CN107937508A - 一种致心律失常性右室发育不良心肌病基因诊断试剂盒 - Google Patents

一种致心律失常性右室发育不良心肌病基因诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种致心律失常性右室发育不良心肌病基因诊断试剂盒，其特征在于：该技术涉及一种应用大规模平行测序平台NGS技术检测致心律失常性右室发育不良心肌病基因诊断试剂盒。本发明的主要特征在于：A.独特设计并制备捕获探针，针对基因CTNNA3、DES、DSC2、DSG2、DSP、JUP、LMNA、PKP2、RYR2、TGFB3、TMEM43、TTN全部外显子片段；B.设计独特带有标签序列的接头；C.通用引物对探针序列进行PCR扩增；D.设计独特的混合后目的片段的捕获操作。

Description

一种致心律失常性右室发育不良心肌病基因诊断试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学诊断和生物技术，涉及一种致心律失常性右室发育不良心肌病基因突变的体外诊断试剂盒，是一种应用于新一代测序平台NGS技术的一种致心律失常性右室发育不良心肌病基因诊断试剂盒。
技术背景
致心律失常性右室心肌病(ARVC)又称心律失常右室性发育不良(ARVD)，是一种少见的遗传性心肌病，以右室心肌纤维化、脂肪沉积为病变的基础，临床上表现为快速的室性、室上性心律失常，进行性右室心衰竭以及猝死，部分患者无明显症状而以猝死为首发表现。ARVC是一种常染色体遗传性疾病，根据临床研究，在人群中的发病率约为1/1000-1/5000，同时ARVC也是造成年轻人尤其是运动员猝死的重要原因之一。
Sanger测序作为传统的测序技术，一次反应只能对一段碱基序列进行测定，虽然精准但是效率低，单核苷酸测序成本高。而针对具有遗传异质性的复杂疾病的研究，通常需要对数个甚至数十个基因的全部编码区域进行测序以寻找有价值的突变信息，Sanger测序发不能满足测序的要求。NGS技术又称高通量测序技术，一次对几十万至几百万条DNA分子进行序列测定，大大提高了测序效率，降低了单个碱基测序成本。目前NGS技术在将抗领域的广泛应用，使研究人员对疾病与遗传物质关系的研究达到了新的高度。
NGS技术诊断的优势在于：
1)方便，安全，快捷：仅抽取2-4毫升血；
2)任何时间都可以检查；
3)不限制饮食，服药，任何身体状况都可以检测；
4)相比反复，多项传统检查，更为经济；
5)发病前，疾病极早期诊断的唯一方式；
6)源头确诊，一次检测，终身受益
本发明是在现有的NGS技术之上，通过自主设计捕获全部目的基因的探针，并对探针和反应体系的不断优化，不仅可以一次性检测全部致心律失常性右室发育不良心肌病的致病基因，更提高了检测的准确度，并极大的降低了测序的成本，使之广泛用于临床成为可能。
发明内容
本发明的目的是，提供一种致心律失常性右室发育不良心肌病相关基因突变的目标捕获再测序的试剂盒。该试剂盒提高了基因捕获的通量和基因平行测序的通量，操作简便、成本低。
为实现上述目的，本发明采用捕获目的CTNNA3、DES、DSC2、DSG2、DSP、JUP、LMNA、PKP2、RYR2、TGFB3、TMEM43、TTN基因全部外显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针；用于扩增待测片段的通用引物；测序接头序列；缓冲液；dNTP；高保真聚合酶；链霉素磁珠。本发明采用的技术方案是：一种新的目标捕获再测序方法，包括以下步骤：
A.设计并制备用于捕获致心律失常性右室发育不良心肌病相关基因突变的探针。并将这些探针结合在磁珠、薄膜或者玻片上。
B.将待测基因DNA样品分别片段化至200-400bp，然后将末端补平，加入的ATP使片段两端引入粘性末端。
C.分别加入Illumina公司DNA Sample Prep Kit中设计好的一端带有标签序列的接头序列片段，加入连接酶，使每个片段都与的一对接头连接，形成新的片段。
D.调节反应温度激活DNA聚合酶，用一对Illumina公司Index Kit-PCRprimers通用引物，对步骤c所得不同基因组完成连接的片段序列混合后进行PCR扩增反应；
E.将步骤d所得全部样品的PCR扩增反应产物与步骤a所设计的捕获探针杂交，然后经过多次洗脱纯化反应，得到待测片段。
F.将待测片段通过illumina公司Miseq测序仪的标准方案进行大规模平行测序。
G.将得到的测序结果同标准数据库进行比较，得到诊断结果。
