CN109576800A - 一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法及其试剂盒 - Google Patents

一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法及其试剂盒 Download PDF

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CN109576800A CN201811493189.7A CN201811493189A CN109576800A CN 109576800 A CN109576800 A CN 109576800A CN 201811493189 A CN201811493189 A CN 201811493189A CN 109576800 A CN109576800 A CN 109576800A
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Abstract

本发明公开了一种遗传性扩张型心肌病的基因文库构建方法及其试剂盒，涉及ANKRD1、BAG3、LDB3、LMNA、MYBPC3、MYH6、MYH7、RBM20、SCN5A、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、VCL基因的突变，目标区域为以上16基因的编码氨基酸的外显子区域及外显子上下游各20碱基区域，为保证目标区域全部覆盖，采用制备文库后，杂交探针捕获的方法获得目标区域文库，而后采用LMPCR方法扩增文库，文库纯化后，得到测序用样本文库。该建库方法步骤简单快速，有效降低了文库构建的成本，且涵盖了心律失常的相关基因，结合illumina高通量测序仪，可快速准确得到相关基因变异，对遗传性扩张型心肌病有重要意义。

Description

一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法及其试 剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法和试剂盒。
背景技术
遗传性扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)是一种诱因多样，以心肌扩张和收缩功能障碍为主要特征的心肌病，最终导致心力衰竭。其发病率约为1/250，约20％-35％的DCM患者表现为家族性，其余多为散发性DCM。遗传性DCM的外显度与年龄成正相关，且在同一家族内，患者的发病年龄与临床表现都可能存在较大差异。DCM还可能伴有肌营养不良、传导系统疾病和可能致命的心律不齐。
DCM的主要临床症状包括心律不齐、呼吸困难、易疲劳、昏厥以及腿脚出汗等。大多数患者在中年期开始出现心脏扩大，但也可以发生于从婴幼儿期到老年期的任何一个时间点。DCM的临床表型复杂，同一家庭内不同成员间的发病时间和疾病严重程度都存在显著差异。对于某些患者来说，其疾病的首发症状即为心源性猝死。因此，对于DCM患者来说，早发现、早诊断和早治疗都可以有效的降低疾病的危害、减少猝死的发生。
通常情况下，DCM表现为常染色体显性遗传，但是也有少数关于X连锁、常染色体隐性遗传和线粒体遗传模式的报道。DCM的遗传因素主要是编码心肌肌小节、细胞骨架及其相关蛋白的基因变异，但也包括一些其他在心肌细胞功能中起到重要功能的蛋白编码基因变异。虽然家族性DCM被认为是非综合征型的，且仅影响心脏，但实际上，DCM也可能作为影响人体其他器官和组织的综合征的临床表现的一部分出现，且多为非肌小节或细胞骨架相关蛋白突变引起的。此外，DCM也存在非遗传性诱因，如病毒感染和慢性酒精中毒。单凭借其临床表型有时很难对不同诱因的DCM进行区分，尤其对于相关经验不足的医生来说。这种情况下，基因检测就显示出无可比拟的优势，可在患者症状表现完全之前就明确诊断，且可以提供一定程度上的临床指导。
