CN110241211B

CN110241211B - 诊断结直肠癌的分子组合标志物及检测试剂盒

Info

Publication number: CN110241211B
Application number: CN201910552941.9A
Authority: CN
Inventors: 康亚妮; 毛湛睿; 孙洁林; 张辉; 赵晖
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2019-06-25
Filing date: 2019-06-25
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2039-06-25
Also published as: CN110241211A

Abstract

诊断结直肠癌的分子组合标志物及检测试剂盒。本发明公开了一种microRNA hsa‑miR‑133a‑3p，hsa‑miR‑145‑5p，hsa‑miR‑1‑3p和hsa‑miR‑378d以及其对应靶基因MLEC，SET，PPIA，YY1作为结直肠癌诊断标志物及其应用，在人结直肠癌组织中表现为显著特异性高表达现象，能够明确清楚地表征结直肠肿瘤的发生。针对联合生物标志物hsa‑miR‑133a‑3p，hsa‑miR‑145‑5p，hsa‑miR‑1‑3p，hsa‑miR‑378d以及其对应靶基因MLEC，SET，PPIA，YY1的表达水平进行大规模检测，可以快速、便捷、准确及灵敏的预测和诊断结直肠癌的发生。

Description

诊断结直肠癌的分子组合标志物及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种诊断结直肠癌的分子组合标志物、对应靶基因及检测试剂盒。

背景技术

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，居西方国家癌症相关死亡的第二大原因。CRC肿瘤发生的机制是由染色体不稳定性和微卫星不稳定性引起的原癌基因和抑癌基因的遗传改变的累积，导致基因表达改变。而基因表达在不同的层面上受到严格的调控，在转录后调控水平上研究基因表达对深入研究结直肠癌发生发病机理具有十分重要的临床意义。

microRNA(miRNA)是一类长度为22nt左右的单链非编码小RNA分子，通过与靶mRNA分子结合而沉默其表达。miRNA通过调控基因的表达广泛参与机体生长、发育和疾病发生等各种生命过程。miRNA与多种细胞癌变的关系极为密切，根据miRNA的表达特征可以划分人类癌症并区分正常细胞和癌细胞，甚至能够鉴别出那些从外形上无法确定的癌细胞，用于癌症的诊断。研究表明，结直肠癌患者中一些已知的组织特异性miRNA，如let-7、miR-9、miR-17、miR-19、miR-21、miR-24和miR-155的下调，可作为CRC患者潜在的诊断和治疗生物标志物。

选择性多聚腺苷酸化是一种重要的转录后调控机制，被认为在包括结直肠癌在内的许多类型癌症中参与调解癌症相关基因的表达。选择性多聚腺苷酸化在不改变mRNA编码序列的情况下，使mRNA的3’UTR长度发生改变，可以产生更短的3'UTR，消除miRNA结合位点，使mRNA失去miRNA的抑制作用。选择性多聚腺苷酸化与miRNA表达在结直肠癌肿瘤组织与正常组织中存在显著差异，检测结直肠癌肿瘤不同分期、类型的个体中mRNA的多聚腺苷酸现象及相关miRNA表达水平，对在转录后调控尺度上研究结直肠癌的发生机制具有重要意义，也是结直肠癌诊断和靶向治疗的有效方式和重点方向之一。

目前关于结直肠癌的分子诊断标志物大多为基因表达、DNA甲基化、非编码RNA表达等。公告号为108949985B的已授权专利公开了一种环状RNA circ-WHSC作为结直肠癌诊断生物标志物的应用。公告号为106872590B的已授权专利公开了一种液相色谱串联质谱法检测组织亚油酸含量及4个亚油酸通路相关基因表达作为结直肠癌诊断生物标志物的应用。

从精准医学角度分析，现有的肿瘤诊断方式由于缺乏诊断标志物和靶点基因，导致其灵敏性和特异性较低。

从全基因组范围联合microRNA和选择性多聚腺苷酸化的测序数据精准筛选诊断标志物的方法尚未见报道。

目前关于多聚腺苷酸化相关的microRNA hsa-miR-133a-3p，hsa-miR-145-5p，hsa-miR-1-3p和hsa-miR-378d以及其对应靶基因MLEC,SET,PPIA,YY1作为结直肠癌发生及转移的联合诊断标志物尚未见报道。

因此，本领域的技术人员致力于基于microRNA hsa-miR-133a-3p，hsa-miR-145-5p，hsa-miR-1-3p和hsa-miR-378d以及其对应靶基因MLEC,SET,PPIA,YY1作为结直肠癌诊断标志物，在人结直肠癌组织中表现为显著特异性高表达现象，能够明确清楚地表征结直肠肿瘤的发生。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何提供一种基于miRNA表达水平变化、靶基因位点丢失、靶基因mRNA表达水平变化的结直肠癌诊断联合生物标志物。

为实现上述目的，本发明提供了一种microRNA hsa-miR-133a-3p，hsa-miR-145-5p，hsa-miR-1-3p，hsa-miR-378d和其相对应的靶mRNA MLEC，SET，PPIA，YY1组成的microRNA-mRNA组合物中任意一种或者两种以上的组合在制备治疗结直肠癌诊断药物中的应用。

microRNA hsa-miR-133a-3p，hsa-miR-145-5p，hsa-miR-1-3p和hsa-miR-378d中的任意一种或者两种以上的组合在制备治疗结直肠癌诊断药物中的应用。

mRNA MLEC，SET，PPIA和YY1中的任意一种或者两种以上的组合在制备治疗结直肠癌诊断药物中的应用。

本发明提供了一种诊断结直肠癌的microRNA生物标志物，包括hsa-miR-133a-3p，hsa-miR-145-5p，hsa-miR-1-3p，hsa-miR-378d中的任意一种或两种以上的组合。

