CN105861700B - 一种针对神经肌肉病的高通量检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种针对神经肌肉病的高通量检测方法，属于生物医药技术领域。其包括以下步骤：提取检测对象的基因组DNA；对提取的基因组DNA进行定量，并取3μg进行如下步骤建库；将基因组DNA进行片段化；将片段化的基因组DNA进行末端修复和3’末端添加碱基A；将3’末端添加碱基A的产物连接扩增接头，以便进行有效连接产物的富集；将连接产物进行PCR扩增，富集有效产物；使用探针对富集的模板中的目标区域进行捕获；将捕获的目标片段分离；加上完整接头获得捕获文库；对文库进行定量操作；上机测序；数据分析得到致病位点相关信息。本发明能够同时对一个样本的多个神经肌肉病相关突变进行分析。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种针对神经肌肉病的高通量检测方法。
背景技术
遗传性神经肌肉病（hereditary neuromuscular disease）是以运动功能障碍为主要临床特征的一组遗传性疾病，主要包括遗传性肌病、周围神经病、运动神经病和神经肌肉接头病等，每类疾病根据临床特点、遗传方式以及基因突变位点的不同又分为若干个亚类。各种亚型之间临床表现存在很大重叠，通过肌肉活检、免疫组化、免疫荧光染色等检查可以帮助确定部分亚型，但仍有一大部分无法确定具体类型。
遗传性神经肌肉病的致病基因不仅数目众多，且多数基因庞大，外显子多。以往的分子学诊断依赖Sanger测序，而常规的一代测序中每个基因需要多次PCR，DNA用量大，花费高且实验周期长，往往需要逐一检测多个候选基因，在成本与耗时方面不能满足大规模测序的需求。而靶向捕获二代测序技术对于遗传性肌病的分子诊断具有明显优势，弥补了一代测序的缺陷，可实现同时筛查多个样本及同一类疾病的多个致病基因，为遗传性肌病的诊断开辟了新的领域。
发明内容
针对神经肌肉病致病突变检测的技术现状，本发明提出一种针对神经肌肉病的高通量检测方法，该方法能够在一轮测序中检测多个神经肌肉病相关致病突变位点突变状况。该方法具有灵敏度高、针对性强、覆盖全面、通量大、准确性高等优点。
所述的一种针对神经肌肉病的高通量检测方法，其特征在于包括以下步骤：
1）提取检测对象的基因组DNA；
2）对提取的基因组DNA进行定量，并取3μg进行如下步骤建库；
3）将基因组DNA进行片段化；
4）将片段化的基因组DNA进行末端修复和3’末端添加碱基A；
5）将3’末端添加碱基A的产物连接扩增接头，以便进行有效连接产物的富集；
6）将连接产物进行PCR扩增，富集有效产物；
7）使用探针对富集的模板中的目标区域进行捕获；
8）将捕获的目标片段分离；
9）加上完整接头获得捕获文库；
10）对文库进行定量操作；
11）上机测序；
12）数据分析得到致病位点相关信息。
所述的一种针对神经肌肉病的高通量检测方法，其特征在于所述的步骤1）中基因组DNA来源于人类。
所述的一种针对神经肌肉病的高通量检测方法，其特征在于所述的步骤1）中提取方法包括纯化柱纯化、磁珠纯化或酚氯仿提取。
所述的一种针对神经肌肉病的高通量检测方法，其特征在于所述的步骤2）中定量方法包括基于荧光定量原理的定量装置定量、Q-PCR定量和电泳。
所述的一种针对神经肌肉病的高通量检测方法，其特征在于所述的步骤3）中DNA片段化方法包括超声破碎、转座酶酶切和限制性内切酶酶切。
所述的一种针对神经肌肉病的高通量检测方法，其特征在于所述的步骤7）中探针为针对神经肌肉病相关基因、相关突变点设计得到。
所述的一种针对神经肌肉病的高通量检测方法，其特征在于所述的步骤7）中探针包括CLCN1、SCN4A、CACNA1S、KCNJ2、TIA1、GNE、MYH7、NEB、FLNC、SEPN1、POMT2、VCP、DMD、MYOT、LMNA、CAV3、CAPN3、DYSF、SGCG、SGCA、SGCB、SGCD、TCAP、TRIM32、POMT1、ANO5、FKTN、BAG3、AGL、DAG1、PLEC、EMD的至少一种。
所述的一种针对神经肌肉病的高通量检测方法，其特征在于所述的步骤7）中捕获方法包括液相探针捕获、固相芯片杂交捕获和PCR富集。
所述的一种针对神经肌肉病的高通量检测方法，其特征在于所述的步骤10）中定量方法包括基于荧光定量原理的定量装置定量、Q-PCR定量和电泳。
