CN101935697B - 用于核酸序列检测的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了用于检测样品中所含有的多核苷酸分析物中靶序列存在情况的方法和试剂盒。在实施本发明时，在使发现物与探针有效形成双链复合物的条件下将样品与靶标探针混合，所述靶标探针具有能与所述靶序列杂交的序列，使该复合物中的探针在存在聚合酶和四种可能的核苷三磷酸中选定的一至三种的情况下发生反应，以在该探针的3′末端加入选定的一个或多个靶标指导的核苷酸碱基，从而产生经修饰探针。使经修饰探针与检测探针杂交，两种探针连接在以其形成两探针连接产物，并检测连接产物的存在情况。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于检测样品中一种或多种多核苷酸序列存在情况的方法和试剂盒。
背景技术
鉴定核酸序列是许多领域中的关键性诊断工具，这些领域包括医学、法医学、食品生产、畜牧业等，例如Jobling等,NatureReviewsGenetics,5:739-751(2004)；Jo等,Semin.Oncol.,32:11-23(2005)；Woo等,J.Clin.Microbiol.,41:1996-2001(2003)。例如，DNA扩增技术已经应用于所有这些领域中，包括用于检测病毒及细菌、监测病毒载荷、检测罕见和/或难于培养的病原体、快速检测生物恐怖威胁、检测癌症患者中的最低残留疾病、食品病原体测试、血液供给筛查等的应用，例如Mackay,Clin.Microbiol.Infect.,10:190-212(2004)；Bernard等,ClinicalChemistry,48:1178-1185(2002).
合适的核酸扩增方法包括靶标扩增和信号扩增，并可包括但不仅限于聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR，有时称为寡核苷酸连接酶扩增，OLA)、循环探测技术(CPT)、链置换测定(SDA)、滚环扩增(RCA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、和侵入式切割技术(invasivecleavagetechnology)。所有这些方法都需要两种引物或一种引物来与靶序列杂交，以起始扩增。所有这些方法都需要与靶序列杂交以形成杂交复合物的引物核酸(包括核酸类似物)，并加入以某种方式修饰引物以形成经修饰引物的酶。例如，PCR通常需要两种引物、dNTP和DNA聚合酶；LCR需要邻近地与靶序列杂交的两种引物以及连接酶；CPT需要一种可切割的引物以及切割酶；侵入式切割需要两种引物和切割酶。
尽管核酸扩增技术具有在这些广泛应用中所反映出来的优点，但在同一样品中平行实施这些技术(即多重测定)方面进展有限，这时在同一反应混合物中同时扩增和检测多种靶序列，例如Einifro等,Clin.Microbiol.Rev.,13:559-570(2000)；Henegarin等,Biotechniques,23:504-511(1997)。当多重测定包括针对不同靶序列的不同引发事件时，这些事件对不同的靶标的相对效率可能有所不同。这是由于所使用的多种引物之间在稳定性和结构上的差异所导致的。如果不同靶标的产物链复性速率不同，则对于所有靶标而言，伴随引发事件的竞争程度不会都相同。对于包括多重连接事件的反应(如LCR)，这可能较小，但每个靶序列的连接事件的相对效率可能存在显著差异。由于连接事件重复多次，因此这种效应会被放大。对于包括逆转录(3SR、NASBA)或klenow链取代(SDA)的反应，聚合反应持续能力的程度在不同靶序列之间可能存在差异。对于包括不同可复制RNA探针的测定，每个探针的复制效率通常都不同，因此探针在Qβ复制酶所催化反应中非公平竞争。因此，需要这样一种扩增方法，它在多重测定中产生不同且有可能错误的信号的可能性更低。
微阵列技术提供了对含有多种多核苷酸分析物的样品进行同时测量的可选方法，例如美国专利No.5,700,637,Wang等,Proc.Nat.Acad.Sci.,99:15687-15692(2002)，然而，这些技术在科研实验室以外的用途有限。此外，该技术在多重分析中使用如下主要方法，即获得样品中所存在每种目的分析物的数据。这样，多重测定主要考虑在所靶向的多种分析物中进行解析和区分。靶标的数目通常以一定方式受到识别事件(例如探针对靶标的特异性、设计不发生对扩增产生负影响的相互作用之引物组的困难程度)或者检测方法(例如生色团或发光团的宽吸收谱或发射谱限制了可独立测定的这些标记的数目)的限制。尽管如此，本领域内许多工作都涉及通过能在单个过程中检测或解析更多分析物来改善现有方法的多重能力。
最近，若干高度多重及超高通量的基因分型系统已经开始广为使用(Matsuzaki,等,Nat.Methods1:109-111(2004),Hardenbol,等,GenomeRes.15:269-275(2005),Murray,S.S.,等,Nat.Methods,1:113-117(2004))。然而，这些系统中的大多数由于探针长度限制而不够灵活，并且由于探针间的杂交而使得样品处理中的多重性仍然是有限的。因此，需要开发具有高度多重性的灵敏且精确的核酸检测方法。
发明内容
本发明提供可用于核酸扩增、核酸检测和蛋白质分析的方法。在一个方面中，本发明包括检测样品中所含有的多核苷酸分析物中靶序列存在情况的方法。该方法包括以下步骤：
(a)在有效形成所述分析物与探针的双链复合物的条件下，将样品与靶标探针混合，所述靶标探针含有能与靶序列杂交的序列；
(b)在聚合酶及四种可能核苷三磷酸中选定的一至三种存在的情况下使该复合物中的所述探针进行反应，从而向所述探针的3'末端添加一个或多个由靶标指导的核苷酸碱基，以产生经修饰探针；
(c)使所述经修饰探针与检测探针杂交，其中该检测探针不与所述靶标杂交，且这两种探针中的至少一种具有粘末端，所述粘末端从该末端开始具有与另一探针的单链区互补的单链区；
(d)通过该反应将所述修饰探针与检测探针连接起来，以形成双探针连接产物；和
(e)检测该连接产物的存在情况。
在一个实施方案中，步骤(b)可任选地包括通过变性或降解所述靶标而使所述经修饰探针从靶标上解离。
在一个实施方案中，所述靶标探针在步骤(b)的聚合反应之前或之后具有粘末端。在另一个实施方案中，步骤(c)中一种探针在其3'或5'末端的粘末端单链序列中与另一探针单链序列互补的部分可包括一个或多个碱基对。
在一个实施方案中，步骤(d)中修饰探针和检测探针的连接包括酶促连接和化学连接。
在一个实施方案中，(a)中的靶标探针可包括不与靶序列互补的任意序列。该任意序列可包括通用引发位点、启动位点、切割位点、非天然核苷酸、限制性酶切位点等。
在另一实施方案中，所述靶标探针可以是具有发夹结构的单链多核苷酸，或者是双链多核苷酸。双链靶标探针的一个末端可以是通过共价键连接的。双链靶标探针的另一末端可以在步骤(b)中加入核苷三磷酸之前或之后是粘末端。粘末端的单链区可包括一个或多个核苷酸。
在一个实施方案中，(c)中的检测探针可包括任意序列。该任意序列可包括通用引发位点、启动位点、切割位点、非天然核苷酸、限制性酶切位点等。
在另一个实施方案中，(c)中的检测探针可以是具有发夹结构的单链多核苷酸，或者是双链多核苷酸。双链检测探针的一个末端可以是通过共价键连接的。双链检测探针的另一末端是粘末端。所述粘末端的单链区可包括一个或多个核苷酸。
在一个实施方案中，步骤(b)中的聚合酶可包括DNA依赖性DNA聚合酶或RNA依赖性DNA聚合酶。
在一个实施方案中，反应步骤(a)-(e)可以这样进行：在单个反应管中加入这些步骤所需的组分，并在基本等温的条件下进行这些步骤。
在一个实施方案中，步骤(a)中靶标探针的量以摩尔计显著过量于靶标分析物的量，并且该方法还可包括重复步骤(a)和(b)，以提高样品中存在的修饰探针数。重复步骤(a)和(b)可包括在每个步骤(b)之后加热样品以从靶标多核苷酸上释放修饰探针，以及作为每个步骤(a)的一部分冷却样品使未反应的靶标探针与所述靶序列杂交。
在一个实施方案中，本发明提供用于检测小目的靶标区域的方法，所述小目的靶标区域例如1-6个碱基的区域(例如SNP或位置已知的点突变)，所述靶标探针可具有与目的靶标区部分互补或者紧邻目的靶标区的3'末端核苷酸碱基，并且可以进行步骤(b)以使得该修饰探针的3'末端序列与目标靶标区互补。在这个实施方案中，可通过加入单个核苷三磷酸实施步骤(b)。
在一个实施方案中，本发明提供用于检测样品中一种或多种多核苷酸中的多种目的靶序列的方法，可将该样品与多种靶标探针混合，每种靶标探针都是具有能与样品多核苷酸区域形成双链复合物的发夹环结构的单链多核苷酸。这时，该方法的步骤(a)可包括将样品分成两个或更多个样品等分试样，并将每个样品等分试样与所述多种靶标探针混合；步骤(b)可包括使每个样品等分试样与四种不同核苷三磷酸中选定的一种至三种反应，对每个等分试样使用四种核苷三磷酸中一种至三种的不同组合；步骤(c)可包括使该修饰探针与等分试样特异性探针杂交，步骤(d)可包括使该修饰探针与等分试样特异性检测探针反应以形成连接产物；步骤(e)可包括在检测前扩增每个等分试样中的连接产物。检测多种连接产物可包括在扩增过程中在每个等分试样中掺入特定的标记。扩增方法可包括聚合酶链式反应、滚环扩增和转录。扩增产物可在检测前进行化学或酶促处理。在另一个方面中，在通过与附着在固体表面(如阵列)上的探针杂交来进行检测之前，可以混合来自每个等分试样的扩增产物，也可以不混合。
在一个实施方案中，可以在反应管中从固体表面上合成多种靶标探针的混合物。所述多种靶标探针从固体支持物上的释放形成了多种靶标探针的混合物。该多种靶标探针的混合物可用于检测样品中一种或多种多核苷酸中的多种目的靶标序列。
在一个实施方案中，本发明提供用于检测样品中一种或多种多核苷酸中的多种目的靶标序列的另一种方法，可将该样品与多种靶标探针混合，每种靶标探针都是具有能与样品多核苷酸区域形成双链复合物的发夹环结构的单链多核苷酸。这里，该方法的步骤(e)可包括将连接产物分成两个或更多个样品等分试样，并在检测前用特定的引物来扩增每个等分试样。扩增方法可包括聚合酶链式反应、滚环扩增(如果连接产物为环形)。在检测之前可以对所述扩增产生进行化学或酶处理。作为替代地，该方法的步骤(e)可包括转录多种连接产物并通过与固体表面上的探针杂交来检测转录物。
在一个实施方案中，所述检测探针和所述经修饰探针都可以是具有发夹环结构的单链多核苷酸，其可以具有彼此互补的粘末端，以使步骤(d)中形成的二探针连接产物为环状多核苷酸。在另一实施方案中，该方法在步骤(d)中可包括对连接产物进行核酸外切酶处理。在另一实施方案中，可以在扩增和检测前切割该环状连接产物。
在另一实施方案中，用于检测连接产物存在情况的步骤(e)可包括使用该连接产物作为模板来合成可检测的多核苷酸化合物。例如，可以通过PCR、滚环扩增(RCA)来扩增和检测所述连接产物，或者使用该连接产物作为靶标特异性转录物的来源。在一个方面中，可通过由该连接产物中所包含的启动子序列起始或者由该连接产物中存在的环序列起始来产生靶标特异性转录物。
在一个实施方案中，靶标探针或检测探针之一可以附着在固体支持物上，以使得步骤(d)中产生的连接产物也附着在该固体支持物上。检测所述连接产物存在情况的步骤(e)可包括检测该支持物上该连接产物的存在情况。
在一个实施方案中，该方法可用于蛋白质结合测定，这时多核苷酸分析物负载在蛋白质结合剂上。
在一个实施方案中，本发明提供用于在蛋白质结合测定中检测样品中多种蛋白质分析物的方法，所述样品可以与多种蛋白质结合剂混合，每种蛋白质结合剂载有可区分的多核苷酸序列。这里，该方法的步骤(a)可包括多种靶标探针，每种靶标探针都是具有能与结合剂上所附着多核苷酸序列形成双链复合物的发夹环结构的单链多核苷酸。这里，该方法的步骤(e)可包括将连接产物分成两个或更多个等分试样，并在检测前用特定引物扩增每个等分试样。扩增方法可包括聚合酶链式反应、滚环扩增(如果连接产物为环状)。在检测前可对扩增产物进行化学或酶处理。在另一实施方案中，可通过与附着在固体表面(如阵列)上的检测探针杂交来检测扩增产物。在另一实施方案中，所述靶标探针和检测探针之一可以附着在固体表面上。
在一个实施方案中，该方法可用于检测来自细胞裂解物的靶标核酸分子。步骤(a)可包括将靶标探针与该细胞裂解物中的靶标核酸分子杂交。
在一个实施方案中，本发明提供用于检测RNA多核苷酸分析物的方法，该方法的步骤(a)可包括将样品与靶标探针混合；步骤(b)可包括使该复合物中的探针在逆转录酶聚合酶存在下反应，以形成经修饰探针；步骤(c)可包括将该经修饰探针与检测探针杂交；步骤(d)在连接酶存在下将该经修饰探针与检测探针连接起来，形成双链连接产物。反应步骤(a)-(e)可以这样进行：在单个反应管中依次加入这些步骤所需的组分，并在基本等温的条件下进行这些步骤。所述检测探针可包括启动子区，以使步骤(d)中产生的连接产物将靶标探针序列置于该启动子区的控制之下，步骤(e)包括使两种探针的连接产物与启动子依赖性聚合酶在有效启动合成含有靶标-探针互补序列的转录物的条件下反应，并检测该转录物的存在情况。可以将所述转录物与用于产生该转录物的反应介质中所存在的分子信标反应，从而在步骤(e)中检测该转录物的存在情况。该方法还可包括重复步骤(a)-(e)，这时步骤(a)中的靶标序列由所述转录物提供。在另一个方面中，该方法在步骤(b)中可包括在形成经修饰探针后以化学或酶促方式降解RNA分析物。
在另一个方面中，该方法包括用于检测含有已知靶标序列的DNA分析物、RNA分析物(如RNA病毒基因组、siRNA或miRNA)的试剂盒。该试剂盒包括：(a)具有发夹环结构的单链靶标探针，该发夹环结构具有能在有效形成分析物-探针双链异源双链体复合物的条件下与所述靶标序列杂交的序列；(b)聚合酶；(c)四种可能的核苷三磷酸中的一种至三种；(d)单链DNA检测探针，其具有与所述经修饰探针粘末端序列互补的粘末端序列，其中所述检测探针(i)不与靶标杂交并且(ii)含有启动子区；(e)聚合酶；和(f)能与分析物靶标序列杂交并由此产生可检测信号的探针，例如分子信标探针。
在操作该试剂盒时，向反应管中加入靶标分析物和含水介质，并加入试剂盒组分以起始反应，从而在该管中(a)形成分析物与靶标探针的双链复合物；(b)在靶标探针的3'末端添加选定的一个或多个由靶标指导的核苷酸，以产生经修饰探针；(c)将该经修饰探针与检测探针连接起来，以形成两种探针的连接产物；(d)形成含有分析物-靶标序列的连接产物转录物；和(e)将分子信标探针与该转录物结合，以产生可检测信号。
为了用于检测一种或多种RNA或DNA分析物中的多种目的靶标序列，该单链DNA靶标探针可包括多种靶标探针，每种靶标探针都具有带有发夹环结构的单链多核苷酸，该发夹环结构能与样品多核苷酸的某区域形成双链复合物。
所述检测探针的启动子区可以是RNA聚合酶启动子，启动子依赖性聚合酶可以是RNA聚合酶。当所述检测探针包括发夹结构时，该发夹区本身可发挥启动子区的功能。
当结合附图和所附权利要求书阅读以下对本发明的详细描述时，将可以更为完整地理解本发明的这些及其他目的和特征。
附图说明
图1A和图1B显示在利用单链靶标探针和单链发夹检测探针的一个一般性实施方案(1A)中，以及利用单链发夹靶标探针和单链检测探针的又一个一般性实施方案(1B)中，实施本发明方法的步骤；
图2A-2G展示了在多个实施方案中实施本发明的步骤；
图3展示了使用四色检测方案进行的用于检测多种目的分析物序列的本发明方法；
图4显示了用于检测一种或多种选定蛋白质的蛋白组学探针，其中根据本发明进行探针检测；
图5展示了根据本发明的一个实施方案检测RNA分析的步骤；
图6展示了根据本发明进行多重miRNA检测的步骤；
图7展示了产生经修饰探针的步骤。在所述靶标探针3'末端有限的碱基延伸之后在20％变性聚丙烯酰胺凝胶上分离探针(箭头指示添加了碱基的靶标探针)。1.探针R+F，靶标RS1389629-G；2.探针R+F，靶标RS1389629-C；3.探针R+2F，靶标RS1389629-G；4.探针R+2F，靶标RS1389629-C；
图8展示了将经修饰探针与检测探针进行连接以及用核酸外切酶来消化任何线性探针和靶标的步骤。20％变性聚丙烯酰胺凝胶显示了连接和核酸外切酶消化的结果。箭头指示延伸了3'末端的靶标探针与检测探针(环化探针)的连接。凝胶分离进行1.5小时。1.RS1389629-G；2.Oct25-2005F；3.Oct25-2005R；4.Oct25-20052F；5、7.连接F+R；6、8.连接2F+R；9、11.连接-外切酶消化(F+R)；10、12.连接-外切酶消化(2F+R)；
图9展示了使用的探针和模板。用于多重SNP检测的合成靶标及探针的凝胶鉴定。1.通用-CT(49mer),2.U通用-CA(49mer),3.SNP1-探针(35mer),4.SNP2-探针(38mer),5.SNP3-探针(46mer),6.SNP4-探针(41mer),7.SNP1-模板(40mer),8.SNP2-模板(41mer),9.SNP3-模板(38mer),10.SNP4-模板(39mer)；
图10展示了用于SNP检测的步骤。使用发夹探针和大豆合成靶标，通过检测延伸及连接产物来检测单个SNP。1.通用-CA,2.通用-CT,3-6.SNP1、2、3、4探针的延伸；7-10.SNP1、2、3、4探针的延伸连接；11-14.环化的探针:SNP1、2、3、4探针的延伸连接-核酸外切酶消化；
