CN111961730B - 基于硫代修饰环介导等温扩增法的miRNA检测试剂盒 - Google Patents

基于硫代修饰环介导等温扩增法的miRNA检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于硫代修饰环介导等温扩增法的miRNA检测试剂盒，由环介导扩增反应液、酶、引物和探针混合液、标准品组成。本发明以碱基硫代修饰的接头探针Linker A/B在目标miRNA存在下连接形成的哑铃状DNA作为扩增子，与同样部分碱基硫代修饰的FIP/BIP引物结合，引发LAMP指数级扩增，硫代修饰的DNA结构能进一步增强扩增效率，形成的扩增产物打开信号探针‑分子信标产生荧光信号，通过实时荧光定量PCR仪监测目标产物荧光信号，从而检测目标miRNA，具有稳定性强、特异性好、灵敏度高的特点。本发明可用于甲状腺乳头状癌患者血清中多种miRNA的检测，作为肿瘤标志物用于甲状腺乳头状癌的辅助诊断。

Description

基于硫代修饰环介导等温扩增法的miRNA检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及肿瘤等重大疾病患者生物样品(细胞、血清等)中miRNA浓度的检测新技术，尤其涉及基于硫代修饰的环介导等温扩增的miRNA检测试剂盒。能够为临床甲状腺癌等重大疾病的早期诊断，提供高灵敏的生物样品肿瘤标志物辅助判断依据。
背景技术
miRNA是一类长度约为20-25个核苷酸的单链非编码RNA分子，也是现代分子生物学用于鉴定多种细胞功能、生物学和病理学过程的重要生物标志物之一。miRNA通过碱基互补配对识别mRNA靶序列对基因转录进行转录后修饰调控，、干扰mRNA的翻译或导致mRNA的降解。miRNA可以调控人体2/3以上的蛋白编码基因。研究表明，miRNA参与多种生理学和病理学过程，包括癌细胞的扩增、生长、分化、代谢和调控。因此，miRNA不仅对于细胞生长、发育和分化有关的多种关键基因具有调控作用，并与包括癌症在内的多种人类疾病有关。
在不同的癌症组织中发现许多异常表达的miRNA参与了癌症的发病发展机理，如在乳腺癌、肺癌和结直肠癌和其它人类B淋巴细胞瘤中均发现miRNA有不同程度的上调或下调。miRNA既可作为抑癌基因(miR-200a、miR-15a、Let-7等)下调原癌基因的活性；也可作为癌基因(miR-155、miR-175p、miR-21等)下调抑癌基因的活性。因此，在癌症诊断和预后研究中，miRNA有望成为用于临床诊断和治疗的极具前景的生物标志物，对miRNA进行高特异和高灵敏检测具有重要的意义。
miRNA由于存在序列长度短，单细胞拷贝数变异大，体内丰度低，以及同一家族内序列相似性高等内源性特点，给生物体内miRNA检测带来了巨大的挑战，使得miRNA检测具有一定的局限性。传统的检测miRNA的方法有Northern印迹杂交、微阵列和茎环引物逆转率实时荧光定量PCR技术等。但每种方法都有其自身的缺点，如检测通量低、繁琐、耗时长、灵敏度低、容易出现假阳性结果等。基于传统方法的这些缺点，开发新型高灵敏、高特异的miRNA检测方法显得尤为重要。
基于等温核酸扩增的miRNA检测方法近年来受到越来越多的关注，该方法克服了一些传统方法的局限性，如其所需反应温度是恒定的，不需要PCR反应的变温循环，因此对实验操作技能和仪器设备的要求较低，为实验室研究开辟了新的空间，同时又提高了核酸扩增产量。其中LAMP是较为常用的等温扩增技术，由于其指数级的扩增特性，通常具有很高的灵敏度，该技术利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下进行靶标的识别和延伸，可在15-60分钟内实现109-1010倍的扩增，具有高特异、高灵敏、简单、便捷及低成本的特点，已广泛用于各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于硫代修饰环介导等温扩增法的miRNA检测试剂盒，试剂盒包括：环介导扩增反应液(含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物等)、酶(Bst2.0DNA聚合酶，SplintR连接酶)、引物和探针混合液(针对目标miRNA的接头探针，硫代引物，分子信标信号探针)、标准品(不同浓度的目标miRNA)。引物和探针混合液管需存放于棕色管。其中引物和探针混合液中的接头探针、硫代引物、信号探针的序列如下(下划线部分为硫代碱基)：