所述的一种针对神经肌肉病的高通量检测方法，其特征在于所述的步骤11）中上机测序通过二代测序平台进行。
所述的一种针对神经肌肉病的高通量检测方法，其特征在于所述的步骤12）通过对所得测序数据与人类基因组的参考序列进性对比，最终对所测基因的每个突变位点情况进行分析，得到致病突变相关信息。
所述的利用所述的方法检测神经肌肉病相关致病突变位点基因的试剂盒。
所述的一种检测神经肌肉病相关致病突变位点的系统，包括：
核酸抽提装置，所述核酸抽提装置适用于从检测对象中分离基因组DNA；
文库制备装置，所述文库制备装置适用于以基因组DNA为样品进行神经肌肉病相关基因的捕获文库的制备；
测序装置，所述测序装置适用于对所述扩增产物进行测序，以便得到测序结果；
分析装置，所述分析装置适用于基于所述测序结果，确定神经肌肉病治病突变情况。
所述的系统，其特征在于所述分析装置进一步包括比对单元，所述比对单元中存储有参考序列，用于将所述测序结果与参照序列进行比对，以便确定所述核酸样本是否存在突变。
本发明采用上述技术方案，以现有技术相比，具有如下技术效果：本发明针对神经肌肉病相关突变检测，提供了一种针对神经肌肉病多个相关位点的高通量检测方法，该方法能够同时对一个样本的多个神经肌肉病相关突变进行分析。
附图说明
图1是根据本发明一个实施例的检测神经肌肉病相关突变位点的方法流程示意图；
图2是根据本发明一个实施例的检测神经肌肉病相关突变位点的系统的结构示意图。
具体实施方式
如图1和2，本发明提供了一种针对神经肌肉病的高通量检测方法，包括以下步骤：
1）提取检测对象的基因组DNA；
2）对提取的基因组DNA进行定量，并取3μg进行如下步骤建库；
3）将基因组DNA进行片段化；
4）将片段化的基因组DNA进行末端修复和3’末端添加碱基A；
5）将3’末端添加碱基A的产物连接扩增接头，以便进行有效连接产物的富集；
6）将连接产物进行PCR扩增，富集有效产物；
7）使用探针对富集的模板中的目标区域进行捕获；
8）将捕获的目标片段分离；
9）加上完整接头获得捕获文库；
10）对文库进行定量操作；
11）上机测序；
12）数据分析得到致病位点相关信息。
本发明提供了一种针对神经肌肉病的高通量检测方法，主要技术流程：提取基因组DNA、文库制备、文库质检定量、上机测序及数据分析。具体如下：
根据本发明的一个实施例，目标基因捕获的方法不受限制。可以使用PCR富集的方法捕获目标基因。根据本发明的一个实施，可以使用生物素标记的液相探针与待测样品中的目标区域进行杂交，之后使用链霉亲和素标记的磁珠将杂交产物分离出来，最后通过PCR富集目标区域同时在目标区域两侧连接完整的接头，形成文库。由此，可以将目标基因序列从基因组中捕获并富集。
根据本发明的一个实施例，基因组DNA样本的来源并不受特别限制。根据本发明的一些具体实施例， 基因组DNA样本从是受检人的血浆中分离。根据本发明的进一步的实施例，优选基因组DNA样本是从神经肌肉型患者血浆中分离的。由此，可以有效地对神经肌肉病患者的基因组DNA样本进行检测。
根据本发明的一个实施例，探针是针对神经肌肉病32个基因的相关位点进行设计。
根据本发明的一个实施例，使用纯化柱纯化基因组DNA，之后进行凝胶回收电泳，确认DNA质量。
根据本发明的一个实施例，基因组DNA纯化定量,之后取3μg进行DNA片段化，其中使用的片段化方法包括但不限于超声破碎、转座酶酶切、限制性内切酶酶切，优先选用超声破碎。
根据本发明的一个实施例，将片段化DNA进行末端修复及3’末端添加碱基A。
根据本发明的一个实施例，将3’末端添加碱基A的产物连接扩增接头。
根据本发明的一个实施例，将连接产物进行PCR扩增。
根据本发明的一个实施例，将生物素标记探针与富集的样品中的目标区域进行杂交。
根据本发明的一个实施例，使用链霉亲和素标记磁珠将杂交有目区域DNA的探针捕获下来。
根据本发明的一个实施例，使用PCR富集捕获的目标区域DNA，同时在两端加上完整的文库接头序列。
根据本发明的一个实施例，将文库定量，使用的荧光定量分析仪定量包括但不限于Qubit。
根据本发明的一个实施例，使用以下引物序列进行第一次PCR扩增：
Primer F:
5’-ACACTCTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
Primer R:
5’-GTACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