图11展示了从单个靶标产生多种经修饰探针的步骤。该图显示了通过包括变性、退火和延伸的循环实现环状探针(延伸探针与检测探针的连接产物)的线性增加。1.靶标探针,2.合成靶标,3.检测探针,4.4个循环的扩增-连接-核酸外切酶消化,5.10个循环的扩增-连接-核酸外切酶消化,6.15个循环的扩增-连接-核酸外切酶消化,7.25个循环的扩增-连接-核酸外切酶消化,8.35个循环的扩增-连接-核酸外切酶消化,9.50个循环的扩增-连接-核酸外切酶消化；
图12展示了靶标探针修饰的特异性。通过加入dXTP来限制靶标探针的延伸和连接。图12A显示了用dXTP检测SNP1和SNP2的结果。图12B显示了用dXTP检测SNP3和SNP4的结果。特异性检测到的条带(第1道和第7道)是环化的探针，其中所述靶标探针的3'末端发生了碱基延伸，并与具有3'末端互补序列的检测探针相连接。1、7.dGTP；2、8.dCTP；3、9.dTTP；4、10.dATP；5、11.无dXTP；6、12.无靶标；
图13展示了用于多重SNP检测的步骤。使用发夹探针和大豆合成靶标来检测多重SNP。1-4,SNP1、2、3、4探针延伸；5,多重SNP延伸；6-9,SNP1、2、3、4探针延伸连接；10,多重SNP延伸-连接；11-14,SNP1、2、3、4探针延伸连接-核酸外切酶消化；15,多重SNP延伸-连接-核酸外切酶消化；
图14展示了对多重SNP检测连接产物进行PCR扩增的步骤。对来自碱基延伸的靶标探针和检测探针的环化探针进行PCR确认。图14A,来自四种合成靶标模板的检测反应；图14B,来自大豆株系PI基因组DNA的检测反应；图14C,由大豆株系Essex的检测反应。1、2、3检测SNP1；4、5、6检测SNP2；7、8、9检测SNP3；10、11、12检测SNP4；1、4、7、10,具有与反义引物互补的部分的单连接产物；2、5、8、11,多重延伸-连接-核酸外切酶消化的产物；3、6、9、12,除了具有与反义引物互补部分的单连接产物以外的3种延伸-连接-核酸外切酶消化的产物；
图15展示了对连接产物进行滚环扩增的步骤。使用环特异性反义引物对环化探针进行滚环扩增。1.SNP1-连接-核酸外切酶消化；2.SNP2-连接-核酸外切酶消化；3.SNP3-连接-核酸外切酶消化；4.SNP4-连接-核酸外切酶消化；5.多重SNP(4种SNP)-连接-核酸外切酶消化；6.阴性对照；7.SNP2-连接-核酸外切酶消化,200倍稀释；8.SNP3-连接-核酸外切酶消化,200倍稀释；9.SNP2-PI；10.SNP2-Essex；
图16展示了RNA检测的步骤。通过已延伸的靶标探针和检测探针的逆转录及连接来检测RNA。1.检测探针:Univ-探针-CA；2.靶标探针:RHG-SNP2-探针-38；3.8分钟RT,箭头指示已延伸的靶标探针；4.合成的RNA靶标；5.10分钟连接反应；6.20分钟连接；7.30分钟连接；8.10分钟连接核酸外切酶消化；9.20分钟连接核酸外切酶消化；10.30分钟连接核酸外切酶消化；
图17展示了单管等温扩增和RNA检测的步骤。使用发夹靶标探针和检测探针进行用于合成RNA检测的单管等温测定。1.检测探针；2.RNA靶标；3.靶标探针；4.用dGTP-连接进行的单管RT,箭头指示环化探针；5.用dATP-连接进行的单管RT；6.用dTTP-连接进行的单管RT；7.用dCTP-连接进行的单管RT；8.无模板；9.无RT；
图18展示了连接产物转录的步骤。使用发夹靶标探针和检测探针进行用于总RNA检测的单管等温测定。1.18S-T7发夹探针-连接-核酸外切酶消化；2.18S-通用CA探针-连接-核酸外切酶消化；3.18S双链T7-连接；4.T7发夹探针；5.通用CA探针；
图19展示了用于等温扩增RNA的单管测定。用于RNA检测的单管等温测定-逆转录-连接-体外转录(Invitrotranscription,IVT)。1.(玉米-18S-rRNA探针+玉米总RNA)RT+T7双链启动子无连接酶；2.(玉米-18S-rRNA探针+玉米总RNA)RT+T7双链启动子-连接-IVT；3.(玉米-18S-rRNA探针+玉米总RNA)RT+T7双链启动子-连接。
具体实施方式
本文公开的组合物和方法利用允许一致且定量地扩增和检测靶标核酸序列的某些材料和程序。这些材料和程序在下文详细描述。
本发明方法的一些主要特征为：
1.选择发夹探针以改善杂交特异性并提高多重性。
2.通过加入四种核苷三磷酸中选定的一种至三种，可以操纵聚合酶操作以产生受控延伸产物，从而获得对等位片段的区分。
3.连接操作不依赖于模板，从而获得进一步的等位片段区分。
4.模板非依赖性连接操作提供了向连接产物中加入期望特征的更大灵活性，例如，可以含有任意选择的可用于扩增和检测的标签序列。
5.连接产物可以是带有哑铃结构的环状多核苷酸，该哑铃环状DNA具有许多独特的应用。
6.可以操纵扩增操作成为等温的。
7.信号可以是严格定量的，因为在某些扩增操作的实施方案中扩增是线性的。
8.可以在DNA复制或转录中掺入经修饰核苷酸或其他部分。
A.定义
除非另外指明，对下文的术语给出以下定义：
1.“靶向序列或靶向多核苷酸”指多核苷酸探针中设计成与分析物中的某序列基本互补的部分或区域。“靶向序列”也称为探针的“分析物特异性区域”。相对地，分析物中的序列称为“靶标序列”。“靶标多核苷酸或靶标序列”指试图检测的多核苷酸序列。所述靶标多核苷酸可得自任何来源，并可包含任何数目的不同组成部分。例如，靶标可以是核酸(如DNA或RNA)、转运RNA、siRNA、miRNA，并可包括核酸类似物或其他核酸模拟体。靶标可以是甲基化的、非甲基化的，或者两者都有。靶标可经亚硫酸氢盐处理，非甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶。此外，应该理解，“靶标多核苷酸”可以指靶标多核苷酸本身及其代用物(例如扩增产物)和天然序列。在一个实施方案中，所述靶标多核苷酸是miRNA分子。在一个实施方案中，所述靶标多核苷酸缺少多聚A尾。在一个实施方案中，所述靶标多核苷酸是来自已降解来源的短DNA分子，例如但不仅限于法医学样品中的DNA分子(参阅如Butler,2001,ForensicDNATyping:BiologyandTechnologyBehindSTRMarkers)。本发明教导的靶标多核苷酸可来自任何多种来源，包括但不仅限于病毒、原核生物、真核生物，例如但不仅限于植物、真菌和动物。这些来源可包括但不仅限于全血、组织活检、淋巴、骨髓、羊水、毛发、皮肤、精液、生物战剂、肛门分泌物、阴道分泌物、汗、唾液、口腔拭子、多种环境样品(例如农业样品、水样和土壤样品)、一般研究样品、一般纯化样品、培养细胞和裂解的细胞。应该理解，可使用任何多种本领域已知的方法从样品中分离靶标多核苷酸，例如AppliedBiosystemsABIPrism.TM.6100核酸制备工作站以及ABIPrism.TM.6700自动化核酸工作站,Boom等,美国专利No.5,234,809,mirVanaRNA分离试剂盒(Ambion)等。应该理解，可以在分析前切割或切断靶标多核苷酸，包括使用诸如机械力、超声处理、限制性核酸内切酶切割的方法或者本领域已知的任何方法。一般而言，本发明的靶标多核苷酸可以是单链的，但在一些实施方案中靶标多核苷酸也可以是双链的，单链可通过变性产生。
2.“靶标探针”是包含靶标识别区段的线性单链核酸分子或双链核酸分子。所述识别区段包含识别选定靶标多核苷酸的多核苷酸探针。该靶标探针可与待检测多核苷酸靶标中的互补碱基序列杂交。所述探针多核苷酸的序列应为至少6个碱基，优选为6至50个碱基，最好为12－30个，以赋予该探针特异性，从而确保其与靶标的良好结合。然而，这样的碱基序列不需要是单个连续互补的多核苷酸序列，而是可以包含由非互补序列间隔开的两个或更多个单个互补序列。
可用的靶标探针包括寡核苷酸、寡核苷酸类似物或者其组合。靶标探针可包含靶标识别部分，并任选地包含非靶标识别部分。所述靶标识别部分与该靶标模板的被称为探针互补区的靶标模板序列互补。靶标探针可含有不与靶标模板的任何部分互补的其他序列(和/或其他特征)。此序列被称为靶标探针的非靶标互补部分。所述探针的非靶标互补部分(如果有的话)可有利于例如该探针的检测、固定或分离。靶标探针的非靶标互补部分可以为任何长度，但通常长度为1至100个核苷酸，优选长度为4至8个核苷酸。非靶标互补部分通常位于所述探针的5'末端。为了有助于检测和定量延伸的靶标探针，靶标探针可包含一个或多个检测标记。靶标探针可以(但不必需)包括除所述靶标互补部分以外的非靶标互补部分和/或特征。因此，例如，靶标探针可由靶标互补部分组成，靶标探针可包含靶标互补部分，靶标探针可包含组成靶标互补部分的核苷酸。
如果所述靶标多核苷酸是双链的，则所述靶标探针可包含有义靶标识别部分，非靶标识别部分可包含反义靶标互补部分。
所述靶标探针可以是含有或不含有发夹结构的单链多核苷酸，或者可以是双链多核苷酸。线性单链靶标探针和双链靶标探针均包含靶标互补部分和任意序列部分。对于双链靶标探针，双链靶标探针的一个末端是通过共价键连接的。该共价键可以不使用核苷酸进行桥接。在步骤(b)中加入核苷三磷酸之前或之后双链靶标探针的另一末端可以是粘末端。粘末端的单链区可包含一个或多个核苷酸。
线性单链靶标探针可包含含有短互补序列节段(可能少至5或6个核苷酸)的预定的发夹结构，从而这些互补节段会退火以提供发夹寡核苷酸。本文使用的术语“发夹寡核苷酸”指这样的单链寡核苷酸：所述单链寡核苷酸在其5'和3'末端处或附近均含有互补序列，以使所述互补序列退火，导致通过氢键键合的内部互补序列形成以环化形式保持的环状结构。发夹寡核苷酸与真正的单链DNA环(例如通过本文所述方法形成的环)之间的差异是，单链环通过共价键保持在一起，以形成没有游离5'和3'末端的单环。此外，本文所述的起始发夹寡核苷酸含有彼此倒置的内部互补序列，以使当所述序列定位时，3'和5'末端会在同一区段内杂交，以获得短的线性区段，而只有寡核苷酸中未杂交的部分形成环状结构。此外，可以仅有一个所述互补序列位于多核苷酸的5'或3'末端，另一互补序列在所述多核苷酸的末端被短核苷酸区段代替，该短核苷酸区段不与该多核苷酸的任何部分互补。
线性单链靶标探针和双链靶标探针中包含的任意序列部分由本发明使用者的期望、意愿和动机来决定。例如，任意序列可包括启动子位点、限制性酶切位点、通用引物位点、切割位点、地址标签部分、检测标签部分、非天然核苷酸等。
靶标探针可通过多种方法产生。它们可以化学合成，例如根据Beaucage和Caruthers(1981),TetrahedronLetts.,22(20):1859-1862所述的固相亚磷酰胺三酯法合成，例如使用自动化合成仪，如Needham-VanDevanter等(1984)NucleicAcidsRes.,12:6159-6168所述。寡核苷酸也可以自制以及从本领域技术人员已知的多种商业来源订购。必要时寡核苷酸的纯化一般通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换HPLC进行，如Pearson和Regnier(1983)J.Chrom.255:137-149所述。合成寡核苷酸的序列可使用Maxam和Gilbert(1980),Grossman和Moldave(编辑)AcademicPress,NY,MethodsinEnzymology65:499-560中的化学降解法来验证。也可以方便地从技术人员已知的多个商业来源订购定制寡核苷酸。
在一个实施方案中，可以在平的固体表面合成多种靶标探针的混合物。从固体表面释放多种靶标探针形成了多种靶标探针的混合物。所述多种靶标探针的混合物可用于检测样品中一种或多种多核苷酸中多种靶序列的存在情况。
通过合成方法制备靶标探针时，可能需要使探针的5'末端磷酸化，因为寡核苷酸合成仪通常不产生在其5'末端带有磷酸的寡核苷酸。如果不这样的话，探针5'末端缺少磷酸会阻止探针的5'和3'末端进行连接。可按照本领域熟知的方法进行磷酸化，例如使用如美国专利No.5,593,840中所述的T4多核苷酸激酶。
3.本文使用的“经修饰探针”指结构、序列和/或组成发生变化的靶标探针，所述变化是由于依赖于探针与分析物中特定多核苷酸序列(“靶标序列”)杂交的反应而发生的。在本发明的一个实施方案中，经修饰探针是由于有选择地加入了四种核苷三磷酸中的一种至三种而延伸了有限个碱基的靶标探针。
本发明与传统的单碱基延伸(singlebaseextension,SBE，有时称为“小量测序”)不同。单碱基延伸或小量测序法将至少一种带标记或经修饰的dNTP用于等位片段区分。一般而言，该核苷酸发生衍生化以使得不再发生进一步延伸，因此仅加入单个核苷酸。涉及SBE的以下参考文献明确地通过参考整体并入本文：美国专利No.5,639,611；美国专利No.5,824,476；美国专利No.5,981,176；美国专利No.4,851,331；美国专利No.5,888,819；美国专利No.6,004,744；美国专利No.5,137,806；美国专利No.6,287,778B1；美国专利No.5,582,970；美国专利No.6,307,039；美国专利No.6,013,431；美国专利No.5,846,710；美国专利No.5,710,028；美国专利No.6,153,379；美国专利No.5,665,539；美国专利No.6,287,778；美国专利No.5,856,092；WO92/15712；美国专利No.4,656,127；EPO371437B1；美国专利No.5,595,890；美国专利No.6,015,675；美国专利No.5,578,458。本发明不依赖于经修饰的dNTP，而是使用后续的连接反应来进行等位片段区分。只有正确延伸的靶标探针能与待检测的检测探针连接。
4.“检测探针”是包含在步骤(b)中与经修饰靶标探针杂交的互补部分的线性单链核酸分子或双链核酸分子。位于3'末端或5'末端的互补部分为线性双链。经修饰靶标探针可与待检测的检测探针中互补的碱基部分杂交。互补部分的序列应为至少一个碱基，优选为2至15个，最好为2至3个碱基。
检测探针的3'末端或5'末端不与靶标探针所杂交的有义靶标序列杂交，但可与反义靶标序列部分互补。
可用的检测探针包括寡核苷酸、寡核苷酸类似物或其组合。检测探针可含有不与经修饰靶标探针中任何部分互补的其他序列(和/或其他特征)。此序列被称为检测探针的非靶标探针互补部分。所述探针的非靶标探针互补部分(如果有的话)可有利于例如该探针的检测、固定或分离。检测探针的非靶标探针互补部分可以为任何长度，但通常长度为1至100个核苷酸，优选长度为4至8个核苷酸。非靶标探针互补部分通常位于探针的5'末端或3’末端。为了有助于经修饰靶标探针的检测和定量，检测探针可包含一个或多个检测标记。例如，非靶标探针互补部分可包括启动子位点、限制性酶切位点、引物位点、切割位点、地址标签部分、检测标签部分、非天然核苷酸等。
检测探针可以是含有发夹结构的单链多核苷酸，或者可以是双链多核苷酸。线性单链检测探针和双链检测探针均包括靶标探针互补部分和任意序列部分。对于双链检测探针，双链靶标探针的一个末端可以或者可以不通过共价键连接。所述共价键可以不使用核苷酸进行桥接。双链靶标探针的另一末端可以是粘末端，可包含一个或多个核苷酸。
线性单链检测探针可包括与靶标探针类似的预定的发夹结构，只是没有任何与靶标序列杂交的部分。
通过合成方法制备检测探针时，可能需要使探针的5'末端磷酸化，因为寡核苷酸合成仪通常不产生在其5'末端带有磷酸的寡核苷酸。如果不这样的话，探针5'末端缺少磷酸这一情况会阻止探针的5'和3'末端进行连接。可按照本领域熟知的方法进行磷酸化，例如使用如美国专利No.5,593,840中所述的T4多核苷酸激酶。
5.“连接产物”由检测探针与经修饰探针连接产生。所述连接产物可以是具有发夹结构的线性单链多核苷酸，或者可以是双链多核苷酸或线性环状多核苷酸。
对于产生线性环状连接产物的情况，未反应的探针可构成不希望的非特异性扩增的背景。在一个优选的实施方案中，使任何未反应的环化前探针和/或靶标序列不可用于扩增。如本领域技术人员所知，这可以通过多种方式实现。在一个实施方案中，加入会降解任何线性核酸的核酸外切酶，留下闭合的环状产物。合适的3'核酸外切酶包括但不仅限于exoI、exoIII、exoVII、exoV和聚合酶(因为许多聚合酶具有优良的核酸外切酶活性)等。在扩增之前，必需从反应混合物中除去任何核酸外切酶，例如通过使核酸酶热变性来进行。
还有许多本领域技术人员的理想方法可以包括在内，并可用于富集连接产物(美国专利No.6858412,美国专利No.6329150)。
连接产物可包括由检测探针或靶标探针赋予的许多用于检测和扩增目的的独特特征。例如，连接产物可包括至少一个启动子位点、限制性酶切位点、引物位点、切割位点、地址标签位点、检测标签位点、非天然核苷酸等。
“通用”引发位点是通用引物所杂交的位点。一般而言，“通用”指单个引物或引物组可用于多个扩增反应。例如，在多个不同靶序列的检测或基因分型中，所有的靶标探针可共享相同的通用引发序列，使得可以使用单组引物对多种不同连接产物进行多重扩增。这使合成容易(例如仅合成一组引物)，使成本降低，还具有杂交动力学优点。非常重要的是，使用这样的引物极大地简化了扩增多种连接产物的多重性。还应该注意，可以使用通用引发序列/引物的“组”。例如，在高度多重性的反应中，使用若干组而不是一组通用序列可能是有用的，例如，一组不同的连接产物可具有相同的引发序列，另一组不同连接产物具有不同的组，等等。