接头探针：
Linker A
AGCACCCTCAACATCGAAGCACTCGTGAAGAGGCTGTAAGGCAAGTTCGAAGCTGGATAGGCTTCGATGTTGAGGGTGCTACATCGTTACC，
Linker B
Phosphate AGACAGTGTTATGCTTCCCGTAATGCATGTGGCACCAATGTGCCTCTACAATTAGGATTTTCAACTGGTGTGAACTTTGTTGTTCAGCCAGTCCACATGCATTACGGGAAGCA，
硫代引物：
PS FIP引物
AGCACCCTCAACATCGAAGCACTCGTGAAGAGGCTGTA，
PS BIP引物
TGCTTCCCGTAATGCATGTGGACTGGCTGAACAACAAAGT，
信号探针：
FAM CACACCACTCTACAATTAGGATTTTCAACTGGTGTG BHQ。
本发明试剂盒可应用于甲状腺乳头状癌患者血清中多种miRNA的检测，作为肿瘤标志物用于甲状腺乳头状癌的辅助诊断。其中以部分碱基硫代修饰的接头探针Linker A/B在目标miRNA存在下连接形成的哑铃状DNA作为扩增子，与同样部分碱基硫代修饰的FIP/BIP引物结合，引发LAMP指数级扩增，硫代修饰的DNA结构能够进一步增强扩增效率，形成的扩增产物打开信号探针-分子信标产生荧光信号，通过实时荧光定量PCR仪监测目标产物荧光信号，从而检测目标miRNA，具有稳定性强、特异性好、灵敏度高的特点。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
(1)根据目标miRNA的基因序列设计接头探针Linker A/B；
(2)根据Linker A/B接头探针的来源序列设计扩增引物FIP/BIP，并对探针和引物的特定区域碱基进行硫代修饰，提高扩增效率；
(3)将已知浓度的目标miRNA做10倍梯度稀释，配制浓度为1amol/L～10nmol/L的溶液，在实时荧光定量PCR仪中进行LAMP反应，建立Ct值/miRNA浓度的工作曲线；
(4)收集生物样品(肿瘤细胞或甲状腺乳头状癌患者/健康人的血清)，并提取样本的miRNA；
(5)按照上述荧光定量LAMP检测方法检测样品中目标miRNA的含量；
本发明提供的miRNA试剂盒需于-20℃储存，尽量减少反复冻融；引物和探针混合液需避光条件保存。
本发明的另一个目的是提供所述一种miRNA检测试剂盒在生物样品miRNA浓度检测中的应用。本发明是一种基于硫代修饰环介导等温扩增的miRNA检测试剂盒。
本发明试剂盒的使用方法：在每次样品检测中均带随行标准曲线，通过检测样品在荧光定量PCR仪中的Ct值代入标准曲线来计算其中miRNA的浓度。
细胞样品中RNA提取
采用AxyPrepTM Multisource Total RNA Miniprep Kit(Axygen,AP-MN-MS-RNA-50)提取细胞样品中miRNA，过程如下：弃去培养皿中的培养基，直接加入300μL Buffer R-I，用移液枪吹打8下，转移至EP管中；用装有21号针头的注射器反复抽吸8次，充分裂解细胞。再加入110μL Buffer R-II，涡旋震荡30s后，4℃、12,000g离心5min。吸取上清液至新的EP管中，加入200μL异丙醇，吹打混匀后转移到制备管，4℃、6,000g离心1min，弃滤液。加入500μL Buffer W1A，静置1min后，4℃、12,000g离心1min，弃滤液。加入700μL Buffer W2，静置1min后，4℃、12,000g离心1min，弃滤液，并重复操作一次。将制备管放回离心管中，4℃、12,000g离心2min，去除残留的乙醇。将制备管转移至新的EP管，静置2min，加入50μLBuffer TE，静置1min后，4℃、12,000g离心1min；收集RNA，于-80℃保存备用。
血清样品中miRNA的提取
