CN106754878A - 乳腺癌易感基因变异文库构建方法 - Google Patents

乳腺癌易感基因变异文库构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种乳腺癌易感基因变异文库构建方法，包括以下步骤：A.根据乳腺癌相关基因的变异区域，设计能够检测这些变异区域的引物对；B.计算得到各引物对的判断参数R，将判断参数R的值小于或等于1的引物对，归为第一组引物组合液，将判断参数R的值大于1的引物对，归为第二组引物组合液；C.将待测样品DNA抽提纯化；D.分别采用第一组引物组合液和第二组引物组合液对纯化后的样品进行初始PCR扩增；E.对所述目标片段进行接头连接得到带接头片段；F.采用第一组引物组合液和第二组引物组合液的混合液进行文库PCR扩增，得到测序文库。本发明的乳腺癌易感基因变异文库构建方法所构建的文库测序通量高，灵敏度强，特异性强，能够用于检测游离DNA低频突变的。

Description

乳腺癌易感基因变异文库构建方法
技术领域
本发明涉及一种乳腺癌易感基因变异文库构建方法，属于生物技术领域。
背景技术
目前肿瘤的发病率和死亡率高于其他疾病，开发以非侵入式诊断策略进行肿瘤基因诊断研发，针对肿瘤靶标与化疗用药后复发、转移与抗药性，而传统疾病诊断通过临床经验、病理监测、细胞检测作为依据，有灵敏度的限制，也无法做到早期发现早期治疗或提早预测提早预防。
新一代高通量基因检测技术，当今主要以Illumina公司的Hiseq，Miseq系列和Life公司的Ion TorrentTM系列测序仪为代表，有着其他技术不可比拟的高通量、低成本等优势。已被广泛用于各类生物学研究核医学检测。对有参考的物种序列，进行全基因组重测序，在全基因组水平上检测突变位点，发现个体差异的分子基础。新一代测序技术通过全基因组测序构建了大量常规物种的基因组图谱，也促进了测序技术的告诉发展。同时，高通量测序技术在基因诊断和基因治疗方面也有着重要的作用。
SNPs(单核苷酸多态性)指在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一直，而只有一个碱基不同的现象。SNP是人类DNA中常见的变异形式，数以百万存在整个人类的基因组中，部分SNP能够导致蛋白质氨基酸编码改变或基因表达调控改变。
乳腺癌是严重影响妇女健康的最常见恶性肿瘤之一，我国妇女的乳腺癌发病率也正逐年上升。而早期乳腺癌的治愈率可达80％～90％，因此早期检测及预防对乳腺癌的治疗起到重要的作用。乳腺癌易感基因是与乳腺癌的发生具有紧密关联的基因。大量研究证实遗传因素在疾病的易感性中发挥重要作用，复杂疾病的遗传因素己证实存在微效基因剂量效应，即微效基因作用的累加才可以形成明显的表型综合效应。因此，对疾病的多个易感基因及突变位点进行检测至关重要，约占整个基因组中遗传突变的92％。对乳腺癌的易感基因的研究并不需要对全基因组测序，而只需要对特定的几个基因进行研究，目标序列捕获测序的出现，使得对基因组塔顶区域的研究成为可能。这项技术首先合成大量能与基因组特定区域互补结合的寡核苷酸序列，通过PCR扩增富集目标区段，然后用高通量测序技术对这些区段进行测序。
目前，检测乳腺癌易感基因的常见方法是Sanger测序法和基因芯片法，Sanger测序法能对乳腺癌易感基因进行区域检测，但Sanger测序法每次只能对一个样品的某一段区域进行测序，因此检测效率低、成本高。而且由于sanger测序原理的限制，在检测带有杂合子的样品信号时会出现双峰乃至多峰，使得该样品无法准确识别出来，导致检测灵敏度低(20％)。基因芯片法，该方法只能针对一个或数个已知突变的位点设计检测探针形成检测芯片，因此无法用于检测未知突变位点，检测的结果也就不够全面、准确。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种测序通量高，灵敏度强，特异性强，基于二代测序平台技术，能够用于检测游离DNA低频突变的乳腺癌易感基因变异文库构建方法。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种乳腺癌易感基因变异文库构建方法，包括以下步骤：
A.根据乳腺癌相关基因的变异区域，设计能够检测这些变异区域的引物对；
B.通过引物设计软件得到各引物对的参数W1、Tm1、W2和Tm2，从而计算得到各引物对的判断参数R，计算公式如下：
R＝0.1×[W1+Tm1/(Tm1+Tm2)]+0.9×[W2+Tm2/(Tm1+Tm2)]；
其中，W1是扩增产物的GC含量，Tm1是扩增产物的退火温度，W2是上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值，Tm2是上游引物退火温度和下游引物退火温度的平均值，
将判断参数R的值小于或等于1的引物对，归为第一组引物组合液，将判断参数R的值大于1的引物对，归为第二组引物组合液；
C.将待测样品DNA抽提纯化；
D.分别采用第一组引物组合液和第二组引物组合液对纯化后的样品进行初始PCR扩增得到目标片段，然后清除引物，采用第一组引物组合液进行初始PCR扩增时的退火温度低于采用第二组引物组合液进行初始PCR扩增时的退火温度；
E.对所述目标片段进行接头连接得到带接头片段，然后进行纯化；
F.采用第一组引物组合液和第二组引物组合液的混合液对纯化后的带接头片段进行文库PCR扩增，然后进行纯化，得到测序文库。
上述乳腺癌相关基因包括BRCA1、BRCA2、CHEK2、PALB2、BRIP1、TP53、PTEN、STK11、CDH1、ATM、BARD1、MLH1、MRE11、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、PMS1、PMS2、RAD50、RAD51C、XRCC1、CYP1B1中的一种或多种。
