CN108179176B - 一种基于miRNA搭桥对两个互不重叠的扩增引物进行双向延伸检测miRNA的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于miRNA搭桥对两个互不重叠的扩增引物进行双向延伸检测miRNA的方法，属于医学生物技术领域。本发明在检测miRNA时有两条引物：扩增引物1与miRNA的3’端一半的序列互补，含T7启动子和标签序列；扩增引物2与miRNA的5’端一半的序列相同，含标签序列。在逆转录酶作用下依托miRNA搭桥可实现两条扩增引物的双向延伸，形成一个含有标签序列、miRNA、T7启动子的dsDNA分子。该分子在T7聚合酶的作用下转录出含有标签序列及miRNA的RNA分子，可根据标签分子对其进行定性分析。本方法具有高特异、高灵敏和高通量的特点，为以miRNA作为生物标志物的疾病诊断提供技术可能。
Description
技术领域
本发明涉及核酸分子检测领域，具体涉及一种基于miRNA搭桥对两个互不重叠的核苷酸片段进行双向延伸检测miRNA的方法及试剂盒。
背景技术
miRNAs在基因表达调控中非常重要，高达30％的哺乳动物的遗传基因的表达都有miRNAs的调控。到目前为止，在人类基因组中已发现超过1000种的miRNAs。成熟的miRNA是一类自然发生的、小的非编码RNA分子，其中许多miRNA分子仅仅只有一个或几个核苷酸的不同。miRNAs的表达具有组织特异性，且丰富度不同，具有几个数量级的差别。更重要的是，miRNA被认为在人类疾病的诊断中是最具潜力的生物标志。
miRNA与普通的RNA相比主要有如下三个特征：(1)miRNAs是很小的分子，约21-25核苷酸长，丰度有相当大的差异；(2)成熟的miRNAs与它们的前体及初前体同时存在；(3)许多miRNAs在序列上高度相关，如它们的不同亚型仅仅只有一个或几个核苷酸的不同。这些独特的性质给常规分析带来挑战，要么需要繁琐的分离miRNA的方法，要么特异性不高，无法将不同亚型区分，或者是检测敏感度低，无法检测低丰度的miRNAs。
由于miRNA太短，约为20核苷酸，无法直接通过常规引物进行扩增。通常需要在miRNAs末端添加一个尾巴，如poly(A)尾，然后再进行扩增。也可通过使用柄状环形引物与miRNA的一部分序列形成互补而进行cDNA延伸。这些方法在引物设计和检测效果上都有一些问题，如引物设计成本高，检测灵敏度不高，无法区分成熟miRNA和前体miRNA(pre-miRNA)等。
针对上述问题，有必要提供一种不仅能特异性的区分待测miRNA与待测miRNA相似的序列、目标miRNA的前体及同时检测多种miRNA，而且简单易行，能快速、高灵敏检测样品中miRNA的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高特异、高灵敏和高通量的、可同时检测多种miRNA的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种miRNA检测方法，包括步骤：
(1)扩增引物及稳定序列设计：
a.扩增引物1(命名为oligo1)：oligo1有两个部分，3’端与待检测的miRNA一半的序列互补配对，即通过10或11核苷酸长度与miRNA的3’端的半个分子杂交，5’端是T7启动子序列及标签序列(命名为ZC1和/或ZC2)，可根据标签序列ZC1或ZC2设计捕获探针和检测探针，用于对后续扩增产物的定性或定量检测，标签序列可根据需要进行设计，数量为1-2条，长度为16～20nt左右；T7启动子序列是T7聚合酶识别位点，用于后续的T7聚合酶转录；
b.稳定序列1：为了增加oligo1和待检测的miRNA杂交体的稳定性，引入稳定序列1，其与标签序列ZC1和/或ZC2、T7启动子序列部分互补配对结合；
c.扩增引物2(命名为oligo2)：与oligo1特征相似，有两个部分，3’端与待检测的miRNA的5’端序列相同(约10或11核苷酸长度)，与miRNA全长的cDNA序列互补配对结合；5’端含有一个标签序列ZC3，该标签序列可以用于后续扩增产物定性检测时包被探针或检测探针的设计；
d.稳定序列2：为了增加oligo2和新合成的miRNA-cDNA杂交体的稳定性，引入稳定序列2，其与标签序列ZC3互补配对结合；
(2)miRNA检测：
a.oligo1和待检测的miRNA3’端一半的序列结合，形成miRNA-oligo1复合物，为增加该复合物的稳定性，稳定序列1通过碱基互补配对的原则结合到该复合物上来，最终oligo1、稳定序列1以及miRNA通过融合效应(stacking effect)形成一个稳定的oligo1/miRNA杂合体，该杂合体在逆转录酶的作用下得到含全长miRNA分子cDNA的复合物由此实现miRNA的第一次延伸；
b.以上复合物在RnaseH的作用下，oligo1/miRNA杂合体中的miRNA会被降解，形成oligo1-miRNA～cDNA；
c.oligo2和oligo1-miRNA-cDNA互补配对结合，形成oligo2-oligo1-miRNA～cDNA复合物；为增加该复合物的稳定性，稳定序列2通过碱基互补配对的原则结合到该复合物上来，最终Oligo2、稳定序列2、稳定序列1以及oligo1合成的miRNA～cDNA通过融合效应(stacking effect)形成一个稳定的杂合体，在逆转录酶的作用(以DNA为模板合成DNA的活性)下得到含有T7启动子序列、标签序列以及miRNA分子全长的双链DNA，此为第二次延伸；
d.在(c)中形成的双链DNA序列结构为T7启动子--ZC2--ZC1--miRNA～cDNA--ZC3，该双链DNA可以通过TMA或NASBA方法进行RNA扩增，得到序列为ZC2--ZC1--miRNA～cDNA--ZC3的RNA分子；
e.检测所述RNA的扩增产物的存在与否和/或数量，从而得出待测的miRNA的检测结果。
在另一优选例中，上述步骤(1)a中oligo1的5’端是T7启动子序列及标签序列ZC1和ZC2，步骤(1)b中稳定序列1与标签序列ZC1和ZC2、T7启动子序列部分互补配对结合。
在另一优选例中，上述步骤(2)e中所述的检测结果为定性或定量结果。
在另一优选例中，步骤(2)e中检测所述RNA的扩增产物的方法包括分子信标、平板杂交-信号放大、或者核酸胶体金检测。