本发明提供了一种诊断结直肠癌的mRNA标志物，包括MLEC，SET，PPIA和YY1中的任意一种或者两种以上的mRNA。

本发明提供了一种诊断结直肠癌的microRNA-mRNA生物标志物，包括microRNAhsa-miR-133a-3p，hsa-miR-145-5p，hsa-miR-1-3p，hsa-miR-378d和其相对应的靶mRNAMLEC，SET，PPIA，YY1组成的microRNA-mRNA组合物中任意一种或者两种以上的组合。

本发明还提供了一种用于结直肠癌检测的试剂盒，包括用于对hsa-miR-133a-3p，hsa-miR-145-5p，hsa-miR-1-3p，hsa-miR-378d中的任意一种或两种以上的组合进行检测的引物组，所述引物组包括反转录引物和正向引物。

本发明还提供了一种用于结直肠癌检测的试剂盒，包括用于对hsa-miR-133a-3p，hsa-miR-145-5p，hsa-miR-1-3p，hsa-miR-378d相对应的靶mRNA MLEC，SET，PPIA和YY1中的任意一种或者两种以上的组合进行检测的引物组，所述引物组包括正向引物和反向引物。

本发明还提供了一种联合microRNA-mRNA的鉴别结直肠癌的试剂盒，包括用于对hsa-miR-133a-3p，hsa-miR-145-5p，hsa-miR-1-3p，hsa-miR-378d和其相对应的靶mRNAMLEC，SET，PPIA，YY1组成的microRNA-mRNA组合物中任意一种或者两种以上的组合进行检测的引物组。

进一步的，所述引物组包括用于对hsa-miR-133a-3p，hsa-miR-145-5p，hsa-miR-1-3p和hsa-miR-378d中任意一种或两种以上的组合进行检测的反转录引物及正向引物，和用于对靶mRNA MLEC，SET，PPIA和YY1中任意一种或两种以上的组合进行检测的正向引物和反向引物。

技术效果

与现有技术相比，本发明首次发现hsa-miR-133a-3p，hsa-miR-145-5p，hsa-miR-1-3p，hsa-miR-378d以及其对应靶基因MLEC，SET，PPIA，YY1可作为结直肠癌联合诊断标志物，相对于正常组织，其在结直肠癌肿瘤中呈特异性高表达现象；

通过检测疑似结直肠癌患者活检样品的hsa-miR-133a-3p，hsa-miR-145-5p，hsa-miR-1-3p，hsa-miR-378d以及其对应靶基因MLEC，SET，PPIA，YY1的表达，可以快速、准确及灵敏的检测和诊断结直肠癌的发生。

联合3T-seq(3’UTR标签文库)技术和miRNA-seq技术，检测结直肠癌组织及癌旁正常组织中全基因组水平的miRNA表达谱和选择性多聚腺苷酸化模式，得到诊断标志物及其作用靶点。

针对联合生物标志物hsa-miR-133a-3p，hsa-miR-145-5p，hsa-miR-1-3p，hsa-miR-378d以及其对应靶基因MLEC，SET，PPIA，YY1的表达水平进行大规模检测时，可采用定制芯片的方式进行测序，便捷、高通量地完成检测。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的结直肠癌患者癌症组织和癌旁组织样品总RNA琼脂糖凝胶电泳结果；

图2是本发明的结直肠癌患者癌症组织和癌旁组织的3T-seq待测文库2100结果；

图3是本发明的结直肠癌患者癌症组织和癌旁组织的miRNA-seq待测文库2100结果；

图4是本发明的3T-seq文库测序原始数据的质检结果；

图5是本发明的miRNA-seq文库测序原始数据的质检结果；

图6是本发明的诊断标记物用于区分结肠癌样本和正常对照的ROC曲线图；

图7是本发明的hsa-miR-133a-3p和MLEC的联合分析结果；

图8是本发明的hsa-miR-145-5p和SET的联合分析结果；

图9是本发明的hsa-miR-1-3p和PPIA的联合分析结果；

图10是本发明的hsa-miR-378d和YY1的联合分析结果。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

本发明首次采用miRNA-seq技术与检测全基因组水平选择性多聚腺苷酸化的3T-seq技术(ZL 201410138517.7)联合分析的方法，对结直肠癌组织诊断标志物及其作用靶点进行筛选和检测，具有较好的研究意义和应用前景。

①联合分析高通量测序数据

1、通过联合3T-seq(3’UTR标签文库)技术和miRNA-seq技术，检测结直肠癌组织及癌旁正常组织中全基因组水平的miRNA表达谱和选择性多聚腺苷酸化模式；

2、对两种高通量测序数据分别进行分析，得到在结直肠癌组织中mRNA3’UTR区域缩短的基因以及出现显著表达差异的miRNA及其作用靶点。

3、对两种高通量测序数据进行联合分析，筛选诊断标志物标准：选择性多聚腺苷酸化引起的mRNA3’UTR缩短而丢失miRNA结合位点的miRNA-mRNA，同时miRNA与mRNA表达水平呈负相关。

4、最终发现4对miRNA-mRNA作为最终的诊断标记物，分别为hsa-miR-133a-3p和MLEC,hsa-miR-145-5p和SET,hsa-miR-1-3p和PPIA以及hsa-miR-378d和YY1。