上述引物对所覆盖的变异区域包括chr17：43082440-43082543、chr17：43092005-43092100、chr17：43092907-43092953、chr17：43093990-43094074、chr17：43106475-43106492、chr17：43115753-43115774、chr13：32326505-32326575、chr13：32332322-32332386、chr13：32332536-32332638、chr13：32333139-32333219、chr13：32336459-32336562、chr13：32337435-32337471、chr13：32363206-32363316、chr13：32398684-32398766、chr22：28694055-28694109、chr22：28696891-28696981、chr22：28695721-28695804、chr16：23603593-23603647、chr16：23626324-23626397、chr16：23637929-23638081、chr17：61683586-61683662、chr17：61686124-61686151、chr17：61776442-61776534、chr17：61808594-61808664、chr17：61857193-61807220、chr10:87933035-87933086、chr10:87933124-87933183、chr10:87960993-87961048、chr17:7669616-7669662、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673831、chr17:7674183-7674253、chr17:7675053-7675108、chr17:7676214-7676245、chr19:1207007-1207038、chr19:1219351-1219462、chr19:1223130-1223160、chr16：68808708-68808772、chr16：6881687-68818751、chr16：68808708-68808772、chr16：68819374-68819424、chr16：68808708-68808772、chr11:108235723-108235773、chr11:108247101-108247109、chr11:108250805-108250828、chr11:108330374-108330408、chr2:214730424-214730455、chr2:214745751-214745803、chr2:214780922-214780935、chr2:214809412-214809443、chr3:37020368-37020459、chr3:37028815-37028859、chr3:37048982-37049005、chr11:94445816-94445870、chr11:94445816-94445870、chr11:94460995-94461029、chr2:47403286-47403289、chr2:47412447-47412470、chr2:47445572-47445651、chr2:47482870-47482922、chr2:47795926-47795977、chr2:47798612-47798658、chr2:47800355-47800407、chr2:47806534-47806558、chr1：45329342-45329461、chr1：45331536-45331683、chr1：45332017-45332092、chr1：45332219-45332276、chr1：45332651-45332685、chr1：45332794-45332839、chr1：45333412-45333489、chr8:89946150-89946231、chr8:89955480-89955520、chr8:89981487-89981518、chr2:189791856-189791868、chr2:189854456-189854497、chr2:189877284-189877298、chr2:5982845-5982871、chr2:5991989-5992032、chr2:6005894-6005938、chr5:132575868-132575961、chr5:132588687-132588761、chr5:132594901-132594943、chr17：58692662-58692788、chr17：58695139-58695189、chr17：58696693-58696757、chr17：58709872-58709987、chr17：58720748-58720811、chr19:43543621-43543687、chr19:43552171-43552220、chr19:43553615-43553675、chr2:38070908-38070971、chr2:38071019-38071064、chr2:38074427-38074472、chr2:38074797-38074864中的一个或多个。
上述步骤F中的混合液是第一组引物组合液和第二组引物组合液按照体积比为1﹕1混合而成。
上述引物对的5’端均引入脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基。
上述步骤D中初始PCR扩增时，在反应体系中加入二甲基亚砜，加入二甲基亚砜的体积占反应体系体积的3％～7％。
上述步骤F中文库PCR扩增时，在反应体系中加入甘油，加入甘油的体积占反应体系体积的5％～8％。
上述步骤E中带接头片段的纯化是采用磁珠进行纯化，所述步骤F中文库PCR扩增产物的纯化是采用磁珠进行纯化。
上述步骤D中第一组引物混合液在初始PCR扩增时的实验条件是：99℃，2min，1个循环；99℃，15s，55℃，20s，72℃，30s 15个循环；
上述步骤D中第二组引物组合液在初始PCR扩增时的实验条件是：99℃，2min，1个循环；99℃，15s，65℃，20s，72℃，30s，15个循环；
上述步骤F中第一组引物组合液和第一组引物组合液的混合液在文库扩增的实验条件是：98℃，2min，1个循环；99℃，15s，62℃，1min，5个循环。
本发明具有积极的效果：
(1)本发明提供一种基于二代测序平台技术的乳腺癌易感基因文库构建方法，能够实现样本浓度低起始量(低于10ng)、高通量、短周期、低成本的建库。采用本发明的文库构建方法所得到的文库进行测序，可以一次检测23个基因的上百个突变位点相对于一代测序突变的成本节约4000元/样本。本发明主要是对肿瘤易感人群，尤其是携带乳腺癌易感基因突变和多态性的人群，结合测序技术，通过基因检测可以确定自身肿瘤易感基因的突变状态和多态性情况，对肿瘤发生风险并进行干预，真正意义上做到“早发现、早诊断、早治疗”。对乳腺癌高危人群的诊断和预防策略提供指南，如进行定期体检或有效普查以获得早诊早治，大大降低乳腺癌的发病率和死亡率。