切割位点是允许在特定位置切割核酸的位点。合适的切割位点包括但不仅限于掺入尿嘧啶或其他核糖核苷酸、限制性核酸内切酶位点等。在一个优选的实施方案中，切割位点包括尿嘧啶碱基。这使得可以使用尿嘧啶-N-糖基化酶——除去尿嘧啶碱基而留下核糖部分的酶。将这种处理与通过加热改变pH(至碱性)组合或与使该位点接触切割碱性核苷的脱嘌呤内切核酸酶组合，使得可以高度特异地切割连接产物。可以包括多于一个切割位点。
向连接产物或连接产物的扩增子中加入地址标签部分，以允许分离核酸片段的混合物。地址标签部分的一种优选形式是杂交标签序列。在这一实施方案中，选择地址标签部分以使得可以与阵列的表面或固体支持物上的互补俘获探针杂交。地址标签部分作为连接产物的独特标识。一般而言，将地址标签及相应俘获探针的组发展成使它们彼此之间以及与反应混合物中其他组分(包括靶序列和靶序列以外较大的核酸序列，例如基因组DNA中的序列)的交叉杂交均最小。其他形式的地址标签为可使用质谱法分离的质量标签、可基于电泳迁移率或柱层析分离的电泳标签等。
用于在阵列杂交(如高密度阵列)中检测的地址标签优选为约20个核苷酸的长度，描述于Shoemaker等(1996)NatureGenetics14:450。地址标签序列应该尽可能地不同，但仍保持相似的杂交特性，以便于在高密度寡核苷酸阵列上同时进行分析。如Shoemaker等(见上文)所述，可以使用算法来选择数千(超过9000)种尽可能不同的20mer地址标签序列，它们预计具有相似的解链温度，没有二级结构且任何两个序列之间均无广泛相似性(5个错配以上)。此外，杂交是很灵敏的，能检测杂交信号的微小差异。例如，如Shoemaker等(见上文)所述，在120种寡核苷酸的杂交混合物中检测到了2倍的浓度变化。
地址标签的使用使得可以使用“通用阵列”，例如，可将阵列制成具有可用于多种应用的一组俘获探针。允许使用通用阵列的地址标签序列之用途描述于有限的文献中，参阅如Chee等,Nucl.AcidRes.19:3301(1991)；Shoemaker等,NatureGenetics14:450(1998)；Barany,F.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:189-193；EP0799897A1；WO97/31256，均通过参考明确并入本文。
在一个实施方案中，使用地址标签，但不使用其杂交特性。而是使用不同长度的地址标签，或者改变地址标签的序列以产生不同的分子量。这种实施方案中重要的是，每种地址标签具有不同的分子量。从本文所述的其他扩增子中切下地址标签，并对其进行质谱分析或依赖于不同分子量进行分离的其他技术，如凝胶电泳。
6.术语“扩增”指连接产物在体内或体外的扩增、复制、增殖或多重表达，得到约2.5倍或更多的拷贝。2.5倍这一数字是基于目前的检出限，而不是生物学状态。如果所述连接产物为环状多核苷酸，则可以在扩增之前切割该环状连接产物。本领域技术人员会理解，可以使用多种合适的扩增技术来扩增连接产物或已切割的连接产物，以形成本发明的扩增子，随后对其进行检测，一般通过下文详细描述的方法进行检测。合适的扩增方法包括靶标扩增和信号扩增，包括但不仅限于聚合酶链式反应(PCR)、连接链式反应(有时称为寡核苷酸连接酶扩增(OLA))、循环探针技术(CPT)、链置换测定(SDA)、滚环扩增(RCA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)和侵入性切割技术。所有这些方法都需要与靶序列杂交以形成杂交复合物的引物核酸(包括核酸类似物)，并加入以某种方式修饰该引物以形成经修饰引物的酶。例如，PCR通常需要两种引物、dNTP和DNA聚合酶；LCR需要邻近地与靶序列杂交的两种引物以及连接酶；CPT需要一种可切割的引物以及切割酶；侵入式切割需要两种引物和切割酶，等等。因此，一般而言，向含有必要的扩增组分的反应混合物中加入连接产物，形成扩增子。相反，通过转录扩增连接产物可以不需要引物。所述扩增可由连接产物内包含的启动子序列来起始。在另一个方面中，可以使用连接产物中特殊的结构(如环序列)来起始转录。
一般而言，所述扩增子包含可检测标记，例如荧光标记，可检测标记可通过酶掺入，或者可以存在于原始引物中。需要时，可以通过如本领域技术人员所知的多种方式除去未反应的引物。接着使杂交复合物解离，通过阵列检测所述扩增子并任选地定量。在一些情况下，第一扩增子作为次级反应的靶序列，次级反应接着产生大量可检测的第二扩增子。例如，可以使用转录物作为靶标来重复扩增过程。
因此，反应从将引物核酸加入到形成杂交复合物的连接产物中开始。一旦在所述引物与所述连接产物之间形成了杂交复合物，就使用酶(有时称为“扩增酶”)来修饰所述引物。像所有本文所述方法一样，所述酶可以在测定中的任何点加入，可以在加入引物前、加入引物时或者加入引物后加入。酶的身份将取决于所使用的扩增技术。类似地，修饰也将取决于扩增技术。相反，转录扩增不需要引物。转录酶将与连接产物的特定序列结合，以起始扩增。
一旦酶修饰了引物形成扩增子，就使杂交复合物解离。在一个方面中，通过改变测定条件来实现解离。在另一个方面中，经修饰引物不再与所述连接产物杂交，并解离。可以如下文所述在信号及靶标扩增反应中使用这些方面中的一种或两种。一般而言，将扩增步骤重复进行允许发生多个循环的时间，取决于原始靶序列的拷贝数和检测的灵敏度，循环为1至数千个，优选10至100个，特别优选15至50个循环。在某些实施方案中，例如在希望定量特定序列时，可能期望进行若干个平行的扩增反应，每个反应使用不同的循环数，从而至少在一组反应中扩增反应会在指数期中，因此将提供扩增产物水平与原始序列数之间的直接相关性。
在一个优选的实施方案中，所述连接产物或靶标的扩增为PCR(聚合酶链式反应)。可在酶处理之前或之后通过PCR扩增所述连接产物。例如，可以切割环状连接产物，接着通过PCR进行扩增。“聚合酶链式反应”或“PCR”是指通过对DNA互补链进行同时引物延伸来体外扩增特定DNA序列的反应。换言之，PCR是制备引物结合位点侧翼靶核酸的多个拷贝或复本的反应，这样的反应包括一次或多次重复以下步骤：(i)使靶核酸变性；(ii)使引物与引物结合位点退火；和(iii)在核苷三磷酸存在下，通过核酸聚合酶延伸引物。通常，该反应在热循环仪器中在对每个步骤优化的不同温度间循环。具体的温度、每个步骤的持续时间和步骤之间的改变速率取决于本领域技术人员所熟知的许多因素，例如可参考McPherson等编辑,PCR:APracticalApproach和PCR2:APracticalApproach(IRLPress,Oxford,分别为1991和1995)。例如，在使用TaqDNA聚合酶的常规PCR中，双链靶核酸可在＞90℃的温度下变性，在50-75℃的温度下引物退火，并在72-78℃的温度下引物延伸。术语“PCR”涵盖该反应的衍生形式，包括但不仅限于RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR等。反应体积从数百纳升(例如200nL)至数百微升(例如200μL)。“逆转录PCR”或“RT-PCR”指这样的PCR：之前先进行将靶标RNA转化成互补单链DNA的逆转录反应，然后扩增该互补单链DNA，例如Tecott等,美国专利No.5,168,038，其通过参考并入本文。“实时PCR”指随着反应的进行而监测反应产物(即扩增子)的量的PCR。存在许多实时PCR形式，其主要区别在于用来监测反应产物的监测化学方法，例如Gelfand等,美国专利No.5,210,015(“taqman”)；Wittwer等,美国专利No.6,174,670和6,569,627(螯合染料)；Tyagi等,美国专利No.5,925,517(分子信标)，这些专利均通过参考并入本文。用于实时PCR的检测化学方法综述于Mackay等,NucleicAcidsResearch,30:1292-1305(2002)，该文献也通过参考并入本文。
在另一实施方案中，可通过滚环扩增(RCA)来扩增环状连接产物。在核苷三磷酸和聚合酶与环状寡核苷酸模板组合时滚环扩增起始。RCA技术可用于溶液中、原位和微阵列中。在固相形式中，可实现单分子水平的检测和定量(Lizardi等,1998)。对于线性DNA合成的情况，使用引发的环状模板。在反应中使用至少两类核苷三磷酸以及催化有效量的所需聚合酶。在DNA合成中聚合酶在引物处起始，延伸引物并沿着环继续，产生期望的寡核苷酸产物序列。它继续进行通过起始点，随着已合成DNA(或RNA)的离去而取代它，并沿着环进行许多次。该方法与RNA合成类似，只是聚合酶能在环状模板的任何点处起始合成，而无需引物的帮助。这种扩增的连续合成产生了长单链多聚链，它由与该环状模板序列互补的核苷酸序列的许多个末端对末端的拷贝组成，并含有所需寡核苷酸产物的多个拷贝。使用指数式(或级联)滚环扩增(美国专利No.5,854,033和6,143,495；PCT申请No.WO97/19193)和多重引发的滚环扩增(Dean等,GenomeResearch11:1095-1099(2001))可以获得极高产量的扩增产物。
在一个优选的实施方案中，可通过RNA聚合酶转录连接产物。本发明方法中可以使用能在体内或体外进行转录并且启动子序列已经鉴定的任何RNA聚合酶。优选不需要复合物的稳定RNA聚合酶以及对特定启动子序列具有高度特异性的SP6RNA聚合酶(Butler和Chamberlin,J.Biol.Chem.257:5772-5778(1982))(Schenborn和Meirendorf,NucleicAcidsResearch13:6223-6236(1985))。具有这种特征的其他RNA聚合酶也是优选的。一般而言，所选择的RNA聚合酶能够从双链T7启动子或者带有双链T7启动子茎部的发夹检测探针所提供的启动子序列开始转录。已知多种启动子序列，具有已鉴定启动子序列的任何合适的RNA聚合酶均可使用。
就环状模板而言，转录合成的过程可在环状模板的任何点起始，而无需引物或启动子序列的帮助。这种扩增性连续合成产生了长单链多聚链，它由与该环状模板序列互补的核苷酸序列的许多个末端对末端的拷贝组成，并含有所需寡核苷酸产物的多个拷贝。
7.“检测标记”为了帮助检测和定量本发明扩增的核酸，可将检测标记直接掺入所扩增的核酸中，或者将其与检测分子偶联。本文使用的“检测标记”是可直接或间接与扩增核酸结合并且产生可直接或间接测量的可检测信号的任何分子。用于掺入核酸中或者与核酸或抗体探针偶联的许多这样的探针是本领域技术人员已知的。
在这个实施方案中，标记可以多种方式掺入：(1)引物包含该标记，例如附着到碱基、核糖、磷酸或核酸类似物中相似结构上；(2)使用修饰的核苷酸，所述核苷酸被修饰成在碱基或核糖(或者核酸类似物的相似结构)上用标记进行了修饰；接着将这些以标记修饰的核苷酸转化成三磷酸形式并掺入由延伸酶(如聚合酶)新合成的链中；(3)使用修饰的核苷酸，其包含可用于(在酶促反应之后)添加可检测标记的官能团；(4)使用修饰的引物，其包含可用于以类似方式添加可检测标记的官能团；或者(5)可以使用经直接标记并与扩增子的一部分杂交的标记探针。任何这些方法都产生可检测的扩增子。
合适的荧光标记实例包括荧光素、5,6-羧甲基荧光素、得克萨斯红、硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基(NBD)、香豆素、丹磺酰氯和罗丹明。优选的荧光标记为荧光素(5-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺酯和罗丹明(5,6-四甲基罗丹明)。它们可得自多种商业来源，包括MolecularProbes,Eugene,Oregon和ResearchOrganics,Cleveland,Ohio。
带标记的核苷酸是检测标记的优选形式，因为它们可直接掺入连接产物或扩增的连接产物中。可掺入扩增的DNA或RNA中的检测标记实例包括核苷酸类似物例如BrdUrd(Hoy和Schimke,MutationResearch290:217-230(1993))、BrUTP(Wansick等,J.CellBiology122:283-293(1993))和以生物素修饰的核苷酸(Langer等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:6633(1981))或者其他合适的半抗原，例如地高辛(Kerkhof,Anal.Biochem.205:359-364(1992))。合适的荧光标记核苷酸为异硫氰酸荧光素-dUTP、花青素-3-dUTP和花青素-5-dUTP(Yu等,NucleicAcidsRes.,22:3226-3232(1994))。用于DNA的优选核苷酸类似物为BrdUrd(BUDR三磷酸,Sigma)，用于RNA的优选核苷酸类似物为生物素-16-尿苷-5'-三磷酸(生物素-16-dUTP.BoehringherMannheim)。
掺入扩增核酸中的检测标记(如生物素)可在其后使用本领域熟知的灵敏方法进行检测。例如，生物素可使用链霉亲和素-碱性磷酸酶缀合物(Tropix,Inc.)检测，它与生物素结合，其后通过适当底物(例如化学发光底物CSPD：3-(4-甲氧基螺甾-[1,2,-二氧六环-3-2'-(5'-氯)三环[3.3.1.1.sup.3,7]癸基]-4-基)苯基磷酸二钠；Tropix,Inc.)的化学发光进行检测。
由于检测扩增RNA的一种优选检测标记为以吖啶酯标记的DNA探针(GenProbe,Inc.,如Arnold等,ClinicalChemistry35:1588-1594(1989)所述)。以吖啶酯标记的检测探针使得可以检测扩增RNA而无需洗涤，因为未杂交的探针可用碱破坏(Arnold等(1989))。
组合两种或更多种这些检测标记的分子也认为是检测标记。任何已知的检测标记都可以与本发明的探针、标签以及使用本发明方法标记和检测所扩增核酸的方法一起使用。用于检测和测量检测标记所产生的信号的方法也是本领域技术人员已知的。例如，放射性同位素可通过闪烁计数器或直接显影来检测；荧光分子可通过荧光分光光度计来检测；磷光分子可使用分光光度计检测，或者用照相机直接显影；酶可通过检测或显影该酶所催化反应的产物来检测；抗体可通过检测与该抗体偶联第二检测标记来检测。这些方法可以直接用于本发明的扩增方法。本文使用的“检测分子”是与扩增核酸相互作用并偶联了一个或多个检测标记的分子。
在一个实施方案中，标记是通过检测扩增产物或其片段的分子量(例如通过层析或质谱来检测)进行检测的质量标签。
在另一实施方案中，本发明中以长度测定、以长度分离的测定以及以长度分离的测定介质等词语表示的检测共同表示基于长度、大小、质量或任何其他物理特性实现DNA片段分离的方法及其相关装置。这一般包括液相层析、电泳和直接质谱，更具体地，分别包括高效液相层析(HPLC)和毛细管电泳或凝胶电泳以及MALDI-TOFMS。
8.“微阵列或阵列”本发明一个优选的方面是它产生高通量筛选毛细管。在本文所述测定中，使用微阵列可以同时鉴定由鉴定例如SNP的扩增连接产物所产生的几个至数百万个不同地址标签。例如，使用简单的点印迹杂交法，可产生具有数千个固定化探针的膜，用于筛选由连接产物扩增库所产生的标签。下文描述的固相技术可调试成每平方英寸中毫不夸张地含有数百万个不同的固定化核酸。类似地，可以在膜上固定非常大的扩增DNA(例如标签)组，用于同时筛选连接产物所产生的一个或多个序列。
“微阵列”或“阵列”指具有平坦表面的固相支持物，其带有核酸的阵列，该阵列的每个成员含有固定在空间确定的区域或位置的寡核苷酸或多核苷酸的相同拷贝，所述区域或位置不与该阵列的其他成员重叠；也就是说，所述区域或位置在空间上是离散的。空间确定的杂交位置还可以是“可寻址的”，因为其位置及其固定的寡核苷酸是已知的或者是预定，例如是在使用前就已确定的。有序的阵列包括但不仅限于通过光刻术、点样、印制制备的阵列、电极阵列、“凝胶板”阵列等。阵列的大小可以从一个要素至数千个、数万个或甚至数百万个要素之间变化。取决于所需的阵列要素数目，一些阵列类型或阵列制备方法可能是更为有利的，如本领域技术人员所知。一般地，寡核苷酸或多核苷酸是单链的，并共价附着至固相支持物，通常是在5'末端和3'末端附着。微阵列中含有核酸的不重叠区域的密度一般高于100个/cm2，更优选高于1000个/cm2。微阵列技术综述于以下参考文献中：Schena编辑,Microarrays:APracticalApproach(IRLPress,Oxford,2000)；Southern,CurrentOpin.Chem.Biol.,2:404-410(1998)；NatureGeneticsSupplement,21:1-60(1999)。本文使用的“微阵列”或“阵列”还可以指“随机微阵列”或“随机阵列”，它们指空间上离散的寡核苷酸或多核苷酸区是在空间上不可寻址的。也就是说，所附着的寡核苷酸或多核苷酸的身份不能(至少开始时不能)通过其位置来识别。在一个方面中，随机微阵列是微珠的平面阵列，其中每个微珠附着有单一类型杂交标签附加物，例如来自最小交叉杂交的寡核苷酸组。可通过多种方法形成微珠阵列，例如Brenner等,NatureBiotechnology,18:630-634(2000)；Tulley等,美国专利No.6,133,043；Stuelpnagel等,美国专利No.6,396,995；Chee等,美国专利No.6,544,732等。同样，在形成后，随机阵列中的微珠或其寡核苷酸可以多种方式进行鉴定，包括通过光学标记(如荧光染料比或量子点)、形状、序列分析等进行鉴定。