ANKRD1(ankyrin repeat domain 1)该基因编码的蛋白定位于内皮细胞的细胞核，通过IL-1和tnf-的刺激诱导。对大鼠心肌细胞的研究表明，该基因作为转录因子发挥作用。该蛋白与肌钙蛋白肌肽和肌钙蛋白之间的相互作用表明，它也在肌原纤维拉伸传感器系统中起作用。
BAG3(BCL2associated athanogene 3)BAG编码蛋白与Hip竞争性结合Hsc70/Hsp70ATP结构域。肌小节的Z盘结构上并在该结构上呈现高表达水平的Bcl-2相关抗凋亡蛋白3(Bcl-2associatedathanogene3，BAG3)的基因变异同DCM相关。2011年，Villard E首次报道了BAG3基因上的rs2234962多态位点与DCM导致的心衰有关，提示BAG3基因可能是导致DCM发病的候选基因，随后在日本家族性DCM患者中也发现BAG3基因突变点Arg218Trp和Leu462Pro以及相关的多态点(rs3858339、rs196295、rs117671123、rs78439745、rs3858340)与DCM有关。
LDB3(LIM domain binding 3)该基因编码含有PDZ域的蛋白质。PDZ motifs是由80-120个氨基酸残基组成的模块化蛋白-蛋白相互作用域。含有PDZ域的蛋白质在细胞骨架组装中相互作用，或与其他涉及膜蛋白靶向和聚类的蛋白相互作用。该基因编码的蛋白通过其n端PDZ域与-actinin-2相互作用，通过其C端LIM域与蛋白激酶C相互作用。LIM域是一个富含半胱氨酸的基序，由包含两个锌结合模块的50-60个氨基酸定义。这种蛋白质也与肌凝蛋白家族的所有三个成员相互作用。该基因的突变与肌原纤维肌病和扩张型心肌病有关。
MYH6(myosin heavy chain 6)心肌肌球蛋白是由两个重链亚基、两个轻链亚基和两个调控亚基组成的六聚体。该基因编码心肌肌球蛋白的重链亚基。该基因位于编码心肌肌球蛋白-重链亚基的基因下游约4kb处。该基因突变导致家族性肥厚性心肌病和房间隔缺损3。
RBM20(RNA binding motif protein 20)该基因编码的蛋白，能与RNA结合并调节剪接。该基因突变与家族性扩张型心肌病有关。
TCAP(titin-cap)该基因编码在横纹肌和心肌中发现的一种蛋白质，它与肌动蛋白Z1-Z2结构域结合，是肌动蛋白激酶的底物，这种相互作用被认为对肌动蛋白组装至关重要。有研究表明该基因变异导致该基因编码蛋白功能异常，与心肌病有关。
TNNC1(troponin C1,slow skeletal and cardiac type)肌钙蛋白是横纹肌收缩的中枢调节蛋白，与原肌凝蛋白一起位于肌动蛋白丝上。肌钙蛋白由3个亚基组成:TnI，是肌动球蛋白ATP酶的抑制剂；TnT，含有原肌凝蛋白的结合位点；TnC是由这个基因编码的蛋白质。钙与TnC的结合消除了TnT的抑制作用，从而使肌动蛋白与肌球蛋白相互作用，ATP水解，产生张力。这种基因的突变与1Z型扩张型心肌病有关。
TTN(titin)这个基因编码横纹肌的大量蛋白质。该基因的产物分为n端i带和c端a带两个区域。i带是分子的弹性部分，在PEVK区域的两侧包含两个富含脯氨酸、谷氨酸、缬氨酸和赖氨酸的串联免疫球蛋白结构域。a带被认为是蛋白功能的主要部分，它包含了免疫球蛋白和纤维连接蛋白重复序列的混合物，并且具有激酶活性。一个n端z-disc区域和一个c端M-line区域分别与肌节的Z-line和M-line结合，使单个titin分子的长度达到肌节长度的一半。Titin还含有肌肉相关蛋白的结合位点，因此它可以作为肌肉细胞中收缩机制组装的粘附模板。它也被确认为是染色体的结构蛋白。这种基因的选择性剪接会导致多种转录变体。titin的i-带、M-line和Z-disc区域存在较大的变异性。i-带区域的变异性导致了不同titin亚型弹性的差异，从而导致了不同肌肉类型弹性的差异。该基因的突变与家族性肥厚性心肌病有关。