在另一优选例中，步骤(2)e中检测所述RNA的扩增产物的方法为平板杂交-信号放大检测，具体为根据标签序列(如ZC3)设计捕获探针，该捕获探针可以和ZC3互补配对结合，进而可以将扩增的RNA分子固定在微孔板中或其他固相载体上；再根据标签序列(如ZC1、ZC2)设计检测探针，该检测探针可以和ZC1和ZC2碱基互补配对结合，检测探针可以标记上生物素，进而将生物素标记到扩增出的RNA分子上，后续可依次添加链霉亲和素-HRP酶(Strep-HRP)、化学发光底物，最终通过化学发光的方法检测扩增产物的有无或数量，进而判断miRNA的检出情况。
在本发明的第二方面，提供了一种用于检测miRNA的试剂盒，所述试剂盒含有：
a.扩增引物1(命名为oligo1)：oligo1有两个部分，3’端与待检测的miRNA一半的序列互补配对，即通过10或11核苷酸长度与miRNA的3’端的半个分子杂交，5’端是T7启动子序列及标签序列(长度在16～20nt左右，命名为ZC1和/或ZC2)；
b.稳定序列1：与标签序列ZC1和/或ZC2、T7启动子序列互补配对结合；
c.扩增引物2(命名为oligo2)：有两个部分，3’端与待检测的miRNA的5’端序列相同(约10或11核苷酸长度)，与miRNA全长的cDNA序列互补配对结合；5’端含有一个标签序列ZC3；
d.稳定序列2：与标签序列ZC3互补配对结合。
在另一优选例中，上述的试剂盒还含有一种或多种以下组分：
(1)扩增酶混合液，包括AMV、T7聚合酶和RNaseH；
(2)用于显色反应的试剂。
在另一优选例中，所述的试剂盒中含有二种或多种针对不同miRNA的扩增引物1和扩增引物2。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
1、可高通量检测miRNA，根据不同miRNA设计不同扩增引物以及不同标签序列，可实现多个miRNA分子同时扩增的目的。
2、灵敏度高，该技术方法在检测miRNA时，灵敏度能够达到0.01fM级别。
3、特异性强，该技术方法能够区分一个碱基差异的不同miRNA分子，同时能够区分成熟miRNA与前体miRNA分子。
附图说明
图1显示了本发明方法的流程示意图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
【实施例1】胃癌细胞系中miRNA的检测
通用方法，本方法设计原理图如图1。
应用该技术检测胃癌细胞系(细胞株KATD，SUN-5)中miR-21、miRNA-34、miR-106等miRNA。
1)胃癌细胞株的培养及总RNA的提取
将胃癌细胞株KATD，SUN-5培养后，用Trizol的方法提取总RNA。
2)不同miRNA扩增所需oligo的设计
表1针对miR-21、miRNA-34、miR-106的检测体系
3)不同胃癌细胞miRNA的检测
A、miRNA的扩增
按照下列体系扩增miRNA：
癌细胞总RNA 2μL
扩增buffer(含oligo1及其稳定序列，
oligo2及其稳定序列)： 17μL
扩增酶混合液(AMV&T7聚合酶&RNaseH) 1μL
在42℃反应90min后，待检。
B、miRNA扩增产物的检测
用微孔板杂交法检测miRNA扩增产物，根据miRNA序列及ZC序列信息，在检测体系中检测探针和捕获探针会和扩增的miRNA产物结合，形成检测探针-miRNA产物-捕获探针复合物，该复合物会被微孔中包被的一段探针捕获并固定在微孔中。向微孔中再依次加入一段可以和检测探针结合的并标有biotin的探针、链霉亲和素-HRP酶，化学发光底物，最终发光检测。具体的，
(1)扩增产物固定杂交
杂交体系：
(2)弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的杂交洗涤液，共洗涤3次。
(3)每孔加入200μL封闭液，室温振荡1分钟。
(4)弃去孔内液体，每孔加入100μL链霉亲和素-HRP酶联物，室温震荡30分钟。
(5)弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的杂交洗涤液，共洗涤3次。
(6)配制底物溶液，底物A、底物B、底物稀释液(Tris缓冲液，pH8.5)按比例1：1：8混匀。
(7)每孔加入95μL底物溶液，孵育5分钟后，置于化学发光检测仪上进行相对光单位(RLU)测定。
4)结果
化学发光值：
| 细胞株 | miR-21 | miR-34 | miR-106 |
| KATD | 246413 | 202749 | 166840 |
| SNU-5 | 18325 | 215455 | 139008 |
| Blank | 1845 | 1170 | 1930 |
检出值与Blank比值大于5即为检测阳性，从检测结果看，该miRNA检测方法能够较好的检测出胃癌细胞株中的miRNA。
【实施例2】miRNA特异性的检测
选择miRNA let7家族的四个成员(序列如下表2)进行相关实验，针对每一种miRNA设计oligo，同时检测四种miRNA，以验证该方法检测miRNA的特异性。
表2 miRNA let7家族的四个成员序列
| miR-let-7b-5p | ugagguaguag guugugugguu |
| miR-let-7c-5p | ugagguaguag guuguaugguu |
| miR-let-7e-5p | ugagguaggag guuguauaguu |
| miR-let-7d-5p | agagguaguag guugcauaguu |
表3针对miRNA let7家族的四个成员的检测体系
A、miRNA的扩增
用每种miRNA的探针配制扩增体系，同时对四种miRNA进行扩增，具体扩增体系如下：
miRNA(10fM)： 2μL
扩增buffer(含oligo1及其稳定序列，
oligo2及其稳定序列)： 17μL
扩增酶混合液(AMV&T7聚合酶&RNaseH) 1μL
在42℃反应90min后，待检。
B、miRNA扩增产物的检测
用微孔板杂交法检测miRNA扩增产物，最终通过化学发光信号(RLU)的有无来检测miRNA扩增的结果，实验结果如下：
