CN102965428A

CN102965428A - 一种检验鉴别遗传性心肌肥厚相关基因突变的试剂盒

Info

Publication number: CN102965428A
Application number: CN 201110293856
Authority: CN
Inventors: 侯青
Original assignee: Kang Xu Gene Technology (beijing) Co Ltd
Current assignee: Kang Xu Gene Technology (beijing) Co Ltd
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2011-09-30
Publication date: 2013-03-13

Abstract

本发明涉及一种检测遗传性心肌肥厚相关基因突变样品制备试剂盒。具体的涉及一种应用大规模平行测序平台技术检测遗传性心肌肥厚相关基因的产品，该试剂盒包括a)独特设计并制备捕获探针，针对基因ACTC1、ACTN2、BRAF、CALR3、CASQ2、CSRP3、GLA、HRAS、JPH2、KRAS、LAMP2、LDB3、MAP2K1、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、PRKAG2、RAF1、SOS1、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、TTR、VCL全部外显子片段；b)设计独特带有标签序列的接头；c)通用引物对探针序列进行PCR扩增；d)设计独特的混合后目的片段的捕获操作。这个方法和试剂盒制备的大规模平行测序平台样品通量大、效率高、操作简便，极大地降低了测序检验成本。

Description

一种检验鉴别遗传性心肌肥厚相关基因突变的试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学诊断和生物技术，涉及一种检测肥厚型心肌病相关基因突变的体外诊断试剂盒，具体的是一种采用大规模平行测序平台技术检验鉴别遗传性心肌肥厚相关基因突变的试剂盒。

技术背景

心室肌肥厚是一种症状或者说是一种临床表现，并不是病名.关于心室肌肥厚，定义就是在心脏中，心室心肌形态上发生变化，数量上增加，造成心室室壁的增厚，而心室的室腔相对空间减小，血容量减少。对于造成心室肌肥厚的原因有多种，比如高血压，冠心病，肥厚性心肌病，瓣膜病(如主动脉关闭不全)等.除了上述原因外，还有一些遗传因素造成的代谢障碍、心肌发育过程障碍也会引起心肌肥厚。这些疾病多数起病隐匿、临床表现相似，物理检查差异不大，但是治疗方法和预后方面存在巨大的差异。

最常见的遗传性心肌肥厚的原因是肥厚型心肌病。肥厚型心肌病(HCM)是一种原发性的心肌疾病，表现为不明原因的左心室和/或右心室以及室间隔非对称性的肥厚。它的病理学特征是肥厚心肌细胞紊乱。临床表现多样，可以无症状，亦可表现为心衰、心律失常、猝死等恶性心脏事件，是年轻人心源性猝死的首位病因，年死亡率1-6％。过去认为HCM是一种罕见的心脏疾病。但近年流行病学调查显示白人HCM的发病率高达0.2％。而我国HCM患者超过200万。可见HCM不再是所谓的罕见疾病。巨大的患病群体和严重的临床预后以及患者带病生存的质量差，造成了巨大的社会和家庭负担。

西方发达国家20年前就系统地开展了HCM分子遗传学研究，已公认的遗传度最高的心血管疾病，并明确HCM为常染色体显性遗传的单基因疾病，即后代只要继承了父母任何一方(患病者)的含突变基因的染色体即可能发病。已经发现至少15个突变基因、超过700个位点突变是HCM的病因。

对于心肌肥厚疾病的鉴别诊断传统的方法主要依靠临床表现、心电图、超声心动图和心脏核磁。这些手段存在很大的缺点：1.心室肥厚出现时间差异性大，早期无肥厚，有的出现肥厚需几十年时间；2.导致心室肥厚因素众多，不仅有时与高血压难以鉴别，还有很多疾病表现出与HCM完全一致的心脏大体形态学特点，例如Fabry病是一个性连锁遗传的溶酶体Ot.半乳糖奇酶缺乏性疾病。此病属于性连锁遗传，致病基因定位在Xq22，目前已经在此基因区内发现了150个基因突变，其中错义点突变75％，基因缺失占15％，多数家族表现为个体基因突变。临床研究证明有6.3％的年龄超过40以上发病的肥厚性心肌病患者属于Fabry病。而Fabry病不需要手术干预，只要药物替代治疗可以的。并且Fabry病发生心源性猝死的风险要远远低于肥厚型心肌病。故传统诊断方法面临明确诊断时间晚(症状出现后)、容易发生误诊、难以判断预后等问题。