VCL(vinculin)粘着蛋白是一种与细胞-细胞和细胞-基质连接相关的细胞骨架蛋白，也是几种参与将f-肌动蛋白固定到细胞膜上的相互作用蛋白之一。VCL缺陷是1W型心肌病扩大的原因。扩张型心肌病是一种以心室扩张和收缩功能受损为特征的疾病，导致充血性心力衰竭和心律失常。该基因已发现多种可选择性剪接的转录本变体，但一些变体的生物学有效性尚未确定。
MYH7(myosin heavy chain 7)是一种编码心脏β-肌球蛋白重链的基因。MYH7是肥厚性心肌病(HCM)最重要的致病基因，约30％-50％的HCM患者主要是由MYH7基因突变所致。心脏β-肌球蛋白重链是人心室肌球蛋白的主要成分，在心肌细胞的能量供应和维持心肌细胞内外钙离子的浓度起到非常重要的作用。MYH7基因定位于14q12，含有40个外显子，其中38个外显子参与编码含1935个氨基酸残基的蛋白质。编码的蛋白具有3个功能区：球状头部区S1、头杆结合S2和杆状尾部区，头部区包含ATP酶活性位点和与肌动蛋白结合位点以及与必须链(ELC，essentiallightchain)结合的界面，是肌球蛋白的重要功能区域。国内外已报道超过200多种单碱基突变，某些突变可表现出外显率高、症状出现早、进展快、心肌肥厚重、已出现心力衰竭甚至猝死等恶性表现。总体来说该基因的突变与家族性肥厚性心肌病、肌球蛋白贮存性肌病、扩张型心肌病和Laing早期远端肌病有关。
TNNI3(troponin I3)是一种编码心脏肌钙蛋白I的基因。肌钙蛋白I(TnI)与肌钙蛋白T(TnT)、肌钙蛋白C(TnC)是构成横纹肌细丝肌钙蛋白复合体的三个亚基。TnI是抑制亚单位，阻断肌动蛋白-肌球蛋白的相互作用，从而调节横纹肌松弛。该基因编码TnI-心脏蛋白，在心肌组织中唯一表达。cTnI基因全长612kb，含8个外显子，该基因突变导致家族性肥厚性型心肌病和家族性限制性心肌病。
TNNT2(troponin T2,cardiac type)是一种编码心脏肌钙蛋白T的基因，位于染色体1q32，约17kb，由17个外显子组成。肌钙蛋白T能与肌钙蛋白C、肌钙蛋白I、原肌球蛋白结合，在Ca2+调节细肌丝的活动过程中起关键作用。目前已经发现了TNNT2的30种不同的突变。在各种TNNT2基因突变(错义突变、剪接信号突变、小片段缺失)导致的HCM约占所有HCM的15％。
TPM1(tropomyosin 1)是一种编码α原肌球蛋白的基因。该基因位于染色体15q22，大小为32.7KDa，含284个氨基酸。该基因编码的产物属于原肌球蛋白家族，属于高度保守、分布广泛的肌动蛋白结合蛋白，存在于收缩系统的横纹肌和平滑肌，以及非肌肉细胞的细胞骨架。原肌球蛋白由两条平行的多肽链组成α螺旋构型，每条原肌球蛋白首尾相接形成一条连续的链同肌动蛋白细肌丝结合,正好位于双螺旋的沟(grooves)中。该基因编码的产物结构是α螺旋链，是形成横纹肌的主要原肌球蛋白，具有调节肌动蛋白和肌球蛋白之间的钙依赖相互作用的功能。
MYBPC3(myosin binding protein C,cardiac)是一种编码心肌肌球蛋白结合蛋白的基因。心肌肌球蛋白结合蛋白-C位于心肌肌小节中的C区，约占肌原纤维中蛋白总数的2％。该蛋白属于免疫球蛋白超家族，只在心脏中表达。其编码基因MYBPC3位于染色体11p11.2，含35个外显子，表达1274个氨基酸残基。其蛋白由11个主要子域构成，编号C0-C10。心肌肌球蛋白结合蛋白属细胞内球蛋白超家族，与肌球蛋白结合位点位于C8～C10结构域。结合了MyBP-C的肌凝蛋白和肌联蛋白，有更加稳定的肌小节结构。心肌肌球蛋白结合蛋白在C1、C2结构域之间有1个特有的N末端模序，作为cAMP依赖的蛋白激酶以及钙调蛋白依赖的蛋白激酶的作用位点。磷酸化心肌特定的模序调节心肌收缩力，故MyBP-C不仅参与心肌结构的维持，还参与细胞内信息传递，影响肌丝的舒缩运动。MYBPC3基因突变多为缺失、插入、重复等，导致产生一种缺少肌球蛋白和肌蛋白集合位点的平截蛋白，从而造成肌小节结构和功能损害。