(2)本发明中所用的引物组合物是针对乳腺癌易感基因突变和多态位点的特定序列进行设计，通过5’端引入脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基，使得各引物之间相互干扰性小。通过分管扩增捕获所选取变异区域，相互之间几乎不干扰。根据判断参数R将引物组合物分管进行扩增，在其他条件相同的条件下，文库构建的成功率由原来的72％提高到89％。本发明可以用于微量DNA文库构建，降低对检测样本的要求，样本的DNA浓度可以低至1ng～10ng，与其他建库相比，文库起始量降低了40ng。
(3)本发明测得的基因突变和多态与金标准实验结果对比，二代测序的敏感度和特异度分别是98.3％和99.6％；
(4)本发明对样本的DNA浓度要求很低，所以可以适用于非侵入式采集外围血、口腔粘膜、唾液等，具有方便采样、可早期检测与复发评估、易定期追踪、高灵敏度、高精准分辨率及专一性的优势。
(5)本发明对初始扩增和文库扩增过程中使用的试剂进行优化，建立最适合建库的反应条件，与现有的实验步骤相比，本发明在文库初始扩增和文库扩增，引入一定少量的有机试剂，初始扩增时采用二甲基亚砜、文库扩增时采用甘油，通过在反应步骤中加入有机试剂，文库构建的成功率由原来的89％提高到95％。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
主要试剂：
所有试剂购买自正规厂家：Multisource Genomic DNA Miniprep Kit(Axygen)、乳腺癌易感基因检测引物第一组引物组合液和第二组引物组合液(上海百力格生物技术有限公司)、5*Ion AmpliSeqTM HiFi Mix(Life technologies)、FuPa ReagentTM(Lifetechnologies)、AmPure XP Reagent磁珠(Life technologies)、Ion PGM Beads(Lifetechnologies)、PGM Template OT2Solutions(Life technologies)、Platinum PCR SuperMix High Fidelity(Life technologies)、Library Amplification Primer Mix(Lifetechnologies)等。上机模板准备和上机过程中用到的试剂和耗材与Ion Torrent二代测序平台相配套，包括PGM Template OT2kit和Ion 314chip等部分。本方法实验前需要新鲜配制的试剂：75％乙醇(100％乙醇与无核酸酶水按3:1比例配制)。
主要仪器：
Ion Torrent PGM测序仪、3.0荧光定量仪、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、灭菌锅、磁力架、移液枪、PCR仪、震荡仪等。
本实施例的乳腺癌易感基因变异文库构建方法，包括以下步骤：
A.根据乳腺癌相关基因的变异区域，设计能够检测这些变异区域的引物对；
B.根据引物和产物的GC含量、Tm值，将引物对分成两组，即第一组引物组合液和第二组引物组合液；
C.将待测样品DNA抽提纯化；
D.采用第一组引物组合液和第二组引物组合液对纯化后的样品分别进行初始PCR扩增，得到目标片段，然后清除引物；
E.对所述目标片段进行接头连接得到带接头片段，然后采用磁珠进行纯化；
F.采用第一组引物组合液和第二组引物组合液的混合液对纯化后的带接头片段进行文库PCR扩增，然后采用磁珠进行纯化，得到测序文库。
整个过程中，也可以在任何步骤按照要求通过切胶回收或磁珠片段选择的方法对DNA片段分子大小进行选择，最终获得所需大小DNA片段的文库分子，并且在接头连接中引入特征性序列标签，用于测序中不同文库的区分。与阴性样品，质控品一起进行大规模平行测序，仪器获得的结果经数据处理和生物信息学分析，得出样本中含有的SNP位点信息。所述阴性样本为正常人基因组DNA，所述的质控品为加入1％的control particles,是一种商品化试剂，包含在上机测序的试剂盒PGM Sequencing OT2kit中，作为上机测序实验的内参，对测序情况进行评估和质控，如果测序结果中不包含1％的control particles结果，说明上机实验失败，结果不可靠。
一、引物设计。
根据乳腺癌相关基因的变异区域，设计能够检测这些变异区域的引物对。
本发明中，乳腺癌相关基因包括但不限于下列基因：
表1乳腺癌易感基因信息表
序号 基因名称 DNA Locus mRNA Locus
1 BRCA1 NG_005905.2 NM_007294
2 BRCA2 NG_012772.3 NM_000059
3 CHEK2 NG_008150.1 NM_001005735
4 PALB2 NG_007406.1 NM_024675
5 BRIP1 NG_007409.2 NM_032043
6 TP53 NG_017013.2 NM_000546
7 PTEN NG_007466.2 NM_000314
8 STK11 NG_007460.2 NM_000455
9 CDH1 NG_008021.1 NM_001317184
10 ATM NG_009830.1 NM_000051
11 BARD1 NG_012047.2 NM_000465
12 MLH1 NG_007109.2 NM_000249
13 MRE11 NG_007261.1 NM_001330347
14 MSH2 NG_007110.2 NM_000251
15 MSH6 NG_007111.1 NM_000179
16 MUTYH NG_008189.1 NM_001048171
17 NBN NG_008860.1 NM_001024688
18 PMS1 NG_008648.1 NM_000534
19 PMS2 NG_008466.1 NM_000535
20 RAD50 NG_021151.1 NM_005732
21 RAD51C NG_023199.1 NM_002876
22 XRCC1 NG_033799.1 NM_006297
23 CYP1B1 NG_008386.2 NM_000104
本实施例根据上述各乳腺癌相关基因的变异区域，设计用于检测这些乳腺癌易感基因的变异区域是否存在变异的引物对。变异区域包括各基因的外显子区域，或者与外显子相连的上下游30bp的内含子区域，或者与乳腺癌相关的其他突变和多态区域。引物对能够覆盖表1中所有基因的需要检测的变异区域。所覆盖的区域如下：