采用miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit(QIAGEN，217204)提取血清样品中miRNA，过程如下：取200μL血清或血浆样品加入60μL RPL buffer，震荡混匀(>5s)，室温静置3min，加入20μL RPP buffer，震荡混匀(>20s)，室温下孵育3min后12000g室温离心3min，使颗粒物沉淀(上清液为清澈透明无色液体)。将上清液(约230μL)转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，震荡混匀，将全部液体转移至RNeasy UCP MinElute吸附柱中，盖紧盖子，以大于8000g的转速离心15s，弃去收集管中的液体。向吸附柱中加入700μL RWTbuffer，盖紧盖子，以大于8000g的转速离心15s，弃去收集管中的液体。向吸附柱中加入500μL RPE buffer，盖紧盖子，以大于8000g的转速离心15s，弃去收集管中的液体。向吸附柱中加入500μL 80％乙醇，盖紧盖子，以大于8000g的转速离心2min，弃去收集管以及其中的液体。将吸附柱放入新的收集管中，打开吸附柱的盖子，以最大转速离心5min，使吸附膜上液体挥干，弃去收集管以及其中的液体。将吸附柱放入新的1.5ml的收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20μL RNase-free水，室温放置1min，盖紧盖子，以最大转速离心1min收集RNA，于-80℃保存备用。
样品中miRNA浓度的检测：
反应总体积为20μL。9μL连接反应混合溶液，其中包括8μL待测样品，1μL含有Linker A/B(各50fmol)、dNTP(10nmol)的SplintR缓冲液(50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,1mMATP,10mM DTT)，95℃加热5min，在冰上放置2min。随后将其加到含有4U SplintR连接酶,1.1pmol BIP/FIP引物,1.6pmol信号探针和4U Bst 2.0DNA聚合酶的Isothermal缓冲溶液(20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10mM KCl,2mM MgSO4,0.1％Triton X-100,pH 8.8)中形成20μL LAMP混合反应液。在ABI StepOnePlus荧光定量PCR仪上16℃孵育45min，随后进行LAMP扩增，LAMP扩增程序为60℃等温孵育，每隔2.5min采集数据30s，共进行40个循环。
荧光定量结果报告：①以不同浓度的目标miRNA标准品在本试剂盒中检测到的Ct值与miRNA浓度建立标准曲线，作为样品定量的标准。②检测样品的Ct值，根据所获得的标准曲线，计算待测样品中的miRNA浓度。
本发明为了克服现有的方法检测灵敏度低、繁琐、耗时长、容易出现假阳性结果等问题，提供了一种新型的miRNA检测新技术——基于硫代修饰的环介导等温扩增技术(PS-LAMP法)用于检测miRNA浓度的试剂盒。本发明试剂盒可用于超微量miRNA浓度的检测(成功用于肿瘤细胞和甲状腺乳头状瘤患者血清中miRNA检测，用于肿瘤辅助诊断)。本发明试剂盒是一种样品需求量少、灵敏度高、检测时间短、操作简便、适合推广的产品，是目前肿瘤早期诊断能够取得较大突破的正确方向之一。
附图说明
图1是本发明的原理图。
图2是本试剂盒中PS-LAMP检测方法的选择性。
图3是本试剂盒中PS-LAMP检测方法的标准曲线。
图4是本试剂盒中PS-LAMP法与经典Stem-loop RT-qPCR法标准曲线比较(Ct1和C1为PS-LAMP法Ct值和样品浓度，Ct2和C2为Stem-loop RT-qPCR法Ct值和样品浓度)。
图5是本试剂盒中PS-LAMP法和常规LAMP法标准曲线和荧光扩增曲线比较(图5A为PS-LAMP法和常规LAMP法标准曲线比较，其中Ct1和C1为PS-LAMP法Ct值和样品浓度，Ct3和C3为常规LAMP法Ct值和样品浓度；图5B为PS-LAMP法荧光扩增曲线；图5C为常规LAMP法荧光扩增曲线)。