②利用qPCR法对收集的人临床结直肠癌组织及癌旁组织进行检测：

1、设计并合成hsa-miR-133a-3p和MLEC,hsa-miR-145-5p和SET,hsa-miR-1-3p和PPIA以及hsa-miR-378d和YY1的qPCR引物；

2、分别提取组织样品RNA；反转录后利用合成的引物进行qPCR，采用相对定量法检测结直肠癌癌症组织与癌旁组织中4对miRNA-mRNA的表达水平变化。

实施例1通过3T-seq与miRNA-seq联合分析的高通量测序法筛选诊断标志物：

1、组织研磨

1)将组织研磨所需用到的研钵、研磨杵、剪刀、手术刀、镊子、勺子清洗干净，于60℃烘箱烘烤3h后包好锡箔纸，在180℃烘箱内烘烤过夜；

2)进行组织研磨前上述用品均经需要过液氮预冷；

3)取出经过保存于液氮的临床样品，切取黄豆大小的组织块放入预冷好的研钵中，研磨，同时不断的少量多次地补充液氮，直至研磨至粉状，这个过程一般需要10min-15min；

4)研磨至粉状后，加入适量的预冷TRIzoI继续进行研磨，使得组织粉末和TRIzol充分混匀；

5)待TRIzol完全融化后转移至做好标记的1.7mL DNase/RNase Free的离心管中，开始进行RNA抽提，若不马上使用则冻于-80℃超低温冰箱内。

2、总RNA的抽提与质检

采用TRIzol说明书中分离RNA的方法进行总RNA的提取，具体步骤如下：

1)将装有经过TRIzol裂解的组织的离心管置于室温平衡5min；

2)按每毫升TRIzol加0.2mL氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，上下剧烈震荡15s，之后静置5min，4℃条件下12 000×g离心15min；

3)离心过后可看见明显的分层现象，小心吸取上清的无色水相，转移至新的1.7mLDNase/RNase Free离心管中，按0.5mL异丙醇/mL TRIzol的比例加入异丙醇，上下颠倒混匀，在室温下静置10min，4℃条件下12 000×g离心10min，可见管底有白色总RNA沉淀；

4)小心弃去上清，按每毫升TRIzol加1mL75％乙醇的比例加入75％乙醇洗涤沉淀，4℃条件下7 500×g离心5min；

5)吸去上清，空气干燥5min-10min，加入适量的DNase/RNase-Free无菌水溶解RNA沉淀，若不马上使用则冻于-80℃超低温冰箱内。

6)使用Nanodrop 2000对总RNA进行定量，之后用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

7)取2μL提取好的总RNA经过适当的稀释后用Nanodrop 2000定量，使用DNase/RNase-Free无菌水作为校准时的溶液。质量较好的总RNA A260/280的比值应该在2.0-2.2之间。

8)配制0.8％的琼脂糖凝胶，电泳缓冲液为0.5×TBE，120V恒压电泳15min，之后在凝胶成像仪上观察。如图1所示，以其中三位患者的癌症组织和癌旁组织样品RNA为例，其中C代表癌症组织，N代表癌旁组织，完整的RNA样品在电泳图中应该呈现出3条清晰的条带，由上至下分别代表了28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA。结果表明样品中的28S、18S、5S三条带均清晰可见，符合后续3T-seq技术和miRNA-seq技术建库要求。

3、构建3T-seq文库

1)Bio-GsuⅠ-Oligo(dT)₂₀包被磁珠

引物探针的合成及配制

合成带有生物素及硫代磷酸修饰的Bio-GsuⅠ-Oligo(dT)₂₀引物探针，加入DNase/RNase free的Tris-HCl(pH7.5)配置成100μmol/L浓度。吸取链霉亲合素标记的M280磁珠50μL加入RNase free的1.7mL离心管中，之后将离心管置于磁架上，直至磁珠全部富集到内壁。用移液器吸走清液，用100μL Binding Buffer 1重悬洗涤磁珠，之后再放于磁架上，磁珠全部吸附于离心管内侧后，吸去清液，共洗涤3次。之后将5μL的100μM的Bio-GsuⅠ-Oligo(dT)₂₀引物探针和95μL Binding Buffer 1混合后加入至装有预洗过的磁珠的离心管中，在旋转混匀仪上室温旋转混匀，孵育过夜。Binding Buffer 1的配方如表1所示(所用的试剂、各类耗材均为RNA级别)：

表1 Binding Buffer 1的配方

5mol/L NaCl	8mL
		0.5mol/L EDTA	2mL
RNase free water	10mL
		Total volume	20mL

2)mRNA逆转录合成一链cDNA

(1)mRNA的poly(A)尾巴与磁珠的结合

从旋转混匀仪上取下离心管，并将其置于磁架上，待溶液澄清后，吸去上清。之后取下离心管，用200μL Binding Buffer 2重悬与探针过夜孵育的GsuⅠ-Oligo(dT)₂₀磁珠，将重悬后的磁珠转移至新的1.7mL DNase/RNase free离心管中，再用Binding Buffer 2洗涤2次，每次200μL。

Binding Buffer 2的配方如表2所示(所用的试剂、各类耗材均为RNA级别)：

表2 Binding Buffer 2的配方

0.5mol/L EDTA(pH 8.0)	400μL
		0.1mol/L DTT	1mL
8mol/L LiCl	1.25mL
		1mol/L Tris-HCl(pH 7.0)	2mL
RNase free water	15.35mL
		Total volume	20mL