基因诊断的优势在于：一是特异性高，旦明确致病基因突变，就是100％确诊；二是早期诊断，即可在症状出现前或不可逆病理改变前作出诊断；三是能够根据基因型判断良恶性临床转归和预后，提供针对性的“个体化治疗”；四是可根据基因型提供遗传咨询和生育指导。这一切都揭示了基因诊断在临床上有巨大的应用前景。

由于遗传性的心肌肥厚性疾病涉及的病种多、基因多、突变位点多。如何经济有效的进行基因诊断是非常困难的。传统的PCR、多重PCR、第一代自动测序仪测序都只是针对少量的位点筛查可行。但是面对遗传性的心肌肥厚涉及如此多的的已知突变位点和大量未知潜在突变位点的诊断目标时，这些方法就暴露出时间长、成本高、操作难度大的软肋。

近年，大规模DNA平行测序平台(massively parallel DNA sequencing platform)已经发展为主流的测序技术，这项测序技术的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。利用这种平台更能轻松地把病人所有涉及心肌细胞发育和功能的基因完整检测出来，使HCM这类复杂遗传性疾病的基因诊断成为可能。

但是直接使用大规模DNA平行测序平台检测的成本目前仍然令个人难以承受。本发明可以同时把多个甚至几十病人的遗传性的心肌肥厚相关基因精确的选择性捕获，然后用于大规模测序平台，可以进一步极大地降低基因诊断的成本，使之广泛应用于临床成为可能。

发明内容

本发明的目的是，提供一种检测遗传性的心肌肥厚相关基因突变的多重目标捕获再测序的试剂盒。该试剂盒提高了基因捕获的通量和基因平行测序的通量，操作简便、成本低。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种新的多重目标捕获再测序方法，包括以下步骤：

a.设计并制备用于捕获遗传性的心肌肥厚相关基因的突变捕获探针。并将这些探针结合在磁珠、薄膜或者玻片上。

b.将待测基因组DNA样品分别片段化至100-400bp，然后将末端补平，加入的ATP使片段两端引入粘性末端。

c.分别加入设计好的一端带有标签序列的接头序列片段，加入连接酶，使每个片段都与一对接头连接，形成新的片段。标签序列的设定位置在接头的粘性末端。标签序列的设计见表1。

d.调节反应温度激活DNA聚合酶，用一对标准引物，对步骤c所得不同基因组完成连接的片段序列混合后进行PCR扩增反应；标准引物见表2。

e.将步骤d所得PCR扩增反应产物与步骤a所设计的捕获探针杂交，杂交反应后通过多次洗脱纯化反应，得到待测片段。

f.将待测片段通过illumina公司的标准方案进行大规模平行测序。

g.将得到的测序结果同标准数据库进行比较，得到诊断结果。

为实现上述技术方案，步骤a所述的捕获探针可以是脱氧核糖核酸(DNA)，也可以是核糖核酸(RNA)组成，但不仅限于DNA和RNA。探针的长度从20bp至100bp不等的与目标互补的片段组成。探针可以是结合在磁珠上的，也可以结合在载玻片上，但不仅限于这些介质。

其中，步骤a所述的捕获探针，包括覆盖以下基因ACTC1、ACTN2、BRAF、CALR3、CASQ2、CSRP3、GLA、HRAS、JPH2、KRAS、LAMP2、LDB3、MAP2K1、 MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、PRKAG2、RAF1、SOS1、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、TTR、VCL全部外显子片段和两端50bp范围内的序列。这些探针以叠瓦式设计，片段长度为15bp-50bp，最优为22bp；探针之间重叠部分为2-8bp，最优为5bp；覆盖度为1×至10×，最优为3×。