检出值与Blank比值大于5即为检测阳性，从检测结果看，该检测方法在检测不同亚型的miRNA时，具有很好的特异性。
【实施例3】miRNA灵敏度的检测
以miRNA let7家族成员中的miR-let-7b-5p进行相关实验，将合成好的miRNA溶解成100μM，然后进行10倍梯度稀释，对不同稀释度的miRNA进行检测，检测结果如下：
检出值与Blank比值大于5即为检测阳性，从检测结果看，本专利检测miRNA方法的灵敏度可以达到0.01fM级别。
序列表
<110> 斯格特生物（Signosis Inc）
<120> 一种基于miRNA搭桥对两个互不重叠的扩增引物进行双向延伸检测miRNA的方法
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taatacgact cactataggg agatcggaga acatggtcgg atacctcaac atcagt 56
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtatccgac catgttctcc gatctcccta tagtgagtcg tatta 45
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagggtgcga cactatctcg actagcttat cag 33
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcgagatag tgtcgcaccc tt 22
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gatacctcaa catcagtttt tgctcgactt gccaccgaat a 41
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<211> 36
<212> DNA
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<400> 7
atagtgtcgc accctttttt atagtgtcgc accctt 36
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<400> 8
tattcggtgg caagtcgagc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
taatacgact cactataggg agacctctag cagttgggca acgtaaacaa ccagct 56
<210> 11
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tacgttgccc aactgctaga ggtctcccta tagtgagtcg tatta 45
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttcaccgacc tatccatcgg gttggcagtg tctt 34
<210> 12
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<212> DNA
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acccgatgga taggtcggtg aa 22
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<212> DNA
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<400> 13
cctctagcag ttgggcattt tgctcgactt gccaccgaat a 41
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acgtaaacaa ccagcttttt gctcgacttg ccaccgaata 40
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atggataggt cggtgaattt tatggatagg tcggtgaa 38
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<400> 16
tattcggtgg caagtcgagc 20
<210> 17
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taatacgact cactataggg agaatgggtc gcagtcgtca accgtgctac ctgcact 57
<210> 18
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acggttgacg actgcgaccc attctcccta tagtgagtcg tatta 45
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<211> 34
<212> DNA
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<400> 19
acccgatgga taggtcggtg aaaaaagtgc ttac 34
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ttcaccgacc tatccatcgg gt 22
<210> 21
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atgggtcgca gtcgtcattt tgctcgactt gccaccgaat a 41
<210> 22
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
accgtgctac ctgcactttt tgctcgactt gccaccgaat a 41