取大约50μg的总RNA至新的1.7mL DNase/RNase free离心管中。将离心管置于65℃热变性5min，完后立即插入冰中。之后加入Binding Buffer 2将总体积补充至1mL，再加至制备好的GsuⅠ-Oligo(dT)₂₀磁珠中，室温孵育10min。

(2)合成一链cDNA

将完成孵育的离心管插至磁力架上，待溶液完全澄清后，吸走清液。配置新鲜的Wash Buffer A和Wash Buffer B试剂，并使用这两种试剂依次洗涤磁珠，以除去未同磁珠结合的RNA。先用Wash Buffer A洗涤磁珠2次，每次500μL，之后用500μL Wash Buffer再洗涤1次磁珠。每次用Wash Buffer重悬磁珠后需要置于磁架上静置1min至溶液完全澄清。Wash Buffer A和Wash Buffer B的配方如表3和表4所示(所用的试剂、各类耗材均为RNA级别)：

表3 Wash Buffer A配方

10％SDS	211.8μL
		1mol/L Tris-HCl(pH 7.0)	200μL
0.5mol/L EDTA(pH 8.0)	40μL
		8mol/L LiCl	37.5μL
Glycogen(RNA级别,20mg/mL)	10μL
		RNase free water	19.163mL
Total volume	20mL

表4 Wash Buffer B配方

1mol/L Tris-HCl(pH 7.0)	200μL
		0.5mol/L EDTA(pH 8.0)	40μL
8mol/L LiCl	37.5μL
		Glycogen(RNA级别,20mg/mL)	10μL
RNase free water	19.375mL
		Total volume	20mL

磁珠洗涤完后开始进行cDNA第一链的合成。使用100μL 1×First-strandsynthesis Buffer润洗磁珠，共润洗4次。1×First-strand synthesis Buffer由Invitrogen公司的逆转录酶SuperScriptⅢReverse Transcriptase带有的5×First-strand Buffer稀释得到。

在PCR管中完成逆转录体系配制，逆转录体系配制如表5所示(所用试剂、各类耗材均为RNA级别)：

表5逆转录体系

*与常规dNTP不同，此处使用的dNTP mix是由dATP(100mmol/L)、dGTP(100mmol/L)、dTTP(100mmol/L)以及甲基化dCTP(10mmol/L)按照一定的比例混合得到的。

之后放入PCR仪中进行cDNA的一链合成。cDNA的反应程序设为37℃30min，之后42℃，30min。在cDNA一链合成的过程中每隔8min将PCR管从仪器中取出，暂停程序，轻弹混匀之后放回PCR仪内继续程序。反应完成后将PCR管插入冰中终止一链合成。

3)合成cDNA的二链

反应终止后将离心管置于磁力架上，待溶液澄清之后吸去清液。之后用WashBuffer 1洗涤磁珠，共洗涤3次，每次100μL。Wash Buffer 1配方如表6所示(所用试剂、各类耗材均为RNA级别)：

表6 Wash Buffer 1配方

5×First-strand Buffer	80μL
		0.1mol/L DTT	40μL
RNase free water	280μL
		Total volume	400μL

用30μL Wash Buffer 1重悬磁珠，之后在冰上配制二链合成试剂，二链合成反应体系配制如表7所示(所用试剂、各类耗材均为RNA级别)：

表7二链合成反应体系

10×Second-strand Buffer	25μL
		10mmol/L each dNTP mix*	5μL
E.coli DNA polymerase(10U/μL)	4μL
		E.coli DNA ligase(10U/μL)	1μL
RNase H(5U/μL)	1μL
		RNase free water	184μL
Total volume	220μL

*常规dNTP中的dCTP被dUTP取代，此处使用的dNTP由100mmol/L的dATP/dGTP/dTTP/dUTP按照相应的比例混合得到。

将配置好的二链合成体系与重悬好的磁珠混匀，放到恒温混匀仪(Thermomixercomfort)上，将震荡速率设定为1 000r/min，30s间歇。16℃反应2h。反应期间每隔10min检查离心管，轻弹混匀，防止磁珠全部沉降至管底。2h过后往离心管中加入15μL 0.5mol/LEDTA(pH 8.0)，之后将离心管插入冰中以终止反应。

将终止反应后的离心管放于磁架上，静置2min后移除清液。Wash Buffer C使用前预热至75℃，每次用200μL洗涤，共2次。之后用Wash Buffer D洗涤磁珠3次，每次用200μL洗涤。目的在于除去Wash Buffer C中的SDS,避免其影响下游的酶促反应。Wash Buffer C和Wash Buffer D配方分别如表8和表9所示：

表8 Wash Buffer C配方

5mol/L NaCl	4mL
		10％SDS	2mL
2.5mol/L Tris	40μL
		0.5mol/L EDTA(pH 8.0)	20μL
Glycogen(RNA grade,20mg/mL)	10μL
		ddH₂O	14mL
Total volume	20mL

表9 Wash Buffer D配方

5mol/L NaCl	4mL
		100×BSA(10mg/mL)	400μL
2.5mol/L Tris	40μL
		0.5mol/L EDTA(pH 8.0)	20μL
ddH₂O	15.6mL
		Total volume	20mL

4)随机断裂新合成的cDNA

将完成Wash Buffer D洗涤离心管置于磁力架上，用Wash Buffer 2润洗磁珠，每次100μL，共2次，使磁珠可以适应酶切体系。Wash Buffer 2随用随配。Wash Buffer2配方如表10所示：

表10 Wash Buffer 2配方

冰上配制片段化酶的反应体系，配方如表11所示：

表11片段化酶反应体系

10×Fragmentase Reaction Buffer	5μL
		100×BSA(10mg/mL)	0.5μL
ddH₂O	39.5μL
		Total volume	45μL