下面具体实施例结合附图对本发明进行进一步阐述，但这些实施例仅限于说明本发明而不限制本发明的范围。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
一种基于硫代修饰的环介导等温扩增法的miRNA检测试剂盒，基于硫代修饰环介导等温扩增实现对目标miRNA浓度的检测。选取miR-200a作为检测对象为例，将目标miRNA的互补序列分为两部分，分别设计到两条接头探针Linker A/B的发夹结构DNA上，当目标miRNA出现时，两条Linker探针各自与miRNA杂交，互相靠近，并在SplintR连接酶作用下连接形成两端均有茎环结构的哑铃形扩增子。在反应体系中加入扩增引物(PS FIP/BIP)，使扩增子与内部引物结合，在具有链置换活性的Bst 2.0DNA聚合酶驱动下启动DNA合成，形成新的发夹结构并延伸，进行循环的扩增和链置换过程，最终产生包含重复序列和多个环的花椰菜状DNA产物(图1)。根据研究团队前期的LAMP检测方法研究，对LAMP扩增内部引物特定区域进行硫代修饰，降低中间产物LAMP loop的相变温度，进而形成自组装扩增，增强LAMP扩增效率。此PS-LAMP扩增反应过程中会产生大量扩增子，这些具有许多茎环结构的扩增子序列可分为四种类型，我们选择了一种茎环结构作为识别单元，根据茎环结构环上碱基，设计了信号探针，当扩增产物中的茎环结构与信号探针的环序列碱基互补配对时，信号探针打开发出荧光信号，实现对扩增产物的定量检测，并且该信号探针具有高选择性，可区分单核苷酸碱基差异。试剂盒包括：环介导扩增反应液(含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物等)、酶(Bst 2.0DNA聚合酶，SplintR连接酶)、引物和探针混合液(针对目标miRNA的接头探针，硫代引物，分子信标信号探针)、标准品(不同浓度的目标miRNA)。引物探针混合液管需存放于棕色管。
环介导扩增反应的接头探针、内部引物以及相应的分子信标信号探针序列如下(下划线部分碱基为硫代)：
接头探针：
Linker A
AGCACCCTCAACATCGAAGCACTCGTGAAGAGGCTGTAAGGCAAGTTCGAAGCTGGATAGGCTTCGATGTTGAGGGTGCTACATCGTTACC，
Linker B
Phosphate AGACAGTGTTATGCTTCCCGTAATGCATGTGGCACCAATGTGCCTCTACAATTAGGATTTTCAACTGGTGTGAACTTTGTTGTTCAGCCAGTCCACATGCATTACGGGAAGCA。
硫代引物：
PS FIP引物
AGCACCCTCAACATCGAAGCACTCGTGAAGAGGCTGTA。
PS BIP引物
TGCTTCCCGTAATGCATGTGGACTGGCTGAACAACAAAGT。
信号探针：
FAM CACACCACTCTACAATTAGGATTTTCAACTGGTGTG BHQ。
本发明提供的miRNA检测试剂盒需于-20℃储存，尽量减少反复冻融；引物和探针混合液需避光条件保存。
实施例2
1.材料与方法
1.1引物与探针
本试剂盒中LAMP引物由PrimerExplorer V5(http://primerexplorer.jp/ lampv5e/index.html)设计。引物和探针序列如下(下划线部分碱基为硫代)：
接头探针：
Linker A
AGCACCCTCAACATCGAAGCACTCGTGAAGAGGCTGTAAGGCAAGTTCGAAGCTGGATAGGCTTCGATGTTGAGGGTGCTACATCGTTACC，
Linker B
Phosphate AGACAGTGTTATGCTTCCCGTAATGCATGTGGCACCAATGTGCCTCTACAATTAGGATTTTCAACTGGTGTGAACTTTGTTGTTCAGCCAGTCCACATGCATTACGGGAAGCA。
硫代引物：
PS FIP引物
AGCACCCTCAACATCGAAGCACTCGTGAAGAGGCTGTA，
PS BIP引物
TGCTTCCCGTAATGCATGTGGACTGGCTGAACAACAAAGT。
信号探针：