chr17：43082440-43082543、chr17：43092005-43092100、chr17：43092907-43092953、chr17：43093990-43094074、chr17：43106475-43106492、chr17：43115753-43115774、chr13：32326505-32326575、chr13：32332322-32332386、chr13：32332536-32332638、chr13：32333139-32333219、chr13：32336459-32336562、chr13：32337435-32337471、chr13：32363206-32363316、chr13：32398684-32398766、chr22：28694055-28694109、chr22：28696891-28696981、chr22：28695721-28695804、chr16：23603593-23603647、chr16：23626324-23626397、chr16：23637929-23638081、chr17：61683586-61683662、chr17：61686124-61686151、chr17：61776442-61776534、chr17：61808594-61808664、chr17：61857193-61807220、chr10:87933035-87933086、chr10:87933124-87933183、chr10:87960993-87961048、chr17:7669616-7669662、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673831、chr17:7674183-7674253、chr17:7675053-7675108、chr17:7676214-7676245、chr19:1207007-1207038、chr19:1219351-1219462、chr19:1223130-1223160、chr16：68808708-68808772、chr16：6881687-68818751、chr16：68808708-68808772、chr16：68819374-68819424、chr16：68808708-68808772、chr11:108235723-108235773、chr11:108247101-108247109、chr11:108250805-108250828、chr11:108330374-108330408、chr2:214730424-214730455、chr2:214745751-214745803、chr2:214780922-214780935、chr2:214809412-214809443、chr3:37020368-37020459、chr3:37028815-37028859、chr3:37048982-37049005、chr11:94445816-94445870、chr11:94445816-94445870、chr11:94460995-94461029、chr2:47403286-47403289、chr2:47412447-47412470、chr2:47445572-47445651、chr2:47482870-47482922、chr2:47795926-47795977、chr2:47798612-47798658、chr2:47800355-47800407、chr2:47806534-47806558、chr1：45329342-45329461、chr1：45331536-45331683、chr1：45332017-45332092、chr1：45332219-45332276、chr1：45332651-45332685、chr1：45332794-45332839、chr1：45333412-45333489、chr8:89946150-89946231、chr8:89955480-89955520、chr8:89981487-89981518、chr2:189791856-189791868、chr2:189854456-189854497、chr2:189877284-189877298、chr2:5982845-5982871、chr2:5991989-5992032、chr2:6005894-6005938、chr5:132575868-132575961、chr5:132588687-132588761、chr5:132594901-132594943、chr17：58692662-58692788、chr17：58695139-58695189、chr17：58696693-58696757、chr17：58709872-58709987、chr17：58720748-58720811、chr19:43543621-43543687、chr19:43552171-43552220、chr19:43553615-43553675、chr2:38070908-38070971、chr2:38071019-38071064、chr2:38074427-38074472、chr2:38074797-38074864。
本实施例中的引物对的设计和制备采用现有的常规方法。本实施例中的引物对包括特异性上游引物和特异性下游引物，上游引物和下游引物是根据所覆盖的变异区域在参考基因组的起始和终止位置设计的。引物均由母液稀释而成，母液由百力格生物技术有限公司合成的干粉稀释而成，引物的最终浓度为100nM。引物纯度应达到PAGE或者HPLC级，不含杂带。设计时所用核苷酸序列均来自NCBI数据库公布的基因序列，引物扩增后的产物长度主要集中在100bp-500bp之间。
引物的核苷酸序列可为任意的已知序列，其序列自身不形成发卡二级结构，且G、C含量占碱基数量总和的30％～70％，引物序列选择长度18bp～25bp的核苷酸序列。使用专门的多重引物设计软件包(如DNA soft wares的Visual OMP,Multi PLX，ABI的PrimerExpress等)来设计引物，为了减少在核酸扩增过程中假象例如引物二聚体的形成，引物对经过预测在扩增过程中显示最小的与引物中其他引物的相互作用、各个引物对的Tm等参数尽量接近、不要存在严重的二级结构比如发夹、dimers等。通过使用不同的软件，综合评价，将引物尽可能设计为靶特异性或者扩增子特异性的，并且引物通常被分组为子集以使引物间相互作用、引物二聚体形成和超级扩增子减少至最低程度。