为实现上述技术方案，步骤A所述的捕获探针是脱氧核糖核酸(DNA)，或是核糖核酸(RNA)组成，但不仅限于DNA和RNA。探针为120bp的与目标互补的片段组成。探针可以是结合在磁珠上的，也可以结合在载玻片上，但不仅限于这些介质。链霉素磁珠材质是铝镍钴系永磁合金或是钡铁氧体、钕铁硼永磁材料、橡胶磁，但不仅限于这些材质。
其中，步骤A所述的捕获探针，包括覆盖以下基因CTNNA3、DES、DSC2、DSG2、DSP、JUP、LMNA、PKP2、RYR2、TGFB3、TMEM43、TTN全部编码外显子片段和两端50bp范围内的序列。这些探针以叠瓦式设计，片段长度为50bp-180bp，最优为75bp；片段长度为60bp-200bp，最优为80bp；片段长度为65bp-220bp，最优为85bp；片段长度为70bp-240bp，最优为90bp；探针之间重叠部分为5-20bp，最优为8bp；目标区碱基的探针覆盖度为1×至10x，最优为3×。
本发明的主要优点在于：
1.本发明可以在一次测序反应中同时进行多个不同来源样本全部致心律失常性右室发育不良心肌病相关基因的检测；全部序列直接测出，准确率可以达到99.99％。
2.本发明的试剂盒可以一次完成1-48个样品的平行捕获，提高了捕获效率，极大地降低了样品准备的成本。
3.本发明的试剂盒可以一次完成1-1152个样品的全部致心律失常性右室发育不良心肌病相关基因，近4000条序列的平行检测，充分利用设备的高通量特性，极大降低了每个样品的测序成本。
4.本发明的试剂盒可以一次反应同时分辨错义、插入和缺失突变。大大增加了临床检出率和准确性。
5.本发明的检测方法步骤简单，减少重复操作的环节，因而避免了复杂操作过程中存在的诸多不确定引物，提高了检测准确率和稳定性。
6.本发明所提供的检测方法所需时间大大少于sanger法的测序技术.
7.实例：在完成同样的检测量(100人份的检测量)，sanger法需要2个人工同时工作一周。我们的方法只需要一个人在一天内完成全部的检测量。
8.检测的准确度大大优于基因芯片技术，更符合临床检测要求。基因芯片只能检测碱基错义突变，而插入和缺失突变无法同时检测。我们的方法可以同时检测错义、插入、缺失和可变剪切的基因突变。
具体实施方式
下面用实施例仅是对本发明实际应用的举例描述，本发明的实际应用不仅限于以下实施例：
1.下面通过实施例的方式对本发明进一步详细、完整的说明，但并不将本发明限制在所述的实施例范围之中。
2.采用TIANamp Blood DNA Midi Kit(DP332)对待测样品进行基因组提取，洗脱缓冲液(TE)体积不少于200μL，OD260/280值达到1.8～2.0，取2μL 25ng/μL的DNA做为起始模板.
3.用Qubit对样品进行定量，定量后用ddH2O将g DNA样品稀释至25ng/μL。
4.建库
5.基因组样品DNA片段化及加接头与标签
6.取1.5ml Ethanol加入到4.5ml TargetCap Stop Solution溶液中，充分混匀，使Ethanol的终浓度为25％。将1X的TargetCap Stop Solution放置室温。
7.取出Purification Beads放置室温，孵育至少30min。
8.配置70％的Ethanol溶液。
9.提前10min开启PCR仪预热，设置PCR仪程序如下：
45℃ 10min
4℃ 1min
4℃ ∞
10.将TargetCap Frag-Tag Buffer高速涡旋混匀，取17ml加入到每个PCR管中；
11.取2μL浓度为25ng/μL的样品加入到上述PCR管中；
12.将TargetCap Frag-Tag Enzyme Mix高速涡旋混匀，取2μL加入到含有样品的PCR管中；
13.盖上管盖，高速剧烈涡旋20s后，离心5s，立即放置于设置好体系的PCR仪中；
14.PCR完成后，4℃孵育1min，立即将PCR管转移到冰上；
15.每个反应管中加入32μL 1X TargetCap Stop Solution，剧烈涡旋振荡5s，室温孵育1min。
16.使用Purification Beads纯化接头——标签文库
17.剧烈涡旋振荡Purification Beads，使其均一无沉淀；
18.取52μL重悬浮的Purification Beads到每一个含DNA样品的管中，旋紧管盖，涡旋振荡5s，瞬离，室温孵育5min；
19.将平板放在磁力架上，室温静止5min，直到溶液清澈；
20.保持平板在磁力架上，弃上清，当吸取上清液时，避免碰到PurificationBeads；
21.继续保持平板试管在磁力架上，然后向每个样品孔中加入200μL 70％Ethanol溶液，孵育1min，吸弃Ethanol。重复该步骤一次。
22.将平板试管放置37℃1-3min或室温放置3min，使样品干燥，；