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gacctatcca tcgggttttt gacctatcca tcgggt 36
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tattcggtgg caagtcgagc 20
<210> 25
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ugagguagua gguugugugg uu 22
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ugagguagua gguuguaugg uu 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ugagguagga gguuguauag uu 22
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
agagguagua gguugcauag uu 22
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<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
taatacgact cactataggg agatcggaga acatggtcgg ataccaacca cacaac 56
<210> 30
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggtatccgac catgttctcc gatctcccta tagtgagtcg tatta 45
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
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<400> 31
aagggtgcga cactatctcg acctactacc tca 33
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gtcgagatag tgtcgcaccc tt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tcggagaaca tggtcggttt tgctcgactt gccaccgaat a 41
<210> 34
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<212> DNA
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ataccaacca cacaactttt gctcgacttg ccaccgaata 40
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<212> DNA
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<210> 38
<211> 45
<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgtaaacca tacaactttt gctcgacttg ccaccgaata 40
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggataggtc ggtgaatttt tggataggtc ggtgaa 36
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tattcggtgg caagtcgagc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acggttgacg actgcgaccc attctcccta tagtgagtcg tatta 45
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acccgatgga taggtcggtg aactcctacc tca 33
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttcaccgacc tatccatcgg gt 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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accgtaacta tacaactttt gctcgacttg ccaccgaata 40
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
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<211> 20
<212> DNA
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<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
taatacgact cactataggg agaacccgat tggtgcagat acaccaacta tacaac 56
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acggttgacg actgcgaccc atggtgtatc tgcaccaatc gggt 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
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<400> 56
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