根据本发明的一个实施例，使用Illumina公司通用的建库PCR引物进行第二次PCR扩增，包括一条通用的上游引物，和一条带有标签（Index）序列的下游引物，使用高效的PCR扩增酶进行PCR。使用带有标签（Index）序列的引物进行PCR以后，可以将不同来源的文库进行混合，然后上机测序。
PCR引物序列如下：
TrueSeq Universal Primer:
5’-
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’；
TrueSeq Primer-Index X :
5’-
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’；
其中，下划线N部分的碱基可以依据Illumina的官方说明使用多种碱基组合，从而产生更多的、不同标签的引物，用于不同的文库的区分。
根据本发明的一个实施例，为了有效提高建库各步骤中的产物纯度、减少杂质干扰、有利于后续步骤的进行，可以对文库制备中各步骤的产物进行纯化回收，纯化方法包括但不限于磁珠纯化、纯化柱纯化、琼脂糖胶电泳纯化、优选磁珠纯化。
根据本发明的一个实施例，使用Q-PCR的方法对测序文库进行质检定量，其中以Ilumina P5、P7作为引物，使用Illumina phix control kit v3作为标准品。
根据本发明的一个实施例，通过高通量测序平台进行测序，优选Illumina Miseq平台，并进行数据分析，确定是否存在突变。
下面将结合实施例1 具体地对本发明的方案进行解释。
实施例1
本实施例是采用Miseq测序技术对受检人血浆中的基因组DNA进行检测的，具体操作步骤如下:
1、按照说明书操作，使用Roche的High Pure PCR Template Preparation Kit提取受检人的血浆中的基因组DNA。
2、使用超声破碎仪将基因组DNA破碎成500bp左右的小片段。
本实施例中，使用Covaris超声破碎仪，按照标准操作，将3μg DNA片段化。
3、使用Agencourt AMPure XP 磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.5:1，用50μl去核酸酶水洗脱，具体操作如下：
| A | 将AMPure XP beads置于室温下至少30min。 |
| B | 将试剂漩涡震荡混合至颜色均匀一致。 |
| C | 向1.5ml 低吸附离心管中加入1.5倍的均匀的AMPure XP beads，取50μl PCR产物。移液器吹打混匀10次，室温放置5min。 |
| D | 将离心管放在磁力架上直至溶液澄清（大约3到5min）。 |
| E | 保持离心管在磁力架上。弃掉离心管中的上清时小心不要碰到磁珠。 |
| F | 继续保持离心管在磁力架上，向每个离心管中加入500μl的70%乙醇 |
| G | 将管子放置1min，使所有磁珠沉淀，弃掉乙醇 |
| H | 重复步骤F和G一次 |
| I | 在37℃加热模块中干燥样品5min或直到残余的乙醇完全消失。 |
| J | 加入50μl nuclease-free water，在漩涡混匀器上混匀，室温温育2min。 |
| K | 保持离心管在磁力架上，静置2到3min，直到溶液澄清。 |
| L | 将50μl左右的上清液转移至一个新的1.5ml离心管中。弃掉beads |
4、使用T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、T4 PNK进行末端修复。反应体系如下：
| 成份 | 体积（μl） |
| DNA sample | 48 |
| Nuclease-Free water | 35.2 |
| 10×End Repair Buffer | 10 |
| dNTP Mix | 1.6 |
| T4 DNA Polymerase | 1 |
| Klenow DNA Polymerase | 2 |
| T4 Polynucleotide Kinase | 2.2 |
反应条件为： 20℃，30min。
5、使用Agencourt AMPure XP 磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.5:1，用32μl洗脱，具体操作如下：
| A | 将AMPure XP beads置于室温下至少30min。 |