用片段化酶反应体系重悬磁珠，置于冰上5min后加入5μL双链DNA片段化酶(10000U/mL)。放入37℃的水浴锅中反应40min。反应期间每过8min从水浴锅中取出离心管，轻弹离心管以混匀体系，避免磁珠全部沉降至管底。40min孵育后再加入5μL 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，将离心管插入冰中以终止反应。

5)3’UTR末端从磁珠上的释放

(1)目的片段的释放

从冰中取出离心管并将其插至磁力架上，待磁珠全部富集后吸除清液。之后依使次用Wash Buffer 3和Wash Buffer 4洗涤磁珠。先使用Wash Buffer 3洗涤磁珠3次，每次100μL。之后用Wash Buffer 4洗涤2次，每次100μL。所用的Wash Buffer 3和Wash Buffer 4均需新鲜配制，具体配方如表12和13所示：

表12 Wash Buffer 3配方

10×buffer B(同GsuⅠ配套)	30μL
		100×BSA(10mg/mL)	6μL
ddH₂O	264μL
		Total volume	300μL

表13 Wash Buffer 4配方

10×buffer B(同GsuⅠ配套)	20μL
		0.5mmol/L SAM	4μL
ddH₂O	176μL
		Total volume	200μL

之后在冰上完成GsuⅠ的消化反应体系的配制，体系配方如表14：

表14消化反应体系

将配制好的消化反应体系加至装有磁珠的离心管中重悬。之后将离心管放置金属浴中进行酶切反应，30℃下反应2h。反应过程中每间隔8min取出离心管轻弹混匀。待2h之后将离心管置于磁架上室温静置，待溶液澄清后，吸取清液并转移至新的1.7mL离心管中。之后向离心管中加入100μL的TE(10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH 8.0)进一步洗脱文库，在磁力架上静置片刻后吸取出上清，并将之同之前的上清合并，所得即为3’端标签原始文库。

(2)纯化原始文库

使用苯酚氯仿异戊醇抽提的方法纯化原始文库，纯化的具体方法如下所示：

向包含着3’UTR标签原始文库的上清洗脱液中加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1,pH 8.0)，涡旋震荡充分混匀至液体呈乳白色后，室温13 000r/min离心5min。离心完成后小心的吸取上层的水相，转移至新的1.7mL离心管中。

之后依次加入吸取的上清2.5倍体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.2)以及1/100体积的Glycogen，颠倒混匀后于-80℃冰箱内冷冻30min或-20℃冰箱内冷冻过夜以辅助核酸的沉降。

沉降完成后在4℃条件下13 000r/min离心30min，在不干扰沉淀的条件下倒掉上清。之后使用75％乙醇洗涤沉淀，4℃条件下13 000r/min离心5min。弃去上清。将离心管放回离心机中，高速短暂离心后，吸去残留的液体，之后保持管盖打开的状态直至沉淀晾干。最后加入10μL 10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)重悬溶解沉淀。

6)高通量测序的文库构建

(1)cDNA末端修复及3’末端加A

使用快速末端修饰试剂盒来修复cDNA的末端，在PCR管中配制表15的反应体系：

表15快速末端修饰试剂盒来修复cDNA的末端的反应体系

原始文库	10μL
		10×End Repair Reaction Mix	5μL
End Repair Enzyme Mix	2.5μL
		E.coli DNA ligase(10U/μL)	0.5μL
ddH₂O	32μL
		Total volume	50μL

将PCR管放入PCR仪中，20℃反应5min，反应过程中保持热盖关闭。待反应结束后将反应体系转移至1.7mL离心管中，加入150μL ddH₂O将总体积提升至200μL，便于后续操作。使用苯酚氯仿抽提方法纯化DNA，纯化的步骤同原始文库的方法相同，最后用10μL 10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)重悬溶解沉淀。

之后进行3’末端加A，在PCR管中完成反应体系的配制，反应体系的组成如表16所示：

表16 3’末端加A的反应体系

末端修复后的DNA文库	10μL
		10×Ex Taq Buffer	3μL
10mmol/L dATP	2.5μL
		Ex Taq Enzyme(5U/μl)	0.5μL
ddH₂O	14μL
		Total volume	30μL

将PCR管放入PCR仪中，70℃反应30min，热盖温度设为85℃。待反应结束后将反应体系转移至1.7mL离心管中，加入170μL ddH₂O提升总体积至200μL，便于后续操作。使用苯酚氯仿抽提方法纯化DNA，具体步骤同纯化原始文库相同，最后用10μL 10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)重悬溶解沉淀。

(2)接Illumina公司高通量测序通用接头

上一步所获的DNA文库与制备好的Illumina高通量测序通用接头连接。在PCR管中完成连接反应体系的配制，反应体系的组成如表17：

表17反应体系的组成

末端修复后的DNA文库	10μL
		10×T4 DNA Ligase Buffer	2μL
50％PEG 4000	2μL
		P5/P7接头	2μL
T4 DNA Ligase	1μL
		ddH₂O	3μL
Total volume	20μL

混匀之后将PCR管放入PCR仪中，22℃反应3h，期间关闭热盖。反应结束后加入适量ddH₂O，将体系的体积补至20μL，便于后续操作。使用苯酚氯仿抽提方法纯化DNA，具体步骤同纯化原始文库相同，最后用10μL 10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)重悬溶解沉淀。