23.取下平板，分别向每个样品孔中加入11μL ddH2O，涡旋混匀并瞬离后，室温孵育2min；
24.将平板放在磁力架上，室温静止2min，直到溶液清澈；
25.用移液器吸取上清液(约10μL)转移到置于冰上的PCR管中，备用。
26.扩增接头——标签文库DNA
27.准备PCR反应混合液(单位μL)
28.取上述反应液40μL加入到纯化后的DNA文库样品管中，涡旋混合5s，瞬离；
29.按以下程序(50体系)
30.使用Purification Beads纯化扩增后的文库
31.将扩增后的样品转移至室温，加入50μL悬浮的Purification Beads，盖上管盖，涡旋振荡5s后瞬离，室温孵育5min；
32.将样品管放到磁力架上，室温放置3-5min；
33.保持其在磁力架上，吸弃上清后，向每管中加入200μL 70％的Ethanol溶液，静止1min，重复该步骤一次；
34.放置37℃1-3min或室温3min，使样品干燥，向每个样品孔中加入13μL ddH2O，涡旋混匀并离心后，室温孵育2min；
35.将样品管置于磁力架上静止2min，用移液器吸取上清至干净的PCR管中，备用。
36.评估文库DNA的质量及浓度
37.将D1000 Lodder与D1000 Buffer提前30min取出置于室温；
38.按照Lodder/Sample：Buffer＝1∶3的比例加入；
39.DNA片段大小位于245～325bp(最高峰值E(245，325))
40.杂交与捕获
41.按照要求准备杂交的DNA文库样品；
42.杂交捕获＞3Mb，加入750～1500ng DNA文库至一个干净PCR管中，加入适量的ddH2O，使溶液终体积为12ul。(62.5～125ng/μL)；
43.杂交捕获＜3Mb，加入500～750ng DNA文库至一个干净PCR管中，加入适量的ddH2O，使溶液终体积为12ul。(41.7～62.5ng/μL)；
44.用探针进行杂交
TargetCapHyb Buffer -20℃→RT
TargetCapHyb Blocker Mix -20℃→Ice
TargetCap RNase Block -20℃→Ice
Capture Library -80℃→Ice
45.向Capture Library冻干粉中加入200μL ddH2O复溶后，置于冰上；
46.取50μLTargetCap RNase Block加入到150μLddH2O中，配置成25％的TargetCap RNase Block溶液；
47.按以下比例配置捕获探针混合液，涡旋振荡混匀，瞬离；
48.向每一个接头一标签DNA样品，加入5μL TargetCapHyb Blocker Mix，吹打混匀，涡旋震荡5s，瞬离；
49.将样品转移到PCR仪中，设置以下反应程序：
50.在完成上述步骤2后暂停，向样品管中加入13μL捕获探针混合溶液，吹打混匀；
51.为减少蒸发，立即换上新盖子，将样品封闭，继续PCR。
52.准备链霉亲和素磁珠进行杂交捕获
53.剧烈悬浮Streptavidin T1 Magnetic Beads；
54.别向新的1.5ml离心管中加入50μL悬浮的Streptavidin T1 Magnetic Beads；
55.向每个离心管中加入200μL TargetCap Binding Buffer，用移液器吹打混匀，放置到磁力架上，静止5min，移去上清；重复该步骤2次。
56.捕获
57.样品杂交完成后，转移至室温；
58.用多道移液器将杂交后的样品转移到上述已经清洗过的200μL链霉素磁珠中，1800rpm，室温孵育30min；
59.在65℃条件下预热TargetCap Wash Buffer 2；
60.当孵育结束，把离心管温和离心后，放置在磁力架上，静止1min，吸弃上清；
61.分别向每个样品管中加入200μL TargetCap Wash Buffer 1，吹打混匀，重悬浮Streptavidin T1 Magnetic Beads后，置于磁力架上，静止1min，待溶液清澈后吸弃上清；
62.将样品管从磁力架上拿下，置于室温，分别向每个样品管中加入200μL预热后的TargetCap Wash Buffer 2，吹打混匀，重悬浮Streptavidin T1 Magnetic Beads；
63.盖上管盖，剧烈涡旋振荡5s后，瞬离；
64.将样品放置65℃下孵育5min后，移至磁力架上，静止1min，待溶液清澈后吸弃上清；
65.重复步骤62-64次；
66.轻轻涡旋样品管，吸弃残留的TargetCap Wash Buffer 2，从磁力架上拿下；