| B | 将试剂漩涡震荡混合至颜色均匀一致。 |
| C | 向1.5ml 低吸附离心管中加入1.5倍的均匀的AMPure XP beads，取50μl PCR产物。移液器吹打混匀10次，室温放置5min。 |
| D | 将离心管放在磁力架上直至溶液澄清（大约3到5min）。 |
| E | 保持离心管在磁力架上。弃掉离心管中的上清时小心不要碰到磁珠。 |
| F | 继续保持离心管在磁力架上，向每个离心管中加入500μl的70%乙醇 |
| G | 将管子放置1min，使所有磁珠沉淀，弃掉乙醇 |
| H | 重复步骤F和G一次 |
| I | 在37℃加热模块中干燥样品5min或直到残余的乙醇完全消失。 |
| J | 加入32μl nuclease-free water，在漩涡混匀器上混匀，室温温育2min。 |
| K | 保持离心管在磁力架上，静置2到3min，直到溶液澄清。 |
| L | 将32μl左右的上清液转移至一个新的1.5ml离心管中。弃掉beads |
6、使用Exo(-) Klenow酶进行3’端加A碱基。反应体积如下：
| 成份 | 体积（μl） |
| DNA sample | 30 |
| Nuclease-Free water | 11 |
| 10×Klenow Polymerase Buffer | 5 |
| dATP | 1 |
| Exo(-) Klenow | 3 |
反应条件为：37℃，30min。
7、使用Agencourt AMPure XP 磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.5:1，用15μl洗脱，具体操作如下：
| A | 将AMPure XP beads置于室温下至少30min。 |
| B | 将试剂漩涡震荡混合至颜色均匀一致。 |
| C | 向1.5ml 低吸附离心管中加入1.5倍的均匀的AMPure XP beads，取50μl PCR产物。移液器吹打混匀10次，室温放置5min。 |
| D | 将离心管放在磁力架上直至溶液澄清（大约3到5min）。 |
| E | 保持离心管在磁力架上。弃掉离心管中的上清时小心不要碰到磁珠。 |
| F | 继续保持离心管在磁力架上，向每个离心管中加入500μl的70%乙醇 |
| G | 将管子放置1min，使所有磁珠沉淀，弃掉乙醇 |
| H | 重复步骤F和G一次 |
| I | 在37℃加热模块中干燥样品5min或直到残余的乙醇完全消失。 |
| J | 加入15μl nuclease-free water，在漩涡混匀器上混匀，室温温育2min。 |
| K | 保持离心管在磁力架上，静置2到3min，直到溶液澄清。 |
| L | 将15μl左右的上清液转移至一个新的1.5ml离心管中。弃掉beads |
8、使用TA DNA连接酶在模板两端加接头序列。反应体系如下：
| 成份 | 体积（μl） |
| DNA sample | 13 |
| Nuclease-Free water | 15,5 |
| 5×T4 DNA Ligase Buffer | 10 |
| Adaptor Mix | 10 |
| T4 DNA Ligase | 1.5 |
反应条件为：20℃，15min。
9、使用Agencourt AMPure XP 磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.5:1，用32μl洗脱，具体操作如下：
| A | 将AMPure XP beads置于室温下至少30min。 |
| B | 将试剂漩涡震荡混合至颜色均匀一致。 |
| C | 向1.5ml 低吸附离心管中加入1.5倍的均匀的AMPure XP beads，取50μl PCR产物。移液器吹打混匀10次，室温放置5min。 |
| D | 将离心管放在磁力架上直至溶液澄清（大约3到5min）。 |
| E | 保持离心管在磁力架上。弃掉离心管中的上清时小心不要碰到磁珠。 |
| F | 继续保持离心管在磁力架上，向每个离心管中加入500μl的70%乙醇 |
| G | 将管子放置1min，使所有磁珠沉淀，弃掉乙醇 |
| H | 重复步骤F和G一次 |
| I | 在37℃加热模块中干燥样品5min或直到残余的乙醇完全消失。 |
| J | 加入32μl nuclease-free water，在漩涡混匀器上混匀，室温温育2min。 |