构建和使用固相核酸阵列来检测靶核酸在文献中已充分描述。参阅Fodor等(1991)Science,251:767-777；Sheldon等(1993)ClinicalChemistry39(4):718-719；Kozal等(1996)NatureMedicine2(7):753-759以及Hubbell美国专利No.5,571,639。还参阅Pinkel等PCT/US95/16155(WO96/17958)。简言之，组合策略允许通过最少的合成步骤数合成含有大量探针的阵列。例如，有可能使用仅32个化学合成步骤来合成和附着所有可能的DNA8mer寡核苷酸(48或65536中可能的组合)。一般而言，VLSIPSTM过程提供了使用仅仅4n个合成步骤在阵列上产生4n种不同寡核苷酸探针的方法。添加、洗涤和检测阵列上的扩增产物的方法是熟知的。
9.“互补或基本互补”指在核苷酸或核酸之间(例如双链DNA分子两条链之间或者寡核苷酸引物与单链核酸的引物结合位点之间)的杂交或碱基配对或者形成双链体。一般而言，互补核苷酸是A和T(或者A和U)或者C和G。如果最佳比对和比较并且具有适当核苷酸插入或缺失的一条链的核苷酸与另一条链中至少约80％(通常至少约90％至95％，更优选约98％至100％)的核苷酸配对，则称两个单链RNA或DNA分子是基本互补的。或者，当RNA或DNA链在选择性杂交条件下与其互补序列杂交时，则为基本上互补。一般地，当在至少14至25个核苷酸的节段中至少约65％互补(优选至少约75％，更优选至少约90％互补)时，将发生选择性杂交。参阅M.KanehisaNucleicAcidsRes.12:203(1984)，其通过参考并入本文。本文中，将多种杂交区或标签和引物选择成与其预期杂交配偶体“基本”互补。这意味着，所述区域或引物必须充分互补，以与其各自的链在给定的杂交或聚合条件下杂交。因此，所述多核苷酸序列不需要反映互补序列的确切序列。例如，可将非互补核苷酸序列附着到引物的5'末端，引物序列的其余部分与该链互补。或者，可以将非互补碱基或更长的序列分散到引物区域中，只要该多核苷酸序列与待与其杂交的多核苷酸序列充分互补，并由此形成具有充分稳定性或用于后续操作的结构的双链体。
10.“杂交”指两个单链多核苷酸非共价结合以形成稳定双链多核苷酸的过程。术语“杂交”还可以指三链杂交。所产生的(通常是)双链多核苷酸为“杂交体”或“双链体”。“杂交条件”一般包括低于约1M、更通常低于约500mM和低于约200mM的盐浓度。杂交温度可以低至5℃，但通常高于约22℃，更通常高于约30℃，优选高于约37℃。杂交通常在严格条件(即探针会与其靶序列杂交的条件)下进行。严格杂交条件取决于序列，并在不同的情况下存在差异。较长的片段可能需要较高的杂交温度来进行特异性杂交。由于其他因素(包括互补链的碱基组成和长度、有机溶剂的存在和碱基错配程度)可能影响杂交的严格度，因此参数的组合比任何一个单独参数的绝对值更为重要。一般而言，将严格条件选择成比确定的离子强度和pH下该特定序列的Tm低约5℃。示例性严格条件包括pH7.0至8.3下至少0.01M至不高于1M的Na离子浓度(或其他盐)和至少25℃的温度。例如，5×SSPE(750mMNaCl,50mM磷酸钠,5mMEDTA,pH7.4)的条件和25-30℃的温度适用于等位片段特异性探针杂交。对于严格条件，参阅如Sambrook,Fritsche和Maniatis.“MolecularCloningAlaboratoryManual”第二版ColdSpringHarborPress(1989)以及Anderson“NucleicAcidHybridization”第一版,BIOSScientificPublishersLimited(1999)，它们对于所有上述目的均通过参考整体并入本文。“特异性杂交”或“与……特异性杂交”或类似表述指当复杂混合物(如总细胞)DNA或RNA中存在特定序列时，分子在严格条件下与该特定核苷酸序列显著结合、组成双链或杂交，或者仅与其结合、组成双链或杂交。
“基于杂交的测定”指依赖于在探针与靶标核苷酸序列之间形成稳定双链体或三链体来检测或测量该序列的任何测定。在一个方面中，这些测定的探针与8至100个核苷酸的靶序列区退火(或形成双链体)，或者在另一些方面中，它们与8至40个(或者通常为8至20个)核苷酸的靶序列退火。涉及基于杂交的测定时，“探针”指多核苷酸，其具有能与靶核酸中其互补序列形成稳定杂交体(或三链体)并能够直接或间接检测的序列。基于杂交的测定包括但不仅限于基于使用溶液相中或与固相支持物(如微阵列或微珠)结合的寡核苷酸的测定，例如聚合酶链式反应、NASBA反应、寡核苷酸连接反应、引物的单碱基延伸、可环化探针反应、等位片段特异性寡核苷酸杂交。文献中有关于基于杂交的测定的广泛指导，例如Hames等编辑,NucleicAcidHybridizationaPracticalApproach(IRLPress,Oxford,1985)；Tijssen,HybridizationwithNucleicAcidProbes,PartsI&II(ElsevierPublishingCompany,1993)；Hardiman,MicroarrayMethodsandApplications(DNAPress,2003)；Schena编辑,DNAMicroarraysaPracticalApproach(IRLPress,Oxford,1999)等。在一个方面中，基于杂交的测定是溶液相测定，也就是说，探针和靶序列都在基本没有对反应速率的表面效应或影响的条件下杂交。溶液相测定可包括探针或靶序列附着在微珠上的情况。
“试剂盒”指用于递送材料或试剂进行本发明方法的任何递送系统。在测定的情况下，这些递送系统包括允许保存反应试剂(如适当容器中的探针、酶等)和/或支持材料(如缓冲剂、进行测定的书面说明等)，将其从一个位置运输或递送至另一个位置的系统。例如，试剂盒包括含有用于本发明测定的相关反应试剂和/或支持材料的一个或多个包装物(如盒子)。在一个方面中，本发明的试剂盒包含对干扰多态性位点具有特异性的探针。在另一个方面中，试剂盒包含用于验证对干扰多态性位点具有特异性的探针性能的核酸标准品。这些内容可一起或分别递送至预期受者。例如，第一容器含有用于测定的酶，而第二容器含有探针。
13.“聚合酶”指用于沿着DNA或RNA模板形成寡核苷酸延伸产物的催化剂，通常是酶，其中所述延伸产物与模板互补。核苷酸聚合酶是模板依赖性多核苷酸聚合酶，并利用核苷三磷酸作为延伸寡核苷酸3'末端的构建单元，以提供这样的序列，它与同该寡核苷酸形成双链体的多核苷酸单链部分互补。
一般而言，该催化剂是酶，并且可以是RNA聚合酶、DNA聚合酶或者逆转录酶，这取决于模板。这些酶可来自任何来源，例如细胞、细菌(如大肠杆菌)、植物、动物、病毒、嗜热菌等，其中该聚合酶可化学修饰或通过基因工程修饰，以提供热稳定性和/或提高的活性。这些酶包括PfuDNA聚合酶(天然和重组的)，来自Stratagene,LaJolla,Calif.；UltmaDNA聚合酶，来自PerkinElmer,FosterCity,Calif.；rBstDNA聚合酶，来自EpicentreTechnologies,Madison,Wis.；VENTDNA聚合酶，来自NewEnglandBiolabs,Beverly,Mass.；TliDNA聚合酶，来自PromegaCorp.,Madison,Wis.以及PwoDNA聚合酶，来自BoehringerMannheim,Indianapolis,Ind.等；AmplitaqStoffel片段(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)或者T7DNA聚合酶(Amersham)或DNA聚合酶I的Klenow片段(NewEnglandBiolabs))、AMVRNA聚合酶(NEB)、MMLVRNA聚合酶(Invitrogen)、PowerscriptRNA聚合酶(Clontech)、SuperscriptRNA聚合酶(Invitrogen)等，但不仅限于此。用于本发明的聚合酶通常是热稳定的核苷酸聚合酶(例如AmplitaqStoffel片段)，从而进一步重复变性退火或碱基延伸过程，以提高已加入碱基的靶标探针数。优选地，聚合酶不具有显著的切口活性。优选地，聚合酶缺乏3'→5'核酸外切酶活性，以使探针降解最小化。缺失了3'→5'核酸外切酶活性的突变聚合酶是本领域已知的，并且适用于本文所述的碱基添加法。
可用于本发明的逆转录酶可以是限制逆转录活性的任何聚合酶。可用于本发明的催化活性是RNA依赖性DNA聚合酶活性。逆转录酶可具有RNAseH活性，或者可以缺乏RNAseH活性。优选使用具有RNAseH活性的逆转录酶向靶标探针的3'末端添加碱基。接着可以通过RNAseH或具有RNAseH活性的逆转录酶消化RNA靶标，包括使用来自Moloney小鼠白血病病毒(MMLV-RT)、禽成髓细胞白血病病毒(AMV-RT)的酶。许多其他逆转录酶(例如缺少RNAseH活性而具有RNA依赖性DNA聚合酶活性的SuperscriptII或III)也可与其他RNAseH、Powerscript(clontech),Arrayscript(Ambion)来源一起使用。
14.“粘末端”指双螺旋的一个链比另一个链长出几个单位的DNA末端。
15.“连接”指在模板驱动的反应中在两个或更多个核酸(如寡核苷酸和/或多核苷酸)之间形成共价键或连接。键或连接的性质可广泛变化，连接可以酶促进行或以化学方式进行。本文使用的“连接”通常酶促进行，以在一个寡核苷酸中末端核苷酸的5'碳与另一寡核苷酸3'碳之间形成磷酸二酯键。在通过参考并入本文的以下文献中描述了多种模板驱动的连接反应：Whitely等,美国专利No.4,883,750；Letsinger等,美国专利No.5,476,930；Fung等,美国专利No.5,593,826；Kool,美国专利No.5,426,180；Landegren等,美国专利No.5,871,921；Xu和Kool,NucleicAcidsResearch,27:875-881(1999)；Higgins等,MethodsinEnzymology,68:50-71(1979)；Engler等,TheEnzymes,15:3-29(1982)；以及Namsaraev,美国专利公开No.2004/0110213。许多合适的连接酶是已知的，例如T4DNA连接酶(Davis等,AdvancedBacterialGenetics--AManualforGeneticEngineering(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.,1980))、大肠杆菌DNA连接酶(Panasnko等,J.Biol.Chem.253:4590-4592(1978))、AMPLIGASE.RTM.(Kalin等,Mutat.Res.,283(2):119-123(1992)；Winn-Deen等,MolCellProbes(England)7(3):179-186(1993))、TaqDNA连接酶(Barany,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:189-193(1991)、栖热菌属(Thermus)的嗜热DNA连接酶(AbbottLaboratories)、Thermusscotoductus的DNA连接酶以及Rhodothermusmarinus的DNA连接酶(Thorbjarnardottir等,Gene151:177-180(1995))。由于其连接DNA:RNA杂交体中DNA末端的能力，T4DNA连接酶对于连接RNA靶序列是优选的(Hsuih等,QuantitativedetectionofHCVRNAusingnovelligation-dependentpolymerasechainreaction,AmericanAssociationfortheStudyofLiverDiseases(Chicago,Ill.,Nov.3-7,1995))。
用于核酸扩增和检测的常用的模板驱动连接测定是寡核苷酸连接测定(OLA)，有时称为连接链式反应(LCR)。该方法可以两种不同方式进行，在第一种实施方案中，仅使用靶序列的一个链作为连接模板(OLA)；或者，可以两个链都使用(OLA)。寡核苷酸连接扩增(“OLA”，有时称为连接链式反应(LCR))包括使用靶序列作为模板将两个较小的探针连接成一个长探针。一般可参阅美国专利No.5,185,243、5,679,524和5,573,907；EP0320308B1；EP0336731B1；EP0439182B1；WO90/01069；WO89/12696以及WO97/31256、WO89/09835和美国序列号60/078,102和60/073,011，以上均通过参考并入本文。
本发明的一个独特特征是用于核酸扩增和检测的不依赖于模板的连接测定。检测探针与经修饰靶标探针之间的连接不是由模板指导的，而是通过粘末端将两个邻近的探针连接在一起。检测探针不与靶标多核苷酸杂交。仅有正确延伸的靶标探针会能够与待连接的检测探针杂交，以形成连接产物。
16.本文使用的“核苷酸”包括天然核苷，包括2'-脱氧及2'-羟基化形式，例如Kornberg和Baker,DNAReplication,第二版(Freeman,SanFrancisco,1992)中所述。涉及核苷时，“类似物“包括具有经修饰碱基部分和/或经修饰糖部分的合成核苷，例如Scheit,NucleotideAnalogs(JohnWiley,NewYork,1980)；Uhlman和Peyman,ChemicalReviews,90:543-584(1990)等所述，只要它们能够特异性杂交即可。这些类似物包括设计成具有增强的结合特性、减少的复杂性、提高的特异性等的合成核苷。包含具有增强的杂交或核酸酶抗性特性的类似物的多核苷酸描述于Uhlman和Peyman(见上文)；Crooke等,Exp.Opin.Ther.Patents,6:855-870(1996)；Mesmaeker等,CurrentOpinioninStructualBiology,5:343-355(1995)等中。能增强双链体稳定性的示例性多核苷酸类型包括N3'→P5'氨基磷酸酯(本文中称为“酰胺化物”)、肽核酸(本文中称为“PNA”)、寡聚-2'-O-烷基核糖核苷酸、含有C-5丙炔基嘧啶的多核苷酸、锁核酸(LNA)及相似的化合物。这些寡核苷酸是市售的，或者可以使用文献中所述方法合成。
17.“多态性或遗传变体”。本发明可用于检测核酸样品中的多态性或遗传变异，包括一个或多个连续或不连续核苷酸的变异。示例性可变区包括SNP。某些SNP具有两个等位片段，另一些具有三个等位片段，还有的具有四个等位片段。SNP的存在可指示例如某些种群、疾病状态或者疾病状态的倾向。
“多态性”或“遗传变体”指基因座上一个或多个核苷酸的替换、倒位、插入或缺失，或者DNA从一个基因座易位到另一个基因座。在一个方面中，多态性指多种替代性核苷酸序列之一，所述替代性核苷酸序列可能存在于个体的基因座处，并且相对于同一个体或种群内其他个体中同一基因座的其他序列而言可包含核苷酸替换、插入或缺失。个体在一个基因座处可以是纯合或杂合的，即，个体可以在两个等位片段中具有相同的核苷酸序列，或者在各个等位片段中分别具有不同的核苷酸序列。在一个方面中，基因座处的插入或缺失包括与种群中其他个体中相同基因座(或同一个体中另一等位基因)相比在该基因座添加或缺少1至10个氨基酸。通常，插入或缺失是相对于种群中一个基因座的主要等位基因(例如在种群中的存在频率为50％或更高的等位基因)而言的。
18.“多核苷酸”或“寡核苷酸”可互换使用，均指核苷酸单体的线性多聚体。组成多核苷酸和寡核苷酸的单体能以有规律的单体-单体相互作用模式(例如Watson-Crick型碱基配对、碱基堆积、Hoogsteen或反Hoogsteen型碱基配对等)与天然多核苷酸特异性结合。这样的单体及其核苷酸间键合可以是天然存在的，或者是其类似物，例如天然存在或非天然存在的类似物。非天然存在的类似物可包括PNA、硫代磷酸酯核苷酸间键合、含有允许附着标记(如荧光团或半抗原)的连接基团的碱基等。任何时候当寡核苷酸或多核苷酸的使用需要酶促处理(例如通过聚合酶来延伸、通过连接酶来连接等)时，普通技术人员都会理解，这些情况中的寡核苷酸或多核苷酸将在任何或一些位置上不含有某些核苷酸间连接、糖部分或碱基的类似物。多核苷酸的大小一般为若干个单体单元(例如5-40个，这时称为“寡核苷酸”)至数千个单体单元。当多核苷酸或寡核苷酸以字母序列(大写或小写)例如“ATGCCTG”代表时，应该理解，该核苷酸从左至右为5'→3'的顺序，并且“A”代表脱氧腺苷、“C”代表脱氧胞苷、“G”代表脱氧鸟苷、“T”代表胸苷、“I”代表脱氧肌苷、“U”代表尿苷，除非另外说明，或者可从上下文中明显看出。除非另外指明，命名及原子编号规则将按照Strachan和Read,HumanMolecularGenetics2(Wiley-Liss,NewYork,1999)所述进行。通常，多核苷酸包含通过磷酸二酯键连接的四种天然核苷酸(例如对于DNA为脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷，对于RNA为其核糖对应物)，然而，它们也可包含非天然核苷酸类似物，例如包括经修饰碱基、糖或核苷酸间连接。本领域技术人员十分明确，当酶的活性有特定的寡核苷酸或多核苷酸底物需求(例如单链DNA、RNA/DNA双链体等)时，选择寡核苷酸或多核苷酸底物的合适组成完全在普通技术人员的能力之内，特别是在借助文献的指导时，例如Sambrook等,MolecularCloning,第二版(ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,1989)及类似的参考文献。