PCR的延伸是从引物3’端开始的，并决定着PCR产物的特异性，而5’端则限定PCR产物的长度。5’端修饰后不但不影响正常的PCR反应，而且修饰后的引物能够更稳定地与模板结合，对于PCR产物的分析与进一步操作有很大的方便，在引物上进行基团修饰，引物所携带的修饰基团隔离开其他引物，使得同一反应体系中，完成更多引物的同时扩增。引物5’端修饰包括磷酸化修饰、氨基修饰和引入脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基，优选地为5’端引入脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基。
本实施例中设计的引物对是经过反复实验筛选验证得到的最佳组合引物对，能够实现高效、快速、微量建库，保持了与现有建库方法的文库测序流程的兼容性，灵活方便，可以用于Ion Proton测序平台，适于构建Ion Proton的文库，构建文库可以直接上机测序。
本实施例中的引物对可以直接应用到不同的第二代测序平台，包括但不限于由Illumina，Life Technologies(ABI)，Roche，Helicos Biotechnologies，PacificBiosciences这些公司制造的仪器，同样也适用于其它厂商生产的测序仪。
二、引物对分组。
由于扩增的模板是固定的序列模板，设计引物时不可避免会有GC含量和Tm值不一致的引物对，为了顺利构建测序文库，这些差别较大的引物对在实验的过程中对实验条件和样本的要求会更加严格，并且实验结果不一定立项。
退火温度是引物和模板结合时候的温度参数，即当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度，它是影响PCR特异性的较重要因素，为了确定较适合的退火温度，根据引物和产物的GC含量、退火温度等相关参数计算的判断参数R，从而更加方便准确地将设计合成、稀释后引物分成两组。判断参数R的计算公式如下：
R＝0.1×[W1+Tm1/(Tm1+Tm2)]+0.9×[W2+Tm2/(Tm1+Tm2)]。
其中，W1是扩增产物的GC含量，Tm1是扩增产物的退火温度，W2是上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值，Tm2是上游引物退火温度和下游引物退火温度的平均值。W1、W2、Tm1、Tm2是设计引物核苷酸序列时，通过多重引物设计软件包，自动生成的参数。
通过软件包生成的参数代入，计算公式得到所有引物对的判断参数R(R一般保留5位有效数字)，其中判断参数R的值小于或等于1的引物对，归为第一组引物混合液，判断参数R的值大于1的引物对，归为第二组引物混合液。
以基因CHEK2为例，在NCBI数据库中找到该基因的DNA序列(NG_008150.1)，找到DNA序列中检测覆盖区域：chr22：28694055-28694109、chr22：28696891-28696981、chr22：28695721-28695804；根据软件Primer Express设计覆盖目的区域的引物对，引物对尽可能设计为靶特异性并且与其他引物不相互干扰，设计后的引物核苷酸序列如表2所示。
表2 CHEK2引物序列表
表2中的引物由百力格生物技术有限公司合成，合成引物的5’端引入脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基。
根据判断参数R的取值，序号为1的引物对归为第一组引物组合液；序号为2和3的引物对归为第二组引物组合液。其他乳腺癌相关基因的引物设计和分组参照CHEK2基因，最终将设计检测乳腺癌相关基因变异区域的所有引物对分组，引入脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基的引物对分别合成稀释后，按照分组的结果配置成第一组引物对组合液和第二组引物组合液。第一组引物对组合液和第二组引物组合液在初始扩增分别进行初始扩增反应，能够增加每个反应扩增产物的总体产物率，然后在引物清除步骤再将扩增产物等量混合在一起进行实验。
三、待测样品DNA抽提纯化。
本实施例中检测5例携带乳腺癌易感基因突变和多态位点的样本和5例不携带乳腺癌易感基因突变和多态位点的样本，这10例样本的相关位点已经经过ARMS验证。
本发明中的检测样本为能提取核酸的任意形式的样品，较佳地为口腔粘膜，包括但不限于：全血、血清、血浆和组织样品；组织样品包括但不限于：石蜡包埋组织、新鲜组织和冰冻切片。
3.1样本DNA抽提
采用北京索莱宝口腔、咽拭子DNA提取试剂盒(50T，货号：D3300)提取口腔粘膜的样本DNA，，具体的操作参见试剂盒产品说明书。抽提结束后用Thermo-Fisher核酸蛋白定量仪(NanoDrop 2000)测定样本浓度。
3.2 DNA纯化
1)取5ng DNA，加入Nuclease-free Water至40μL；
2)加入1.5倍体积(60μL)Ampure beads，室温放置5min，再放置于磁力架上约5min，至澄清；
3)弃上清，用75％的酒精(200μL，现配现用)洗涤2次，晾干(不要过干)；
4)用25μL Nuclease-free Water溶解，Qubit检测浓度。
3.3组织样本DNA浓度测定
采用3.0对抽提后的DNA浓度测定：
1)向样本管加入1ul Qubit dsDNA HS Reagent和199ul Qubit dsDNA HSbuffer,漩涡混匀4s；
2)向已添加工作液的样品管内吸弃1ul工作液，加入1ul的DNA样本，漩涡混匀4s，每管的最终体积是200ul；
3)所有管在室温避光孵育2分钟；
4)在3.0主屏上点击“DNA”键，然后选择dsDNA High Sensitivity分析模式；
5)把样本管放入3.0中，盖上盖子，点击read；
6)选择Calculate Initial初始浓度，然后选择Volume of Sample Used:1ul，此时显示的结果为样本初始浓度，单位ng/ul；
7)读取下一个样本：取出Qubit3.0荧光光度计中样本。
四、获得目标片段。
分别采用第一组引物组合液和第二组引物组合液对纯化后的样品进行初始PCR扩增得到目标片段，然后清除引物。
4.1初始PCR扩增
由于初始PCR扩增是多重PCR反应，每一个引物对在扩增反应中与另外的引物竞争有限量的dNTPs、聚合酶和其他试剂，因此存在对改进的方法和组合物需要，以允许选择性扩增一群核酸分子内的多个靶核酸分子，同时避免非特异性扩增产物和引物二聚体的形成，或者将非特异性扩增产物和引物二聚体的程度降至最低，达到更高效、低浓度检测。本发明在反应体系中加入有机试剂，有机试剂包括甘油、橄榄油、DMSO(二甲基亚砜)，优选地，在初始扩增加入的有机试剂为DMSO(二甲基亚砜)。