其中，步骤c所述的接头在引物结合区的下游设计标签，标签末端为粘性末端可以和基因组片段结合。接头序列特征如表1所示。

其中，步骤d的引物能够在同样条件下效率均一地扩增含有不同标签接头的片段，扩增出的片段包含作为标签的碱基序列。在步骤d的扩增时，不同样品已经进行了等量的混合。

本发明的主要优点在于：

1)本发明可以在一次测序反应中同时进行多个不同来源样本全部遗传性的心肌肥厚相关基因的检测；全部序列直接测出，准确率可以达到99.99％。

2)本发明的试剂盒可以一次完成1-18个样品的平行捕获，提高了捕获效率，极大地降低了样品准备的成本。

3)本发明的试剂盒可以一次完成8-96个样品的全部遗传性的心肌肥厚的基因，近4000条序列的平行检测，充分利用设备的高通量特性，极大降低了每个样品的测序成本。

4)本发明的检测方法步骤简单，减少重复操作的环节，因而避免了复杂操作过程中存在的诸多不确定引物，提高了检测准确率和稳定性。

5)本发明所提供的检测方法所需时间大大少于sanger法的测序技术，检测的准确度大大优于基因芯片技术，更符合临床检测要求。

附图是探针设计示意图。

具体实施方式

下面用实施例仅是对本发明实际应用的举例描述，本发明的实际应用不仅限于以下实施例：

实施例一、肥厚型心肌病221例检测MYH7、MYH6、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、TNNC1、ACTC1、TPM1、TTN、CSRP3、DES、DMD、LDB3、VCL、TCAP、 PLN、NEXN、ACTN2、FKTN、MYPN、TMPO、ANKRD1、PSEN1、PSEN2、ABCC9、SGCD、DSG2、EYA4、DSP、SCN5A、LMNA、MURC基因外显子，寻找新的突变位点。

一、探针设计：根据人类基因组数据库公布的基因MYH7、MYH6、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、TNNC1、ACTC1、TPM1、TTN、CSRP3、DES、DMD、LDB3、VCL、TCAP、PLN、NEXN、ACTN2、FKTN、MYPN、TMPO、ANKRD1、PSEN1、PSEN2、ABCC9、SGCD、DSG2、EYA4、DSP、SCN5A、LMNA、MURC的外显子序列设计合成探针，探针为RNA，在目标区段叠瓦式设计，探针长度20bp，重叠区域5bp，覆盖范围达到目标区段两端15bp。采用agilent公司的SureSelect缓冲系统体系。

二、基因组提取：采用Qiagen FlexiGene DNA Kit(Code No：51204)进行提取待测96份样本的基因组，OD值达到1.8-2.0，各取5ug做为起始模板。

三、测序前样品制备

1)目的基因片段化：取定量过的96份基因组DNA，稀释至每100μL中含有5μg基因组DNA，即50ng/μL。取110μL，用超声破碎仪分别进行片段化。

2)末端补平：

取1.5mL EP管，96份基因组样品分别按下表所示，在冰盒上加入各种试剂，保持冰浴状态

试剂	每个反应用量(μL)
		DNA sample	20
Nuclease-free water	10
		10x T4 DNA ligase buffer with 10mM ATP	4
dNTP mix(10mM)	1.6
		T4 DNA polymerase	2
DNA Polymerase I，Large(Klenow)Fragment	0.4
		T4 PNK	2
总反应体系	40

手指轻弹使之充分混合，短暂离心后。水浴锅内20℃孵育30min。

3)末端加A：

取1.5mL EP管，96份基因组样品分别按下表所示，在冰盒上加入各种试剂，保持冰浴状态。

试剂	每个反应用量(μL)
		DNA sample	10
Nuclease free water	2.8

[0042]