19.“引物”指这样的天然或合成寡核苷酸，它们能在与多核苷酸模板形成双链体之后作为核酸合成的起点，并由其3'末端开始沿着模板延伸，从而形成延伸的双链体。在延伸过程中加入的核苷酸序列由模板多核苷酸的序列决定。引物一般通过DNA聚合酶来延伸。引物通常的长度为14至36个核苷酸。
20.“样品”指一定量的材料，其来自生物、环境、医学或需要检测或测量靶核酸的患者来源。一方面，它旨在包括标本或培养物(如微生物培养物)。另一方面，它旨在包括生物样品及环境样品。样品可包括合成来源的标本。生物样品可以是动物(包括人)、流体、固体(如粪便)或组织以及液体和固体的食品及饲料产品和成分，例如乳品、蔬菜、肉和肉制品以及废物。生物样品可包括取自患者的材料，包括但不仅限于培养物、血、唾液、脑脊液、胸膜液、乳、淋巴、痰、精液、针刺抽吸物等。生物样品可得自所有的各种家畜以及野生动物，包括但不仅限于诸如有蹄类、熊、鱼、啮齿类等动物。环境样品包括环境材料(例如表面物质、土壤、水和工业样品)以及得自食品及乳品加工工具、装置、器具、一次性及非一次性零件等的样品。这些实例并不旨在限制可用于本发明的样品类型。“样品”也指来自任何上述来源的溶液，因为它经过加工以用于进一步的测试或测定。
21.“固体支持物”、“支持物”和“固相支持物”可互换使用，指具有刚性或半刚性表面的材料或材料组。在许多实施方案中，固体支持物的至少一个表面基本是平的，但在一些实施方案中，以例如孔、隆起区、引脚、刻蚀槽等将不同化合物的合成区在物理上分开可能是理想的。根据另一些实施方案，固体支持物将采取珠、树脂、凝胶、微球或其他几何构造的形式。微阵列通常包含至少一个平坦的固相支持物，例如玻璃显微镜用载玻片。
22.提到一个分子与另一分子的结合(例如标记的靶序列与探针的结合)时，“特异”或“特异性”指这两个分子之间的识别、接触以及形成稳定的复合物，同时与其他分子的识别、接触或复合物形成显著较弱。在一个方面中，第一分子与第二分子结合的“特异性”指与第一分子识别反应物或样品中另一分子并形成复合物的程度相比，它与所述第二分子形成最多的复合物数目。优选地，这个最多的数目为至少50％。通常，特异性结合事件中所涉及的分子在其表面上或其腔中具有使得彼此结合的分子间特异性识别的区域。特异性结合的实例包括抗体-抗原相互作用、酶-底物相互作用、在多核苷酸和/或寡核苷酸之间形成双链体或三链体、受体-配体相互作用等。提到特异性或特异性结合时，本文使用的“接触”指两个分子足够接近，以使得弱的非共价化学相互作用(例如范德华力、氢键、碱基堆积相互作用、离子相互作用和疏水相互作用等)主导所述分子间的相互作用。
23.“siRNA”指能够干扰细胞(例如哺乳动物细胞，包括人细胞)和机体(例如哺乳动物机体，包括人)中的特定基因并能够导致其转录后沉默的小干扰RNA，其还包括短发夹RNA(shRNA)(Paddison等,Genes&Dev.16:948-958,2002)。RNA干扰现象描述和讨论于Bass,Nature,411:428-29,2001；Elbashir等,Nature,411:494-98,2001以及Fire等,Nature,391:806-11,1998，其中还讨论了产生干扰RNA的方法。基于本文所公开序列的siRNA(例如对于CTSZ和CD24分别为GenBank登记号NM_001336和NM_013230)通常长度小于100个碱基对(“bp”)，优选约为30bp或更短，并可通过本领域已知的方法产生，包括使用互补DNA链或合成方法。siRNA能够干扰细胞(例如哺乳动物细胞，包括人细胞)和机体(例如哺乳动物机体，包括人)中的特定基因并能够导致其转录后沉默。本发明的示例性siRNA可长至30bp、29bp、25bp、22bp、21bp、20bp、15bp、10bp、5bp或者其附近或其间的任何整数。根据本发明，具有不同序列但都针对CTSZ或CD24的siRNA可以按任何比例(包括摩尔比例)同时施用或依次施用。
24.术语“miRNA”指microRNA，这是一类小RNA分子或小非编码RNA分子，它们能对细胞(例如哺乳动物细胞，包括人细胞)和机体(例如哺乳动物机体，包括人)中的特定基因产生干扰、抑制RNA翻译成蛋白质并导致其转录后沉默。(参阅如Zeng和Cullen,RNA,9(1):112-123,2003；Kidner和MartienssenTrendsGenet,19(1):13-6,2003；DennisC,Nature,420(6917):732,2002；CouzinJ,Science298(5602):2296-7,2002)。以前，miRNA被认为是属于非编码microRNA类的小瞬时RNA(stRNA)，其已显示出通过抑制翻译或降解靶mRNA来控制基因表达(参阅CouzinJ,Science298(5602):2296-7,2002)，其一般长度为20-28nt(参阅Finnegan等,CurrBiol,13(3):236-40,2003；Ambros等,RNA9(3):277-279,2003；CouzinJ,Science298(5602):2296-7,2002)。与其它RNA(如siRNA或shRNA)不同，miRNA或stRNA不由任何微基因(microgene)编码，而是通过称为Dicer的酶由异常(可能是双链的)RNA产生，该酶将双链RNA切成小段(参阅CouzinJ,Science298(5602):2296-7,2002)。根据本发明，具有不同序列但都针对CTSZ或CD24的miRNA可以按任何比例(包括等摩尔比)同时施用或依次施用。
25.“Tm”用于表示“解链温度”。解链温度是双链核酸分子群有一半解离成单链时的温度。用于计算核酸Tm的一些方程为本领域所熟知。标准参考文献指出，当核酸在1MNaCl的水溶液中时，可通过以下方程得到对Tm值的简单估计：Tm＝81.5+0.41(％G+C)(参阅如Anderson和Young,QuantitativeFilterHybridization,NucleicAcidHybridization(1985)。其他参考文献(例如Allawi,H.T.&SantaLucia,J.,Jr.,Biochemistry36,10581-94(1997))包括在Tm计算中考虑结构及环境以及序列特征的替代性计算方法。.
B.本发明一般方法的描述
图1A和1B显示了在利用单链靶标探针和单链发夹检测探针(1A)以及单链发夹靶标探针和单链检测探针(1B)的实施方案中实施本发明方法的步骤。
在这两个实施方案中，该方法的目的都是检测样品中所包含DNA或RNA多核苷酸分析物中靶序列的存在情况，例如图1A和1B中分别为多核苷酸分析物20、22，以5'至3'方向显示。靶序列一般包括至少10-12个碱基、一般为10-20个碱基或更多的区域，其中一个或几个碱基特别有意义，例如点突变或缺失突变或者单核苷酸多态性(SNP)。也就是说，目的核苷酸碱基可仅包括一个或几个碱基，但探针结合特异性的靶序列会包括目的靶标碱基附近的一些额外碱基。下文将进一步讨论，所述样品可含有单个分析物，例如带有目的靶区域的一种多核苷酸，或者含有包含一种或多种核苷酸样品的多重靶标。用于检测多种靶区域的本发明方法的操作一般被称为多重模式。
为进行说明，参照图1A和1B描述的方法旨在检测单个SNP靶序列，其包括目的SNP序列的GT序列特征，如图中所示。进行SNP检测的细节在实施例1和2中给出。这种GT序列是靶序列的一部分，所述靶序列可包括10-20个已知序列的碱基，它以GT序列碱基的3'末端结束并与其连接。
所述检测方法包括首先将含有靶标多核苷酸的样品与靶标探针混合，所述靶标探针具有能与分析物靶序列中紧邻目的靶标碱基下游的部分相杂交的序列，在这种情况下是以能与靶序列中GT序列的胸苷(T)碱基杂交的3'末端腺苷(A)结束。在图1A所示方法中，靶标探针为单链DNA探针24，在图1B所示方法中，所示靶标探针为单链探针26，在这种情况下，发夹探针具有茎环双链体结构，其中该发夹探针的靶向互补序列(与分析物靶序列互补的序列)优选地包括该探针发夹环部分中的碱基，以使该靶标探针能与分析物靶序列形成比内部发夹所形成的更长的双链体区，在动力学上有利于形成双链体而不是发夹结构。分析物多核苷酸与靶标探针的混合在使靶标探针与分析物靶标序列互补区有效杂交以形成分析物/探针双链体的条件下进行。
在本方法的下一步中，使该双链体复合物在存在聚合酶以及四种可能的核苷三磷酸中选定的一种至三种的情况下发生反应，以在该探针的3'末端加入确定数目的由靶标指导的核苷酸碱基。在所示的实施方案中，加入了单个胞苷三磷酸(CTP)。该反应将在靶标GT靶序列的互补G碱基处添加胞苷碱基，并且在推测该位点不含有相邻的G碱基的情况下该反应将在向探针中添加单个碱基后停止。在3'末端加入了C碱基的经修饰探针示于图1A的24'和图1B的26'。
更一般地，该反应在一至三种选定的核苷三磷酸存在下进行，确保该聚合酶反应会在遇到分析物的第一个碱基在反应物中不具有互补NTP的情况时终止。因此，如果反应物中含有ATP、CTP和GTP，那么只要靶标中存在连续的T、G或C碱基，聚合酶添加反应就会在探针的3'末端持续添加核苷酸，而在遇到靶序列的第一个A碱基时会停止。
下文中将参考图2B和11进一步讨论，靶标探针优选以显著摩尔过量(例如10-100倍摩尔过量)的量加入，探针修饰反应进行若干个循环，最后一个循环放大分析物与经修饰探针的摩尔比。
在对靶标探针进行一轮或多轮核苷酸添加后，在存在连接酶的情况下将经修饰探针与检测探针反应，所述检测探针具有与经修饰靶标探针的3'末端序列互补的3'末端序列，以将经修饰靶标探针与检测探针连接在一起，如图1A和1B的下图所示。当所述靶标探针为单链探针时(如图1A)，所述检测探针为单链发夹探针(如探针28)，其具有与所述靶标探针的经修饰3'末端互补的突出端。通过经修饰靶标探针与检测探针经其互补3'末端序列的结合形成的连接产物，靶标探针3'末端与所述检测探针5'末端的连接在32显示。当所述靶标探针为单链发夹探针时(如图1B)，所述检测探针可以是单链或双链多核苷酸，例如具有与靶标发夹探针已修饰的3'末端互补的3'末端的单链探针30。通过经修饰靶标探针与所述检测探针经其互补3'末端序列的结合来形成两种探针的连接产物，所述靶标探针5'末端与检测探针3'末端的连接在34显示。
现在就可以通过两探针连接产物的存在来检测目的靶序列，因为仅在分析物指导的靶标探针修饰以及经修饰的靶标探针与检测探针发生碱基配对相互作用后才形成连接产物。进行这些步骤的细节在实施例1和2中给出。下文描述了多种用于检测连接产物的方法，一般包括扩增连接产物和检测扩增产物。因此，本发明提供可扩增靶序列用于检测目的的两个步骤：首先，在摩尔过量的靶标探针存在下通过热循环来扩增靶标探针，以从单个靶标产生多种经修饰探针，接着，扩增最终的两探针连接产物的全部或一部分。
C.探针组分和具体实施方案的操作
图2A显示了用于图1B所示方法的单链发夹探针36。如所示，该探针在其3'和5'末端分别包含决定该探针二级结构的互补序列部分37、42。该探针的3'末端可具有突出端，例如单碱基突出端，如图1B所示，或者可以与该探针的5'末端相平，应该理解，探针修饰步骤将延伸现有的探针突出端，或者在未经修饰探针具有平末端的情况下产生突出端。该探针中设计成与靶序列杂交的部分在该图中38以括弧标出，包括部分37和探针发夹内的额外序列。如上文所述，区域38一般长度为10-20个碱基或更长。该探针的发夹区(以40表示)也可包括额外的任意序列或功能性序列，例如一个或多个限制性位点、通用引发位点、启动子位点或用于探针鉴定的条码序列。
图2B展示了该方法中的探针修饰和扩增反应，如上文参考图1B所述。在这个实施例中，相对于靶标分析物22显著摩尔过量地加入发夹探针26，所述靶标分析物22具有待检测的含有GT的SNP位点。首先，该发夹探针的一部分会与该分析物退火，形成比探针的内部双链体结构更为稳定的双链体结构，因为该结构在探针/分析物复合物中具有更长的双链区。在聚合酶以及选定的1-3种核苷酸(在该情况下为dCTP)存在下，靶标探针在其3'末端延伸，在该情况下延伸单个C碱基，以在该探针中形成双碱基(CA)突出端。进行这些步骤的细节在实施例1中给出。
接着将反应混合物加热至所述探针/分析物双链体的Tm以上，以释放经修饰的探针，接着冷却以使新探针与分析物杂交。在每个这些热循环中，分析物复合物中的探针都如上述在其3'末端延伸。可以重复这种热循环，直至基本上反应混合物中的所有探针都已被修饰。该反应中使用的聚合酶一般是热稳定DNA聚合酶，例如水生栖热菌(T.aquaticus(Taq))聚合酶。进行这些步骤的细节在实施例3中给出。
图2C显示了与图1A中所述探针28相似的单链检测探针44。该探针在其5'和3'末端分别包含决定该探针二级结构的互补序列部分46、48。该探针的3'末端具有与经修饰靶标探针3'末端突出端互补的突出端50(例如2-6个碱基的突出端)以及与该经修饰靶标探针发生互补碱基相互作用所需的碱基结构。除了突出端序列50以外，该检测探针44还可包含额外的任意序列或功能性序列，例如一个或多个限制性位点、通用引发位点、启动子位点或用于探针鉴定的条码序列。
图2D展示了连接反应，其中靶标探针和检测探针(分别为54和56)的互补3'末端突出端接近并连接，形成两探针的连接产物58。连接酶一般是T4DNA连接酶，连接在标准条件下进行，例如RT20分钟。所述检测探针和连接酶一般在产生经修饰探针之后加入反应混合物中。当经修饰探针和检测探针像此处一样都是发夹结构时，得到的连接产物是包含所述靶标探针序列和检测探针序列的环状单链片段，并且所述检测探针片段包含用于合成该连接产物的拷贝的额外元件，例如启动子元件。在此实施方案中，该方法还可包括用核酸外切酶(例如核酸外切酶I和核酸外切酶III)处理最终的反应混合物，以除去未环化(未反应)的探针和靶标。由此，该反应显著富集了期望的两探针连接产物。进行这些步骤的细节在实施例1中给出。
图2E展示了用于扩增该两探针连接产物以检测该连接产物的PCR方法。如所示，可以对完整的环化产物(以60显示)或经切割将该产物断裂成分离的线性链后的相同产物(如链62)进行扩增。将产物(完整的或片段)与带有可检测标记(如所示)的第一通用引物64退火，并进行一轮引物起始的聚合。如所示使用第二通用引物65来产生相反链，得到该连接产物中一部分的双链拷贝。接着使用带通用标记的引物(例如带荧光标记的引物)对这种双链拷贝进行常规PCR扩增，以标记两个扩增链之一。进行PCR反应的细节在实施例5中给出。
图2F显示了用于扩增两探针连接产物55中所包含的靶序列的另一种方法。在此实施例中，连接产物55在检测探针或靶标探针中包含启动子(例如T7启动子序列或者发夹本身)，如图2F所示的RNA转录产物57，在该产物与合适的转录酶(如T7RNA聚合酶)在NTP存在下反应时，所述启动子可用于产生包含靶序列的RNA转录物。可以使用常规分子信标探针59在溶液相中检测所扩增转录物的存在情况，所述分子信标能与该转录物序列反应，产生可检测(未猝灭的)信号。或者，可以在适当的带荧光素标记的核糖核苷三磷酸存在下合成转录物，并通过附着到寡聚物-探针阵列63上来进行检测，如下文所述。后一方法具有能在单个多重反应形式中检测极大数量分析物序列的优点。进行转录反应的细节在实施例8中给出。
用于扩增所述两探针连接产物的全部或一部分的其他方法也适用于本发明，并已考虑在内。一种称为滚环扩增(RCA)的此类方法使用单个引物(例如通用引物)进行线性扩增，使用一对引物进行指数扩增，例如Lizardi等的美国专利No.5,854,033所述。进行滚环扩增的细节在实施例5中给出。
图2G显示包括扩增的带标记双链片段的反应方案，所述片段具有四种不同的靶标特异性序列66、68、70、72。将扩增的片段加入附着有单链探针(如探针76、78)的基因芯片74上，所述探针设计成分别与所述带标记片段(如片段68、66)的序列特异性区域杂交。在杂交条件下使标记片段与芯片探针反应后，可以通过该芯片中每个已知序列区处标记探针的存在与否来确定每种靶序列的存在与否。应该理解，在实践中，该方法可用于多重检测数百至数千种不同的靶序列，例如人基因组中与多种疾病状态相关的一些大量的SNP。在此应用中，当使用大量不同序列的靶标及检测探针时，具有发夹结构的探针在减少可能发生的探针交叉杂交方面是有利的。
为了进一步扩展该方法用于检测大量分析物序列的能力，图3显示了根据本发明一些实施方案设计的多重测定。待检测的是含有多种不同靶序列的样品80，例如基因组DNA80。向样品中加入多种靶标探针92以启动靶标探针与靶序列之间的杂交，以形成杂交复合物。将所述杂交复合物分成四个等分试样82、84、86、88。向每个等分试样中加入单一一种不同的核苷三磷酸，82加入dATP，84加入dGTP，86加入dTTP，88加入dCTP。在聚合酶存在下重复进行杂交和延伸以在每个等分试样中产生经修饰探针之后，可以向每个等分试样中加入不同的检测探针(82为探针1，84为探针2，86为探针3，88为探针4)，以促进所述检测探针与所述经修饰探针之间的连接，以在管94、96、98、100中形成连接产物。接着用带不同标记的通用引物扩展每个管中的连接产物，或者用不同标记的NTP进行转录，以产生带标记的扩增子。混合在每个管中形成的带标记扩增子，接着通过与附着在DNA阵列90上的探针杂交来进行检测。对阵列的解码包括扫描阵列、标出与每个阵列区相关的荧光信号，以及证实以给定核苷酸碱基结束的给定序列的存在情况。可通过混合个体靶标探针来产生所述多种靶标探针92，或者从固体表面(如阵列102)上合成每种靶标探针。对附着在阵列102上的靶标探针进行的切割形成了多种靶标探针92的混合物。进行多重反应的一些细节在实施例5中给出。
