゲーションする。鋳型を、ＡＤ１配列にアニーリングするプライマーセットおよびＡＤ２配列（またはＡＤ２の相補物）にアニーリングするプライマーセットによって増幅することができる。
ｃ．多数の標的化プローブ架橋プローブのハイブリダイゼーションおよび近接ライゲーション

本方法は、第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域（ＴＲＳ２）を鋳型核酸分子の第２の標的配列（ＴＳ２）にハイブリダイズさせるステップであって、第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列（ＡＬＳ２）がアダプターアンカープローブ第２の架橋結合配列（ＢＢＳ２）に結合する、ステップをさらに含み得る（例えば、図９～１２を参照されたい）。第２の架橋プローブは、第２の標的特異的領域（ＴＳＲ２）とＡＬＳ２とを接続するリンカーをさらに含み得る（例えば、図９～１２を参照されたい）。第２の架橋プローブは、第２の標的特異的領域（ＴＳＲ２）と第２のアダプターランディング配列（ＡＬＳ２）との間に第２のリンカーを含み得る。

例えば、図９に例示されている通り、第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域（ＴＳＲ１）は、第１の架橋プローブの３’部位に存在し得、第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域（ＴＳＲ２）は、第２の架橋プローブの３’部位に存在し得る。第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域（ＴＳＲ１）は第１の架橋プローブの５’部位に存在し得、第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域（ＴＳＲ２）は第２の架橋プローブの５’部位に存在し得る（例えば、図１０を参照されたい）。第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域（ＴＳＲ１）は第１の架橋プローブの５’部位に存在し得、第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域（ＴＳＲ２）は第２の架橋プローブの３’部位に存在し得る（例えば、図１２を参照されたい）。第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域（ＴＳＲ１）は第１の架橋プローブの３’部位に存在し得、第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域（ＴＳＲ２）は第２の架橋プローブの５’部位に存在し得る（例えば、図１１を参照されたい）。第１の架橋プローブのリンカーは、第２の架橋プローブのリンカーにさらにハイブリダイズし得る。第１の架橋プローブと第２の架橋プローブとのハイブリダイゼーションにより、４つの核酸分子のアセンブリを安定化することができ、アダプターアンカープローブの５’末端の鋳型の３’末端へのライゲーションを容易にすることができる（例えば、図１１を参照されたい）。

本明細書に記載の方法では２種よりも多くの架橋プローブを使用することができる。本明細書に記載の方法では、例えば、鋳型とアダプターアンカープローブとの間を架橋するために、少なくとも２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、２５種、５０種、７５種、１００種、またはそれよりも多くの架橋プローブを使用することができる。
ＩＶ．直接ハイブリダイゼーションによるアダプター付加

本明細書に開示される方法は、捕捉プローブと鋳型核酸との直接ハイブリダイゼーション、および捕捉プローブのアダプターの伸長産物への付加または組み入れを含み得る。捕捉プローブは、プライマーをハイブリダイズさせることができるアダプターを含み得る。配列決定および／またはライブラリー構築のためにプライマーを使用して増幅を実施することができる。捕捉プローブは、分子バーコードをさらに含み得る。アダプター付加は、捕捉プローブを鋳型核酸にライゲーションすることなく行うこともできる。

無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）および循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）などの低インプット試料から鋳型核酸分子を捕捉し、富化することができる。捕捉および富化は、捕捉プローブの直接ハイブリダイゼーションによって行うことができる。捕捉プローブは、１つまたは複数の結合性部分を含み得る。結合性部分はビオチンであり得る。結合性部分は、支持体に結合され得る。支持体はビーズであり得る。ビーズはストレプトアビジンビーズであり得る。

図１９Ａ～１９Ｃは、捕捉プローブの鋳型核酸への直接ハイブリダイゼーション後にアダプターを付加するまたは組み入れる様々な方法を例示する。標的配列（ハッシュマーク、ＴＳ）を含有する核酸を鋳型として使用することができる。捕捉プローブは、鋳型のＴＳに相補的な標的特異的領域（ＴＳＲ）およびアダプター（ＡＤ）を構成し得る。図１９Ａは、捕捉プローブを用いた鋳型核酸のハイブリダイゼーションまたは捕捉、その後のアダプターの鋳型への直接結合を示す。図１９Ｃは、アダプターを含む捕捉プローブの、鋳型へのハイブリダイゼーション後の鋳型への結合を示す。標的配列（ハッシュマーク、ＴＳ）を含有する核酸を鋳型として使用することができる。捕捉プローブは、鋳型のＴＳに相補的な標的特異的領域（ＴＳＲ）およびアダプター（ＡＤ）を構成し得る。
ａ．エキソヌクレアーゼ消化後のアダプター付加

捕捉プローブの標的特異的領域を鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、捕捉プローブが、標的特異的領域の５’末端に位置する第１のアダプターをさらに含む、ステップと、鋳型核酸分子を、標的特異的領域をハイブリダイズさせた後に、３’から５’のエキソヌクレアーゼと接触させるステップと、鋳型核酸分子の３’末端を伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップとを含む方法が本明細書に開示される。本方法は、第１のアダプターを含むプライマーを第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、第１のアダプターを含むプライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップとをさらに含む。一部の場合では、捕捉プローブの３’末端を伸長させて、第２の伸長産物を生成することができる。

図１９Ｂは、捕捉プローブを用いた鋳型核酸分子のハイブリダイゼーションまたは捕捉、その後の３’から５’のエキソヌクレアーゼを用いた一本鎖３’突出の消化を例示する。消化後、捕捉プローブのアダプターを鋳型として使用して鋳型核酸を伸長させ、したがって、アダプターを伸長産物に組み入れる。

図２２Ａ～２２Ｇは、ハイブリダイゼーション、消化、および伸長についてのステップをさらに例示する。図２２Ｅは、標的特異的プライマーを第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップであって、標的特異的プライマーを第２のアダプターに結合させる、ステップ；および標的特異的プライマーを伸長させて第３の伸長産物を生成するステップを示す。第２の伸長産物および第３の伸長産物をさらに増幅して図２２Ｇの増幅産物を生成することができる。

一部の場合では、開示されている方法は、図２２Ｆに示されている通り、第２のアダプターを第１の伸長産物の５’末端に結合させるステップを含み得る。第２のアダプターの結合を容易にするために、第１の伸長産物の５’末端をリン酸化することができる。第２のアダプターは二本鎖アダプターであり得、第２のアダプターの２本の鎖のうちの一方が第２の伸長産物に結合する。第２のアダプターの結合後、第１の伸長産物および第２の伸長産物を増幅して図２２Ｇの増幅産物を生成することができる。
ｂ．捕捉プローブ伸長後のアダプター付加

ハイブリダイズしたまたは捕捉された鋳型核酸分子を、別々の伸長プライマーを必要とせずに、捕捉プローブの３’末端を伸長させて第１の伸長産物を生成することによって増幅することもできる。捕捉プローブはアダプターを含み得る。

本方法は、第２のアダプターを第１の伸長産物の３’末端に結合させ、それにより、第２のアダプターに結合した第１の伸長産物を生成するステップをさらに含み得る。第２のアダプターの鋳型への結合またはライゲーションを容易にするために、鋳型核酸の５’末端をリン酸化することができる。第２のアダプターは二本鎖アダプターであり得る。二本鎖である第２のアダプターの２本の鎖のうちの一方を鋳型核酸分子に結合させることができる。第２のアダプタープライマーを、第１の伸長産物に結合した第２のアダプターにハイブリダイズさせ、伸長させて第２の伸長産物を生成することができる。第２のアダプターに結合した第１の伸長産物および第２の伸長産物を増幅して増幅産物を生成することができる。

一部の場合では、標的特異的プライマーを、第２のアダプターに結合させた第１の伸長産物にハイブリダイズさせることができる。標的特異的プライマーを伸長させて、第２のアダプターに結合した、第１の伸長産物の相補鎖（第２の伸長産物）を合成することができる。第１の伸長産物および第２の伸長産物を増幅して、より多くの増幅産物を形成することができる。

アダプターを伸長産物に、アダプターが直接または間接的な相互作用のいずれか（either direct indirect interaction）で結合したハイブリダイズした標的プローブを伸長させることによって付加することができる（図２５Ａ、上および中央）。チミンをＤＮＡ鋳型にターミナルヌクレアーゼトランスフェラーゼによって付加することができる（図２５Ａ、下を参照されたい）。ポリ－アデニン（ポリＡ）オリゴヌクレオチドを伸長した鋳型の３’－ポリＴにハイブリダイズさせることができる。図２５Ｂに例示されている通り、ポリＡオリゴヌクレオチドをアダプターに結合させることができ、したがって、ポリＡの３’末端を伸長させた場合に、第１の伸長産物に第１のアダプターを含めることができる。ポリ－シトシン（ポリＣ）を伸長産物の３’末端に付加することができ、これは、第２のアダプターに結合させたポリ－グアニン（ポリＧ）プライマーと相補的に結合し得る（図２５Ｃ）。次いで、ポリＧ－アダプターは、ヌクレオチド付加プロセスを継続することを可能にするための鋳型および第１の伸長産物に付加される第２のアダプターとしての機能を果たし得る（図２５Ｄを参照されたい）。
Ｖ．間接的会合によるアダプター付加

アセンブリを形成する鋳型核酸と１つまたは複数のプローブとの相乗的な相互作用により、標的プローブハイブリダイゼーションを容易にすることができる。多重複合アセンブリにより、鋳型と標的プローブとの間のハイブリダイゼーション相互作用を安定化することができる。架橋プローブは、鋳型の標的領域とハイブリダイズする標的特異的領域およびアダプターアンカープローブの架橋結合配列（ＢＢＳ）にハイブリダイズするアダプターランディング配列（ＡＬＳ）を含み得る。鋳型と架橋プローブとの間のハイブリダイゼーションおよび架橋プローブとアダプターアンカープローブとの間のハイブリダイゼーションにより、多重複合アセンブリを形成することができる。架橋プローブは、ＡＤ１、独自の識別子、ＭＢ、および／または５’リン酸をさらに含み得る。架橋プローブを使用することによって伸長産物を合成することができる。架橋プローブまたはアダプターアンカープローブを鋳型核酸にライゲーションせずにアダプターを伸長産物に付加するまたは組み入れることもできる。本明細書に開示される方法では２種よりも多くの架橋プローブを使用することができる。例えば、鋳型とアダプターアンカープローブとを架橋するために、少なくとも２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、２５種、５０種、７５種、１００種、またはそれよりも多くの架橋プローブを使用することができる。

無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）および循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）などの低インプット試料から鋳型核酸を捕捉し、富化することができる。捕捉および富化は、架橋プローブへのハイブリダイゼーションを通じたアダプターアンカープローブとの間接的会合によって行うことができる。架橋プローブおよび／またはアダプターアンカープローブは、１つまたは複数の結合性部分を含み得る。結合性部分はビオチンであり得る。結合性部分は、支持体に結合され得る。支持体はビーズであり得る。ビーズはストレプトアビジンビーズであり得る。

図２０Ａ～２０Ｄは、架橋プローブおよびアダプターアンカープローブへのハイブリダイゼーションまたは捕捉後に鋳型核酸にアダプターを付加するまたは組み入れることに関する異なる方法を示す。図２０Ａは、捕捉された鋳型核酸へのアダプターのライゲーションを例示する。図２０Ｄは、アダプターを含むアダプターアンカープローブの鋳型への、ハイブリダイゼーション後の近接ライゲーションを示す。

本方法は、第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域を鋳型核酸分子の第２の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列がアダプターアンカープローブの第２の架橋結合配列に結合し得る、ステップをさらに含み得る（例えば、図２１Ａ～２１Ｅを参照されたい）。第２の架橋プローブは、第２の標的特異的領域と第２のアダプターランディング配列とを接続するリンカーをさらに含み得る。
ａ．架橋プローブ伸長後のアダプター付加

第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域を鋳型核酸分子の第１の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列がアダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列に結合し得る、ステップと、第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域を鋳型核酸分子の第２の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列がアダプターアンカープローブの第２の架橋結合配列に結合し得る、ステップと、第１の架橋プローブの３’末端を伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップとを含む方法が本明細書に開示される。第１の架橋プローブは、第１のアダプターを含み得る。

本方法は、第２のアダプターを第１の伸長産物の３’末端に結合させるステップをさらに含み得る。第２のアダプターは二本鎖アダプターであり得る。第２のアダプターの２本の鎖のうちの一方を鋳型核酸分子に結合させることができる。第２のアダプターを鋳型に結合させる前に、鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化することができる。