FAM CACACCACTCTACAATTAGGATTTTCAACTGGTGTG BHQ。
所有DNA序列均由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2细胞样品中RNA提取
采用AxyPrepTM Multisource Total RNA Miniprep Kit(Axygen,AP-MN-MS-RNA-50)提取细胞样品中miRNA，过程如下：弃去培养皿中的培养基，直接加入300μL Buffer R-I，用移液枪吹打8下，转移至EP管中；用装有21号针头的注射器反复抽吸8次，充分裂解细胞。再加入110μL Buffer R-II，涡旋震荡30s后，4℃、12,000g离心5min。吸取上清液至新的EP管中，加入200μL异丙醇，吹打混匀后转移到制备管，4℃、6,000g离心1min，弃滤液。加入500μL Buffer W1A，静置1min后，4℃、12,000g离心1min，弃滤液。加入700μL Buffer W2，静置1min后，4℃、12,000g离心1min，弃滤液，并重复操作一次。将制备管放回离心管中，4℃、12,000g离心2min，去除残留的乙醇。将制备管转移至新的EP管，静置2min，加入50μLBuffer TE，静置1min后，4℃、12,000g离心1min；收集RNA，于-80℃保存备用。
1.3血清样品中miRNA的提取
采用miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit(QIAGEN，217204)提取血清样品中miRNA，过程如下：取200μL血清或血浆样品加入60μL RPL buffer，震荡混匀(>5s)，室温静置3min，加入20μL RPP buffer，震荡混匀(>20s)，室温下孵育3min后12000g室温离心3min，使颗粒物沉淀(上清液为清澈透明无色液体)。将上清液(约230μL)转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，震荡混匀，将全部液体转移至RNeasy UCP MinElute吸附柱中，盖紧盖子，以大于8000g的转速离心15s，弃去收集管中的液体。向吸附柱中加入700μL RWTbuffer，盖紧盖子，以大于8000g的转速离心15s，弃去收集管中的液体。向吸附柱中加入500μL RPE buffer，盖紧盖子，以大于8000g的转速离心15s，弃去收集管中的液体。向吸附柱中加入500μL 80％乙醇，盖紧盖子，以大于8000g的转速离心2min，弃去收集管以及其中的液体。将吸附柱放入新的收集管中，打开吸附柱的盖子，以最大转速离心5min，使吸附膜上液体挥干，弃去收集管以及其中的液体。将吸附柱放入新的1.5ml的收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20μL RNase-free水，室温放置1min，盖紧盖子，以最大转速离心1min收集RNA，于-80℃保存备用。
1.4 PS-LAMP实验条件的优化
为了使空白样品与目标miRNA样品扩增产物荧光信号能达到最大区分效果，在相同的miRNA浓度条件下，连接酶、Linker A和Linker B的浓度、PS-FIP和PS-BIP的浓度、信号探针的浓度、连接酶的浓度和Bst 2.0DNA聚合酶的浓度等实验条件进行了优化，实验条件的改变会影响PS-LAMP反应的荧光值，选择最佳连接酶和接头探针、信号探针、引物和酶浓度。
1.5样品中miRNA浓度的检测
将目标miRNA标准品稀释到不同浓度，即1amol/L、10amol/L、100amol/L、1fmol/L、10fmol/L、100fmol/L、1pmol/L、10pmol/L、100pmol/L、1nmol/L、10nmol/L，用本试剂盒进行PS-LAMP法检测，以目标miRNA浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。
2结果
2.1 PS-LAMP检测反应体系及反应条件