10x NEBuffer 2	2
		dATP(1mM)	4
Klenow exo(3′to5′exo)	1.2
		总反应体系	20

手指轻弹使之充分混合，短暂离心下。干式恒温仪上37℃孵育30min。

4)加带有标签的接头：

这个步骤以片段化前的5μg DNA量为基础，12份基因组样品为一组，组内每个样品使用一种加好标签的接头。分别使用10∶1的摩尔比配比对应标签的接头。取1.5mL EP管，各样品分别按下表所示，在冰盒上加入各种试剂，保持冰浴状态。

试剂	每个反应用量(μL)
		DNA sample	7.6
2x Quick Ligation Reaction Buffer	12.5
		Adapter oligo mix(10μM)	2.4
Quick T4 DNA Ligase	2.5
		总反应体系	25

手指轻弹使之充分混合，短暂离心后。水浴锅上20℃孵育15min。

5)切胶取得目的片段：

1)电泳槽中上样96份的接头连接产物(30μL样品+6uL Loading buffer)，加入不同接头的12份产物为一组；间隔一个泳道加入DNA 50bp ladder(8uL 50bp DNA Ladder+3uL loading buffer)

2)电泳25V 16小时。

3)EB后染色半小时，紫外投射仪下切胶称重，选择片段长度在250-350bp。

6)杂交前文库扩增：

a)在超净台中，取PCR管，按下表所示，在冰盒上加入各种试剂，保持冰浴状态。每12份不同标签接头DNA样品的为一组，等量混合，按照下表配置反应体系。96份样品可以分成8组。

b)PCR扩增

四、采用设计探针捕获目的片段

(一)文库杂交

1、采用agilent公司的Sureselect系统的缓冲液，配制杂交缓冲液：

2、配制好的溶液直接按照每孔40uL的量分装到8连管中，室温放置待用。

3、配制捕获混合液：

i.所用到的离心管、8连管冰上预冷。

ii.取1uL RNase Block加入3uL nuclease-free water稀释。

iii.使用无RNase枪头在8连管中每管加入5uL设计好的捕获探针组。

iv.每管加入2uL稀释好的RNase Block，来回吹吸3-4次混匀。注意不要溅到管壁上。放冰上待用。

4、用agilent公司的Sureselect系统配制Sureselect Block Mix：

Reagent	Volume for 2 reaction(μL)
		Sureselect Block#1(Green Cap)	5

[0070]

Sureselect Block#2(Blue cap)	5
		Sureselect Block#3(Brown cap)	1.2
Total	11.2

5、预制文库的配制。

a、取8组12份样品的混合物分别加入8连管中

b、加入5.6μL SureSelect Block mix。

c、用移液器混匀，注意不要溅到管壁上。

d、加盖密封，将8连管放在PCR的D行，运行下列程序：

Step	Temperature	Time
			1	95℃	5min
2	65℃	Hold

6、在PCR仪上使用温度为105℃的热盖来保持在PCR仪的plate为65℃。

7、将步骤1配置的hybridization buffer8连管放入PCR仪的B行，65℃放置5min。

8、第8步结束后，将步骤4配制好的Capture Library mix8连管放入PCR仪的F行。65℃孵育2min

9、65℃环境下，使用多道移液器取13uL B行的Hybridization buffer加入到F行的SureSelect Capture Library Mix中。

10、65℃环境下，使用多道移液器将D行中所有的样品DNA文库加入F行，缓慢吹吸8-10次，充分混匀。杂交混合液体积应为27uL-29uL，取决于前期孵育时的蒸发量。