あるいは、標的特異的プライマーを第１の伸長産物にハイブリダイズさせることができ、伸長させて第２の伸長産物を生成することができる。標的特異的プライマーは、第２のアダプターに結合され得る。第１のアダプターを含むプライマーを第２の伸長産物にハイブリダイズさせることができ、伸長させて第３の伸長産物を生成することができる。第２の伸長産物および第３の伸長産物を増幅することにより、さらなる増幅産物を生成することができる。

図２０Ｂは、標的核酸分子を鋳型として使用して架橋プローブの３’末端を伸長させることによる伸長産物へのアダプターの組み入れを示す。

図２３Ａ～２３Ｆは、１つまたは複数のアダプターの伸長産物への組み入れを例示する。図２３Ａ～２３Ｃは、第１の架橋プローブのハイブリダイゼーションおよび伸長、ならびに第１の伸長産物を示す。標的特異的プライマーを第１の伸長産物にハイブリダイズさせ、伸長させて、第１の伸長産物の相補鎖を合成することができ、第１のアダプターを含むプライマーを第２の伸長産物にハイブリダイズさせて第２の伸長産物と相補的な配列を生成することができる（図２３Ｄを参照されたい）。図２３Ｆに示されている通り、第２の伸長産物および第３の伸長産物を増幅して増幅産物を生成することができる。別の場合では、第２の（二本鎖）アダプターを第１の伸長産物の３’末端および鋳型核酸分子の５’末端に結合させることができる（図２３Ｅを参照されたい）。第２のアダプターを結合させる前に鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化することができる。架橋プローブは、鋳型核酸分子の後の配列決定、検出、同定、測定、および／または解析のために、結合した鋳型を独自に同定するために、伸長産物に組み入れることができる分子バーコードをさらに含み得る。

ハイブリダイズした、アダプターに結合した架橋プローブを伸長させることにより、アダプターを伸長産物に付加するまたは組み入れることができる。鋳型核酸分子に対する３’プライマー伸長を最初に実施することによってアダプターを伸長産物に付加することもできる。ターミナル核酸トランスフェラーゼによってポリ－チミン（ポリＴ）オリゴヌクレオチドをＤＮＡ鋳型の３’末端に付加することができる。ポリ－アデニン（ポリＡ）オリゴヌクレオチドを伸長した鋳型の３’－ポリＴにハイブリダイズさせることができる。ポリＡオリゴヌクレオチドをアダプターに結合させることができ、したがって、ポリＡの３’末端を伸長させた場合に、第１の伸長産物は第１のアダプターを含むことができる。ポリ－シトシン（ポリＣ）を第１の伸長産物の３’末端に付加することができ、これは、第２のアダプターに結合させたポリ－グアニン（ポリＧ）プライマーと相補的に結合し得る。ポリＧ－アダプターは鋳型としての機能を果し得、第１の伸長産物をさらに伸長させて第２のアダプターを付加することができる。
ｂ．エキソヌクレアーゼ消化後のアダプター付加

架橋プローブにハイブリダイズしたら、鋳型は、一本鎖３’突出を有し得る。３’突出を、３’から５’のエキソヌクレアーゼとして作用する酵素を用いて消化することができる。第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域を鋳型核酸分子の第１の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列がアダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列に結合し、第１の架橋プローブが、標的特異的領域の５’末端に位置する第１のアダプターをさらに含む、ステップと、鋳型核酸分子を、標的特異的領域をハイブリダイズさせた後に、３’から５’のエキソヌクレアーゼと接触させるステップと、鋳型核酸分子の３’末端を第１のアダプターを鋳型として使用して伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップとを含む方法が本明細書に提示される（図２０Ｃを参照されたい）。

図２４Ａ～２４Ｆは、３’から５’のエキソヌクレアーゼを用いた消化後に、１つまたは複数のアダプターを伸長産物に組み入れるステップをさらに例示する。図２４Ａ～２４Ｃは、多数の架橋プローブを鋳型およびアダプターアンカープローブにハイブリダイズさせ、その後、鋳型の３’末端を第１の架橋プローブの第１のアダプターを鋳型として使用して伸長させて、第１のアダプターと相補的な配列を含む第１の伸長産物を生成することを示す。第１の伸長産物を第１のアダプターを含むプライマーとハイブリダイズさせ、プライマーの３’末端を伸長させて、第２の伸長産物を生成することができる（図２４Ｄ～２４Ｅを参照されたい）。標的特異的プライマーを第２の伸長産物にハイブリダイズさせることができ、３’末端を伸長させて第３の伸長産物を生成することができる（図２４Ｄを参照されたい）。標的特異的プライマーを第１の伸長産物にハイブリダイズさせる前に第２のアダプターを標的特異的プライマーに結合させることができる。第２の伸長産物および第３の伸長産物を増幅してより多くの増幅産物を生成することができる（図２４Ｆ）。図２４Ｅに例示されている通り、第２の（二本鎖）アダプターを第１の伸長産物の５’末端および第２の伸長産物の３’末端に結合させることができる。第２のアダプターを結合させる前に第１の伸長産物をリン酸化する必要があり得る。

一部の場合では、第１の架橋プローブの３’末端を伸長させる前、それと同時に、またはその後に鋳型核酸分子の３’末端を伸長させて第１の伸長産物および第２の伸長産物を生成することができる。鋳型核酸の３’を伸長させる前に鋳型核酸分子を３’から５’のエキソヌクレアーゼと接触させて、あらゆる３’突出を除去することができる。
ＶＩ．バイサルファイト変換のワークフロー

核酸をバイサルファイト処理するための方法が本明細書に提示される。バイサルファイト処理された核酸を使用して、核酸のメチル化を研究することができる。バイサルファイト処理により、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換することができる。シトシンのメチル化（例えば、５’－メチルシトシン）により、バイサルファイトによりメチル化されたシトシンがウラシルに変換されるのを防止することができる。

捕捉プローブを鋳型にライゲーションした後、得られた産物をバイサルファイトで処理することができる（例えば、図１３Ｂを参照されたい）。二本鎖配列の形成（例えば、鋳型のＴＳと捕捉プローブのＴＳＲとの間での）により、バイサルファイト処理中、ハイブリダイズした領域内のシトシンをウラシルへの変換から保護することができる（例えば、図１４を参照されたい）。架橋プローブを鋳型に、アダプターアンカープローブにハイブリダイズさせることによって形成された二本鎖配列により、ハイブリダイズした領域内のシトシンをウラシルへのバイサルファイトによる変換から保護することができる。さらに、バイサルファイト処理によりメチル化されていないシトシンをウラシルに変換することができるので、ＴＳ領域におけるシトシンのウラシルへの変換から保護することにより、バイサルファイト変換されていないＤＮＡにアニーリングするように設計された増幅プライマーの使用が可能になり得る。バイサルファイト変換前捕捉のために、変換されていない配列に対してプローブを設計することもできる。変換されていないシトシンにアニーリングするプローブおよびプライマーは、設計がより簡単であり得、また、より良好なハイブリダイゼーションをもたらす。
ａ．標的プローブの鋳型核酸へのハイブリダイゼーションおよび／またはライゲーション後のバイサルファイト処理

本明細書に記載の通り、鋳型核酸（例えば、ＤＮＡ）を、標的化アダプター近接ライゲーションおよび富化（ＴＡＬＥ）ならびにその後の配列決定（ＴＡＬＥ－ＳＥＱ）に使用することができる（例えば、図１３Ｂを参照されたい（１３１０）；（１３１２））。鋳型核酸（例えば、ＤＮＡ）は、例えば、ゲノムＤＮＡ、またはｃｆＤＮＡであり得る。例えば、本明細書に記載の通り、例えば、図１Ａ～図１２および図１７に例示されている通り、鋳型核酸（例えば、ＤＮＡ）を捕捉プローブまたはアダプターアンカープローブに、近接ライゲーションによって結合させることができる（１３１４）。捕捉プローブまたはアダプターアンカープローブに結合させた鋳型核酸（例えば、ＤＮＡ）をバイサルファイトで処理し（１３１６）、伸長させ（１３１８）、その後、例えば、メチル化シーケンシングのために、増幅することができる（１３２０）。一部の場合では、捕捉プローブのＴＳＲを脱離させる前にバイサルファイト処理を行うことができる（例えば、図４Ｂを参照されたい）。一部の場合では、捕捉プローブまたは架橋プローブを鋳型核酸分子にハイブリダイズさせた後にバイサルファイト処理を実施することができる。捕捉プローブまたは架橋プローブにハイブリダイズした鋳型核酸分子をバイサルファイトで処理し、伸長させ、その後、メチル化シーケンシングのために増幅することができる。

捕捉プローブの標的特異的領域または架橋プローブは、鋳型核酸分子の標的配列に基づいて設計されたものであり得、鋳型核酸分子の標的配列は、バイサルファイト処理後にメチル化されていないシトシンを保持し得る。

図１４は、鋳型へのＴＳおよびＴＳＲのハイブリダイゼーションならびに捕捉プローブのライゲーション後に行われるバイサルファイト処理中のＴＳおよびＴＳＲ部位内のメチル化されていないシトシンのウラシルへの変換からの保護を例示する。この実施例では、捕捉プローブが鋳型にハイブリダイズし、捕捉プローブの５’末端が鋳型の３’末端に近接ライゲーションし、二本鎖領域およびヘアピンループが形成される（例えば、図１４を参照されたい）。その後、結合した鋳型をバイサルファイトで処理し、その間、ハイブリダイズしたＴＳＲ－ＴＳ領域内のメチル化されていないシトシンはウラシルに変換されないが、一方、一本鎖領域内の（ループ内の）メチル化されていないシトシンはウラシルに変換される。ＴＳ領域においてシトシンのウラシルへの変換から保護されることにより、バイサルファイト変換されていないＤＮＡにアニーリングするように設計されたプローブの使用が可能になり得る。一部の場合では、プライマー結合性部位（例えば、アダプターおよび／または鋳型内）の１つまたは複数のシトシン残基はバイサルファイト変換から保護されない。バイサルファイト変換後、アダプター内のプライマー結合性部位は、１つまたは複数のウラシルを含み得る。プライマーは、１つまたは複数のウラシルを含むアダプター配列と相補的になるように設計することができる。プライマーは、１つもしくは複数のウラシルを含むアダプター配列に対して１００％相補的、または１つもしくは複数のウラシルを含むアダプター配列に対して１００％未満相補的であり得る。

鋳型は、バイサルファイト処理後に１つまたは複数のウラシルを含み得る。アダプターにアニーリングしたプライマーは、鎖の伸長のために１つまたは複数のウラシルを含む鋳型を使用することができる。伸長した鎖は、１つまたは複数のウラシルに対合する塩基である１つまたは複数のアデニンを含み得る。伸長産物を鋳型から変性させることができる。プライマーを伸長産物に、１つまたは複数のアデニンを含む領域内でアニーリングさせ、伸長させることができる。プライマーを、例えば、アダプタープライマーを用いた鋳型の増幅に使用することができる。
ｂ．標的プローブの鋳型へのハイブリダイゼーションおよび／またはライゲーション前のバイサルファイト処理

鋳型核酸分子を、捕捉プローブまたは架橋プローブへのハイブリダイゼーションおよび捕捉プローブまたはアダプターアンカープローブへのライゲーションの前にバイサルファイト処理することができる（例えば、図１３Ａを参照されたい（１３００））。ＤＮＡをバイサルファイトで処理して、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換することができる（１３０２）。バイサルファイト処理されたＤＮＡを標的化アダプター近接ライゲーションおよび富化（ＴＡＬＥ）ならびにその後の配列決定（ＴＡＬＥ－ＳＥＱ）（１３０４）のためのインプットとして使用することができる。例えば、図１Ａ～図１２および図１７に例示されている通り、バイサルファイト処理されたＤＮＡを、近接アダプターライゲーション（１３０６）のためのインプットとして使用することができる。プローブのＴＳＲは、既存のメチル化されていないシトシンがウラシルに変換されている鋳型にアニーリングするように設計することができる。近接アダプターライゲーション後、伸長（１３０６）を実施し、その後、標的増幅（１３０８）を行うことができる。
ＶＩＩ．クリーンアップ／特異性
ａ．エキソヌクレアーゼを使用したオフターゲット核酸分子またはランダムなライゲーション産物のクリーンアップ

一部の場合では、捕捉プローブのＴＳＲが鋳型にアニーリングすることなしに、捕捉プローブの５’末端を鋳型の３’末端にライゲーションすることができる。アダプターアンカープローブが架橋プローブを介した鋳型との会合なしで、アダプターアンカープローブの５’末端を鋳型の３’末端にライゲーションすることができる。これらのライゲーション事象の産物は、望ましくないものであり得る。直接ハイブリダイゼーションおよびライゲーションステップの後に、得られた核酸分子混合物にエキソヌクレアーゼを添加して、プローブの鋳型へのあらゆる非特異的結合を消化することができる。