图4展示了该方法来扩展和检测多核苷酸104的用途，多核苷酸104具有确定的序列，并且其本身作为测定试剂(在这种情况下是对给定抗原108具有特异性的抗体106)的标记物。例如，在鉴定具有特定表位特征的蛋白组学研究中，该抗原可以是排列在固体表面上的大量抗原之一。同样，该研究可包括具有不同表位特异性的多种抗体，每种抗体携带具有其自身靶序列的试剂特异性多核苷酸。应该理解，所述多核苷酸标记物提供几乎无限的可单个检测的不同标记物数目，例如可用于大规模蛋白组阵列。
将抗体试剂与固体支持物(如附着有分析物的珠子)结合并洗涤珠子以除去未结合试剂后，可使该珠子接触含有靶标探针(如探针112)的反应混合物，其中每种探针都具有靶向序列，该靶向序列设计成与该珠所结合的多种不同序列的多核苷酸标记物之一杂交。现在如所示延伸探针(例如延伸单个碱基(C))，得到经修饰探针，例如探针114，每个经修饰探针具有不同的靶向序列，但具有相同的单碱基延伸。如上述，该反应可以用摩尔过量的靶标探针进行，使得可以通过数个热循环来扩增探针。
延伸探针之后，将靶标探针与共有序列检测探针(如探针116)在连接酶存在下反应，形成两探针连接产物，例如环状产物118。通过上述方法之一进行检测可代表大量不同序列标志物的这些产物，所述方法通常包括形成含有标志物特异性序列的该连接产物的经扩增标记片段，以及在寡核苷酸阵列120上解码所述标记片段。这样，可以通过标记探针与寡聚物阵列120上相应寡核苷酸的结合来查明原始抗原珠中的抗原结合的任何标记物序列的存在情况。或者，可以用通用引物扩增连接产物，接着分成一个或多个等分试样122、124、126，并用抗原特异性引物扩增每个等分试样，以检测每种抗原的存在情况。
D.用于RNA检测的方法和试剂盒
本节研究了本发明用于扩增和检测序列特异性RNA靶标的具体应用。进行这些方法的细节在实施例6、7、8中给出。参考图5，具有以GT序列结束的靶序列的RNA多核苷酸分析物以128显示。如上文的讨论，所述靶序列可以为10-20个碱基或更长，但其中关键的目的碱基是所述靶序列3'末端附近的碱基，例如该图中的GT两个碱基。同上文的更为一般性的描述一样，该方法中的第一步是通过将探针的靶向部分与RNA分析物在四种dNTP中选定的一至三种(在这种情况下为dCTP)存在下杂交来延伸靶标探针(例如发夹探针130)，以形成分析物/探针复合物132。接着，如所示在一至三种选定的dNTP(如dCTP)以及能将RNA转录成DNA的逆转录酶(如MMLV,Invitrogen)存在下进行探针扩增，以获得延伸的靶标探针134。像所指出的一样，反应混合物可以用RNase(如RNaseH)进行处理，以降解双链体中的分析物RNA。
该方法中使用的检测探针优选为发夹探针136，其具有与延伸的靶标探针突出端互补的3'突出端以及能支持RNA在RNA聚合酶(如T7聚合酶)存在下进行转录的内部启动子序列(例如T7启动子)。这样，两种探针的反应以及在连接酶存在下的探针连接得到了环状单链的两探针连接产物138，其具有内部启动子序列，其后是探针特异性序列。在RNA聚合酶存在下产生转录物。使用所得的转录物作为靶标重复扩增过程。为了进行检测，可向反应混合物中引入分子信标探针。所示分子信标探针(如59)会与转录物杂交，产生可检测信号，如图2F所示。
E.用于多重小RNA检测的方法和试剂盒
小RNA(miRNA)一般包括长度约22(18-25)个碱基的单链内源寡聚核糖核苷酸，它由Dicer从较大的茎环前体RNA加工而成。长度约22个碱基的小RNA的长度不足以容纳用于PCR或NASBA扩增的两种引物。因此，用于miRNA定量的可靠技术极少(Allawi等,ThirdWaveTechnologies,RNA.2004July；10(7):1153-61)。已使用了Northern印迹，但其结果不是定量的(Lagos-Quitana等,2001,Science,294(5543),853-854)。许多miRNA研究人员致力于监测miRNA在不同组织、在不同发育阶段或在用多种化学试剂处理之后的水平。然而，miRNA很短的长度使他们的研究非常困难。
图6显示了根据本发明一些实施方案设计的多重测定。待检测的是含有多种不同小RNA靶序列的样品140，例如细胞裂解样品140。向样品中加入多种靶标探针142和四种dNTP中的一至三种，在这种情况下是dCTP。在聚合酶存在下进行杂交和延伸以在反应管144中产生经修饰探针之后，可向反应管144中加入一种或多种检测探针，以促进检测探针与经修饰探针之间发生连接，使得在反应管146中形成连接产物。接着用通用引物扩增连接产物，以在反应管148中产生扩增子。将所述扩增子分成一个或多个等分试样，分别为152、154、156。接着用特异性引物扩增每个等分试样。在每个等分试样中检测到该扩增产物表示存在该特定miRNA。或者，用掺入检测标记来扩增连接产物，接着通过与附着在固体表面150上的探针杂交来进行检测。对阵列的解码包括扫描阵列、标出与每个阵列区相关的荧光信号以及确定给定小RNA的存在情况。
在一个实施方案中，本发明的方法允许检测和鉴定微生物，例如感染哺乳动物的病原体。因此，本发明可用于例如鉴定感染人受试者的特定病毒株，例如人免疫缺陷病毒或乳头瘤病毒(HPV)等的特定病毒株。微生物菌株彼此之间的差异经常仅为数个核苷酸，而其基因组的其余部分相同。因此，可以产生识别保守区的探针，以鉴定特定的可变核苷酸。
例如，可通过本发明的方法检测多种感染性疾病。它们一般由细菌、病毒、寄生生物和真菌传染原引起。还可以使用本发明来测定多种传染原对药物的抗性。
本发明还可用于检测传染原的药物抗性。例如，万古霉素抗性的屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、甲氧苯青霉素抗性的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、青霉素抗性的肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、多重药物抗性的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)和AZT抗性的人免疫缺陷病毒均可通过本发明进行鉴定。
还可以通过本发明的方法鉴定遗传病。这通过对染色体及遗传异常或遗传病进行产前或产后筛查来实现。可检测的遗传病实例包括21羟化酶缺陷、囊性纤维化病、脆性X综合征、特纳综合征、迪谢内肌营养不良、唐氏综合征或其他三体性、心脏病、单基因病、HLA分型、苯丙酮尿症、镰状细胞贫血、泰-萨克斯病、地中海贫血、克兰费尔特综合征、亨廷顿病、自身免疫病、脂肪沉积、肥胖症、血友病、先天性代谢缺陷和糖尿病。
可通过本发明方法检测的癌症一般涉及癌基因、肿瘤抑制基因或者与DNA扩增、复制、重组或修饰有关的基因。其实例包括BRCA1基因、p53基因、APC基因、Her2/Neu扩增、Bcr/AB1、K-ras基因以及16及18型人乳头瘤病毒。本发明的多个方面可用于鉴定上述基因在以下常见人类癌症中的扩增、大缺失以及点突变和小缺失/插入：白血病、结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、骨肉瘤和其他骨癌、睾丸癌和卵巢癌、头颈癌和子宫颈赘生物。
在环境监测领域中，本发明可用于在天然和改造的生态系统及微生态系统(microcosm)中检测、鉴定和监测病原性微生物和固有微生物，所示微生态系统为例如市政污水净化系统和水库或者进行生物除污的污染区。还有可能检测含有可代谢外源物质之基因的质粒，以在种群动态研究中监测特定的靶微生物，或者在环境及工业机构中检测、鉴定或监测遗传改造的微生物
本发明还可用于多个法医学领域，包括用于军队人员和犯罪调查的人鉴定、亲缘认定和家族关系分析、HLA相容性分型以及筛查血液、精液或移植器官的污染。
在食品工业及饲料工业中，本发明具有广泛的用途。例如，它可用于鉴定和表征生产性生物，例如用于生产啤酒、红酒、乳酪、酸乳、面包等的酵母。另一有用的领域涉及对产品和工艺(如家畜、巴斯德灭菌和肉加工)的污染进行质量控制和认证。其它用途包括表征用于育种的植物、鳞茎和种子，鉴定植物特异性病原体的存在以及检测和鉴定动物育种计划中的兽医学感染。
以下实施例用于更完整地描述使用本发明的方式以及公开实施本发明多个方面的最佳模式。应该理解，这些实施例不用于限制本发明的真实范围，而是用于说明目的。本文引用的所有参考文献均通过参考并入本文。
实施例1
基于等位片段特异性杂交进行靶标探针延伸
本实施例证明了带有自身互补序列(发夹结构)的靶标探针在杂交条件下与靶序列形成杂交复合物。如果所述靶标探针的3'末端在聚合条件下与靶序列中的等位片段特异性核苷酸互补，则可以基于所添加核苷酸的类型或数目而向该靶标探针的3'末端添加一个或多个核苷酸。这种延伸会使靶标探针的3'末端序列与检测探针的3'末端序列互补，使得有可能连接两种探针。设计并从IntegratedDNATechnology订购了名为Oct-25-2005-R的发夹探针，用于测试该延伸反应。设计了两种合成靶序列来测试等位片段特异性延伸。靶序列之一名为RS1389629-G，与靶标探针完全互补。另一靶序列名为RS1389629-C，也与靶标探针互补，但不与靶标探针3'末端的最后一个碱基互补。设计了两种检测探针，分别命名为Oct25-2005F和Oct-25-2005-2F。Oct25-2005F与延伸的靶标探针附近的靶序列互补。Oct25-2005F与延伸的靶标探针之间的连接是模板依赖性连接。Oct-25-2005-2F不与靶序列互补。Oct-25-2005-2F与延伸的靶标探针之间的连接是非模板依赖性的。
具有发夹结构的靶标探针序列Oct-25-2005-R:
5′-磷酸-GGCTCCATACGGACTCCCACAGTGAGGAGCC3′
(SEQIDNO：1)
用于模板依赖性连接的具有发夹结构的检测探针序列Oct25-2005F:
5′-磷酸-ATCCCATTATCCTCCATGCAATGGGATCCA-3’
(SEQIDNO：2)
用于非模板依赖性连接的具有发夹结构的检测探针序列Oct-25-2005-2F:
5′-磷酸-CCGTGTGCTATATGTTAGTATTGGACACACACGGCCA3’
(SEQIDNO：3)
与靶标探针完全互补的靶序列RS1389629-G:
5’AATATATGGAGGATAATGGGATCCAGGCTCCTCACTGTGGGAGAAGAAGTT3’
-带有等位片段G的靶标
(SEQIDNO:4)
与靶标探针互补但不与靶标探针3'末端的最后一个碱基互补的靶序列RS1389629-C:
5’AATATATGGAGGATAATGGGATCCACGCTCCTCACTGTGGGAGAAGAAGTT3’
-带有等位片段C的靶标
(SEQIDNO:5)
如下文使用这些彼此仅有一个核苷酸不同(SNP)的靶序列之一进行四个平行的延伸反应(30μl)：
1)无检测探针存在时的靶标探针延伸反应:将靶标DNA(100μM)1μl和发夹探针Oct-25-2005-R(100μM)3μl加入含有以下成分的延伸反应混合物中：0.5μl10mMdGTP、0.5μl10mMdTTP(10mM)、3μl10×Stoffel缓冲液(100mMTris-HCl,pH8.3,100mMKCl)、0.5μl10U/μlAmpliTagDNA聚合酶Stoffel片段(ApplicationBiotechnology)、4.8μl25mMMgCl2。
2)有检测探针存在时的靶标探针延伸反应:将靶标DNA(100μM)1μl、发夹探针Oct-25-2005-R(100μM)3μl、发夹探针Oct-25-2005-F或Oct-25-2005-2F(100μM)3μl加入含有以下成分的延伸反应混合物中：0.5μl10mMdGTP、0.5μl10mMdTTP(10mM)、3μl10×Stoffel缓冲液(100mMTris-HCl,pH8.3,100mMKCl)、0.5μl10U/μlAmpliTagDNA聚合酶Stoffel片段(ApplicationBiotechnology)、4.8μl25mMMgCl2。
在按如下设置的热循环仪(MJResearch)上延伸发夹靶标探针Oct-25-2005-R:
95℃预变性2分钟
95℃1分钟、60℃1分钟的10个循环
70℃5分钟
95℃3分钟
反应后，在4℃孵育样品
向样品中加入DNA上样缓冲液(0.05％溴酚蓝、30％蔗糖)。接着在20％变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳样品。将代表发夹检测探针的每个发夹探针上样到凝胶中。
结果：结果表明，在与靶标RS1389629-G杂交后，发夹延伸探针Oct-25-2005-R的3'末端形成了3个核苷酸的粘末端(-TGG)(图7)，但是在存在靶标RS1389629-C的其他泳道中则没有，靶标RS1389629-G中含有与探针3'末端互补的SNP。
检测探针与延伸的靶标探针之间发生连接反应以形成环状连接产
物:
1)模板依赖性连接:从延伸反应1)中吸出4μl等分试样，并加入16μl连接酶混合物[2μlT4DNA连接酶缓冲液(500mMTris-Hcl,pH7.510mMATP)、0.8μlT4DNA连接酶(3U/μl,Promega)、0.5μl发夹检测探针Oct-25-2005-F、12.7μl水]中。在16℃下将连接反应物孵育6小时。
2)非模板依赖性连接:从延伸反应2)中吸出4μl等分试样，并加入16μl连接酶混合物[2μlT4DNA连接酶缓冲液(500mMTris-Hcl,pH7.510mMATP)、0.8μlT4DNA连接酶(3U/μl,Promega)、0.5μl发夹检测探针Oct-25-2005-2F、13.2μl水]。在16℃下将连接反应物孵育6小时。
进行核酸外切酶处理以去除线性模板或探针，但不除去环状连接产物：
将来自连接反应的5μl等分试样与5μl核酸外切酶混合物混合，所述核酸外切酶混合物通过混合以下成分来制备：每个反应1μl10×ExoI缓冲液(NewEnglandBiolabs)、0.5μl20u/μl核酸外切酶I(大肠杆菌)(NewEnglandBiolabs)、0.5μl100u/μl核酸外切酶III(大肠杆菌)(NewEnglandBiolabs)以及3μl水。接着在37℃下将反应物孵育3小时。
接着将5μl每种Exo消化产物在20％变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并通过SYBRGreenI(Roche)染色和紫外光使环化产物显影(图8)。
实施例2
使毗邻SNP位点的靶标探针延伸单个核苷酸，以用于SNP检测。
本实施例描述了使毗邻SNP位点的靶标探针延伸单个核苷酸，以用于SNP检测。靶标探针与近邻SNP位点的靶序列杂交。仅有在其3'末端加入正确碱基的靶标探针能与检测探针连接，形成连接的环状产物。根据所加入核苷酸的类型来鉴定SNP。延伸的靶标探针与检测探针之间的反应是粘末端连接。如果反应物中仅存在正确的单个核苷三磷酸和DNA聚合酶，则与靶序列退火的靶标发夹探针3'末端从该发夹序列的3'末端延伸一个核苷酸。随着变性、退火和延伸的更多个循环，反应混合物中已延伸碱基的靶标探针数将增加。在DNA连接酶存在下，在其3’末端具有两个核苷酸的突出端并与延伸的靶标探针突出端互补的检测发夹探针将与延伸的靶标探针连接，形成环状哑铃样产物。环状哑铃样产物对核酸外切酶有抗性。因此，在核酸外切酶消化后，检测与所加入核苷酸类型相关的连接环状产物将会帮助鉴定SNP的类型。
根据与大豆受体样激酶RHG1基因序列的比对设计并合成了四种合成靶序列。“/”表示SNP位置。含有四种SNP的基因组DNA序列区段如下：
SNP1
GAACAACGTTAACCCATGTTGTTTTTTGTTTCTCTTATGTGTGTGGAGCCTTGTTGTGCTCCCCTCATGCGTGAGGCCAGTTTTGTGTGAAGATGAAGGTTGGGATGGAGTGGTTGTGACAGCATCAAACCTCTTAGCACTTGAAGCTTTCAAGCAAGAGTTGGC/TTGATCCAGAAGGGTTCTTGCGGAGCTGGAATGACAGTGGCTATGGAGCTTGTTCCGGAGGTTGGGTTGGAATCAAGTGTGCT
SNP2
TGATCCAGAAGGGTTCTTGCGGAGCTGGAATGACAGTGGCTATGGAGCTTGTTCCGGAGGTTGGGTTGGAATCAAGTGTGCTC/AAGGGACAGGTTATTGTGATCCAGCTTCCTTGGAAGGGTTTGAGGGGTCGAATCACCGACAAAATTGGCCAACTTCAAGGCCTCAGGAAGCTTAGTCTTCATGATAACCAAATTGGTGGTTCAATCCCTTCAACTTTGGGACTTCTTCCCAACCTTAGAGG|
SNP3
CCTTTACCAGCTAGCCTAACTCACTCATTTTCTCTCACTTTTCTTTCTCTTCAAAATAACAATCTTTCTGGCTCCCTTCCTAACTCTTGGGGTGGGAATTCCAAGAATGGCTTCTTTAGGCTTCAAAATTTGATCCTAGATC/AATAACTTTTTCACTGGTGACGTTCCTGCTTCTTTGGGTAGCTTAAGAGAGCTCAATGAGATTTCCCTTAGTCATAATAAGTTTAGTGGAGCTATACCAAATGAAA
SNP4