| K | 保持离心管在磁力架上，静置2到3min，直到溶液澄清。 |
| L | 将32μl左右的上清液转移至一个新的1.5ml离心管中。弃掉beads |
10、对连接产物进行扩增，反应体系如下：
| 成份 | 体积（μl） |
| Indexing Adaptor-ligated library | 15 |
| Nuclease-Free water | 21 |
| Primer F | 1.25 |
| Primer R | 1.25 |
| 5× PCR Buffer | 10 |
| 100mM dNTP Mix | 0.5 |
| DNA Polymerase | 1 |
PCR反应条件为：98℃预变性2min;98℃变性30s,65℃退火30s,72℃延伸1min,共循环4次；最终72℃延伸10min。由此，获得PCR产物。
备注：
Primer F:
5’-ACACTCTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’ ；
Primer R:
5’-GTACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’。
11、使用Agencourt AMPure XP 磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.5:1，用30μl洗脱，具体操作如下：
| A | 将AMPure XP beads置于室温下至少30min。 |
| B | 将试剂漩涡震荡混合至颜色均匀一致。 |
| C | 向1.5ml 低吸附离心管中加入1.5倍的均匀的AMPure XP beads，取50μl PCR产物。移液器吹打混匀10次，室温放置5min。 |
| D | 将离心管放在磁力架上直至溶液澄清（大约3到5min）。 |
| E | 保持离心管在磁力架上。弃掉离心管中的上清时小心不要碰到磁珠。 |
| F | 继续保持离心管在磁力架上，向每个离心管中加入500μl的70%乙醇 |
| G | 将管子放置1min，使所有磁珠沉淀，弃掉乙醇 |
| H | 重复步骤F和G一次 |
| I | 在37℃加热模块中干燥样品5min或直到残余的乙醇完全消失。 |
| J | 加入30μl nuclease-free water，在漩涡混匀器上混匀，室温温育2min。 |
| K | 保持离心管在磁力架上，静置2到3min，直到溶液澄清。 |
| L | 将30μl左右的上清液转移至一个新的1.5ml离心管中。弃掉beads |
12、使用生物素标记的探针与样品杂交，反应如下体系：
| 成份 | 体积（μl） |
| library | 3.4 |
| Hybridization buffer | 13 |
| Capture Liprary | 7 |
| Block Buffer | 5.6 |
反应条件为：95℃,5min变性，之后保持在65℃，16-24h
13、使用链霉亲和素标记的磁珠，通过生物素与链霉亲和素结合，将杂交有样品目标序列的探针捕获到磁珠上。步骤如下：
14、使用DNA聚合酶对捕获到的目标序列进行扩增。反应体系如下：
| 成份 | 体积（μl） |
| Capture on DNA | 14 |
| Nuclease-Free water | 22.5 |
| 5× PCR Buffer | 10 |
| TrueSeq Universal Primer | 1 |
| TrueSeq Primer-Index4 | 1 |
| 100mM dNTP Mix | 0.5 |
| DNA Polymerase | 1 |
PCR反应条件为：98℃预变性2min;98℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸1min,共循环12次；最终72℃延伸10min。由此，获得PCR产物。
备注：PCR引物序列如下：
TrueSeq Universal Primer:
5’-
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’；
TrueSeq Primer-Index4 :
5’-
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’。