67.向每个样品管中加入23μL ddH2O，置于冰上。
68.序列标签及PCR
69.在冰上按以下反应体系配制PCR反应混合液：
试剂 1个反应 16个反应
Nuclease-free water 13.5uL 229.5uL
5×PCR Reaction Buffer 10uL 170uL
dNTP Mix(25mM each) 0.5uL 8.5uL
DNA Polymerase 1uL 17uL
Total 25uL 425uL
70.分别向每个样品管中加入25μL上述PCR反应混合液；
71.分别向每个样品管中加入1μL P701～P712；
72.分别向每个样品管中加入1μL P501～P508；
73.将上述溶液混合均匀后，依照以下条件设置PCR反应体系：
74.PCR反应完成后，将样品管转移至磁力架上，室温放置2min，待溶液清澈后，将液体转移至新的管中，备用，丢弃磁珠。
75.Purification Beads纯化扩增的捕获文库
76.使用前将Purification Beads置于室温，孵育30min，吹打混匀；
77.分别向每个样品管中加入60μL混匀的Purification Beads，吹打混匀后室温孵育5min；
78.将样品管转移至磁力架上，室温静止5min，待液体澄清后吸弃上清；
79.向每个样品管中加入200μL70％的Ethanol溶液室温孵育1min后吸弃液体，重复1次；
80.保持样品管在磁力架上，室温放置3min，使Ethanol挥发；
81.将样品管从磁力架取下，向每个样品管中加入25μL ddH2O，用移液器吹打混匀，室温孵育2min；
82.将样品管置于磁力架上，静止2min，待溶液清澈后，吸取上清至新的样品管中；
83.使用Agilent 2200 TapeStation进行定量。
84.样品在illumina公司的Miseq进行上机测序。
85.数据结果通过CLC Genomics Workbench 7.0进行生物信息学分析。
86.结论
87.通过1次测序，2天完成270个样品所有目的基因631条序列的测序工作，测序总数达到9095960条。用ABI3730xl进行所有基因的平行对照，突变检出率为65％。而本方案的测序突变检出率达到88％，检验准确率100％。

Claims (11)

1.一种致心律失常性右室发育不良心肌病基因诊断试剂盒，其包括：捕获目的CTNNA3、DES、DSC2、DSG2、DSP、JUP、LMNA、PKP2、RYR2、TGFB3、TMEM43、TTN基因全部外显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针；用于扩增待测片段的通用引物；测序接头序列；缓冲液；dNTP；高保真聚合酶；链霉素磁珠。
2.根据权利要求1所述“一种致心律失常性右室发育不良心肌病基因诊断试剂盒”，全部探针在3’采用生物素修饰。
3.根据权利要求1所述“一种致心律失常性右室发育不良心肌病基因诊断试剂盒”这种探针是寡聚核糖核酸(RNA)，或寡聚脱氧核糖核酸(DNA)，但是不仅限于RNA和DNA，可以包括生物素、荧光或者同位素等修饰后的DNA或者RNA。
4.根据权利要求1所述“一种致心律失常性右室发育不良心肌病基因诊断试剂盒”的探针是结合在磁珠上的，或结合在载玻片上，但不仅限于这些介质。
5.根据权利要求1所述“一种致心律失常性右室发育不良心肌病基因诊断试剂盒”的探针针对目标区域以高密度叠瓦式设计，探针序列与CTNNA3、DES、DSC2、DSG2、DSP、JUP、LMNA、PKP2、RYR2、TGFB3、TMEM43、TTN为互补序列。
6.根据权利要求1所述“一种致心律失常性右室发育不良心肌病基因诊断试剂盒”探针长度在50-180bp，最优为75bp。
7.根据权利要求1所述“一种致心律失常性右室发育不良心肌病基因诊断试剂盒”探针长度在60-200bp，最优为80bp。
8.根据权利要求1所述“一种致心律失常性右室发育不良心肌病基因诊断试剂盒”探针长度在65-2200bp，最优为85bp。
9.根据权利要求1所述“一种致心律失常性右室发育不良心肌病基因诊断试剂盒”探针长度在70-240bp，最优为90bp。
10.根据权利要求1所述“一种致心律失常性右室发育不良心肌病基因诊断试剂盒”探针重叠部分适宜范围为5bp-20bp，最优为8bp。
11.根据权利要求1所述“一种致心律失常性右室发育不良心肌病基因诊断试剂盒”链霉素磁珠材质是铝镍钴系永磁合金或是钡铁氧体、钕铁硼永磁材料、橡胶磁，但不仅限于这些材质。
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