(3)胶回收纯化文库

配制2％的琼脂糖凝胶，所用的电泳缓冲液均为0.5×TBE，120V，电泳30min放于凝胶成像仪中观察，可观察到未连接的接头条带与文库的弥散条带充分分离。准确切取含200bp-500bp片段大小的DNA的胶块，放入新的经过称重的离心管中。产物用胶回收试剂盒(Zymo Research)参照其说明书进行回收，回收步骤如下所示：加入3倍体积ADB(例如100mg的琼脂糖凝胶加入300μL的ADB)。55℃孵育5min-10min至胶完全溶化。将溶化后的溶液转移至套在收集管上的离心柱中，13000r/min室温离心1min，弃去流出液。之后加入200μL DNAWash Buffer，同等转速离心30s，弃去流出液。最后加入适量的ddH2O，将离心柱放置于新的1.7mL离心管中，13 000r/min室温离心1min，离心管中收集到的液体即为回收到的合适大小的DNA。

(4)文库的放大与片段筛选

以胶回收得到的DNA文库为模板，使用高保真酶进行PCR反应，之后再次进行片段的筛选以得到可以进行测序的文库。

在PCR管中完成扩增体系的配制，其具体组成如表18：

表18扩增体系的反应组成

3’UTR标签文库	5μL
		5×Q5 Reaction Buffer	2μL
2.5mmol/L each dNTP Mix	2μL
		P5 primer(10μmol/L)	1μL
P7 primer(10μmol/L)	1μL
		Q5高保真DNA聚合酶(2U/μL)	0.3μL
USER Enzyme(1U/μL)	1.5μL
		ddH₂O	12.2μL
Total volume	25μL

混匀体系，将PCR管放入PCR仪中，热盖设为105℃，扩增程序如下所示：

通过2％的琼脂糖凝胶电泳，实现待测文库和接头片段、引物片段的分离。具体的凝胶配置方法、电泳条件以及切取的片段范围、胶块中的DNA回收与连接测序接头后的回收步骤相同。

(5)Qubit定量

取Qubit专用管并做好标记。准备working solution，即将

dsDNA HSReagent用

dsDNA HS Buffer按1:200的比例稀释。分别取190μL workingsolution加入两个管中，两管分别加入两种10μL

standard，涡旋混匀2s-3s。取198μLworking solution加入其它PCR管中，加2μL待测样品，涡旋混匀2s-3s；上述所有的管子接下来在室温中孵育2min。使用

3.0Fluorometer，进行样品的定量，选择加入的样品体积，之后将样品依次放入试样室中，进行读取，屏幕上显示的数值即为待测样品的浓度。

(6)2100质检

使用安捷伦的High Sensitivity DNA Kit进行2100质检，其具体流程参照说明书如下所示：

将高敏感性DNA染料浓缩液和高敏感性DNA凝胶基质放置于室温中避光平衡30min。之后将DNA染料浓缩液涡旋混匀10s，之后稍稍离心，保证DMSO完全融解。吸取15μLDNA染料至一个装有高敏感性DNA凝胶基质的小管中，盖上盖子，涡旋混匀10s后将彻底混合好的溶液转移至过滤器的离心柱中。室温6000r/min离心10min。丢弃滤器离心柱，避光4℃保存。

使用前将配置好的胶与染料的混合液放置室温避光平衡30min。从密封袋中取出新的高灵敏度芯片并放置到专门的架子上，吸取9μL凝胶-染料混合液加入芯片第三排右边侧的加样孔底部。确定架子上固定的活塞注射器中的活塞位于1mL处，盖好架子，按下注射器的柱塞直至达到柱塞上端达到固定的位置，用夹子卡住，并等待1min。之后打开夹子，柱塞被松开使其归位(至少归位至0.3mL的标记处)。再等待5s，慢慢地将柱塞拉回1mL的位置。打开盖子，在第四列剩余的3个加样孔中各加入9μL凝胶-染料混合液。在前3列每个加样孔中加入5μL绿盖中的DNA marker。在第4排第三个加样孔中加入1μL黄盖中的DNA ladder。前3列其余的11个加样孔中分别加入1μL的样品或DNA marker。将芯片水平放置在适配的IKA涡旋混匀仪上，2 400r/min混匀1min。打开软件、仪器，取出实验前放入其中的用于清洗电极的加有ddH₂O的芯片放入待测芯片。盖好盖子，运行软件。检测完毕后导出数据，取出芯片，并再次清洗电极。

图2为结直肠癌患者的癌症组织及癌旁组织的3T-seq待测文库2100的结果，结果均表明文库质量良好，可用于进行下一步数据分析。

在3T-seq文库的构建过程中，所用到的的引物探针和高通量测序接头序列如表19所示。

表19 3T-seq文库的引物探针和高通量测序接头序列

4、构建miRNA-seq文库

miRNA-seq文库用Illumina公司的TruSeq Small RNA Library Prep试剂盒，参照其说明书进行构建，其所用到的接头序列也参照该试剂盒中的说明书，具体步骤如下：1)3’接头连接

取1个PCR管置于冰盒上，加入5uL total RNA样品(1ug)+1uL RA3。吹打混匀，瞬离一次。将PCR管置于PCR仪上，70℃(100℃热盖)孵育2min后将PCR管取出放于冰盒上。

取1个新PCR管置于冰盒上，配置连接Mix A，具体组成如表20所示：

表20 3’接头连接体系

HML(Ligation Buffer)	2uL
		RNase Inhibitor(1uL/sample)	1uL
T4 RNA Ligase 2,Deletion Mutant(1uL/sample)	1uL
		Total volume	4μL