CTGCTTTTCTGCCTGATCAGAAAGAGATCAACATCTAAGGCCGGGAACGGCCAAGCCACCGAGGGTAGAGCGGTCACTTATGAGGACAGAAAAAGGAGTCCCTCCAGTTGCTGG/CTGGTTGATGTTGAAGCAGGTGGGGAGGCTGGAGGGGAACTAGTCCATTTTGATGGACCAATGGCTTTTACAGCTGATGATCTCTTGTGTGCAACAGCTGAGATCATGGGAAAGAGCACCAATGGAA
合成靶标、靶标发夹探针和检测探针如下：
SNP1合成靶标(RHG-SNP1-模板-C-40)
5’-CTTTCAAGCAAGAGTTGGCTGATCCAGAAGGGTTCTTGCG-3’
(SEQIDNO：10)
用于SNP1的靶标探针(RHG-SNP1-探针-35)
5′-磷酸-GATCCAGAATCTTGCGCAAGAACCCTTCTGGATCA-3’
(SEQIDNO：11)
用于SNP1的检测探针(Univ-CT)
5′-磷酸-
CCGTGTGCTACATCTAAGTATAGGACTATGTTATATTGGGCACACGGCT-3’
(SEQIDNO：12)
SNP2合成靶标(RHG-SNP2-模板-C-41)
5’-GTTGGAATCAAGTGTGCTCAGGGACAGGTTATTGTGATCCA-3’
(SEQIDNO：13)
用于SNP2的靶标探针(RHG-SNP2-探针-38)
5′-磷酸-GGGACAGGATCTTGCGCGGATCACAATAACCTGTCCCT-3’
(SEQIDNO：14)
用于SNP2的检测探针(Univ-CA)
5′-磷酸-
CCGTGTGCTACATCTAAGTATAGGACTATGTTATATTGGGCACACGGCA-3’
(SEQIDNO：15)
SNP3合成靶标(RHG-SNP3-模板-C-38)
5’-AATTTGATCCTAGATCATAACTTTTTCACTGGTGACGT-3’
(SEQIDNO：16)
TargetprobeforSNP3(RHG-SNP3-probe-46)
5′-磷酸-
TAACTTTTTCACATCTTGCGCGGCACGTCACCAGTGAAAAAGTTAT-3’
(SEQIDNO：17)
用于SNP3的检测探针(Univ-CT)
5′-磷酸-
CCGTGTGCTACATCTAAGTATAGGACTATGTTATATTGGGCACACGGCT-3’
(SEQIDNO：12)
SNP4合成探针(RHG-SNP4-模板-C-39)
5’-AGTCCCTCCAGTTGCTGCTGGTTGATGTTGAAGCAGGTG-3’
(SEQIDNO：18)
用于SNP4的靶标探针(RHG-SNP4-探针-41)
5’-磷酸-GGTTGATGATCTTGCGCGGCAGCCTGCTTCAACATCAACCA-3’
(SEQIDNO：19)
用于SNP4的检测探针(Univ-CA)
5′-磷酸-
CCGTGTGCTACATCTAAGTATAGGACTATGTTATATTGGGCACACGGCA-3’
(SEQIDNO：15)
每个SNP反应均独立进行。
引物退火及延伸:在200μlPCR管中建立反应，在15μl反应体积中含有2.5个单位的AmpliTagDNA聚合酶Stoffel片段(ApplicationBiotechnology)、10mMTris-HCl(pH8.3)、10mMKCl、4mMMgCl2、0.15mMdGTP。反应物含有5μM延伸探针和1.5μM靶标DNA。循环程序由最初在95℃变性3分钟以及其后50个循环的95℃30秒、58℃退火并延伸1分钟组成。最后在72℃延伸5分钟。
连接反应:对于每个待进行的30μl反应，按如下制备15μl连接混合物：3μl10×T4DNA连接酶缓冲液(500mMTris-Hcl,pH7.510mMATP)、1.2μlT4DNA连接酶(3U/μl,Promega)、1μl100μMUniv探针和9.8μl水。
将15μl连接混合物加入15μl延伸反应物中。连接反应在热循环仪(MJResearch)中以16℃进行1小时，并以37℃进行20分钟。
核酸外切酶反应以除去线性靶标或探针：将来自连接反应的6μl等分试样与4μl核酸外切酶混合物混合，所述核酸外切酶混合物通过混合以下成分来制备：每个反应0.5μl核酸外切酶I(大肠杆菌)(20u/μl,NewEnglandBiolabs)、0.5μl核酸外切酶III(大肠杆菌)(100u/μl,NewEnglandBiolabs)和3μl水。接着将反应物在37℃下孵育3小时。
接着将5μl每种核酸外切酶消化产物在20％变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并通过SYBRGreenI(Roche)染色和紫外光使环化产物显影(图10)。
泳道11、12、13、14的条带在核酸外切酶处理后为环状哑铃样产物。结果明确展示了本发明用于SNP检测的可行性。
实施例3
通过基于对探针延伸反应进行热循环增加延伸靶标探针的量来进
行的灵敏度测试
分别使反应物循环1、10、15、25、35、50次进行探针退火和延伸：在200μlPCR管中建立反应，在15μl反应体积中含有2.5个单位的AmpliTagDNA聚合酶Stoffel片段(ApplicationBiotechnology)、10mMTris-HCl(pH8.3)、10mMKCl、4mMMgCl2、0.15mMdGTP。反应物含有5μM延伸探针和1.5μM靶标DNA。循环程序由最初在95℃变性3分钟以及其后50个循环的95℃30秒、58℃退火并延伸1分钟组成。最后在72℃延伸5分钟。
在核酸外切酶处理后使用检测探针基于连接反应产物来估计随着循环数提高而产生的延伸产物量。图11的结果(泳道4和9)明确显示，增加探针退火和延伸反应的循环增加了连接产物。
实施例4
核苷酸添加在延长靶标探针方面的特异性
如实施例2所述进行反应，只是使用较少量的靶标(0.1μM)。进行24个反应：每种加入单个核苷酸的SNP以及未加入核苷酸或未加入靶标模板的两个阴性对照各4个反应(表1)。靶标探针在靶标中C碱基附近与靶序列杂交。加入四种核苷三磷酸之一来延伸所分离的靶标探针。在核酸外切酶处理后基于检测探针的连接反应来评估延伸产物。实验数据显示，仅正确加入的dGTP碱基能延伸靶标探针，形成环状连接产物(图12)。
表1在寡核苷酸靶标上延伸发夹探针，然后与检测发夹探针连接
实施例5
在单管中进行多重SNP反应
通过同时使用合成靶标和全基因组DNA来评估在单管中进行的多重SNP反应。
用于本实验的合成DNA靶标和发夹探针与实施例2中所列出的相同。从大豆育种株系PI和Essex中提取和纯化基因组DNA。
基于通过扩增连接环状产物的PCR来确认多重SNP反应。将PCR引物设计成特异性扩增每种连接的环状产物。一种对应于靶标探针的引物对每种SNP具有基因特异性。对应于检测探针的另一种对于四种SNP是通用的。
寡核苷酸序列：
四种SNP的通用引物(Univ-引物2)
5’ATGTTATATTGGGCACAC3’
(SEQIDNO：20)
用于SNP1的基因特异性引物
CCAGAAGGGTTCTTG
(SEQIDNO：21)
用于SNP2的基因特异性引物
CAGGTTATTGTGATC
(SEQIDNO：22)
用于SNP3的基因特异性引物
CTTTTTCACTGGTGAC
(SEQIDNO：23)
用于SNP4的基因特异性引物
GTTGATGTTGAAGCAG
(SEQIDNO：24)
多重延伸反应：30μl多重反应物含有四种延伸探针中每种5μM、四种合成DNA靶标中每种100nM或50ng大豆基因组DNA、5单位AmpliTagDNA聚合酶Stoffel片段(ApplicationBiotechnology)、10mMTris-HCl(pH8.3)、10mMKCl、4mMMgCl2、0.15mMdGTP。温度条件为：首先在95℃预变性3分钟，95℃变性30秒、58℃退火及延伸1分钟的50个循环，加上72℃最后延伸5分钟。
多重连接反应：将延伸产物的6μl等分试样与24μl连接混合物混合，所述连接混合物含有1.5μl每种检测探针(100μMUniv-CA和100μMUniv-CT)、3μl10×T4DNA连接缓冲液、2.5μlT4DNA连接酶(3U/μl，Promega)和18.5μl水。连接反应在热循环仪(MJResearch)中以16℃进行20分钟，并以37℃进行20分钟。
多重核酸外切酶处理以消化靶标和未连接的探针：将连接反应物的5μl等分试样与(每个反应)0.25μl核酸外切酶I(大肠杆菌)(20u/μl,NewEnglandBiolabs)、0.25μl核酸外切酶III(大肠杆菌)(100u/μl,NewEnglandBiolabs)混合，并在37℃孵育3小时。将0.5μl每种经核酸外切酶处理的产物进行20％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(图13)。
1.PCR特异性扩增环化探针以验证多重反应产物的特异性。
对1μl净化的连接产物(将来自合成模板的产物稀释100倍)进行PCR。使用每个引物对来扩增多重反应。还包括了阳性对照和阴性对照：1)与引物互补的单个连接产物，2)多重连接反应物，3)没有引物互补连接产物的多重反应物，4)未连接的引物特异性探针，5)仅有水。温度模式为95℃3分钟；95℃40秒、58℃40秒、72℃40秒(35个循环)；72℃5分钟。所产生的所有PCR产物的大小均为约70-80bp(表2，图14)。
表2使用特异性和通用引物扩增来检测连接
2.对环化探针进行滚环扩增以验证多重反应产物的特异性
将连接物或连接混合物用于RCA。加入对以上列出各个SNP连接产物具有特异性的1μl反义引物等分试样。将10μl反应物加热至70℃并冷却至室温，然后加入5μlRCA混合物[800μMdNTP、50mMTris-HCl(pH8.3)、250mMKCl、7.5mMMgCl2、0.8μg/μlBSA、10U/μlPhi29DNA聚合酶]，然后在30℃孵育过夜。在70℃孵育10分钟终止反应。对1μl反应物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳(图15)。
实施例6
使用本发明进行RNA及DNA检测
本实施例描述了不仅能够检测单核苷酸多态性而且还可用于检测和定量复杂混合物中的DNA及RNA的发夹形核酸探针。在靶核酸不存在的条件下，发夹探针的3'和5'互补序列形成稳定的茎环构象。在变性条件下，如果存在靶序列，则靶标发夹探针将能够与该靶标杂交，形成杂交复合物。靶标探针中的发夹结构提高探针的杂交特异性，因为只有在热力学上比发夹结构本身更稳定的探针-靶标杂交复合物才能形成杂交复合物。形成正确的探针-靶标杂交复合物以后，核酸聚合酶将沿着靶序列延伸所述探针，产生可连接的粘末端。检测探针能与延伸的靶标探针连接形成连接产物，所述检测探针具有与延伸的靶标探针粘末端互补的粘末端，并且不与靶标杂交。必要时，在检测探针中可以包括T7启动子序列。在连接产物中加入RNA聚合酶和rXTP会允许将转录进行至累积了所需(可检测)量的RNA转录产物。或者，可以使用发夹环结构来起始RNA转录。使用合成RNA模板来进行该反应。
靶标探针序列(RHG-SNP2-探针-38)
5′-磷酸-GGGACAGGATCTTGCGCGGATCACAATAACCTGTCCCT-3’
(SEQIDNO：14)
检测探针序列(Univ-CA)
5′-磷酸-
CCGTGTGCTACATCTAAGTATAGGACTATGTTATATTGGGCACACGGCA-3’
(SEQIDNO：15)
合成的RNA靶序列1(SNP2-模板-RNA-C)
5rGrUrGrCrUrCrArGrGrGrArCrArGrGrUrUrArUrUrGrUrGrArUrCrCrArGrC-3
(SEQIDNO：25)
合成的RNA靶序列2(玉米-28s-探针-G)
5’-PHOS/CGCCTGTCATCCTCCATGCTCGGGTCCCGACAGGCGT-3’
(SEQIDNO：26)
合成的RNA靶序列3(玉米-18S-模板)
5’-
rGrCrArGrGrCrGrArUrCrCrUrCrCrArUrGrCrGrGrUrArArUrUrUrGrCrGrCrGrCrCrUrGrCrU-3′
(SEQIDNO：27)
合成的RNA靶序列4(玉米-18S-探针-G)
5’-PHOS/GCAGGCGATCCTCCATGCGGTAATTTGCGCGCCTGCT-3’
(SEQIDNO：28)
包含T7启动子序列的检测探针(T7-发夹-3)
5/5Phos/CTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATCCTCCATGCTAATACGACTCACTATAGGGAGCA3’
(SEQIDNO：29)
包含T7启动子序列的有义及反义线性双链检测探针
有义链(T7-反向引物)
5’-PHOS/CTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’
(SEQIDNO：30)
反义链(T7-正向引物)
5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGCA-3’
(SEQIDNO：31)
RT反应
通过将反应物在95℃加热5分钟使含有1μlSNP2-模板-RNA(25μM)和1.5μlRHG-SNP2-探针-C(50μM)的反应物变性，其后(任选地)退火并加入2.5μlRT混合物[0.5μlDTT(0.1M)、1μl5×第一链缓冲液、0.25μldXTP(5mM)、0.25μlM-MLV逆转录酶(200u/μl)、0.5μlH2O]，通过吹吸使反应物充分混合，并在37℃孵育8分钟、15分钟，接着将反应物在65℃孵育15分钟，以使逆转录酶失活。
连接
在37℃下，向5μlRT反应物中加入10μl连接混合物[0.8μlT4DNA连接酶(3U/μl)、1.5μl10×T4连接缓冲液、1.0μlUniv-CA(50μM)、6.7μl水]。该反应在37℃下分别进行10、20、30分钟。
核酸外切酶处理
连接反应之后，加入1μl核酸外切酶(ExoI:ExoIII＝1:1)并在37℃孵育3小时，以除去线性RNA和DNA分子。
结果：可以通过靶标发夹探针和加入四种核苷酸之一来区分RNA序列差异(图17)。
实施例7
用于RNA检测的单管等温测定(RT连接)
在单个管中进行RT反应和连接反应。通过将反应物在95℃加热5分钟使含有1μlSNP2-模板-RNA(25μM)和1.5μlRHG-SNP2-探针-C(50μM)的反应物变性，其后(任选地)退火并加入2.5μlRT混合物[0.5μlDTT(0.1M)、1μl5×第一链缓冲液、0.25μldXTP(5mM)、0.25μlM-MLV逆转录酶(200u/μl)、0.5μlH2O]，通过吹吸使反应物充分混合，接着加入10μl连接混合物[0.8μlT4DNA连接酶(3U/μl),1.5μl10×T4连接缓冲液、1.0μlUniv-CA(50μM)、6.7μl水]。反应在37℃进行20分钟。该反应后，加入1μl核酸外切酶(ExoI:ExoIII＝1:1)并在37℃孵育3小时，以除去线性RNA和DNA分子。
结果：可以通过靶标发夹探针和加入四种核苷酸之一来区分RNA序列差异(图18)。
实施例8
用于RNA检测的单管等温测定，其中在RT和连接反应之后对连接
产物进行体外转录
对于该实验，将含有T7启动子的合成有义及反义线性双链检测探针用于此测定。
有义链(T7-反向引物)
5’-PHOS/CTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’
(SEQIDNO：30)
反义链(T7-正向引物)
5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGCA-3’
(SEQIDNO：31）
混合等量的T7反向引物和T7正向引物并在95℃加热3分钟，在37℃退火以产生“T7双链启动子”。
反应物含有0.25μl玉米总RNA(0.5μg/μl)以及1.5μl18S-rRNA-探针-G或28S-rRNA-探针-G(50μM)、2.5μlRT混合物[0.5μlDTT(0.1M)、1μl5×第一链缓冲液、0.25μldXTP(5mM,Invitrogen)、0.25μlM-MLV逆转录酶(200u/μl,Invitrogen)、0.5μlH2O]，通过吹吸充分混合，并加入10μl连接混合物[0.8μlT4DNA连接酶(3U/μl,Promega)、1.5μl10×T4连接缓冲液、1.0μl双链T7启动子或T7-发夹-3(50μM)、6.7μl水]。充分混合，接着加入15μlIVT混合物[5×IVT缓冲液混合物，含有NTP(ABI)6μl、T7-RNA聚合酶(ABI)0.75μl、焦磷酸盐(ABI)0.75μl、RnaseH0.75μl、DEPC水6.75μl]。反应在37℃进行2小时。
以上教导旨在说明本发明，并不是以其具体内容限制本发明权利要求的范围。尽管描述了本发明的一些优选实施方案，但本领域技术人员很清楚，可以在其中进行多种变化和更改，而不脱离本发明，所附的权利要求书旨在涵盖落入本发明真实构思和范围内的所有这些变化和更改。
SEQUENCELISTING
<110>北京原平皓生物技术有限公司
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<130>MP1001563