反应总体积为20μL。9μL连接反应混合溶液，其中包括8μL待测样品，1μL含有Linker A/B(各50fmol)、dNTP(10nmol)的SplintR缓冲液(50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,1mMATP,10mM DTT)，95℃加热5min，在冰上放置2min。随后将其加到含有4U SplintR连接酶,1.1pmol BIP/FIP引物,1.6pmol信号探针和4U Bst 2.0 DNA聚合酶的Isothermal缓冲溶液(20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10mM KCl,2mM MgSO4,0.1％Triton X-100,pH 8.8)中形成20μL LAMP混合反应液。在ABI StepOnePlus荧光定量PCR仪上16℃孵育45min，随后进行LAMP扩增，LAMP扩增程序为60℃等温孵育，每隔2.5min采集数据30s，共进行40个循环。
2.2选择性实验
以miRNA-200a为研究对象，同时在相同条件下使用来自miR-200家族，且表现出高序列同源性的其他miRNA，例如miR-200b，miR-200c，miR-429，miR-141作为对照，进行干扰试验。当检测浓度为1fmol/L时，通过比较目标miR 200a和其他miR-200家族miRNA的Ct值来检查选择性。结果如图2所示，miR-200a的Ct值约为25，而其他miRNA的Ct值均大于35。表明PS-LAMP法能有效区分来自miRNA-200家族的其他与靶标具有相似序列的miRNA，具有较好的方法选择性。
2.4标准曲线的建立
以目标miRNA浓度的对数值为横坐标x，LAMP扩增曲线Ct值为纵坐标y绘制了标准曲线，如图3所示，miRNA浓度在1amol/L-10nmol/L范围内，该标准曲线线性良好(R2＝0.9881)。建立的PS-LAMP法可通过测定样品Ct值，实现目标miRNA浓度的定量检测。
实施例3
细胞中miRNA浓度检测
使用标准曲线法，将PS-LAMP法应用于HT 29人结肠癌细胞中提取的总RNA样品中miR-200a的含量测定，结果显示人结肠癌细胞总RNA(0.5μg/μL)中miR-200a的含量为0.65pmol/L，与stem-loop RT-PCR的测定结果吻合。
血清中miRNA浓度检测
将PS-LAMP法应用于血清中甲状腺乳头状癌新型miRNA肿瘤标志物的筛选，与健康人相比，在甲状腺乳头状癌患者血清中，miR-146显著增加，而miR-199显著降低，两种miRNA作为生物标志物，可有效筛选出甲状腺癌患者。如表1所示，利用该PS-LAMP方法测定了甲状腺乳头状癌患者和健康人(各18例)血清中miR-146和miR-199浓度。可采用二项logistic回归方程预测患有甲状腺乳头状癌的概率，其中，二项logistic回归方程为
Figure BDA0002704015200000091
其中C1和C2分别为血清中miR-146和miR-199的含量，当二项logistic回归方程中P值大于0.824时，患者可诊断为甲状腺乳头状癌，且与临床穿刺病理活检结果完全符合，说明该试剂盒可作为一种恶性肿瘤诊断试剂盒。
实施例4
将PS-LAMP法与现行的Stem-loop RT-qPCR法进行了比较，如图4所示，在对miR-200a的检测中，PS-LAMP法的检测范围为1amol/L–10nmol/L，标准曲线R2＝0.9881，检测限为1amol/L，现行的经典Stem-loop RT-qPCR法的检测范围为1pmol/L–10nmol/L，R2＝0.9992，检测限为1pmol/L。表明该试剂盒与经典Stem-loop RT-qPCR法相比检测浓度范围广，检测限更低，说明该试剂盒实用性良好。
同时，我们还将本试剂盒PS-LAMP法与未经过硫代修饰引物和探针的常规LAMP法进行对比，如图5所示，常规LAMP法检测范围为1fmol/L–1nmol/L，R2＝0.9727，检测限为1fmol/L，经过硫代修饰，检测方法的灵敏度大幅提高，检测时间缩短，实用性更好。
表1 患者和健康人血清中miR-146和miR-199浓度
Figure BDA0002704015200000092
Figure BDA0002704015200000101
序列表