吹打混匀，瞬离一次。每管样品加入4uL连接Mix A，吹打混匀，终体积10uL；放在PCR仪中28℃孵育1h；之将PCR管取出，加入1uL STP(stop solution)，吹打混匀，28℃继续孵育15min。将PCR管取出放于冰盒上。

2)5’接头连接

取新PCR管，加入2.2uL(1uL/sample)RA5。置于PCR仪上70℃(100℃热盖)孵育2min。将PCR管取出放于冰盒上配置连接Mix B，具体组成如表21所示：

表21 5’接头连接体系

吹打混匀后将3uL连接Mix B加入样品管中，充分吹打混匀；放在PCR仪中28℃孵育1h。

3)反转录cDNA第一条链

将25mM dNTP Mix与Ultrapure water按1:1比例混匀配成12.5mM dNTP Mix备用。取2个新PCR管，分别加入对应6uL样品。每管加入1uL RNA RT Primer(RTP),吹打混匀，瞬离一次。置于PCR仪上70℃(100℃热盖)孵育2min。将PCR管取出放于冰盒上，PCR仪调至50℃；

取1个新PCR管置于冰盒上，配置反转录Mix，具体组成如表22：

表22反转录cDNA第一条链体系

5x First Strand Buffer	2μL
		12.5mM dNTP Mix	0.5μL
100mM DTT	1μL
		RNase Inhibitor	1μL
SuperScript II Reverse Transcriptase	1μL
		Total volume	5.5μL

吹打混匀，瞬离一次，每管样品加入5.5uL反转录Mix，吹打混匀，终体积12.5uL。置于PCR仪上50℃(100℃热盖)孵育1h后将PCR管取出放于冰盒上。

4)扩增文库

取2个新PCR管置于冰盒上，分别加入如表23所示的试剂配成PCR Master Mix：

表23扩增文库的体系

Ultrapure water	8.5μL
		PML(PCR Mix)	25μL
RP1(RNA PCR Primers)	2μL
		RPIX(RNA PCR Primer Index X)	2μL
Total volume	37.5μL

吹打混匀，瞬离一次，将37.5uL PCR Master Mix分别加入样品中，吹打混匀，终体积50uL。按以下程序进行PCR(热盖100℃)：

5)PAGE胶垂直电泳回收纯化文库

取2个新PCR管，分别将CRL(custom resolution ladder)、HRL(high resolutionladder)与DNA loading dye按2uL:2uL的比例混合，吹打混匀。分别将10uL DNA loadingdye加入2个样品管中，吹打混匀。取出预制PAGE胶(NEB)，安装好垂直电泳系统(白色胶条朝外，用前撕掉；梳子向内，拔掉点样)。

用1x TBE Buffer灌注系统，内槽没过梳孔，外槽没过胶条位置，按照HRL 2uL、CRL2uL、文库样品25uL、文库样品25uL、CRL 2uL、HRL 2uL的顺序从左到右点样。室温下120V电泳1h。

电泳完成后，取1mL枪头盒盖，加入50mL 1x TBE Buffer，5uL Gel Red染液混匀，用胶铲撬开预制胶板，将胶放入盒盖中，避光，摇床孵育5min；捞出PAGE胶，UV light下观察。根据HRL条带的位置，切出145bp-160bp间的胶块回收DNA文库。

6)回收纯化文库

自制破胶离心管：取1个1mL离心管，用酒精灯加热1mL注射器针头，在离心管底扎3-4个孔。将胶块加入1mL离心管中，放入1.5mL离心管。12000r/min离心5min。弃掉1mL离心管，向1.5mL离心管中加入300uL 10mM Tris-HCl，混合仪上4℃孵育过夜；之后取下离心管，20000×g离心5min。将上清转移至新EP管。

向2管中分别加入：100％ Ethanol 975uL、3M NaAC 30uL和Glycogen 2uL，Vortex混匀放在-80℃1h，期间预冷离心。取出离心管，20000×g离心1h。弃上清，用70％Ethanol洗2遍，每次20000×g离心5min。弃上清，瞬离一次，吸去残存液体，开盖晾干。用15uL 10mMTris-HCl溶解，取2uL入新PCR管用于Qubit，其余4℃保存。

7)Qubit定量

具体的操作方法与3T-seq文库构建中的Qubit定量步骤相同。

8)2100质检

具体的操作方法与3T-seq文库构建中的2100质检步骤相同。

图3为miRNA-seq文库的Agilent 2100Bioanalyzer检测结果。结果均表明文库质量良好，可用于进行下一步数据分析。

5、上机测序及数据分析

1)上机测序

3T-seq文库经Illumina Hiseq X Ten平台进行双端测序后得到原始数据，首先经过FastQC进行初步的质量检测，从而对产出的数据质量进行初步的整体评估，检测结果如图4所示。其中，图4-1是癌症组织样品文库质检结果；图4-2是癌旁组织样品文库质检结果。

miRNA-seq文库Illumina NextSeq 500平台进行单端测序后得到原始数据，首先经过FastQC进行初步的质量检测，从而对产出的数据质量进行初步的整体评估，检测结果如图5所示。其中，图5-1是癌症组织样品文库质检结果；图5-2是癌旁组织样品文库质检结果。