ある実施例では、捕捉プローブのＴＳＲが鋳型のＴＳへのアニーリングなしで、捕捉プローブの５’末端を鋳型の３’末端にライゲーションすることができ、その結果、直鎖状分子（例えば、ステムループを欠いた分子）がもたらされる（例えば、図１５Ｂを参照されたい）。捕捉プローブのＴＳＲの鋳型のＴＳとのハイブリダイゼーションに基づくあらゆる特異的結合の結果、鋳型をエキソヌクレアーゼ（例えば、３’から５’のエキソヌクレアーゼ）による消化から保護するヘアピンループがもたらされ得る（例えば、図１５Ａを参照されたい）。図１５Ａは、捕捉ＴＳＲの鋳型ＴＳへの特異的ハイブリダイゼーションおよび捕捉プローブの５’末端の鋳型の３’末端へのライゲーションを示す。ハイブリダイゼーションおよびライゲーションにより、鋳型をエキソヌクレアーゼ（例えば、３’から５’のエキソヌクレアーゼ）消化から保護するヘアピンループが形成され得る。鋳型の５’末端は、５’から３’のエキソヌクレアーゼによる切断を防止することができる遮断物を含み得る。図１５Ｂは、捕捉プローブの５’末端の鋳型の３’末端へのライゲーションを示し、ここで、鋳型のＴＳＲは鋳型のＴＳにアニーリングしない、または鋳型のＴＳＲはＴＳを含まない。１つまたは複数の架橋プローブを使用する場合には、アダプターアンカープローブの５’末端を鋳型の３’末端にライゲーションすることができ、前記アダプターアンカープローブは鋳型に１つまたは複数の架橋プローブを通じて会合している。ライゲーションの結果、エキソヌクレアーゼ（例えば、３’から５’のエキソヌクレアーゼ）消化から保護するためのヘアピンループ形成はもたらされず、オフターゲットのランダムなライゲーション産物の分解がもたらされる。図１５Ｂは、遊離の鋳型、遊離の捕捉プローブ、および捕捉プローブと鋳型とのオフターゲットライゲーション産物を切断するエキソヌクレアーゼ（例えば、３’から５’のエキソヌクレアーゼ）を例示する。オフターゲットライゲーション産物のエキソヌクレアーゼによる切断の結果、捕捉プローブが鋳型と特異的にハイブリダイズしており、捕捉プローブが鋳型に結合（例えば、ライゲーション）したライゲーション産物の選択がもたらされ得る。エキソヌクレアーゼ処理後、その後の伸長および増幅ステップを実施する前に精製ステップを実施して、エキソヌクレアーゼをライゲーション産物から除去することができる。
ｂ．固相抽出

例えば、アダプターアンカープローブを鋳型にライゲーションする前に、架橋プローブにハイブリダイズした鋳型（またはアダプターアンカープローブが架橋プローブを介して会合した鋳型）を選択するための方法が本明細書に提示される。本方法では、固相抽出を用いることができる。本方法を用いて、アダプターアンカープローブが、アダプターアンカープローブと特異的に会合した鋳型にライゲーションする尤度を増加させることができる。捕捉プローブ、架橋プローブ、またはアダプターアンカープローブを固体支持体に結合させるための方法が本明細書に提示される。アダプターアンカープローブが架橋プローブと無関係に鋳型に結合する（例えば、ライゲーションする）可能性があることにより、最適以下の特異性が導入され得る。そのような非特異的ライゲーション産物ならびに結合していないプローブ、標識（例えば、ビオチン）および捕捉部分（例えば、ストレプトアビジンビーズ）を利用することができる。

捕捉プローブ、架橋プローブ、またはアダプターアンカープローブは、標識を含み得る。開示されている方法は、捕捉プローブ、架橋プローブ、またはアダプターアンカープローブを標識によって捕捉するステップをさらに含み得る。標識は、ビオチンであり得る。標識は、ポリＡもしくはポリＴ、または特定の配列などの核酸配列であり得る。核酸配列は、約５～３０塩基の長さであり得る。核酸配列は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含み得る。標識は、捕捉プローブ、架橋プローブ、またはアダプターアンカープローブの３’末端に存在し得る。標識は、５－ブロモウリジン、およびビオチンなどの、抗体が認識することができるペプチド、または修飾された核酸であり得る。標識と捕捉プローブ、架橋プローブ、またはアダプターアンカープローブのコンジュゲートは「クリック」化学などの反応によって行うことができる。「クリック」化学により、蛍光色素のようなレポーター分子をＤＮＡのような生体分子にコンジュゲートすることが可能になり得る。クリックケミストリーは、共有結合産物（例えば、１，５－二置換１，２，３－トリアゾール）をもたらすことができる、アジドとアルキンとの間の反応であり得る。銅が触媒としての機能を果し得る。

標識は、固体支持体上に捕捉され得る。固体支持体は磁気であり得る。固体支持体は、ビーズ、フローセル、ガラス、プレート、１つもしくは複数のマイクロ流体チャネルを含むデバイス、またはカラムを含み得る。固体支持体は磁気ビーズであり得る。

固体支持体（例えば、ビーズ）は、標識に結合することができる１つまたは複数の捕捉部分を含み得る（例えば、それでコーティングすることにより）。捕捉用部分はストレプトアビジンであり得、ストレプトアビジンはビオチンに結合することができる。捕捉用部分は抗体であり得る。抗体は標識に結合することができる。捕捉用部分は、核酸、例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む核酸であり得る。核酸である捕捉用部分は、例えば、アダプターアンカープローブまたは架橋プローブ上の配列に結合することができる。一部の場合では、固体表面に結合させた抗ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド抗体を捕捉用部分として使用することができる。

標識と捕捉用部分とは、１つもしくは複数の共有結合または非共有結合を通じて結合させることができる。捕捉プローブ、架橋プローブ、またはアダプターアンカープローブを固体支持体上に捕捉した後、例えば、結合していない鋳型を試料から除去するために、固体支持体を洗浄することができる。一部の場合では、洗浄ステップは行わない。洗浄はストリンジェントまたは温和であり得る。捕捉された捕捉プローブ、架橋プローブ、またはアダプターアンカープローブ（および会合した鋳型）を、例えば標識がビオチンであり、捕捉用部分がストレプトアビジンである場合には、遊離のビオチンを試料に添加することによって溶出することができる。

捕捉プローブの５’末端の鋳型の３’末端へのライゲーションは、捕捉プローブが固体支持体上に捕捉されている間に行うことができる。捕捉プローブの５’末端の鋳型の３’末端へのライゲーションは、捕捉プローブ／鋳型複合体を固体支持体から溶出した後に行うことができる。捕捉プローブまたはアダプターアンカープローブが固体支持体上に捕捉されている間に捕捉プローブの５’末端またはアダプターアンカープローブをリン酸化することができる。

アダプターアンカープローブの５’末端の鋳型の３’末端へのライゲーションは、アダプターアンカープローブ（および会合した架橋プローブおよび鋳型）が固体支持体上に捕捉されている間に行うことができる。アダプターアンカープローブの５’末端の鋳型の３’末端へのライゲーションは、アダプターアンカープローブ（および会合した架橋プローブおよび鋳型）を固体支持体から溶出させた後に行うことができる。捕捉プローブの５’末端またはアダプターアンカープローブを、固体支持体から溶出させた後にリン酸化することができる。

伸長ステップ（例えば、捕捉プローブ内のＡＤ１アダプターにアニーリングするＡＤ１プライマーの伸長）は、捕捉プローブまたはアダプターアンカープローブが固体支持体上に捕捉されている間、または固体支持体からの捕捉プローブ（およびライゲーションした鋳型）の溶出後もしくはアダプターアンカープローブ（およびライゲーションした鋳型）の溶出後に実施することができる。

図１６Ａは、鋳型、架橋プローブ、およびアダプターアンカープローブハイブリダイゼーション後のストレプトアビジンビーズを使用したクリーンアップの実施を例示し、アダプターアンカープローブの３’末端はビオチン化されている。ハイブリダイゼーション複合体および遊離のアダプターアンカーアダプター（free adaptor anchor adaptor）の両方がビーズに結合し得る。結合していない鋳型および架橋プローブを洗い流すことができる。それでもなおハイブリダイゼーション複合体との近接ライゲーションが起こり得る。ライゲーションは複合体がビーズ上にある間に実施することができる。ライゲーションは複合体をビーズから溶出させた後に実施することができる。しかし、遊離のアダプターアンカープローブに関しては、任意の鋳型ＤＮＡにライゲーションする可能性が劇的に低減し得る。図１６Ｂでは、第１の架橋プローブおよび／または第２の架橋プローブの５’末端または３’末端は、ビオチン化され得る。ハイブリダイズしていないアダプターアンカーアダプターおよび鋳型を除去するために、ストレプトアビジンビーズを使用することができ、それにより、アダプターアンカープローブと鋳型とのランダムなライゲーションを防止することができる。
ＶＩＩＩ．鋳型核酸分子

鋳型核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ、または合成ＤＮＡであり得る。ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、断片化ＤＮＡ、または損傷ＤＮＡであり得る。ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、低分子非コードＲＮＡ、ポリソームＲＮＡ、イントロンＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、または無細胞ＲＮＡであり得る。

鋳型核酸は、天然に存在する核酸または合成核酸であり得る。鋳型核酸は、修飾された複素環式塩基を有し得る。修飾は、メチル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、アルキル化リボース、または他の複素環であり得る。鋳型核酸は、修飾された糖部分を有し得る。修飾された糖部分は、ペプチド核酸を含み得る。鋳型核酸は、ペプチド核酸を含み得る。鋳型核酸は、トレオース核酸を含み得る。鋳型核酸は、ロックド核酸を含み得る。鋳型核酸は、ヘキシトール核酸を含み得る。鋳型核酸は、フレキシブルな核酸であり得る。鋳型核酸は、グリセロール核酸を含み得る。

鋳型核酸分子を無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）および循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）などの低インプット（例えば、核酸材料１ｎｇ）試料から捕捉し、富化することができる。低インプット試料は、１ｎｇ、２ｎｇ、３ｎｇ、４ｎｇ、５ｎｇ、６ｎｇ、７ｎｇ、８ｎｇ、９ｎｇ、１０ｎｇ、またはそれよりも多くの核酸材料を有し得る。低インプット試料は、１０ｎｇ未満、９ｎｇ未満、８ｎｇ未満、７ｎｇ未満、６ｎｇ未満、５ｎｇ未満、４ｎｇ未満、３ｎｇ未満、２ｎｇ未満、１ｎｇ未満、またはそれ未満の核酸材料を有し得る。低インプット試料は、２００ｐｇから１０ｎｇまでの核酸材料を有し得る。低インプット試料は、１０ｎｇ未満の核酸材料を有し得る。低インプット試料は、１０ｎｇ未満、５ｎｇ未満、１ｎｇ未満、１００ｐｇ未満、５０ｐｇ未満、２５ｐｇ未満、またはそれ未満の核酸材料であり得る。一部の場合では、インプット試料は、１ｎｇ、１０ｎｇ、２０ｎｇ、３０ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、またはそれよりも多くの核酸分子を有し得る。インプット試料は、５０ｎｇ未満、４０ｎｇ未満、３０ｎｇ未満、２０ｎｇ未満、１０ｎｇ未満、１ｎｇ未満、またはそれ未満の核酸材料を有し得る。捕捉および富化は、標的プローブハイブリダイゼーションによって行うことができる。標的プローブは、捕捉プローブ、架橋プローブ、および／またはアダプターアンカープローブであり得る。標的プローブは、１つまたは複数の結合性部分を含み得る。結合性部分はビオチンであり得る。結合性部分は、支持体に結合され得る。支持体はビーズであり得る。ビーズはストレプトアビジンビーズであり得る。

鋳型核酸は損傷を受け得る。損傷核酸は、塩基の変更もしくは欠損、および／または骨格の修飾を含み得る。鋳型核酸は、酸化、放射線、またはランダム変異によって損傷を受け得る。鋳型核酸は、バイサルファイト処理によって損傷を受け得る。

損傷ＤＮＡに関しては、本開示では、二本鎖ＤＮＡ修復ステップを排除することができ、プロセスのステップが少ないことからＤＮＡ喪失が少なくなることに起因して、より高い変換率および改善された感度がもたらされる。

図１７Ａは、損傷ｄｓＤＮＡ（ニックを有する）またはｓｓＤＮＡのいずれかの、ライブラリー構築のための鋳型としての使用を例示する。損傷は、バイサルファイト処理に起因し得る。損傷ｄｓＤＮＡに関しては、ｄｓＤＮＡを変性させることができ、したがって、少なくとも１つの損傷を受けていない鎖を鋳型として使用することができる。次いで、鋳型を捕捉プローブにハイブリダイズおよび結合させ、種々のプライマーを使用して増幅することができる。