<110> 浙江大学
<120> 基于硫代修饰环介导等温扩增法的miRNA检测试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 91
<212> DNA
<213> 根据目标miRNA序列设计的接头探针Linker A序列(人工序列Unknow)
<400> 1
agcaccctca acatcgaagc actcgtgaag aggctgtaag gcaagttcga agctggatag 60
gcttcgatgt tgagggtgct acatcgttac c 91
<210> 2
<211> 113
<212> DNA
<213> 根据目标miRNA序列设计的接头探针Linker B序列(人工序列Unknow)
<400> 2
agacagtgtt atgcttcccg taatgcatgt ggcaccaatg tgcctctaca attaggattt 60
tcaactggtg tgaactttgt tgttcagcca gtccacatgc attacgggaa gca 113
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 根据Linker A/B接头探针的来源序列设计的扩增引物FIP序列(人工序列Unknow)
<400> 3
agcaccctca acatcgaagc actcgtgaag aggctgta 38
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 根据Linker A/B接头探针的来源序列设计的扩增引物BIP序列(人工序列Unknow)
<400> 4
tgcttcccgt aatgcatgtg gactggctga acaacaaagt 40
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 根据Linker A/B接头探针的来源序列设计的检测探针分子信标序列(人工序列Unknow)
<400> 5
cacaccactc tacaattagg attttcaact ggtgtg 36
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 目标miRNA miR-200a序列(人工序列Unknow)
<400> 6
uaacacuguc ugguaacgau gu 22

Claims (2)

1.一种基于硫代修饰环介导等温扩增法的miRNA检测试剂盒，其特征在于，由环介导扩增反应液、酶、引物和探针混合液、标准品组成，其中引物和探针混合液由接头探针，硫代引物，信号探针组成；引物和探针混合液中的接头探针、硫代引物、信号探针的序列如下：
接头探针：
Linker A
AGCACCCTCAACATCGAAGCACTCGTGAAGAGGCTGTAAGGCAAGTTCGAAGCTGGATAGGCTTCGATGTTGAGGGTGCTACATCGTTACC，
Linker B
Phosphate AGACAGTGTTATGCTTCCCGTAATGCATGTGGCACCAATGTGCCTCTACAATT
AGGATTTTCAACTGGTGTGAACTTTGTTGTTCAGCCAGTCCACATGCATTACGGGAAGCA；
硫代引物：
PS FIP引物
AGCACCCTCAACATCGAAGCACTCGTGAAGAGGCTGTA，
PS BIP引物 TGCTTCCCGTAATGCATGTGGACTGGCTGAACAACAAAGT；
信号探针：
FAM CACACCACTCTACAATTAGGATTTTCAACTGGTGTG BHQ；
其中下划线部分为硫代碱基；其中环介导扩增反应液为氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶为Bst 2.0 DNA聚合酶、SplintR连接酶，标准品为不同浓度的目标miRNA。
2.根据权利要求1所述的miRNA检测试剂盒，其特征在于，引物和探针混合液管需存放于棕色管。
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