acaccaacta tacaactttt gctcgacttg ccaccgaata 40
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<400> 59
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<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
tattcggtgg caagtcgagc 20
Claims (8)
1.一种miRNA检测方法，所述方法为非诊断目的的，其特征在于，包括如下步骤：
（1）扩增引物及稳定序列设计：
a. 扩增引物1，命名为oligo1：oligo1有两个部分，3’端与待检测的miRNA一半的序列互补配对，即通过10或11核苷酸长度与miRNA的3’端的半个分子杂交，5’端是T7启动子序列及标签序列ZC1和/或ZC2，根据标签序列ZC1或ZC2设计捕获探针和检测探针，用于对后续扩增产物的定性检测，标签序列根据需要进行设计，数量为1-2条，长度为16~20个核苷酸；T7启动子序列是T7 聚合酶识别位点，用于后续的T7聚合酶转录；
b. 稳定序列1：为了增加oligo1和待检测的miRNA杂交体的稳定性，引入稳定序列1，其与标签序列ZC1和/或ZC2以及T7启动子序列部分互补配对结合；
c. 扩增引物2，命名为oligo2：与oligo1特征相似，有两个部分，3’端与待检测的miRNA的5’端序列相同，长度为10或11个核苷酸，与miRNA全长的cDNA序列互补配对结合；5’端含有一个标签序列ZC3，该标签序列用于后续扩增产物定性检测时捕获探针或检测探针的设计；
d. 稳定序列2：为了增加oligo2和新合成的miRNA-cDNA杂交体的稳定性，引入稳定序列2，其与标签序列ZC3互补配对结合；
（2）miRNA检测：
a. oligo1和待检测的miRNA 3’端一半的序列结合，形成miRNA-oligo1复合物，为增加该复合物的稳定性，稳定序列1通过碱基互补配对的原则结合到该复合物，最终oligo1、稳定序列1以及miRNA通过融合效应形成一个稳定的oligo1 /miRNA杂合体，该杂合体在逆转录酶的作用下得到含全长miRNA分子cDNA的复合物由此实现miRNA的第一次延伸；
b. 以上复合物在RnaseH的作用下，oligo1/miRNA杂合体中的miRNA会被降解，形成oligo1-miRNA~cDNA；
c. oligo2和oligo1-miRNA-cDNA互补配对结合，形成oligo2- oligo1-miRNA~cDNA复合物；为增加该复合物的稳定性，稳定序列2通过碱基互补配对的原则结合到该复合物，最终Oligo2、稳定序列2、稳定序列1以及oligo1合成的miRNA~cDNA通过融合效应形成一个稳定的杂合体，利用逆转录酶以DNA为模板合成DNA的活性，得到含有T7启动子序列、标签序列以及miRNA分子全长的双链DNA，此为第二次延伸；
d.在（c）中形成的双链DNA序列结构为T7 启动子--ZC2--ZC1--miRNA~cDNA--ZC3，该双链DNA通过TMA 或 NASBA方法进行RNA扩增，得到序列为ZC2--ZC1--miRNA~cDNA--ZC3的RNA分子；
e. 检测所述RNA 的扩增产物的存在与否和/或数量，从而得出待测的miRNA的检测结果。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）a中oligo1的5’端是T7启动子序列及标签序列ZC1和/或ZC2，步骤（1）b中稳定序列1与标签序列ZC1和/或ZC2以及T7启动子序列部分互补配对结合。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（2）e中所述的检测结果为定性或定量结果。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（2）e中检测所述RNA 的扩增产物的方法包括分子信标、平板杂交-信号放大、或者核酸胶体金检测。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）e中检测所述RNA 的扩增产物的方法为平板杂交-信号放大检测，具体为根据标签序列ZC3设计捕获探针，该捕获探针和ZC3互补配对结合，进而将扩增的RNA分子固定在微孔板中或其他固相载体上；再根据标签序列ZC1和/或ZC2设计检测探针，该检测探针和ZC1和/或ZC2碱基互补配对结合，检测探针标记上生物素，进而将生物素标记到扩增出的RNA分子上，后续依次添加链霉亲和素-HRP酶、化学发光底物，最终通过化学发光的方法检测扩增产物的有无或数量，进而判断miRNA的检出情况。
6.一种用于检测miRNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：
a. 扩增引物1，命名为oligo1：oligo1有两个部分，3’端与待检测的miRNA一半的序列互补配对，即通过10或11个核苷酸长度与miRNA的3’端的半个分子杂交，5’端是T7启动子序列及长度为16~20个核苷酸的标签序列ZC1和/或ZC2；
b. 稳定序列1：与标签序列ZC1和/或ZC2以及T7启动子序列互补配对结合；
c. 扩增引物2，命名为oligo2：有两个部分，3’端与待检测的miRNA的5’端序列相同，长度为10或11个核苷酸，与miRNA全长的cDNA序列互补配对结合；5’端含有一个标签序列ZC3；
d. 稳定序列2：与标签序列ZC3互补配对结合。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有一种或多种以下组分：
（1）扩增酶混合液，包括AMV逆转录酶、T7聚合酶和RNaseH；
（2）用于显色反应的试剂。
8.如权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有二种以上针对不同miRNA的扩增引物1、扩增引物2及对应的稳定序列。
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