鋳型は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）に由来し得る。ｃｆＤＮＡは、供給源が胎児または腫瘍であり得る。鋳型は、対象のリキッドバイオプシー、固体生検、または固定組織に由来し得る。鋳型は、ｃＤＮＡであり得、逆転写によって生成することができる。鋳型核酸は、これだけに限定されないが、血漿、血清、喀痰、唾液、尿、または汗を含めた体液試料に由来し得る。鋳型核酸のメチル化パターンを調査するため、および／または鋳型核酸の組織起源を決定するために、体液試料をバイサルファイト処理することができる。鋳型核酸は、肝臓、食道、腎臓、心臓、肺、脾臓、膀胱、結腸、または脳に由来し得る。鋳型核酸が由来する器官におけるメチル化パターンを分析するために、鋳型核酸をバイサルファイトで処理することができる。対象は、自己免疫疾患、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、神経障害、およびがんなどのメチル化関連疾患に罹患し得る。

鋳型核酸は、男性対象または女性対象に由来し得る。対象は乳児であり得る。対象はティーンエイジャーであり得る。対象は若年成人であり得る。対象は高齢者であり得る。

鋳型核酸は、ヒト、ラット、マウス、他の動物、または特定の植物、細菌、藻類、ウイルスなどを起源とし得る。鋳型核酸は、霊長類を起源とし得る。霊長類は、チンパンジーまたはゴリラであり得る。他の動物はアカゲザルであり得る。鋳型はまた、宿主－病原体、細菌集団などを含めた異なる種のゲノムの混合物に由来し得る。鋳型は、２つまたはそれよりも多くの種のゲノムから発現されたＲＮＡから作製されたｃＤＮＡであり得る。

鋳型核酸は、標的配列を含み得る。標的配列はエクソンである。標的配列はイントロンであり得る。標的配列は、プロモーターを含み得る。標的配列は、以前に知られているものであり得る。標的配列は、以前に部分的に知られているものであり得る。標的配列は、以前に知られていないものであり得る。標的配列は、染色体、染色体の腕、または遺伝子を含み得る。遺伝子は、状態、例えば、がんに関連付けられる遺伝子であり得る。

例えば自己ライゲーションの率を低下させるために、ハイブリダイゼーション前に鋳型核酸分子を脱リン酸化することができる。
ＩＸ．捕捉プローブ

標的配列を有する鋳型核酸分子を捕捉するために、捕捉プローブを使用することができる。捕捉プローブを鋳型核酸分子に近接によってライゲーションすることもできる。遊離プローブと鋳型のライゲーション率は、ライゲーションする末端間の空間が比較的広いことに起因して非常に低い可能性がある。しかし、ハイブリダイズした捕捉プローブにより、捕捉プローブと鋳型との間のライゲーションの確率が、遊離の捕捉プローブとのライゲーションの確率と比較して増加し得る。捕捉プローブは、ＤＮＡを含み得る。捕捉プローブは、ＲＮＡを含み得る。捕捉プローブは、ウラシルまたはメチル化シトシンを含み得る。一部の場合では、捕捉プローブはウラシルを含まない。

捕捉プローブは、約４００ヌクレオチドを含み得る。捕捉プローブは、約３００ヌクレオチドを含み得る。捕捉プローブは、約２００ヌクレオチドを含み得る。捕捉プローブは、約１８０ヌクレオチドを含み得る。捕捉プローブは、約１５０ヌクレオチドを含み得る。捕捉プローブは、約１２０ヌクレオチドを含み得る。捕捉プローブは、約１００ヌクレオチドを含み得る。捕捉プローブは、約９０ヌクレオチドを含み得る。捕捉プローブは、約８０ヌクレオチドを含み得る。捕捉プローブは、約７０ヌクレオチドを含み得る。捕捉プローブは、約５０ヌクレオチドを含み得る。捕捉プローブは、約４０ヌクレオチドを含み得る。捕捉プローブは、約３０ヌクレオチドを含み得る。捕捉プローブは、約２０ヌクレオチドを含み得る。捕捉プローブは、約１０ヌクレオチドを含み得る。捕捉プローブは、約１０～約４００ヌクレオチド、約１０～約２００ヌクレオチド、約１０～約１２０ヌクレオチド、約２０～約１２０ヌクレオチド、約２０～約６０ヌクレオチド、または約３０～約５０ヌクレオチドであり得る。

捕捉プローブの鋳型核酸へのライゲーションのための温度は、約７０℃、約６５℃、約６０℃、約５５℃、約５０℃、約４５℃、または約４５℃～約５５℃であり得る。

捕捉プローブは、標識をさらに含み得る。標識は、蛍光であり得る。蛍光標識は、有機蛍光色素、金属キレート、炭素ナノチューブ、量子ドット、金粒子、または蛍光無機物であり得る。標識は、放射性であり得る。標識は、ビオチンであり得る。捕捉プローブは、標識された核酸結合分子に結合し得る。核酸結合分子は、抗体、抗生物質、ヒストン、抗体、またはヌクレアーゼであり得る。

複数の捕捉プローブを試料に使用することができる。複数の捕捉プローブは、同様の融解温度を有するように設計することができる。捕捉プローブのセットの融解温度は、約１５℃以内、約１０℃以内、約５℃以内、または約２℃以内であり得る。１つまたは複数の捕捉プローブの融解温度は、約８５℃、約８０℃、約７５℃、約７０℃、約６５℃、約６０℃、約５５℃、または約５０℃であり得る。捕捉プローブの融解温度は、約５０℃～約８５℃、約５５℃～約８０℃、約４５℃～約６０℃、または約５２℃～約５８℃であり得る。

捕捉プローブは、分子バーコード（ＭＢ）を含み得る。捕捉プローブは、アダプター配列（例えば、アダプタープライマーへの結合のための）を含み得る。捕捉プローブは、標的特異的領域（ＴＳＲ）を含み得る。捕捉プローブは、試料を識別するためのインデックスを含み得る。捕捉プローブは、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を、例えばＴＳＲとアダプター配列との間に含み得る。分子バーコードまたはインデックスは、アダプター配列の５’およびＴＳＲの５’であり得る。
ａ．分子バーコード

分子バーコードにより、独自の同定ツールをもたらすことができ、プローブと鋳型との間の特異的結合の観察を可能にすることができる。分子バーコードは、約２５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約８ヌクレオチド、または約４ヌクレオチドを含み得る。分子バーコードは、ＤＮＡを含み得る。分子バーコードは、ＲＮＡを含み得る。分子バーコードは、ウラシルを含み得る。一部の場合では、分子バーコードは、ウラシルを含まない。捕捉プローブは、インデックスを含み得る。インデックスを使用して、試料を同定することができる。インデックスは、２～１６ヌクレオチド長、または約６もしくは約８ヌクレオチドであり得る。
ｂ．アダプターおよびアダプタープライマー

捕捉プローブ内のアダプターにより、増幅のためのプライマー結合の位置をもたらすことができる。アダプタープライマーは、アダプター上の部位に相補的に結合し得、鋳型内の標的配列を増幅するために使用することができる。アダプタープライマーは約５０ヌクレオチドの長さを有し得る。アダプタープライマーは約４５ヌクレオチドの長さを有し得る。アダプタープライマーは約４０ヌクレオチドの長さを有し得る。アダプタープライマーは約３５ヌクレオチドの長さを有し得る。アダプタープライマーは約３０ヌクレオチドの長さを有し得る。アダプタープライマーは約２５ヌクレオチドの長さを有し得る。アダプタープライマーは約２０ヌクレオチドの長さを有し得る。アダプタープライマーは約１５ヌクレオチドの長さを有し得る。アダプタープライマーは約１８～約３０ヌクレオチドの長さを有し得る。

アダプターは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。アダプターは、天然に存在する核酸または合成核酸であり得る。アダプターは、修飾された複素環式塩基を有し得る。修飾は、メチル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、アルキル化リボース、または他の複素環であり得る。アダプターは、修飾された糖部分を有し得る。修飾された糖部分は、ペプチド核酸を含み得る。アダプターは、ペプチド核酸を含み得る。アダプターは、トレオース核酸を含み得る。アダプターは、ロックド核酸を含み得る。アダプターは、ヘキシトール核酸を含み得る。アダプターは、フレキシブルな核酸を含み得る。アダプターは、グリセロール核酸を含み得る。
ｃ．標的特異的領域（ＴＳＲ）

捕捉プローブのＴＳＲまたは架橋プローブは、鋳型の標的配列にハイブリダイズするように設計することができる。ＴＳＲは、バイサルファイト変換された標的配列またはバイサルファイトに対して保護された標的配列に対して設計することができる。一部の場合では、プローブの標的特異的領域の１００％が鋳型の標的配列と相補的であり得る。プローブの標的特異的領域の約７５％が鋳型の標的配列と相補的であり得る。プローブの標的特異的領域の約５０％が鋳型の標的配列と相補的であり得る。標的特異的領域は、約３５ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、または約５ヌクレオチドを含み得る。標的特異的領域は本明細書に記載の標的配列にアニーリングする。
Ｘ．アダプター／アダプタープライマー／増幅

結合した、付加された、または組み入れられたアダプターにより、増幅のためのプライマーハイブリダイゼーションの部位をもたらすことができる。第１のアダプター（ＡＤ１）を鋳型に捕捉プローブまたはアダプターアンカープローブを介して結合させることができる。ＡＤ１に対するプライマーを利用して、鋳型と相補的な鎖を合成することができる。鋳型のさらなる増幅のために第２のアダプター（ＡＤ２）を鋳型の５’末端および／または相補鎖の３’末端に結合させることができる。ＡＤ１プライマーおよびＡＤ２プライマーを使用してライブラリーを構築することができる。ＡＤ１プライマーおよびＴＳＲまたはそれに隣接する領域に対するプライマーを使用して選択的な増幅を実施することができる。

アダプターは、一本鎖核酸であり得る。アダプターは、二本鎖核酸であり得る。アダプターは、部分的な２重鎖であり得、短鎖とそれよりも長い長鎖を有する、または長さが等しい２本の鎖を有する。
ＸＩ．架橋プローブ

標的配列を有する鋳型核酸分子とアダプターアンカープローブをハイブリダイズさせるために、架橋プローブを使用することができる。架橋プローブにより、さらに、アダプターアンカープローブと鋳型の間接的会合が可能になり、それにより、それらの結合が容易になる。遊離のアダプターアンカープローブと鋳型のライゲーション率は、相互作用のランダム性に起因して非常に低い可能性がある。しかし、ハイブリダイズした架橋プローブにより、鋳型とアダプターアンカープローブのライゲーションの確率が、遊離のアダプターアンカープローブとのライゲーションの確率と比較して増加し得る。架橋プローブは、ＤＮＡを含み得る。架橋プローブは、ＲＮＡを含み得る。架橋プローブは、ウラシルおよびメチル化シトシンを含み得る。架橋プローブは、ウラシルを含み得ない。

架橋プローブは、標的配列にハイブリダイズする標的特異的領域（ＴＳＲ）を含み得る。架橋プローブは、アダプターアンカープローブの架橋結合配列にハイブリダイズするアダプターランディング配列（ＡＬＳ）を含み得る。架橋プローブは、ＴＳＲとＡＬＳを接続するリンカーを含み得る。ＴＳＲは、架橋プローブの３’部位に位置し得る。ＴＳＲは、架橋プローブの５’部位に位置し得る。

架橋プローブは、１つまたは複数の分子バーコードを含み得る。架橋プローブは、１つまたは複数の結合性部分を含み得る。結合性部分はビオチンであり得る。結合性部分は、支持体に結合され得る。支持体はビーズであり得る。ビーズはストレプトアビジンビーズであり得る。

架橋プローブは、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１２０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、または約１０ヌクレオチドを含み得る。

試料中の多数の標的配列にアニーリングさせるために多数の架橋プローブを使用することができる。架橋プローブは、同様の融解温度を有するように設計することができる。架橋プローブのセットの融解温度は、約１５℃以内、約１０℃以内、約５℃以内、または約２℃以内であり得る。１つまたは複数の架橋プローブの融解温度は、約７５℃、約７０℃、約６５℃、約６０℃、約５５℃、約５０℃、約４５℃、または約４０℃であり得る。架橋プローブの融解温度は、約４０℃～約７５℃、約４５℃～約７０℃、４５℃～約６０℃、または約５２℃～約５８℃であり得る。