11、用105℃的热盖保持杂交混合液在65℃的环境中孵育24小时。

(二)准备

M-280 Streptavidin(invitrogen公司，112-06D)磁珠

1、分装3ml SureSelect Wash Buffer#2在水浴锅中预热到65℃。

2、旋涡震荡使 M-280 Streptavidin(invitrogen公司，112-06D)磁珠充分分散。

3、每个杂交体系，加入50μL磁珠至1.5ml离心管。

4、洗涤磁珠

5、把磁珠用200ul SureSelect Binding buffer重悬。

(三)用SureSelecte系统进行选择性杂交捕获

1、孵育24h以后的杂交液体积为：28uL

2、快速将PCR上的杂交混合液直接添加至bead solution中，反复颠倒混匀3～5次。

3、将混合液放在脱色摇床上室温孵育30min。样品需充分混匀。

4、轻柔离心。

5、用磁力架分离磁珠和缓冲液并弃去上清液。

6、在磁珠中加入500μL SureSelect Wash Buffer#1，在旋涡振荡器上混和5sec。

7、室温孵育15min。

8、清洗磁珠：

9、在磁珠中加入50μL SureSelect Elution Buffer，在旋涡振荡器上混和5s。

10、在室温中待样品孵育10min。

11、用磁力分离架分离磁珠和缓冲液。

12、用移液器将上清液转移到一个新的1.5ml的离心管中。这个上清液中包含所捕获的DNA。

13、珠子中重新加入50uL SureSelect Elution Buffer，重复步骤9-12。

14、在被捕获的DNA中加入50μL SureSelect Neutralization Buffer。

(四)捕获溶液的脱盐

1、每份样品加入500μL PB buffer，用移液器混合均匀。

2、检查溶液是否为黄色，确保pH在正常范围。静置2min

3、将MinElute旋转离心柱放在2ml的收集管中。

4、移取600μl样品至MinElute离心柱中，放入离心机60sec，13000rpm，弃流体。

5、加入750μl的PE buffer至柱中，放入离心机60sec，13000rpm，弃流体。

6、将MinElute柱子放回2ml的收集管内，离心60sec，13000rpm。

7、静置2min待酒精完全挥发。

8、将MinElute柱子中放入一个新的1.5ml的收集管中，将15μl的EB buffer直接加到MinElute滤膜上，等待5min，然后放置离心机中离心60sec，13000rpm。

9、洗脱液重新加到滤膜上，等待5min，离心60sec，13000rpm。

10、收集洗脱液，保存于-20℃。

(五)捕获样品扩增

1.8组捕获后的混合液7uL

2.配制Herculase Master Mix。8组混合样品分别在冰上混合下列试剂，用枪头轻柔混匀。

Reagent	Volume for 1 reaction
		Nuclease-free water	29.75μL
5X Herculase II Reaction Buffer	10μL
		dNTP mix(10mM each)	1.25μL
SureSelect GA PCR Primers	1μL
		Herculase II Fusion DNA Polymerase	1μL
Total	43μL

3.43uL Herculase Master Mix中加入7uL步骤1中混合好的捕获文库。

4.运行下列PCR程序。

五、上机测序：8组产物在flowcell上各自占据一条lane，按照illumina公司的single-end技术方案进行簇生成和在GAII、系统进行上机测序。

六、数据分析：数据结果通过genomeCLC进行生物信息学分析。

七、结果：通过3次测序反应，30天完成221个样品所有26个目的基因446条序列的测序工作，测序总数达到98566条。，用ABI3730xl进行8个基因的平行对照，突变检出率为65％，本方案的测序突变检出率达到88％，检验准确率100％。

表1：加好标签的接头序列

编号	序列
		OLG1.1-1	5′P-ATAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′
OLG1.1-2	5′ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAT＊T 3′
		OLG1.2-1	5′P-CAAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′
OLG1.2-2	5′ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTG＊T 3′
		OLG1.3-1	5′P-GCAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′
OLG1.3-2	5′ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGC＊T 3′
		OLG1.4-1	5′P-TGAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′
OLG1.4-2	5′ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCA＊T 3′
		OLG2.1-1	5′P-CTAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′
OLG2.1-2	5′ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAG＊T 3′
		OLG2.2-1	5′P-GAAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′
OLG2.2-2	5′ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTC＊T 3′
		OLG2.3-1	5′P-TCAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′
OLG2.3-2	5′ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGA＊T 3′
		OLG2.4-1	5′P-AGAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′
OLG2.4-2	5′ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCT＊T 3′