<160>31
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>31
<212>DNA
<213>靶标探针序列Oct-25-2005-R(5′-磷酸修饰)
<400>1
ggctccatacggactcccacagtgaggagcc31
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>检测探针序列Oct25-2005F(5′-磷酸修饰)
<400>2
atcccattatcctccatgcaatgggatcca30
<210>3
<211>37
<212>DNA
<213>检测探针序列Oct-25-2005-2F(5′-磷酸修饰)
<400>3
ccgtgtgctatatgttagtattggacacacacggcca37
<210>4
<211>51
<212>DNA
<213>靶序列RS1389629-G
<400>4
aatatatggaggataatgggatccaggctcctcactgtgggagaagaagtt51
<210>5
<211>51
<212>DNA
<213>靶序列RS1389629-C
<400>5
aatatatggaggataatgggatccacgctcctcactgtgggagaagaagtt51
<210>6
<211>248
<212>DNA
<213>含有SNP1的基因组DNA序列区段
<400>6
gaacaacgttaacccatgttgttttttgtttctcttatgtgtgtggagcc
ttgttgtgct60
cccctcatgcgtgaggccagttttgtgtgaagatgaaggttgggatggag
tggttgtgac120
agcatcaaacctcttagcacttgaagctttcaagcaagagttggcttgat
ccagaagggt180
tcttgcggagctggaatgacagtggctatggagcttgttccggaggttgg
gttggaatca240
agtgtgct
248
<210>7
<211>244
<212>DNA
<213>含有SNP2的基因组DNA序列区段
<400>7
tgatccagaagggttcttgcggagctggaatgacagtggctatggagctt
gttccggagg60
ttgggttggaatcaagtgtgctcaagggacaggttattgtgatccagctt
ccttggaagg120
gtttgaggggtcgaatcaccgacaaaattggccaacttcaaggcctcagg
aagcttagtc180
ttcatgataaccaaattggtggttcaatcccttcaactttgggacttctt
cccaacctta240
gagg
244
<210>8
<211>248
<212>DNA
<213>含有SNP3的基因组DNA序列区段
<400>8
cctttaccagctagcctaactcactcattttctctcacttttctttctct
tcaaaataac60
aatctttctggctcccttcctaactcttggggtgggaattccaagaatgg
cttctttagg120
cttcaaaatttgatcctagatcaataactttttcactggtgacgttcctg
cttctttggg180
tagcttaagagagctcaatgagatttcccttagtcataataagtttagtg
gagctatacc240
aaatgaaa
248
<210>9
<211>241
<212>DNA
<213>含有SNP3的基因组DNA序列区段
<400>9
ctgcttttctgcctgatcagaaagagatcaacatctaaggccgggaacgg
ccaagccacc60
gagggtagagcggtcacttatgaggacagaaaaaggagtccctccagttg
ctggctggtt120
gatgttgaagcaggtggggaggctggaggggaactagtccattttgatgg
accaatggct180
tttacagctgatgatctcttgtgtgcaacagctgagatcatgggaaagag
caccaatgga240
a
241
<210>10
<211>40
<212>DNA
<213>SNP1合成靶标(RHG-SNP1-模板-C-40)
<400>10
ctttcaagcaagagttggctgatccagaagggttcttgcg40
<210>11
<211>35
<212>DNA
<213>用于SNP1的靶标探针(RHG-SNP1-探针-35)(5′-磷酸修饰)
<400>11
gatccagaatcttgcgcaagaacccttctggatca35
<210>12
<211>49
<212>DNA
<213>用于SNP1的检测探针(Univ-CT)(5′-磷酸修饰)
<400>12
ccgtgtgctacatctaagtataggactatgttatattgggcacacggct49
<210>13
<211>41
<212>DNA
<213>SNP2合成靶标(RHG-SNP2-模板-C-41)
<400>13
gttggaatcaagtgtgctcagggacaggttattgtgatcca41
<210>14
<211>38
<212>DNA
<213>用于SNP2的靶标探针(RHG-SNP2-探针-38)(5′-磷酸修饰)
<400>14
gggacaggatcttgcgcggatcacaataacctgtccct38
<210>15
<211>49
<212>DNA
<213>用于SNP2的检测探针(Univ-CA)(5′-磷酸修饰)
<400>15
ccgtgtgctacatctaagtataggactatgttatattgggcacacggca49
<210>16
<211>38
<212>DNA
<213>SNP3合成靶标(RHG-SNP3-模板-C-38)
<400>16
aatttgatcctagatcataactttttcactggtgacgt38
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<211>46
<212>DNA
<213>NP3的靶标探针(RHG-SNP3-探针-46)(5′-磷酸修饰)
<400>17
taactttttcacatcttgcgcggcacgtcaccagtgaaaaagttat46
<210>18
<211>39
<212>DNA
<213>SNP4合成探针(RHG-SNP4-模板-C-39)
<400>18
agtccctccagttgctgctggttgatgttgaagcaggtg39
<210>19
<211>41
<212>DNA
<213>NP4的靶标探针(RHG-SNP4-探针-41)(5′-磷酸修饰)
<400>19
ggttgatgatcttgcgcggcagcctgcttcaacatcaacca41
<210>20
<211>18
<212>DNA
<213>Univ-引物2
<400>20
atgttatattgggcacac18
<210>21
<211>15
<212>DNA
<213>用于SNP1的基因特异性引物
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ccagaagggttcttg15
<210>22
<211>15
<212>DNA
<213>用于SNP2的基因特异性引物
<400>22
caggttattgtgatc15
<210>23
<211>16
<212>DNA
<213>用于SNP3的基因特异性引物
<400>23
ctttttcactggtgac16
<210>24
<211>16
<212>DNA
<213>用于SNP4的基因特异性引物
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gttgatgttgaagcag16
<210>25
<211>30
<212>RNA
<213>合成的RNA靶序列1(SNP2-模板-RNA-C)
<400>25
gugcucagggacagguuauugugauccagc30
<210>26
<211>37
<212>DNA
<213>合成的RNA靶序列2(玉米-28S-探针-G)(5′-磷酸修饰)
<400>26
cgcctgtcatcctccatgctcgggtcccgacaggcgt37
<210>27
<211>37
<212>RNA
<213>合成的RNA靶序列3(玉米-18S-模板)
<400>27
gcaggcgauccuccaugcgguaauuugcgcgccugcu37
<210>28
<211>37
<212>DNA
<213>合成的RNA靶序列4(玉米-18S-探针-G)(5′-磷酸修饰)
<400>28
gcaggcgatcctccatgcggtaatttgcgcgcctgct37
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<211>57
<212>DNA
<213>包含T7启动子序列的检测探针(T7-发夹-3)(5′-5磷酸修饰)
<400>29
ctccctatagtgagtcgtattaatcctccatgctaatacgactcactatagggagca
57
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<212>DNA
<213>包含T7启动子序列的双链检测探针有义链(5′-磷酸修饰)
<400>30
ctccctatagtgagtcgtatta22
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<211>24
<212>DNA
<213>包含T7启动子序列的双链检测探针反义链
<400>31
taatacgactcactatagggagca24
Claims (20)
1.用于检测样品中所含有的多核苷酸分析物中靶序列存在情况的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在有效形成分析物与探针的双链复合物的条件下，将样品与靶标探针混合，所述靶标探针含有能与靶序列杂交的序列；
(b)在存在聚合酶及四种可能核苷三磷酸中选定的一至三种的情况下使该复合物中的探针发生反应，从而向该探针的3'末端添加一个或多个由靶标指导的核苷酸碱基，以产生经修饰探针；
(c)使所述经修饰探针与检测探针杂交，其中该检测探针不与靶标杂交，且这两种探针中的至少一种具有粘末端，所述粘末端具有与另一探针3'末端或5'末端的单链部分互补的单链部分；
(d)通过该反应将所述两种探针连接起来，以形成两探针连接产物；和
(e)检测该连接产物的存在情况；
用于检测样品中一种或多种多核苷酸中的多个目的靶序列，其中将所述样品与多种靶标探针混合，每种靶标探针均为单链多核苷酸，其具有能与样品多核苷酸的某区域形成双链复合物的发夹环结构，其中步骤(a)包括将该样品分成两个或更多个样品等分试样，并将每个样品等分试样与所述多种靶标探针混合，步骤(b)包括在聚合酶存在下使每个样品等分试样与四种不同核苷三磷酸中选定的一至三种发生反应，每个等分试样使用四种不同核苷三磷酸中一至三种的不同组合，步骤(c)包括使所述经修饰探针与等分试样特异性检测探针杂交，步骤(d)包括通过反应使该经修饰探针与等分试样特异性检测探针连接，形成连接产物，步骤(e)包括在检测前扩增每个等分试样的连接产物；
其中步骤(e)包括在通过与附着在固体表面上的探针杂交来进行检测之前混合每个等分试样的额外步骤；
其中所述多种靶标探针在反应管中在固体表面合成，从固体表面上释放所述多种靶标探针形成了多种靶标探针的混合物；
其中步骤(e)包括在检测前将每个等分试样中的连接产物分成两个或更多个等分试样并用特异性引物扩增每个等分试样的额外步骤；
所述方法用于检测样品中的多种多核苷酸分析物以进行蛋白质结合测定，其中将所述样品与多种蛋白质结合剂孵育，以形成多种结合有蛋白质的多核苷酸分析物，其中步骤(a)包括将多种结合有蛋白质的多核苷酸分析物与多种靶标探针混合，以产生多种杂交复合物，步骤(b)在聚合酶存在下使该杂交复合物与四种不同核苷三磷酸中选定的一至三种发生反应，以产生经修饰探针，步骤(c)包括使该经修饰探针与检测探针杂交，步骤(d)包括通过反应使该经修饰探针与检测探针连接，以形成连接产物，步骤(e)包括将连接产物分成两个或更多个等分试样，并用特异性引物扩增每个等分试样以产生扩增子，并检测每种扩增子。
2.权利要求1的方法，其中步骤(b)包括通过变性或者降解靶标使所述经修饰探针从靶标上解离的额外步骤。
3.权利要求1的方法，其中在步骤(b)的聚合反应之前或之后所述靶标探针具有粘末端，该粘末端的单链部分含有一个或多个核苷酸。
4.权利要求1的方法，其中步骤(c)的检测探针和经修饰探针均为具有彼此互补的粘末端的单链多核苷酸，并且步骤(d)中形成的所述两探针连接产物为环状单链多核苷酸。
5.权利要求4的方法，其中步骤(d)包括在连接反应后消化任何线性探针及靶标的额外步骤。
6.权利要求1的方法，其中步骤(a)中靶标探针的量以摩尔计显著地过量于靶标分析物的量，并且该方法还包括重复进行步骤(a)和(b)以增加所述样品中存在的经修饰探针，所述重复进行步骤(a)和(b)包括在每个步骤(b)之后加热样品以从所述靶标多核苷酸上释放经修饰探针，以及包括作为每个步骤(a)之一部分的使样品冷却，以使未反应的靶标探针与所述靶序列杂交。
7.权利要求1的方法，其用于检测1至6个碱基的目的靶标区，例如SNP或位置已知的点突变，其中所述靶标探针具有与所述目的靶标区部分互补或毗邻该目的靶标区的3'末端核苷酸碱基，并且其中进行步骤(b)以使所述经修饰探针的3'末端序列与所述目的靶标区互补。
8.权利要求1的方法，其中所述检测连接产物的存在情况包括使用该连接产物作为模板进行扩增，以产生可检测的扩增子。
9.权利要求1的方法，其中所述靶标探针或检测探针之一附着在固体支持物上，步骤(d)中产生的连接产物也附着在该固体支持物上，检测连接产物存在情况的步骤(e)包括检测该连接产物在该支持物上的存在情况。
10.权利要求1的方法，其用于蛋白质结合测定，其中所述多核苷酸分析物负载在蛋白质结合剂上。
11.权利要求1的方法，其中检测步骤(d)中产生的连接产物包括扩增该连接产物以产生扩增子，接着使该扩增子与附着在固体表面上的探针杂交。
12.权利要求1的方法，其中所述靶标多核苷酸为RNA多核苷酸，所述聚合酶为逆转录酶聚合酶，通过向单个反应管中加入反应步骤(a)至(e)所需的组分来进行这些步骤，并在基本等温的条件下进行这些步骤。
13.权利要求12的方法，其中步骤(b)包括在形成经修饰探针的过程中或形成之后降解RNA分析物。
14.权利要求12的方法，其中步骤(a)中靶标探针的量以摩尔量计显著地过量于靶标分析物的量，并且该方法还包括重复进行步骤(a)和(b)以增加所述样品中存在的经修饰探针，其中重复进行步骤(a)和(b)包括在每个步骤(b)之后加热样品以从靶标多核苷酸上释放经修饰探针，以及包括作为每个步骤(a)一部分的使样品冷却，以使未反应的靶标探针与所述靶序列杂交。
15.权利要求12的方法，其中所述检测探针包含启动子，步骤(d)的连接产物含有该启动子序列，步骤(e)包括用启动子依赖性聚合酶使所述两探针连接产物在有效启动合成含有该靶标探针序列的转录物的条件下进行反应，并检测该转录物的存在情况。
16.权利要求15的方法，其中检测步骤(e)中转录物的存在情况包括使该转录物与用于产生该转录物的反应介质中所包含的分子信标探针发生反应。
17.权利要求15的方法，其中还包括重复进行步骤(a)至(e)，其中步骤(a)的靶序列由所述转录物提供。
18.用于检测RNA分析物中靶序列存在情况的试剂盒，所述RNA分析物例如RNA病毒基因组、siRNA或miRNA，该试剂盒包含：
(a)单链DNA靶标探针，其具有能在有效形成分析物-探针双链异源双链体复合物的条件下与所述RNA靶标序列杂交的序列；
(b)逆转录酶；
(c)四种可能的核苷三磷酸中的一种至三种；
(d)带有包含单链部分的粘末端的单链DNA检测探针，所述单链部分与在所述靶标探针3'末端序列添加了选定核苷酸之后的所述靶标探针3'末端序列互补，其中所述检测探针(i)不与靶标杂交并且(ii)含有启动子区；
(e)聚合酶；和
(f)能由此产生可检测信号的检测标记，
其中向反应管中加入RNA分析物和含水介质并加入试剂盒组分会有效起始反应，从而(a)形成分析物与靶标探针的双链复合物；(b)在靶标探针的3'末端添加选定的一个或多个由靶标指导的核苷酸碱基，并添加逆转录酶以产生经修饰探针；(c)将所述经修饰靶标探针与所述检测探针连接起来，以形成两探针连接产物；(d)扩增连接产物以产生含有分析物-靶标序列的扩增子；和(e)将检测标记与所述扩增子结合，以在该管中产生可检测信号。
19.权利要求18的试剂盒，其用于检测一种或多种RNA分析物中的多种目的靶序列，其中多种单链靶标探针能与所述多种靶序列形成杂交复合物，其中每个所述单链靶标探针均具有发夹环结构。
20.权利要求18的试剂盒，其中所述检测探针中的启动子序列为RNA聚合酶启动子，所述聚合酶为RNA聚合酶。
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