采用本实施例的第一组引物组合液和第二组引物组合液，若样本的浓度大于10ng，可以将第一组引物组合液和第二组引物组合液混合在一起对样本进行初始PCR扩增。若样本的浓度小于10ng，必须分别采用第一组引物组合液和第二组引物组合液进行初始PCR扩增，以保证文库的质量，下面以样本的浓度小于10ng为例。
按照表3中的初始PCR扩增反应体系，进行试剂配比。
表3初始PCR扩增反应体系成分
反应体系分为两管，一管反应体系采用第一组引物组合液，另一管反应体系采用第二组引物组合液，其他成分相同。
在反应体系中加入少量的二甲基亚砜(DMSO)，能够降低熔解温度，有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区，提高引物特异性，有效促进GC含量高达52％～73％模板的扩增，使用低浓度的引物，少量循环，使得引物间互不干扰。
分两管分别进行初始PCR扩增反应得到目标片段(目标区域测序目的片段)，采用第一组引物组合液的扩增反应程序如表4所示，采用第二组引物组合液的扩增反应程序如表5所示。
表4采用第一组引物组合液的扩增反应程序
表5采用第二组引物组合液的扩增反应程序
PCR反应条件：特异引物与靶序列退火延伸，选择较高的复性温度以减少引物和模板间的非特异性结合,确保PCR反应的特异性。复性时间略微延长,以使引物与模板之间完全结合，但是延伸时间不宜过长,否则会导致非特异性扩增带的出现。
4.2引物清除
在两管扩增反应分别获得目标片段后，不同的扩增目标区域产物再混合在同一个反应体系中，进行文库构建步骤，降低了样品检测的要求，提高测序反应的效率。
将两管初始PCR扩增的产物等体积混合成一管，取20ul的PCR产物混合物，加入2ulFuPa Reagent，此时总体积为22μL，漩涡充分混匀，瞬间离心2秒，根据表6的程序清除引物。
表6引物清除反应程序
PCR产物可立即使用或保存于-20℃冰箱。
五、获得接头片段。
对目标片段进行接头连接得到带接头片段，然后采用磁珠进行纯化。
5.1接头反应
拿出Switch Solution，室温混匀，将清除引物后的目标片段置于样品管中，漩涡充分混匀，瞬间离心2秒,取2ul加入如表7所示的接头反应体系中。
表7接头反应体系成分表
将上述反应体系放入PCR仪内，进行引物清除，反应程序如表8所示。
表8接头反应程序表
Barcode为合成的单链，其中所述随机序列有6～12个碱基随机组成且位于靠近单链游离DNA 3’端的一侧，所述Adaptor序列为任意的已知序列且位于远离单链游离DNA 3’端的一侧，两种试剂均由Life Technologies提供。通过连接反应，获得各连接唯一标签序列的核酸样本，样品可立即使用或保存于-20℃冰箱。
5.2纯化，采用Ampure XP Reagent磁珠：
1)向样品管中加入45μL(1.5倍样品体积)Ampure XP Reagent，混匀，室温孵育5min；
2)将样品管放在磁力架上，静置2min，至管内溶液完全澄清；
3)弃上清，保持离心管在磁力架上，温和添加150μL 70％酒精(现配现用)洗涤beads(轻轻旋转样品管，充分洗涤)；
4)重复上述步骤，充分去除酒精，晾干(磁力架上晾干，不要过干)。
5.3测定样本库的浓度
1)向样本管加入1ul Qubit dsDNA HS Reagent和199ul Qubit dsDNA HSbuffer,漩涡混匀4s；
2)向已添加工作液的样品管内吸弃3ul工作液，加入3ul的DNA样品，漩涡混匀4s，每管的最终体积是200ul；
3)所有管在室温避光孵育2分钟；
4)在3.0主屏上点击“DNA”键，然后选择dsDNA High Sensitivity分析模式；
5)把样本管放入3.0中，盖上盖子，点击read；
6)选择Calculate Initial初始浓度，然后选择Volume of Sample Used:3ul，此时显示的结果为样本初始浓度，单位ng/ul；
7)读取下一个样品：取出Qubit3.0荧光光度计中样品，放入新的样品，按“ReadNext Ssmple”；
8)重复样本读数，直到所有样品读完。
六、文库扩增和纯化
6.1文库扩增
由于文库构建是多重PCR反应，每一个引物对在扩增反应中与另外的引物竞争有限量的dNTPs、聚合酶和其他试剂，因此存在对改进的方法和组合物需要，以允许选择性扩增一群核酸分子内的多个靶核酸分子，同时避免非特异性扩增产物和引物二聚体的形成，或者将非特异性扩增产物和引物二聚体的程度降至最低，达到更高效、低浓度检测。本发明在反应体系中加入有机试剂，有机试剂包括甘油、橄榄油、DMSO(二甲基亚砜)，优选地，在文库扩增加入的有机试剂为甘油。
向纯化后风干的样品中加入50μL Platinum PCR Super Mix High Fidelity(黑色盖)、3.5ul甘油和2ul的第一组引物组合液和第二组引物组合液的混合液,重悬磁珠混匀，磁力架上放置3min，取上清至PCR管中，漩涡混匀进行PCR扩增，扩增反应程序如表9所示。
表9文库扩增反应程序表
甘油能够提高文库产量，有利于扩增后上机测序，扩增后的PCR产物可立即使用或保存于-20℃冰箱。
6.2文库纯化
文库进行磁珠纯化，采用AMPure XP Reagent磁珠：
1)将PCR产物转移至1.5ml离心管内，加入25ul(0.5倍样品体积)AMPure XPReagent充分吹打混匀，室温孵育5min；
2)将样本放置磁力架上，等待5min至管内溶液完全澄清；
4)小心吸取上清液并转移到新的1.5ml离心管内；
5)向上述步骤的离心管中加入60ul(1.2倍原始样品体积)的AMPure XP Reagent磁珠，吹打混匀，室温孵育5min；
6)将样本管放在磁力架上静止3min或至溶液澄清，弃上清；
7)保持离心管在磁力架上，温和添加150ul新鲜配制的75％酒精溶液洗涤beads(轻轻转动样品管，充分洗涤)，旋转离心管，小心去除酒精；
8)重复上述步骤清洗一次，充分去除酒精，晾干(磁力架上晾干，不要过干)，室温风干磁珠5min，不要过度干燥；
9)将样品管从磁力架上取下，加入50μL Low TE溶液到样本管内，漩涡混匀；
10)将样本管放置在磁力架上，静止2min，将洗脱的上清液转移到新的离心管内，用Qubit检测样品浓度；
6.3用3.0测定样本库的浓度
1)向样本管加入1ul Qubit dsDNA HS Reagent和199ul Qubit dsDNA HSbuffer,漩涡混匀4s；
2)向已添加工作液的样品管内吸弃3ul工作液，加入3ul的DNA样品，漩涡混匀4s，每管的最终体积是200ul；