アダプターアンカープローブを特定の架橋プローブの周囲の１つまたは複数の架橋プローブと一緒に使用することが、相乗効果を通じて、特定の架橋プローブのその標的配列へのハイブリダイゼーションの安定化に役立ち得る。多数の架橋プローブアセンブリを形成するためのハイブリダイゼーション温度は、単一の架橋プローブの融解温度よりも高くなり得る。温度が高いことにより、低い温度で起こる可能性がある非特異的ハイブリダイゼーションが低減することにより、より良好な捕捉の特異性がもたらされ得る。ハイブリダイゼーション温度は、個々の架橋プローブの融解温度よりも約５℃、約１０℃、約１５℃、または約２０℃高い温度であり得る。ハイブリダイゼーション温度は、架橋プローブの融解温度よりも約５℃～約２０℃高い温度、または複数の架橋プローブの平均融解温度よりも約５℃～約２０℃高い温度であり得る。

多数の架橋プローブのハイブリダイゼーション温度は、約７５℃、約７０℃、約６５℃、約６０℃、約５５℃、または約５０℃であり得る。多数の架橋プローブのハイブリダイゼーション温度は、約５０℃～約７５℃、５５℃～約７５℃、６０℃～約７５℃、または６５℃～約７５℃であり得る。

架橋プローブは、標識をさらに含み得る。標識は、蛍光であり得る。蛍光標識は、有機蛍光色素、金属キレート、カーボンナノチューブ、量子ドット、金粒子、または蛍光無機物であり得る。標識は、放射性であり得る。標識は、ビオチンであり得る。架橋プローブは、標識された核酸結合分子に結合し得る。核酸結合分子は、抗体、抗生物質、ヒストン、抗体、またはヌクレアーゼであり得る。

架橋プローブは、リンカーを含み得る。リンカーは、約３０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、または約５ヌクレオチドを含み得る。リンカーは、約５～約２０ヌクレオチドを含み得る。

リンカーは、非核酸ポリマー（例えば、炭素の一続き）を含み得る。リンカー非ヌクレオチドポリマーは、約３０単位、約２５単位、約２０単位、約１５単位、約１０単位、または約５単位を含み得る。

架橋プローブを３’末端および／または５’末端において遮断することができる。架橋プローブは、５’リン酸を欠き得る。架橋プローブは、３’ＯＨを欠き得る。架橋プローブは、３’ｄｄＣ、３’逆ｄＴ、３’Ｃ３スペーサー、３’アミノ、または３’リン酸化を含み得る。
ＸＩＩ．アダプターアンカープローブ

アダプターアンカープローブは、約４００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１２０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約９０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、または約１０ヌクレオチドを含み得る。アダプターアンカープローブは、約２０～約７０ヌクレオチドであり得る。

架橋プローブに対するアダプターアンカープローブの融解温度は、約６５℃、約６０℃、約５５℃、約５０℃、約４５℃、または約４５℃～約７０℃であり得る。

アダプターアンカープローブは、標識を含み得る。標識は、蛍光であり得る。蛍光標識は、有機蛍光色素、金属キレート、カーボンナノチューブ、量子ドット、金粒子、または蛍光無機物であり得る。標識は、放射性であり得る。標識は、ビオチンであり得る。アダプターアンカープローブは、標識された核酸結合分子に結合し得る。核酸結合分子は、抗体、抗生物質、ヒストン、抗体、またはヌクレアーゼであり得る。

アダプターアンカープローブは、分子バーコード（ＭＢ）を含み得る。アダプターアンカープローブはアダプター配列（例えば、アダプタープライマーへの結合のための）を含み得る。捕捉プローブは、架橋結合配列（ＢＢＳ）を含み得る。アダプターアンカープローブは、１から１００までのＢＢＳを含み得る。アダプターアンカープローブは、試料を識別するためのインデックスを含み得る。分子バーコードまたはインデックスは、アダプター配列の５’およびＢＢＳの５’に存在し得る。
ＸＩＩＩ．酵素

本明細書に記載の方法およびキットに使用することができるＤＮＡポリメラーゼの例としては、クレノウポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａポリメラーゼ、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、またはＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ１が挙げられる。

本明細書に記載の方法およびキットに使用することができるリガーゼの例としては、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、またはＴｔｈ ＤＮＡリガーゼが挙げられる。

本明細書に記載の方法およびキットに使用することができるエキソヌクレアーゼの例としては、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＡ）、ＩＩ（ｐｏｌＢ）およびＩＩＩ（ｄｎａＱ／ｍｕｔＤ）に関連するエキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、大きな（クレノウ）断片、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＩＸ、エキソヌクレアーゼＸ、ＲｅｃＢＣＤエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＥエキソヌクレアーゼ、ＳｂｃＣＤエンド／エキソヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＴ、またはＴａｔＤエキソヌクレアーゼが挙げられる。エキソヌクレアーゼは、３’から５’のエキソヌクレアーゼまたは５’から３’のエキソヌクレアーゼであり得る。

本明細書に記載の方法およびキットに使用することができる制限エンドヌクレアーゼは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、またはＩＶ型であり得る。制限エンドヌクレアーゼとしては、ＡｃｉＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｐＩ、ＭｌｕＣＩ、ＢｓｐＭＩ、ＥｃｏＰ１５、ＥｃｏＲＩ、ＨｓｄＲ、ＨｓｄＭ、ＨｈａＩ、ＮｏｔＩ、ＦｏｋＩ、またはＢａｅＩを挙げることができる。制限エンドヌクレアーゼは、４－カッター、５－カッター、または６－カッターであり得る。
ＸＩＶ．増幅産物の下流の分析

本明細書に記載の方法を使用して生成された増幅産物を、サザンブロット法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）、ｎＣｏｕｎｔｅｒ分析（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ゲル電気泳動、ＤＮＡマイクロアレイ、質量分析（例えば、タンデム質量分析、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）、連鎖停止反応シーケンシング（サンガーシーケンシング）、または次世代シーケンシングを含めた様々な方法を使用してさらに分析することができる。

次世代シーケンシングは、４５４シーケンシング（ＲＯＣＨＥ）（パイロシーケンシングを使用する）、可逆的ターミネーター色素を使用したシーケンシング（ＩＬＬＵＭＩＮＡシーケンシング）、半導体シーケンシング（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ ＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ）、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング（ＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）、ナノポアシーケンシング（例えば、ＯＸＦＯＲＤ ＮＡＮＯＰＯＲＥまたはＧＥＮＩＡの技術を使用する）、ピロリン酸溶解を使用した微小滴単一分子シーケンシング（ＢＡＳＥ４）、単一分子電子検出シーケンシング、例えば、核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）がナノギャップを通過する際のナノ電極を通るトンネル電流を測定し、電流の差異を算出すること（ＱＵＡＮＴＵＭ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳのＱＵＡＮＴＵＭ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ）、ＧｅｎａｐＳｙｓ Ｇｅｎｅ Ｅｌｅｃｔｏｒｎｉｃ Ｎａｎｏ－Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｕｌｔｒａ－Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ（ＧＥＮＩＵＳ）技術（ＧＥＮＡＰＹＳ）、ＱＩＡＧＥＮのＧＥＮＥＲＥＡＤＥＲ、特定のフルオロフォアによって同定された部分的にランダムなオリゴヌクレオチドと中央決定塩基（central determined base）（または塩基の対）との逐次的ハイブリダイゼーションおよびライゲーションを用いるシーケンシング（ＳＯＬｉＤシーケンシング）を含み得る。シーケンシングは、ペアエンドシーケンシングであり得る。

本明細書に記載の方法を使用して配列決定することができる、試料由来の標的配列の数は、約５、１０、１５、２５、５０、１００、１０００、１０，０００、１００，０００、もしくは１，０００，０００、または約５～約１００、約１００～約１０００、約１０００～約１０，０００、約１０，０００～約１００，０００、もしくは約１００，０００～約１，０００，０００であり得る。

本明細書に記載の方法を使用して生成された核酸ライブラリーは、１つよりも多くの試料から生成されたものであり得る。各ライブラリーは、試料に関連付けられる異なるインデックスを有し得る。例えば、捕捉プローブまたはアダプターアンカープローブは、核酸を同じ試料に由来するものであると同定するために使用することができるインデックスを含み得る（例えば、同じ第１のインデックスを含む捕捉プローブまたはアダプターアンカープローブの第１のセットを使用して、第１の対象由来の第１の試料に由来する第１のライブラリーを生成することができ、同じ第２のインデックスを含む捕捉プローブまたはアダプターアンカープローブの第２のセットを使用して、第２の対象由来の第２の試料に由来する第２のライブラリーを生成することができ、第１のライブラリーおよび第２のライブラリーをプールし、配列決定を行うことができ、インデックスを使用して、配列決定された核酸が由来する試料を見分けることができる）。本明細書に記載の方法を使用して生成された増幅産物を使用して、少なくとも２、５、１０、２５、５０、１００、１０００、または１０，０００試料から、それぞれが異なるインデックスを有するライブラリーを生成することができ、ライブラリーをプールし、例えば次世代シーケンシング技術を使用して配列決定を行うことができる。

配列決定により、少なくとも１００、１０００、５０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、または１０，０００，０００配列リードを生成することができる。配列決定により、約１００配列リードから約１０００配列リードの間、約１０００配列リードから約１０，０００配列リードの間、約１０，０００配列リードから約１００，０００配列リードの間、約１００，０００配列リードから約１，０００，０００配列リードの間、または約１，０００，０００配列リードから約１０，０００，０００配列リードの間を生成することができる。

配列決定の深さは、約１×、５×、１０×、５０×、１００×、１０００×、または１０，０００×であり得る。配列決定の深さは、約１×から約１０×の間、約１０×から約１００×の間、約１００×から約１０００×の間、または約１０００×から約１００００×の間であり得る。
ＸＶ．適用
ａ．核酸の特徴の検出

本明細書に記載の方法およびキットを使用して生成された増幅核酸産物を、１つまたは複数の核酸の特徴について分析することができる。１つまたは複数の核酸の特徴は、１つまたは複数のメチル化事象であり得る。メチル化は、ＣｐＧジヌクレオチド内のシトシンのメチル化であり得る。メチル化塩基は、５－メチルシトシンであり得る。ＣｐＧの状態にないシトシンもメチル化され得る。メチル化されたまたはメチル化されていないシトシンは、ＣｐＧアイランド内のものであり得る。ＣｐＧアイランドは、ゲノムの、ＣｐＧ部位の頻度が高い領域であり得る。ＣｐＧアイランドは、少なくとも２００ｂｐ、または約３００～約３０００ｂｐであり得る。ＣｐＧアイランドのＣｐＧジヌクレオチド含有量は少なくとも６０％であり得る。ＣｐＧアイランドは、遺伝子のプロモーター領域内に存在し得る。メチル化は、５－ｈｍＣ（５－ヒドロキシメチルシトシン）、５－ｆＣ（５－ホルミルシトシン）、または５－ｃａＣ（５－カルボキシルシトシン）であり得る。本明細書に記載の方法およびキットを使用して、例えば、固形組織由来のＤＮＡまたは、例えば、無細胞ＤＮＡを含む生体液、例えば、血漿、血清、尿、もしくは唾液由来のＤＮＡのメチル化パターンを検出することができる。

１つまたは複数の核酸の特徴は、新規の変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異、サイレント変異、フレームシフト変異、挿入、置換、点変異、一塩基多型（ＳＮＰ）、一塩基バリアント（ＳＮＶ）、新規の一塩基バリアント、欠失、再構成、増幅、染色体転座、中間部欠失、染色体逆位、ヘテロ接合性の喪失、機能喪失、機能獲得、ドミナントネガティブ、または致死的な変異であり得る。増幅核酸産物を分析して、生殖細胞系列変異または体細胞変異を検出することができる。１つまたは複数の核酸の特徴を状態、例えば、がん、自己免疫疾患、神経疾患、感染（例えば、ウイルス感染）、または代謝性疾患に関連付けることができる。
ｂ．診断／検出／モニタリング

開示されている方法およびキットを使用して、状態を診断または検出することもできる。状態は、心理学的障害であり得る。状態は、老化であり得る。状態は、疾患であり得る。状態（例えば、疾患）は、がん、神経疾患（例えば、アルツハイマー病、自閉症スペクトラム障害、レット症候群、統合失調症）、免疫不全、皮膚疾患、自己免疫疾患（例えば、眼のベーチェット病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症、感染（例えば、ウイルス感染）、または代謝性疾患（例えば、高血糖症、高脂血症、２型糖尿病）であり得る。がんは、例えば、結腸がん、乳がん、肝がん、膀胱がん、ウィルムスがん、卵巣がん、食道がん、前立腺がん、骨がん、または肝細胞癌、神経膠芽腫、乳がん、肺扁平上皮がん、甲状腺癌、または白血病であり得る（例えば、Jin and Liu (2018) DNA methylation in human disease. Genes & Diseases, 5:1-8を参照されたい）。状態は、ベックウィズ・ヴィーデマン症候群、プラダー・ウィリー症候群、またはアンジェルマン症候群であり得る。