[0128]

OLG3.1-1	5′P-GTAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′
		OLG3.1-2	5′ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAC＊T 3′
OLG3.2-1	5′P-TAAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′
		OLG3.2-2	5′ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTA＊T 3′
OLG3.3-1	5′P-ACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′
		OLG3.3-2	5′ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGT＊T 3′
OLG3.4-1	5′P-CGAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG 3′
		OLG3.4-2	5′ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCG＊T 3′

″p-″means phosphor modification at5′；

″＊″means Phosphorothioate Bond.

表2：扩增用的标准引物

Claims

1.一种检验鉴别遗传性心肌肥厚相关基因突变的试剂盒，其特征在于：捕获目的基因探针；一对用于扩增待测片段的通用引物；12对加入不同标签的测序接头序列；缓冲液；dNTP；高保真聚合酶；

M-280 Streptavidin(invitrogen公司，112-06D)磁珠。

2.根据权利要求1所述的肥厚型心肌病基因检测试剂盒其特征在于；捕获ACTC1、ACTN2、BRAF、CALR3、CASQ2、CSRP3、GLA、HRAS、JPH2、KRAS、LAMP2、LDB3、MAP2K1、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、PRKAG2、RAF1、SOS1、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、TTR、VCL全部外显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针。

3.权利要求2所述的探针可以是寡聚核糖核酸(RNA)，也可以是寡聚脱氧核糖核酸(DNA)，但是不仅限于RNA和DNA，可以包括修饰后的DNA或者RNA等。

4.根据权利要求2所述的探针可以是结合在磁珠上的，也可以结合在载玻片上，但不仅限于这些介质。

5.权利要求2所述的探针针对目标区域以叠瓦式设计，探针序列与目标区域为互补序列。

6.权利要求2所述的探针长度在15-50bp，最优为22bp；探针之间重叠区域为2-10bp，最优为5bp。

7.根据权利要求1所述的一种检验鉴别遗传性心肌肥厚相关基因突变的试剂盒其特征在于；12对加入不同标签的接头序列；

8.权利要求5种所述的标签特征是标签序列的位置接头的最内侧，通过粘性末端与待测片段结合；接头5’和3’端分别进行磷酸化和硫化修饰。

9.按照权利要求1所述，根据权利要求1所述的检验鉴别遗传性心肌肥厚相关基因突变的试剂盒其特征在于：一对通用引物，可以扩增任何加入了标签接头的目的片段，其反应体系和条件完全一致。

10.一种基因检测遗传性心肌肥厚的方法，其特征在于，所述方法包括以下内容：

a.设计并制备捕获ACTC1、ACTN2、BRAF、CALR3、CASQ2、CSRP3、GLA、HRAS、JPH2、KRAS、LAMP2、LDB3、MAP2K1、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、PRKAG2、RAF1、SOS1、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、TTR、VCL全部外显子片段以及邻近50bp的非编码区的探针；

b.将多个待测DNA样品分别连接到设计好的加了特异性标签的接头；

c.将经过步骤b所得的不同样品的DNA片段混合然后使用设计好的通用引物进行扩增；

d.将处理好的待测DNA片段混合物和步骤a所得探针加入反应管中，DNA样本与探针杂交，通过洗脱得到待测的目标片段；

e.调节反应温度激活DNA聚合酶，用一对通用引物对步骤d所得序列进行PCR扩增反应；

f.将步骤e所得PCR扩增反应产物通过大规模基因平行分析平台进行测序。大规模基因平行分析平台可以是illumina公司的GA系列，但是不仅限于此测序平台。

g.根据标签特征分别对不同来源的基因样本比对进行数据分析。