3)所有管在室温避光孵育2分钟；
4)在3.0主屏上点击“DNA”键，然后选择dsDNA High Sensitivi ty分析模式；
5)把样本管放入3.0中，盖上盖子，点击read；
6)选择Calculate Initial初始浓度，然后选择Volume of Sample Used:3ul，此时显示的结果为样本初始浓度，单位ng/ul；
7)读取下一个样品：取出Qubit3.0荧光光度计中样品，放入新的样品，按“ReadNext Sample”；
8)重复样本读数，直到所有样品读完；
纯化后的文库可直接通过Ion Torrent平台进行上机测序，测序结束以后，对获得的测序数据进行分析，通过比对设计的引物和位点信息，筛选出乳腺癌相关基因上的突变和多态位点。
本发明的检测结果与临床ARMS法检测结果一致，测序反应样本的数量分布均匀。本发明对乳腺癌易感基因变异具有检测通量高、特异性强、不易污染、安全性高的优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，对乳腺癌易感人群提供预防指南。。
本发明实施方式中，所述的基因变异存在于乳腺癌但不仅限于如表1列出的乳腺癌相关基因，也存在常见胃癌、肝癌、肠癌、食管癌等相关基因。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。发明人经深入研究和筛选得到一组可以用于Ion Proton的文库，构建的文库可以直接可以上机测序。
为了降低对组织样本浓度和质量的要求，提高测序文库构建的成功率，本发明进行了以下尝试1)采用1ng、3ng、5ng、7ng、9ng的口腔粘膜抽提DNA样本，根据常用的退火温度55℃进行初始浓度扩增，对文库扩增使用60℃退火温度，测得文库的浓度均低于0.5ng/ul。对初始扩增和文库扩增的退火温度进行50℃～65℃的梯度实验，文库的成功率仍然很低；2)根据软件设计引物参数对引物对进行分组，分组以50％为界，上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值小于等于50％为第一组引物组合物，上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值大于50％为第二组引物组合物，第一组引物组合物采用的50℃退火温度进行初始浓度扩增，文库扩增使用60℃退火温度，第二组引物组合物采用的60℃退火温度进行初始浓度扩增，文库扩增使用60℃退火温度，相对于初始扩增不分管扩增，文库的成功率虽然有所提高，但是低于50％；3)退火温度是影响PCR特异性的较重要因素，良好的退火温度，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂，退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成，还有模板序列组成和长度。本发明综合考虑了引物和产物的GC含量和退火温度参数对PCR反应的影响，设计了分管判断参数R，根据判断参数R对引物对分组，在初始扩增和文库扩增的退火温度进行50℃～65℃的梯度试验，选择文库成功率较高的退火温度，最终优选第一组引物组合液初始扩增的退火温度为55℃，第二组引物组合液初始扩增的退火温度为65℃，第一组引物组合液和第二组引物组合液的混合液在文库扩增的退火温度为62℃，文库构建成功率大幅度提升，特别适用于文库起始量低至1ng～10ng的情况。
上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种乳腺癌易感基因变异文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.根据乳腺癌相关基因的变异区域，设计能够检测这些变异区域的引物对；
B.通过引物设计软件得到各引物对的参数W1、Tm1、W2和Tm2，从而计算得到各引物对的判断参数R，计算公式如下：
R=0.1×[W1+Tm1/(Tm1+Tm2)]+0.9×[W2+Tm2/(Tm1+Tm2)]；
其中，W1是扩增产物的GC含量，Tm1是扩增产物的退火温度，W2是上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值，Tm2是上游引物退火温度和下游引物退火温度的平均值，
将判断参数R的值小于或等于1的引物对，归为第一组引物组合液，将判断参数R的值大于1的引物对，归为第二组引物组合液；
C.将待测样品DNA抽提纯化；
D.分别采用第一组引物组合液和第二组引物组合液对纯化后的样品进行初始PCR扩增得到目标片段，然后清除引物，采用第一组引物组合液进行初始PCR扩增时的退火温度低于采用第二组引物组合液进行初始PCR扩增时的退火温度；
E.对所述目标片段进行接头连接得到带接头片段，然后进行纯化；
F.采用第一组引物组合液和第二组引物组合液的混合液对纯化后的带接头片段进行文库PCR扩增，然后进行纯化，得到测序文库。
2.根据权利要求1所述的乳腺癌易感基因变异文库构建方法，其特征在于：所述乳腺癌相关基因包括BRCA1、BRCA2、CHEK2、PALB2、BRIP1、TP53、PTEN、STK11、CDH1、ATM、BARD1、MLH1、MRE11、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、PMS1、PMS2、RAD50、RAD51C、XRCC1、CYP1B1中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的乳腺癌易感基因变异文库构建方法，其特征在于：所述引物对所覆盖的变异区域包括chr22：28694055-28694109、chr22：28696891-28696981、chr22：28695721-28695804、chr17：43082440-43082543、chr17：43092005-43092100、chr17：43092907-43092953、chr17：43093990-43094074、chr17：43106475-43106492、chr17：43115753-43115774、chr13：32326505-32326575、chr13：32332322-32332386、chr13：32332536-32332638、chr13：32333139-32333219、chr13：32336459-32336562、chr13：32337435-32337471、chr13：32363206-32363316、chr13：32398684-