本明細書に提示される方法およびキットを使用して生成された無細胞ＤＮＡのメチル化パターンを、がんのマーカーとして使用することができる（例えば、Hao et al., DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of common cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. 2017；国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１５１１６８３７号を参照されたい）。無細胞ＤＮＡのメチル化パターンを、ＤＮＡの起源組織を決定するために使用ことができる（例えば、国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００５０１９４７７号を参照されたい）。本明細書に記載の方法およびキットを、メチル化ハプロタイプ情報を決定するために使用することができ、無細胞ＤＮＡの組織または細胞の起源を決定するために使用することができる（例えば、Seioighe et al, (2018) DNA methylation haplotypes as cancer markers. Nature Genetics 50, 1062-1063；国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１５１１６８３７号；米国特許出願公開第２０１７０１２１７６７号を参照されたい）。本明細書に記載の方法およびキットを、がんを有する対象およびがんを有さない対象における、例えば無細胞ＤＮＡのメチル化レベルを検出するために使用することができる（例えば、Vidal et al. A DNA methylation map of human cancer at single base-pair resolution. Oncogenomics 36, 5648-5657；国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１４０４３７６３号を参照されたい）。本明細書に記載の方法およびキットを、メチル化レベルを決定するため、または無細胞ＤＮＡ混合物への異なる組織のわずかな寄与を決定するために使用することができる（例えば、国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１６００８４５１号を参照されたい）。本明細書に記載の方法およびキットを、例えば血漿中の無細胞ＤＮＡの起源組織に関して、例えば、メチル化ハプロタイプのパターンおよび存在量を比較することに基づいて使用することができる（例えば、Tang et al., (2018) Tumor origin detection with tissue-specific miRNA and DNA methylation markers. Bioinformatics 34, 398-406；国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１８１１９２１６号を参照されたい）。本明細書に記載の方法およびキットを、がん細胞を正常な細胞と区別するため、および異なるがんの型をそれらの起源組織に従って分類するために使用することができる（例えば、米国特許出願公開第２０１７０１７５２０５号Ａ１を参照されたい）。本明細書に提示される方法およびキットを、母体試料を使用して胎児のＤＮＡまたは胎児の異常を検出するために使用することができる（例えば、Poon et al. (2002) Differential DNA Methylation between Fetus and Mother as a Strategy for Detecting Fetal DNA in Maternal Plasma. Clinical Chemistry, 48: 35-41を参照されたい）。

開示されている方法を、状態をモニタリングするために使用することができる。状態は、疾患であり得る。疾患は、がん、神経疾患（例えば、アルツハイマー病）、免疫不全、皮膚疾患、自己免疫疾患（例えば、眼のベーチェット病）、感染（例えば、ウイルス感染）、または代謝性疾患であり得る。がんは、寛解したものであり得る。開示されている方法では、ｃｆＤＮＡおよびｃｔＤＮＡを使用して低レベルの異常を検出することができるので、本開示により、疾患をモニタリングする比較的非侵襲的な方法を提供することができる。開示されている方法を、処置または治療をモニタリングために使用することができる。処置または治療は、状態、例えば疾患、例えばがんに対して、または本明細書に開示される任意の状態に対して使用することができる。

（実施例１）
アダプターアンカープローブのライゲーション
図１８Ａは、２つの反応スキームの概略図を提示する。左側の反応スキーム（１）では、架橋プローブ、鋳型、およびアダプターアンカープローブを一緒にインキュベートする。架橋プローブが鋳型上の標的配列にハイブリダイズし、架橋プローブがアダプターアンカープローブ上のアダプターランディング配列にハイブリダイズする（１；上）。ハイブリダイゼーションにより、アダプターアンカープローブのリン酸化された５’末端と鋳型の３’末端との近接ライゲーションが容易になる（１；上）。次いで、ＰＣＲを使用して、ライゲーション産物を増幅する（１；下）。右側の第２の反応（２）では、鋳型およびアダプターアンカープローブを架橋プローブの非存在下で一緒にインキュベートする（２；上）。反応スキーム（１）と同様の反応ステップを実施する。

この実施例では、反応スキーム（１）において、標的に特異的な結合性配列を有するアダプターアンカープローブ（配列番号２）を、公知の標的配列を有する鋳型ＤＮＡ（配列番号１）にライゲーションし、これを、架橋プローブ（配列番号３）のハイブリダイゼーションによって容易にした。架橋プローブは、鋳型の標的配列と相補的になるように設計された標的特異的領域を含んだ。配列番号１および配列番号２（表１）におけるイタリック体の文字は、鋳型および架橋プローブのそれぞれ標的配列および標的特異的領域を表す。架橋プローブは、架橋プローブの架橋結合配列と相補的なアダプターランディング配列および標的特異的領域とアダプターランディング配列とを接続するオリゴ－Ｔリンカーをさらに含んだ。表１の配列番号２および配列番号３において架橋結合配列およびアダプターランディング配列に下線が引かれている。架橋結合配列に加えて、アダプターアンカープローブを、アダプターおよび独自の配列の分子バーコードを含有するように設計した。配列番号２の太字の配列は、ＡＤ１プライマー結合性部位を表す。ＡＤ１にアニーリングするプライマーおよびＴＳＲにアニーリングするプライマーを使用して鋳型の標的配列を増幅した。「Ｎ」は、４つのＤＮＡヌクレオチドのいずれかを表す。いずれのヌクレオチドが優先的にライゲーションおよび配列決定されるかを見いだすために、鋳型の異なる３’末端を試験した。アダプターアンカープローブの５’末端における４つのヌクレオチドは、分子バーコードを表す。分子バーコードの種々の組合せを合成し、鋳型と混合した。

以下は、反応スキーム（１）のハイブリダイゼーションおよびライゲーション条件である。鋳型１ｆｍｏｌｅ、架橋プローブ１０ｆｍｏｌｅ、およびアダプターアンカープローブ２００ｆｍｏｌｅを１２μｌの体積で混合し、９５℃で３０秒間変性させ、その後、氷上に置いた。１０×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅバッファー２μＬ、５Ｍのベタイン４μＬ、５０ｍＭのＭｎＣｌ_２ １μＬを変性ＤＮＡ混合物に添加して、最終的な体積２０μＬ中、２．５ｍＭのＭｎＣｌ_２、１Ｍのベタイン、０．０３３ＭのＴｒｉｓ－酢酸（ｐＨ７．５）、０．０６６Ｍの酢酸カリウム、および０．５ｍＭのＤＴＴの最終濃度に達するようにした。混合物をＭＪサーモサイクラーにおいて５０℃で３０分間インキュベートすることによってハイブリダイゼーションを実施した。１００単位のＣｉｒｃｌｉｇａｓｅ ＩＩを混合物に添加し、ＭＪサーモサイクラーにおいて５０℃で２０分間インキュベートすることによってライゲーションを行った。ライゲーション産物１μＬを、０．２μＭのＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ反応の鋳型とした。９５℃で１５秒間の変性条件、５８℃で１５秒間のアニーリング条件、および６８℃で３０秒間の伸長条件を用いて２０サイクルのＰＣＲを実行した。反応スキーム（２）の条件は、鋳型とアダプターアンカープローブとの混合物に架橋プローブを含めなかった以外は同じであった。ＰＣＲ産物１０μＬを２％アガロースゲルに８０Ｖで２０分間流し、ＵＶ光ボックスにおいて、１×ＧｅｌＲｅｄによるゲル染色を用いてＤＮＡバンドを可視化した。

図１８Ｂに示されている通り、レーン１では１００ｂｐおよび５０ｂｐ領域の付近に２つのバンドが出現し、これは反応スキーム（１）のＰＣＲ反応産物を保持した。１００ｂｐはライゲーションした鋳型およびアダプターアンカープローブのサイズに一致し、これにより、ライゲーションが上首尾であったことが示唆される。小さい方のバンドは、増幅ステップに使用したプライマーの予測サイズである。反応スキーム（２）についてのレーン２では約１００ｂｐのバンドは検出可能でなく、これにより、反応スキーム（１）の架橋プローブにより鋳型とアダプターアンカープローブのライゲーションが容易になったことが示唆される。
（実施例２）
エキソヌクレアーゼ消化および伸長によるアダプター付加

図２６は、捕捉プローブハイブリダイゼーションおよび３’から５’のエキソヌクレアーゼによる消化の概略図を提示する。ハイブリダイゼーション捕捉のために、捕捉プローブを鋳型（Ｅ－Ｔ１、配列番号６およびＥ－Ｔ２、配列番号７）上の標的配列にハイブリダイズさせた。反応のために、合成鋳型Ｅ－Ｔ１（表３のインプット混合物１、３、５、７）またはＥ－Ｔ２（表３のインプット混合物２、４、６、８）を捕捉プローブ（配列番号８）とDuplexバッファー中に１：１の濃度比（１μＭ）で混合した。ＤＮＡ混合物を９２℃で２分間変性させ、サーモサイクラーで室温まで冷やした。

表２に鋳型核酸、使用した捕捉プローブ、ＰＣＲプライマー、ならびに実験からの伸長産物の配列を列挙する。アダプター配列が太字で示されており、標的配列がイタリック体で示されている。Ｅ－Ｔ２鋳型はＥ－Ｔ１と比較して標的特異的領域（ＴＳＲ）の下流のヌクレオチド配列をより多く含み、したがって、捕捉プローブにハイブリダイズすると、Ｅ－Ｔ２は一本鎖３’突出を有した。

ハイブリダイゼーション後、３’から５’のエキソヌクレアーゼを使用して、鋳型上の一本鎖３’突出を消化した。エキソヌクレアーゼ消化および伸長のために、ＤＮＡ混合物をＤＮＡポリメラーゼＩ、大きな（クレノウ）断片またはＴ４ポリメラーゼのいずれかと反応させた。表３に各混合物に使用した鋳型と酵素との組合せを列挙する。

約１２０００コピーのＥ－Ｔ１／Ｅ－Ｔ２および捕捉プローブがアニーリングした産物を各消化および伸長混合物のために使用した。クレノウ反応混合物に関しては、１×ＮＥＢバッファー２、５０μＭのｄＮＴＰ、および０．１Ｕ／μｌのクレノウを添加し、２５℃で１５分間インキュベートした。Ｔ４ポリメラーゼ混合物に関しては、１×ＮＥＢバッファー２．１、１０μＭのｄＮＴＰ、および０．０６Ｕ／μｌのＴ４ポリメラーゼを添加し、１２℃で１５分間インキュベートした。

ＰＣＲ産物を、ＰＣＲプライマー（ＥＧＦＲフォワードプライマー、配列番号９および捕捉プローブリバースプライマー、配列番号１０）を使用したｑＰＣＲによって評価した。クレノウまたはＴ４ポリメラーゼと反応しなかったＰＣＲ産物（インプット混合物３、４、７、および８）、および、それにより３’突出をなお保持するその鋳型は、アダプターを含むことが検出されなかった（表３参照）。対照的に、インプット混合物１、２、５、および６ではアダプター付加が検出された。インプット混合物１、２、５、および６の産物は、配列番号１０の配列を有することも検出された。Ｅ－Ｔ１鋳型を用いたサイクル閾値（Ｃｔ）値は、使用したエキソヌクレアーゼ／ポリメラーゼにかかわらず、Ｅ－Ｔ２を用いたものよりも低く、これにより、Ｅ－Ｔ１は３’突出を含まなかったので、Ｅ－Ｔ１鋳型を用いた場合に伸長がより容易に起こったことが示される。
（実施例３）
エキソヌクレアーゼ消化およびＴ４ポリメラーゼを使用した伸長によるアダプター付加

図２７は、捕捉プローブハイブリダイゼーションおよび３’から５’のエキソヌクレアーゼによる消化の概略図を提示する。捕捉プローブを鋳型上の標的配列とハイブリダイズさせた。配列番号１２を含むことが分かっている断片化されたゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を鋳型として使用した。ハイブリダイゼーション捕捉のために、断片化された（ピークサイズ１６０ｂｐ）鋳型ｇＤＮＡ、２０ｎｇを１０ｐｍｏｌの捕捉プローブと共に使用した。ＤＮＡインプットおよびハイブリダイゼーションプローブをハイブリダイゼーションバッファー中、９５℃で３０秒間変性させ、混合物を６０℃まで徐々に冷やした。ハイブリダイゼーションをサーモサイクラーにおいて６０℃で１時間インキュベートした。最終的なハイブリダイゼーションバッファーは、１００ｎｇ／μｌのＤＮＡ、１μｇ／μｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１μｇ／μｌのフィコール、１μｇ／μｌのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム、０．７５ＭのＮａＣｌ、５×ＳＳＣ、および１×デンハート液を含有した。