15、使用Agencourt AMPure XP 磁珠纯化样品，磁珠与样品体积比为1.8:1，用30μl去核酸酶水洗脱，具体操作如下：
| A | 将AMPure XP beads置于室温下至少30min。 |
| B | 将试剂漩涡震荡混合至颜色均匀一致。 |
| C | 向1.5ml 低吸附离心管中加入1.8的均匀的AMPure XP beads，取50μl PCR产物。移液器吹打混匀10次，室温放置5min。 |
| D | 将离心管放在磁力架上直至溶液澄清（大约3到5min）。 |
| E | 保持离心管在磁力架上。弃掉离心管中的上清时小心不要碰到磁珠。 |
| F | 继续保持离心管在磁力架上，向每个离心管中加入500μl的70%乙醇 |
| G | 将管子放置1min，使所有磁珠沉淀，弃掉乙醇 |
| H | 重复步骤F和G一次 |
| I | 在37℃加热模块中干燥样品5min或直到残余的乙醇完全消失。 |
| J | 加入30μl nuclease-free water，在漩涡混匀器上混匀，室温温育2min。 |
| K | 保持离心管在磁力架上，静置2到3min，直到溶液澄清。 |
| L | 将30μl左右的上清液转移至一个新的1.5ml离心管中。弃掉beads |
16、文库质检定量。
将上一步得到的文库Qubit® 2.0（Invitrogen）进行定量，使用Q-PCR进行质检。
17、机测序及数据分析。
将样本使用Illumina Miseq PE-300程序进行双末端测序，以便获得测序结果，具体操作流程详见Miseq操作说明书。
18、数据分析。
Miseq产出的测序结果是fastq形式的DNA序列，对于illumina Miseq 产生的原始数据进行质控以获得高质量数据，将reads在人类基因组上进行定位，根据reads定位信息获取原始SNP信息，对原始SNP信息进行质控以获得高质量的SNP位点，利用多个数据库对产生的高质量SNP位点进行注释，将注释过的SNP位点信息更新到ALMD (AmplicongeneLeiden Muscular Dystrophy Database)中，并使用ALMD对SNP位点进行进一步注释，配合临床表型对可疑位点进行筛选，对于未找到可疑位点的样本进行CNV（拷贝数据变异）筛选，整理诊断报告，具体结果如下：
在本文中所使用的术语”SNP”为单核苷酸多态性（英文：Single NucleotidePolymorphisms，缩写为SNP）指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入。
在本文中所使用的术语”DNA”为脱氧核糖核酸（英文：Deoxyribonucleicacid，缩写为DNA）是一种由脱氧核糖核苷酸组成的双链分子。可组成遗传指令，引导生物发育与生命机能运行，其碱基排列顺序构成了遗传信息，所以在遗传病的诊断中具有重要的作用。
在本文中所使用的术语”Q-PCR”为实时荧光定量核酸扩增（英文：Real-timeQuantitative PCR）。一种利用荧光检测达到实时检测PCR状况的PCR技术。
在本文中所使用的术语“高通量测序技术”指的是第二代高通量测序技术及之后发展的更高通量的测序方法。第二代高通量测序平台包括但不限于Illumina-Solexa（Miseq、Hiseq-2000、Hiseq-2500、Hiseq X ten等）、ABI-Solid和Roche-454测序平台等。随着测序技术的不断发展，本领域技术人员能够理解的是还可以采用其他方法的测序方法和装置进行本检测。根据本发明的具体示例，可以将根据本发明实施例的核酸标签用于Illumina-Solexa、ABI-Solid和Roche-454测序平台等的至少一种进行测序。
高通量测序技术，例如Miseq测序技术具有以下优势：（1）高灵敏度：高通量测序，例如Miseq的测序通量大，目前一个实验流程下来可以产生最多15G碱基数据，高的数据通量可以再测序序列数确定的情况下，使得每条序列获得高的测序深度，所以可以检测到含量更低的突变，同时因其测序深度高，其测序结果也更为可靠。（2）高通量，低成本：利用根据本发明实施例的标签序列，通过一次测序可以检测上万份样本，从而大大降低了成本。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海昂朴生物科技有限公司 复旦大学附属华山医院
<120> 一种针对神经肌肉病的高通量检测方法