32398766、chr22：28694055-28694109、chr22：28696891-28696981、chr22：28695721-28695804、chr16：23603593-23603647、chr16：23626324-23626397、chr16：23637929-23638081、chr17：61683586-61683662、chr17：61686124-61686151、chr17：61776442-61776534、chr17：61808594-61808664、chr17：61857193-61807220、chr10:87933035-87933086、chr10:87933124-87933183、chr10:87960993-87961048、chr17:7669616-7669662、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673831、chr17:7674183-7674253、chr17:7675053-7675108、chr17:7676214-7676245、chr19:1207007-1207038、chr19:1219351-1219462、chr19:1223130-1223160、chr16：68808708-68808772、chr16：6881687-68818751、chr16：68808708-68808772、chr16：68819374-68819424、chr16：68808708-68808772、chr11:108235723-108235773、chr11:108247101-108247109、chr11:108250805-108250828、chr11:108330374-108330408、chr2:214730424-214730455、chr2:214745751-214745803、chr2:214780922-214780935、chr2:214809412-214809443、chr3:37020368-37020459、chr3:37028815-37028859、chr3:37048982-37049005、chr11:94445816-94445870、chr11:94445816-94445870、chr11:94460995-94461029、chr2:47403286-47403289、chr2:47412447-47412470、chr2:47445572-47445651、chr2:47482870-47482922、chr2:47795926-47795977、chr2:47798612-47798658、chr2:47800355-47800407、chr2:47806534-47806558、chr1：45329342-45329461、chr1：45331536-45331683、chr1：45332017-45332092、chr1：45332219-45332276、chr1：45332651-45332685、chr1：45332794-45332839、chr1：45333412-45333489、chr8:89946150-89946231、chr8:89955480-89955520、chr8:89981487-89981518、chr2:189791856-189791868、chr2:189854456-189854497、chr2:189877284-189877298、chr2:5982845-5982871、chr2:5991989-5992032、chr2:6005894-6005938、chr5:132575868-132575961、chr5:132588687-132588761、chr5:132594901-132594943、chr17：58692662-58692788、chr17：58695139-58695189、chr17：58696693-58696757、chr17：58709872-58709987、chr17：58720748-58720811、chr19:43543621-43543687、chr19:43552171-43552220、chr19:43553615-43553675、chr2:38070908-38070971、chr2:38071019-38071064、chr2:38074427-38074472、chr2:38074797-38074864中的一个或多个。
4.根据权利要求1所述的乳腺癌易感基因变异文库构建方法，其特征在于：所述步骤F中的混合液是第一组引物组合液和第二组引物组合液按照体积比为1﹕1混合而成。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的乳腺癌易感基因变异文库构建方法，其特征在于：所述引物对的5’端均引入脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的乳腺癌易感基因变异文库构建方法，其特征在于：所述步骤D中初始PCR扩增时，在反应体系中加入二甲基亚砜，加入二甲基亚砜的体积占反应体系体积的3%～7%。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的乳腺癌易感基因变异文库构建方法，其特征在于：所述步骤F中文库PCR扩增时，在反应体系中加入甘油，加入甘油的体积占反应体系体积的5%～8%。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的乳腺癌易感基因变异文库构建方法，其特征在于：所述步骤D中第一组引物混合液在初始PCR扩增时的实验条件是：99℃，2min，1个循环；99℃，15s，55℃，20s，72℃，30s 15个循环；
所述步骤D中第二组引物组合液在初始PCR扩增时的实验条件是：99℃，2min，1个循环；99℃，15s，65℃，20s，72℃，30s，15个循环。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的乳腺癌易感基因变异文库构建方法，其特征在于：所述步骤F中第一组引物组合液和第一组引物组合液的混合液在文库扩增的实验条件是：98℃，2min，1个循环；99℃，15s，62℃，1min，5个循环。
10.一种采用如权利要求1所述的乳腺癌易感基因变异文库构建方法所构建的测序文库。
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