クリーンアップのために、ハイブリダイズしたアセンブリを、ストレプトアビジンビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）と一緒に室温で１０分間インキュベートした。３回の洗浄（洗浄１：５×ＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ；洗浄２：２×ＳＳＰＥ、０．１％；洗浄３：０．１×ＳＳＰＥ、０．０１％トリトン）を用いてクリーンアップを実施した。

次いで、鋳型上の一本鎖３’突出を消化するため、および鋳型を伸長させるために、３’から５’のエキソヌクレアーゼ（Ｔ４ポリメラーゼ）を捕捉アセンブリに添加した。捕捉アセンブリをＴ４ポリメラーゼ混合物（インプット混合物１、２、３）２５μｌ中に再懸濁させ、１２℃で１５分間インキュベートした。９５℃で１分間の熱殺滅によって反応を停止させた。インプット混合物４にはＴ４ポリメラーゼによる処理を行わなかった。

ｑＰＣＲを行ってアダプターの付加を評価した。富化されたＤＮＡを、プローブＥＧＦＲ標的配列（ＥＧＦＲフォワードプライマー、配列番号１３およびリバースプライマー、配列番号１４）を使用したｑＰＣＲによって評価した。アダプター付加をＥＧＦＲおよびアダプター配列ＰＣＲ（ＥＧＦＲフォワードプライマー、配列番号１３およびプローブリバースプライマー、配列番号１５、表４および５を参照されたい）によって評価した。図２７は、ｑＰＣＲ評価の概略図を例示する。Ｔ４ポリメラーゼで処理した全ての試料（インプット混合物１、２、および３）においてアダプター付加が検出されたが、Ｔ４ポリメラーゼ反応を行わなかった試料ではアダプター付加は検出されなかった（表５参照）。エキソヌクレアーゼ消化に供した混合物（インプット混合物１、２、および３）の循環閾値（Ｃｔ）値は、消化されていない鋳型（インプット混合物４）のものよりも低かった。試料の全てにおいてＥＧＦＲ ＰＣＲについてのＣｔが同様であり、これにより、全ての反応においてＥＧＦＲが捕捉されたことが示された。また、富化されたＤＮＡについてのＣｔを、捕捉富化を行わなかったｇＤＮＡの同じ部分と比較し、ＥＧＦＲの６５％が回収されたことが見いだされた。

本発明の好ましい実施形態が本明細書において示され、記載されているが、そのような実施形態は単に例として提供されていることは当業者には明白である。当業者には、本発明から逸脱することなく多数の変形、変化および置換をすぐに想起される。本明細書に記載の発明の実施形態に対する種々の代替を本発明の実施に用いることができることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲により本発明の範囲が定義されること、ならびに、それにより、これらの特許請求の範囲内に入る方法および構造ならびにそれらの等価物が網羅されることが意図される。

Claims (168)