2)数据分析

3T-seq测序的原始数据用自定义的C++脚本进行过滤，以得到可用且有效的数据。接着用bowtie 2软件比对到UCSC人的参考基因组GRCh37/hg19上。选择性多聚腺苷酸位点的鉴定通过迭代聚类方法实现。采用线性趋势分析方法来确定病人的肿瘤组织与正常组织间发生变化的3’UTR，错误发现率(FDR)则是用R软件进行估计。

miRNA-seq测序的原始数据经过cutadapt程序去掉原始下机数据中的接头序列，使用Trimmomatic程序除去低质量的序列得到clean data，保留15-35nt的片段进行后续分析。接着使用bowti2程序将clean data比对到mirBase中的known miRNA数据库上，进行miRNA表达水平分析，并使用edgeR进行基因表达差异性分析。

实施例2利用qPCR法对收集的人临床结直肠癌组织及癌旁组织进行检测：

1、组织研磨

具体的操作方法与实施例1中的组织研磨步骤相同。

2、总RNA的抽提与质检

具体的操作方法与实施例1中的总RNA抽提与质检步骤相同。

3、总RNA的反转录

使用Takara公司的PrimeScript^TMRT reagent试剂盒进行反转录，包括去除基因组DNA和反转录两个过程，具体步骤如下所示：

1)去除总RNA样品中的基因组DNA，体系配方如表24所示：

表24去除总RNA样品中的基因组DNA的体系配方

置于PCR仪中进行反应，42℃反应2min。

2)反转录反应

将总RNA样品均分至两个pcr管中，在冰上分别配置miRNA和mRNA反转录体系(管1-miRNA反转录体系；管2-mRNA反转录体系)，体系配方如表25和26所示：

表25 1-miRNA反转录体系

表26 2-mRNA反转录体系

去除gDNA后的总RNA样品	5μL
		PrimeScript RT Enzyme Mix	0.5μL
5×PrimeScript Buffer	2μL
		Oligo dT Primer(50μM)	0.5μL
Random 6mers(100μM)	0.5μL
		RNase Free dH₂O	1.5μL
Total volume	10μL

轻柔混匀后立即置于PCR仪中进行反转录反应，反应条件为:

45℃ 15min

85℃ 5s

4℃ 5min

3)qPCR反应

取0.5μL反转录产物，加至19.5μL RNase free water中，稀释40倍。配置qPCR反应体系，体系如表27所示：

表27 qPCR反应体系

充分混匀后瞬离，轻轻弹击管壁以除去气泡，再次离心。之后置于StepOne PlusReal-Time PCR System中，设定程序并进行qPCR反应，反应程序如下：

4)qPCR数据分析

qPCR反应完成之后对获得的数据进行相对表达量分析，具体计算过程如下，计算结果见表28。

ΔCt＝Ct_{normal or caucer}-Ct_U6

ΔΔCt＝ΔCt_{cancer tissue}-ΔCt_{normal tissue}

normalized fold change in miRNA expression＝-2^ΔΔCt(ΔΔCt＞0)或normalized fold change in miRNA expression＝2^ΔΔCt(ΔΔCt＞0)

表28联合诊断标记物在结肠癌样本和正常对照中的qPCR相对表达量

5)受试者工作特征曲线(ROC曲线)绘制及分析

利用SPSS(更新版本v.20)对相对表达量数据进行分析，分析结果见表29，利用GraphPad Prism 7对ROC曲线进行绘制，曲线图见图6。图6中三条ROC曲线分别代表4个miRNA：hsa-miR-133a-3p，hsa-miR-145-5p，hsa-miR-1-3p，hsa-miR-378d的联合ROC曲线，4个基因：MLEC，SET，PPIA，YY1的联合ROC曲线；miRNA-基因联合ROC曲线。结果表明：hsa-miR-133a-3p，hsa-miR-145-5p，hsa-miR-1-3p，hsa-miR-378d和MLEC，SET，PPIA，YY1的联合诊断标记物AUC值(0.985)高于miRNA或mRNA的单独组合(0.880、0.860)，对结直肠癌检测具有非常高的特异性和灵敏度。

表29ROC曲线分析结果

a.在非参数假设下

b.零假设：实面积＝0.5

本实施例中用到的miRNA qPCR引物和mRNA qPCR引物的序列分别见表30和31。

表30miRNA qPCR引物

表31mRNA qPCR引物

通过对结直肠癌组织及癌旁组织中的miRNA-seq及3T-seq数据的联合分析，得到随着选择性多聚腺苷酸化而丢失3’UTR区域miRNA结合位点的基因和相应miRNA：hsa-miR-133a-3p和MLEC,hsa-miR-145-5p和SET,hsa-miR-1-3p和PPIA以及hsa-miR-378d和YY1。如图7-10所示，结果表明：结直肠癌患者癌组织中MLEC，SET，PPIA，YY1的mRNA相对于癌旁正常组织均出现选择性多聚腺苷酸化现象，导致3’UTR区域缩短，miRNA结合位点丢失，同时miRNA表达与mRNA表达均出现显著变化，且呈负相关，这4对miRNA-mRNA可作为结肠癌诊断的是生物标记物。

每图中由上自下分别为：结直肠癌组织及癌旁组织中的基因3’UTR区域长度变化及miRNA结合位点丢失情况；miRNA成熟序列及靶序列；基因在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达变化情况；miRNA在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达变化情况。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.检测microRNA生物标志物表达水平的引物组在制备用于结直肠癌检测的试剂盒中的应用，其特征在于，所述microRNA生物标志物为hsa-miR-133a-3p，hsa-miR-145-5p，hsa-miR-1-3p，hsa-miR-378d的组合。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述引物组包括用于对hsa-miR-133a-3p，hsa-miR-145-5p，hsa-miR-1-3p和hsa-miR-378d的组合的表达水平进行检测的反转录引物和正向引物。