<130> 11
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
acactctctt tccctacacg acgctcttcc gatct 35
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gtactggagt tcagacgtgt gctcttccga tct 33
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 4
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 4
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atct 64
Claims (7)
1.一种探针在制备检测神经肌肉病相关致病突变位点基因的试剂盒中的应用，所述探针包括检测CLCN1、SCN4A、CACNA1S、KCNJ2、TIA1、GNE、MYH7、NEB、FLNC、SEPN1、POMT2、VCP、DMD、MYOT、LMNA、CAV3、CAPN3、DYSF、SGCG、SGCA、SGCB、SGCD、TCAP、TRIM32、POMT1、ANO5、FKTN、BAG3、AGL、DAG1、PLEC和EMD的探针；检测步骤包括：
1）提取检测人类的基因组DNA；
2）对提取的基因组DNA进行定量，并取3μg进行如下步骤建库；
3）将基因组DNA进行片段化；
4）将片段化的基因组DNA进行末端修复和3’末端添加碱基A；
5）将3’末端添加碱基A的产物连接扩增接头，以便进行有效连接产物的富集；
6）将连接产物进行PCR扩增，富集有效产物；
7）使用探针对富集的模板中的目标区域进行捕获；
8）将捕获的目标片段分离；
9）加上完整接头获得捕获文库，其中使用DNA聚合酶对捕获到的目标序列进行PCR扩增；
10）对文库进行定量操作；
11）上机测序；
12）数据分析得到致病位点相关信息，
其中，使用以下引物序列进行第一次PCR扩增：
Primer F：
5’-ACACTCTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’；
Primer R：
5’-GTACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’；
通用的建库PCR引物进行第二次PCR扩增，PCR引物序列如下：
TrueSeq Universal Primer：
5’-
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’；
TrueSeq Primer-Index X：
5’-
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’；
其中，下划线N部分的碱基使用多种碱基组合，从而产生更多的、不同标签的引物。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的步骤1）中提取方法包括纯化柱纯化、磁珠纯化或酚氯仿提取。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的步骤2）中定量方法包括基于荧光定量原理的定量装置定量、Q-PCR定量和电泳。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的步骤3）中DNA片段化方法包括超声破碎、转座酶酶切和限制性内切酶酶切。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的步骤10）中定量方法包括基于荧光定量原理的定量装置定量、Q-PCR定量和电泳。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的步骤11）中上机测序通过二代测序平台进行。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的步骤12）通过对所得测序数据与人类基因组的参考序列进性对比，最终对所测基因的每个突变位点情况进行分析，得到致病突变相关信息。
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