1. 捕捉プローブの標的特異的領域を鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズさせるステップと、
   前記鋳型核酸分子の３’末端を前記捕捉プローブの５’末端に結合させ、それにより、前記捕捉プローブに結合した鋳型核酸分子を生成するステップと、
   第１のアダプタープライマーを前記捕捉プローブの第１のアダプターにハイブリダイズさせるステップと、
   前記第１のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップと、
   第２のアダプターを前記第１の伸長産物の３’末端に結合させ、それにより、前記第２のアダプターに結合した第１の伸長産物を生成するステップと
   を含む方法。
2. 前記捕捉プローブが、分子バーコードをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記第２のアダプターを結合させるステップの前に前記鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記第２のアダプターが二本鎖アダプターであり、前記第２のアダプターの２本の鎖のうちの一方が前記鋳型核酸分子に結合する、請求項３に記載の方法。
5. 第２のアダプタープライマーを前記第２のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記第２のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記第２のアダプターに結合した前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記第２のアダプターに結合した前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記第２のアダプタープライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
9. 捕捉プローブの標的特異的領域を鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズさせるステップと、
   前記鋳型核酸分子の３’末端を前記捕捉プローブの５’末端に結合させ、それにより、前記捕捉プローブに結合した鋳型核酸分子を生成するステップと、
   前記捕捉プローブに結合した前記鋳型核酸分子をバイサルファイトで処理するステップと
   を含む方法。
10. 第１のアダプタープライマーを前記捕捉プローブの第１のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記第１のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
12. 第２のアダプターを前記第１の伸長産物の３’末端に結合させ、それにより、前記第２のアダプターに結合した第１の伸長産物を生成するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記捕捉プローブが、分子バーコードをさらに含む、請求項９に記載の方法。
14. 前記第２のアダプターを結合させるステップの前に前記鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
15. 前記第２のアダプターが二本鎖アダプターであり、前記第２のアダプターの２本の鎖のうちの一方が前記鋳型核酸分子に結合する、請求項１４に記載の方法。
16. 第２のアダプタープライマーを前記第２のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
17. 前記第２のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記第２のアダプターに結合した前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記第２のアダプターに結合した第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記第２のアダプタープライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
20. 標的特異的プライマーを前記第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
21. 前記標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記第２のアダプターに結合した前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記第２のアダプターに結合した前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記標的特異的プライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
24. 捕捉プローブの標的特異的領域を鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズさせるステップと、
    前記鋳型核酸分子の３’末端を前記捕捉プローブの５’末端に結合させ、それにより、前記捕捉プローブに結合した鋳型核酸分子を生成するステップと、
    前記捕捉プローブの３’末端を伸長させ、それにより、前記鋳型核酸分子に結合した第１の伸長産物を生成するステップと
    を含む方法。
25. 前記捕捉プローブに結合した前記鋳型核酸分子をバイサルファイトで処理するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
26. 前記捕捉プローブが、第１のアダプターを含む、請求項２４または２５に記載の方法。
27. 前記捕捉プローブが、分子バーコードをさらに含む、請求項２４または２５に記載の方法。
28. 前記鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化するステップをさらに含む、請求項２４または２５に記載の方法。
29. 第２のアダプターを前記鋳型核酸分子の５’末端に結合させるステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
30. 前記第２のアダプターを結合させるステップの前に前記鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化するステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
31. 前記第２のアダプターが、二本鎖アダプターである、請求項２６に記載の方法。
32. 前記第１のアダプタープライマーを前記捕捉プローブの第１のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
33. 前記第１のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
34. 第２のアダプタープライマーを前記第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
35. 前記第２のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第３の伸長産物を生成するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
36. 前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
37. 前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記第２のアダプタープライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
38. 標的特異的プライマーを前記第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
39. 前記標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第３の伸長産物を生成するステップをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
40. 前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
41. 前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記標的特異的プライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
42. 捕捉プローブの標的特異的領域を鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズさせるステップと、
    前記鋳型核酸分子の３’末端を前記捕捉プローブの５’末端に結合させ、それにより、前記捕捉プローブに結合した鋳型核酸分子を生成するステップと、
    前記標的特異的領域を脱離させるステップと
    を含む方法。
43. 前記標的特異的領域を脱離させるステップの前に、前記捕捉プローブに結合した前記鋳型核酸分子をバイサルファイトで処理するステップをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
44. 前記捕捉プローブが、分子バーコードをさらに含む、請求項４２または４３に記載の方法。
45. 第１のアダプタープライマーを前記捕捉プローブの第１のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項４２または４３に記載の方法。
46. 前記第１のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
47. 第２のアダプターを前記第１の伸長産物の３’末端に結合させ、それにより、前記第２のアダプターに結合した第１の伸長産物を生成するステップをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
48. 前記第２のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
49. 前記第２のアダプターに結合した前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
50. 前記第２のアダプターに結合した前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記第２のアダプタープライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
51. 標的特異的プライマーを前記第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
52. 前記標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
53. 前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
54. 前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記標的特異的プライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
55. 第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域を鋳型核酸分子の第１の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、前記第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列がアダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列に結合する、ステップと、
    前記鋳型核酸分子の３’末端を前記アダプターアンカープローブの５’末端に結合させ、それにより、前記アダプターアンカープローブに結合した鋳型核酸分子を生成するステップと
    を含む方法。
56. 前記アダプターアンカープローブに結合した前記鋳型核酸分子をバイサルファイトで処理するステップをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
57. 前記アダプターアンカープローブが、分子バーコードをさらに含む、請求項５５または５６に記載の方法。
58. 前記第１の架橋プローブの前記第１の標的特異的領域が前記第１の架橋プローブの３’部位に存在する、請求項５５または５６に記載の方法。
59. 前記第１の架橋プローブの前記第１の標的特異的領域が前記第１の架橋プローブの５’部位に存在する、請求項５５または５６に記載の方法。
60. 前記第１の架橋プローブが、前記第１の標的特異的領域と前記第１のアダプターランディング配列との間に第１のリンカーを含む、請求項５５または５６に記載の方法。
61. 前記結合させるステップが、前記鋳型核酸分子の前記３’末端を前記アダプターアンカープローブの前記５’末端にリガーゼを用いてライゲーションすることを含む、請求項５５または５６に記載の方法。
62. 第１のアダプタープライマーを前記アダプターアンカープローブの第１のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項５５または５６に記載の方法。
63. 前記第１のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
64. 第２のアダプターを前記第１の伸長産物の３’末端に結合させ、それにより、前記第２のアダプターに結合した第１の伸長産物を生成するステップをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
65. 前記第２のアダプターを結合させるステップの前に前記鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
66. 前記第２のアダプターが二本鎖アダプターであり、前記第２のアダプターの２本の鎖のうちの一方が前記鋳型核酸分子に結合する、請求項６４に記載の方法。
67. 第２のアダプタープライマーを、前記第２のアダプターに結合した前記第１の伸長産物内の前記第２のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
68. 前記第２のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
69. 前記第２のアダプターに結合した前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
70. 前記第２のアダプターに結合した前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記第２のアダプタープライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
71. 標的特異的プライマーを前記第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
72. 前記標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含む、請求項７１に記載の方法。
73. 前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項７２に記載の方法。
74. 前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記標的特異的プライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項７２に記載の方法。
75. 第１の架橋結合配列を脱離させるステップをさらに含む、請求項５５または５３に記載の方法。
76. 前記第１の架橋プローブの３’末端を伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップをさらに含む、請求項５５または５６に記載の方法。
77. 前記アダプターアンカープローブが、第１のアダプターを含む、請求項５５または５６に記載の方法。
78. 第２のアダプターを前記鋳型核酸分子の５’末端に結合させるステップをさらに含む、請求項７７に記載の方法。
79. 前記第２のアダプターを結合させるステップの前に前記鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化するステップをさらに含む、請求項７８に記載の方法。
80. 前記アダプターが二本鎖アダプターである、請求項７８に記載の方法。
81. 第１のアダプタープライマーを前記アダプターアンカープローブの前記第１のアダプターにハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項７８に記載の方法。
82. 前記第１のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含む、請求項８１に記載の方法。
83. 第２のアダプタープライマーを前記第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項８２に記載の方法。
84. 前記第２のアダプタープライマーを伸長させ、それにより、第３の伸長産物を生成するステップをさらに含む、請求項８３に記載の方法。
85. 前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項８４に記載の方法。
86. 前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記第２のアダプタープライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項８４に記載の方法。
87. 標的特異的プライマーを前記第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップをさらに含む、請求項８２に記載の方法。
88. 前記標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第３の伸長産物を生成するステップをさらに含む、請求項８７に記載の方法。
89. 前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項８８に記載の方法。
90. 前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を前記第１のアダプタープライマーおよび前記標的特異的プライマーを用いて増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項８８に記載の方法。
91. 第２の架橋プローブの第２の標的配列領域を前記鋳型核酸分子の第２の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、前記第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列が前記アダプターアンカープローブの第２の架橋結合配列に結合する、ステップをさらに含む、請求項５５または５６に記載の方法。
92. 前記第２の架橋プローブの前記第２の標的特異的領域が前記第２の架橋プローブの３’部位に存在する、請求項９１に記載の方法。
93. 前記第２の架橋プローブの前記第２の標的特異的領域が前記第２の架橋プローブの５’部位に存在する、請求項９１に記載の方法。
94. 前記第２の架橋プローブが、前記第２の標的特異的領域と前記第２のアダプターランディング配列との間に第２のリンカーを含む、請求項９１に記載の方法。
95. ｉ）前記第１の架橋プローブの前記第１の標的特異的領域が前記第１の架橋プローブの３’部位に存在し、前記第２の架橋プローブの前記第２の標的特異的領域が前記第２の架橋プローブの３’部位に存在する；ｉｉ）前記第１の架橋プローブの前記第１の標的特異的領域が前記第１の架橋プローブの５’部位に存在し、前記第２の架橋プローブの前記第２の標的特異的領域が前記第２の架橋プローブの５’部位に存在する；ｉｉｉ）前記第１の架橋プローブの前記第１の標的特異的領域が前記第１の架橋プローブの３’部位に存在し、前記第２の架橋プローブの前記第２の標的特異的領域が前記第２の架橋プローブの５’部位に存在する；またはｉｖ）前記第１の架橋プローブの前記第１の標的特異的領域が前記第１の架橋プローブの５’部位に存在し、前記第２の架橋プローブの前記第２の標的特異的領域が前記第２の架橋プローブの３’部位に存在する、請求項９１に記載の方法。
96. 前記第１の架橋プローブの前記第１の標的特異的領域が前記第１の架橋プローブの３’部位に存在し、前記第２の架橋プローブの前記第２の標的特異的領域が前記第２の架橋プローブの５’部位に存在し、前記第１の架橋プローブの第１のリンカーと前記第２の架橋プローブの第２のリンカーが、互いにハイブリダイズする、請求項９１に記載の方法。
97. 捕捉プローブまたは前記架橋プローブの標的配列領域が、前記鋳型核酸分子の前記標的配列に基づいて設計されたものであり、前記鋳型核酸の前記標的配列が、前記バイサルファイト処理後にメチル化されていないシトシンを保持する、請求項９、２５、４３、または５６に記載の方法。
98. 核酸分子をバイサルファイトで処理し、それにより、請求項１、２４、４２、または５５に記載の鋳型核酸分子を生成するステップであって、請求項１、２４、４２、または５５に記載の鋳型核酸分子が、前記バイサルファイト処理の産物である、ステップをさらに含む、請求項１、２４、４２または５５に記載の方法。
99. 捕捉プローブまたは前記架橋プローブの標的配列領域が、前記バイサルファイト処理後の前記鋳型核酸分子の前記標的配列に基づいて設計されたものであり、鋳型核酸内のメチル化されていないシトシンが、前記バイサルファイト処理中にウラシルに変換される、請求項９８に記載の方法。
100. 核酸分子の５’末端を脱リン酸化し、それにより、請求項１、９、２４、４２または５５に記載の鋳型核酸分子を生成するステップをさらに含む、請求項１、９、２４、４２または５５に記載の方法。
101. 前記捕捉プローブまたはアダプターアンカープローブが、標識をさらに含む、請求項１、９、２４、４２または５５に記載の方法。
102. 前記標識によって前記架橋プローブを捕捉するステップをさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
103. 前記標識がビオチンである、請求項１０１に記載の方法。
104. 前記標識を固体支持体上に捕捉する、請求項１０２に記載の方法。
105. 前記固体支持体がビーズである、請求項１０４に記載の方法。
106. 前記ビーズが、前記標識を標的とする捕捉用部分を含む、請求項１０５に記載の方法。
107. 前記捕捉用部分がストレプトアビジンである、請求項１０６に記載の方法。
108. 前記鋳型核酸分子の前記３’末端を請求項１、９、２４、４２または５５に記載の捕捉プローブまたはアダプターアンカープローブの前記５’末端に結合させた後、核酸分子を３’から５’のエキソヌクレアーゼと接触させるステップであって、前記核酸分子が、前記捕捉プローブおよび前記鋳型核酸分子を含む、ステップをさらに含む、請求項１、９、２４、４２または５５に記載の方法。
109. 前記増幅産物の配列決定を行うステップをさらに含む、請求項１８、２２、３６、４０、６９、７３、８５、または８９に記載の方法。
110. 前記配列決定が次世代シーケンシングを含む、請求項１０９に記載の方法。
111. 前記鋳型核酸分子が一本鎖ＤＮＡを含む、請求項１、９、２４、４２、または５５に記載の方法。
112. 前記鋳型核酸分子がＲＮＡを含む、請求項１、９、２４、４２、または５５に記載の方法。
113. 前記鋳型核酸分子が損傷ＤＮＡを含む、請求項１、９、２４、４２、または５５に記載の方法。
114. 前記鋳型核酸分子が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料に由来する、請求項１、９、２４、４２、または５５に記載の方法。
115. 前記鋳型核酸分子が、生体試料由来の無細胞核酸を含む、請求項１、９、２４、４２、または５５に記載の方法。
116. 前記無細胞核酸が無細胞ＤＮＡを含む、請求項１１５に記載の方法。
117. 前記無細胞ＤＮＡが循環腫瘍ＤＮＡを含む、請求項１１６に記載の方法。
118. ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ修復ステップが請求項１、９、２４、４２、または５５の前には前記鋳型核酸分子に実施されない、請求項１、９、２４、４２、または５５に記載の方法。
119. プローブを使用して標的配列を捕捉するステップであって、前記プローブが前記標的配列にハイブリダイズし、前記プローブが前記標的配列を含む鋳型に結合する、ステップと、
     前記プローブに結合した前記標的配列をバイサルファイトで処理するステップと
     を含む方法。
120. 架橋プローブを使用して標的配列を捕捉するステップであって、前記架橋プローブにより、アンカープローブの前記標的配列への結合が容易になる、ステップを含む方法。
121. 前記アンカープローブに結合した前記標的配列をバイサルファイトで処理するステップをさらに含む、請求項１２０に記載の方法。
122. 鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズする標的特異的領域および前記鋳型核酸分子の３’末端に結合する５’末端を含む捕捉プローブと、
     前記捕捉プローブの第１のアダプターにハイブリダイズする第１のアダプタープライマーであって、それが伸長することにより、第１の伸長産物が生成される、前記第１のアダプタープライマーと、
     前記第１の伸長産物に結合する第２のアダプターと、
     前記第２のアダプターにハイブリダイズする第２のアダプタープライマーと
     を含むキット。
123. 鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズする標的特異的領域を含む架橋プローブと、
     前記架橋プローブのアダプターランディング配列にハイブリダイズする架橋結合配列および前記鋳型核酸分子の３’末端に結合する５’末端を含むアダプターアンカープローブと
     を含むキット。
124. 捕捉プローブの標的特異的領域を鋳型核酸分子の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、前記捕捉プローブが、前記標的特異的領域の５’末端に位置する第１のアダプターをさらに含む、ステップと、
     前記鋳型核酸分子を、前記標的特異的領域をハイブリダイズさせた後に、３’から５’のエキソヌクレアーゼと接触させるステップと、
     前記鋳型核酸分子の３’末端を前記第１のアダプターを鋳型として使用して伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップと
     を含む方法。
125. 前記捕捉プローブの３’末端を伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップをさらに含む、請求項１２４に記載の方法。
126. 前記第１のアダプターを含むプライマーを前記第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、前記第１のアダプターを含む前記プライマーの３’末端を伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップとをさらに含む、請求項１２４に記載の方法。
127. 第２のアダプターを前記第１の伸長産物の５’末端に結合させるステップをさらに含む、請求項１２５または１２６に記載の方法。
128. 前記第２のアダプターを前記結合させるステップの前に、前記第１の伸長産物の前記５’末端をリン酸化するステップをさらに含む、請求項１２７に記載の方法。
129. 前記第２のアダプターが二本鎖アダプターであり、前記第２のアダプターの２本の鎖のうちの一方が前記第２の伸長産物に結合する、請求項１２７または１２８に記載の方法。
130. 前記第１の伸長産物および前記第２の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項１２９に記載の方法。
131. 標的特異的プライマーを前記第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップであって、前記標的特異的プライマーが第２のアダプターに結合する、ステップと、
     前記標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第３の伸長産物を生成するステップと
     をさらに含む、請求項１２５または１２６に記載の方法。
132. 前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項１３１に記載の方法。
133. 前記捕捉プローブが、分子バーコードをさらに含む、請求項１２４に記載の方法。
134. 前記捕捉プローブが、結合性部分をさらに含む、請求項１２４に記載の方法。
135. 前記結合性部分が、支持体に結合する、請求項１３４に記載の方法。
136. 前記支持体がビーズである、請求項１３５に記載の方法。
137. 前記ビーズがストレプトアビジンビーズである、請求項１３６に記載の方法。
138. 前記結合性部分がビオチンである、請求項１３４に記載の方法。
139. 第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域を鋳型核酸分子の第１の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、前記第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列がアダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列に結合する、ステップと、
     第２の架橋プローブの第２の標的特異的領域を前記鋳型核酸分子の第２の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、前記第２の架橋プローブの第２のアダプターランディング配列が前記アダプターアンカープローブの第２の架橋結合配列に結合する、ステップと、
     前記第１の架橋プローブの３’末端を伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップと
     を含む方法。
140. 前記第１の架橋プローブが、第１のアダプターを含む、請求項１３９に記載の方法。
141. 第２のアダプターを前記第１の伸長産物の３’末端に結合させるステップをさらに含む、請求項１４０に記載の方法。
142. 前記第２のアダプターが二本鎖アダプターであり、前記第２のアダプターの２本の鎖のうちの一方が前記鋳型核酸分子に結合する、請求項１４１に記載の方法。
143. 前記第２のアダプターを結合させるステップの前に、前記鋳型核酸分子の５’末端をリン酸化するステップをさらに含む、請求項１４２に記載の方法。
144. 標的特異的プライマーを前記第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、前記標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップとをさらに含む、請求項１４０に記載の方法。
145. 前記標的特異的プライマーを第２のアダプターに結合させる、請求項１４４に記載の方法。
146. 前記第１のアダプターを含むプライマーを前記第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、前記第１のアダプターを含む前記プライマーの３’末端を伸長させ、それにより、第３の伸長産物を生成するステップとをさらに含む、請求項１４５に記載の方法。
147. 前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項１４６に記載の方法。
148. 前記第１の架橋プローブが、分子バーコードをさらに含む、請求項１３９に記載の方法。
149. 前記第１の架橋プローブが、結合性部分をさらに含む、請求項１３９に記載の方法。
150. 前記結合性部分が、支持体に結合する、請求項１４９に記載の方法。
151. 前記支持体がビーズである、請求項１５０に記載の方法。
152. 前記ビーズがストレプトアビジンビーズである、請求項１５１に記載の方法。
153. 前記結合性部分がビオチンである、請求項１４９に記載の方法。
154. 第１の架橋プローブの第１の標的特異的領域を鋳型核酸分子の第１の標的配列にハイブリダイズさせるステップであって、前記第１の架橋プローブの第１のアダプターランディング配列が、アダプターアンカープローブの第１の架橋結合配列に結合し、前記第１の架橋プローブが、前記標的特異的領域の５’末端に位置する第１のアダプターをさらに含む、ステップと、
     前記鋳型核酸分子を、前記第１の標的特異的領域をハイブリダイズさせた後に、３’から５’のエキソヌクレアーゼと接触させるステップと、
     前記鋳型核酸分子の３’末端を前記第１のアダプターを鋳型として使用して伸長させ、それにより、第１の伸長産物を生成するステップと
     を含む方法。
155. 前記第１のアダプターを含むプライマーを前記第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、前記第１のアダプターを含む前記プライマーの３’末端を伸長させ、それにより、第２の伸長産物を生成するステップとをさらに含む、請求項１５４に記載の方法。
156. 第２のアダプターを前記第１の伸長産物の５’末端に結合させるステップをさらに含む、請求項１５５に記載の方法。
157. 前記第２のアダプターを結合させるステップの前に、前記第１の伸長産物の前記５’末端をリン酸化するステップをさらに含む、請求項１５６に記載の方法。
158. 前記第２のアダプターが二本鎖アダプターであり、前記第２のアダプターの２本の鎖のうちの一方が前記第２の伸長産物に結合する、請求項１５７に記載の方法。
159. 標的特異的プライマーを前記第２の伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、前記標的特異的プライマーを伸長させ、それにより、第３の伸長産物を生成するステップとをさらに含む、請求項１５８に記載の方法。
160. 前記標的特異的プライマーを第２のアダプターに結合させる、請求項１５９に記載の方法。
161. 前記第２の伸長産物および前記第３の伸長産物を増幅し、それにより、増幅産物を生成するステップをさらに含む、請求項１５９に記載の方法。
162. 前記鋳型核酸分子を前記３’から５’のエキソヌクレアーゼと接触させるステップにより、前記鋳型核酸分子の前記３’末端において１つまたは複数のヌクレオチドが切断される、請求項１５４に記載の方法。
163. 前記第１の架橋プローブが、分子バーコードをさらに含む、請求項１５４に記載の方法。
164. 前記第１の架橋プローブが、結合性部分をさらに含む、請求項１５４に記載の方法。
165. 前記結合性部分が、支持体に結合する、請求項１６４に記載の方法。
166. 前記支持体がビーズである、請求項１６５に記載の方法。
167. 前記ビーズがストレプトアビジンビーズである、請求項１６６に記載の方法。
168. 結合性部分がビオチンである、請求項１６４に記載の方法。

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