SCN5A(sodium voltage-gated channel alpha subunit 5)基因负责编码钠通道蛋白的ɑ亚单位(Nav1.5)，Nav1.5调控着心肌细胞的钠内流。Nav1.5除影响到钠内流和细胞除极外，还和诸多的心肌细胞骨架蛋白、肌节蛋白相互联系，因而，SCN5A基因突变导致的Nav1.5结构的异常，不但会引起心脏节律的异常，还可导致心脏结构的异常。该基因的缺陷是长QT综合征3型(LQT3)的原因之一，这是一种常染色体显性心脏病。
传统的Sanger测序技术检测ANKRD1、BAG3、LDB3、LMNA、MYBPC3、MYH6、MYH7、RBM20、SCN5A、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、VCL基因的编码氨基酸的外显子区域及附近内含子区域的基因突变存在很大局限性，表现在：检测通量受到限制，该方法仅适用于少数明确突变热点的检测，而对于候选基因数量多且为候选基因的全部编码区段时难以实现的。需要消耗大量时间，且对于待检测样本的基因组DNA消耗巨大，在实践中同一样本难以获得满足检测需求的足量DNA。因而在日常实践中难以采用Sanger方法进行多基因全部编码区段的检测需求。
采用高通量基因测序技术检测ANKRD1、BAG3、LDB3、LMNA、MYBPC3、MYH6、MYH7、RBM20、SCN5A、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、VCL的基因突变，需要进行测序前样本文库的制备。如在样本文库制备过程中采用多重PCR方法进行目标区域扩增，会存在扩增偏向性，导致目标区域扩增不均，而对后续测序数据产生偏向性影响。
因此，有必要寻找一种新的检测遗传性扩张型心肌病的基因突变的方法，提高诊断准确率，降低成本和劳动强度。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法，该方法建库步骤简便快速，变异类型全面、待测目标区域覆盖完全、测序数据无偏向性、可同时对多个样本进行检测通量高。
本发明的另一目的是提供该方法获得的遗传性扩张型心肌病的基因检测文库。
本发明的另一目的是提供所述文库制备的遗传性扩张型心肌病的基因检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供了一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库，涉及ANKRD1、BAG3、LDB3、LMNA、MYBPC3、MYH6、MYH7、RBM20、SCN5A、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、VCL的基因突变。为保证目标区域全部覆盖，制备文库后采用杂交探针捕获的方法获得目标区域文库，而后采用LMPCR方法扩增文库，再进行文库纯化得到测序基因检测文库。
本发明的一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法，包括如下步骤：
(1)DNA质量标准：提供受试者样本的基因组DNA，经过核酸提取、质检后，要求DNA符合一定质控标准；
(2)文库制备：将上述符合标准基因组DNA，超声随机打断至180bp-220bp短片段，然后进行末端补平加A,连接接头，并通过PCR扩增达到一定总量的DNA文库，该文库满足illumina测序平台专用测序要求；
(3)杂交捕获：将步骤2得到的DNA文库，与疾病相关定制探针进行特异性杂交，捕获含目的区域的文库，再通过磁珠抓取、富集留下含目的区域的DNA文库，即得目标区域文库；
(4)LMPCR扩增：将步骤3得到的目标区域文库，作为LMPCR模板，加入与测序接头匹配的引物及相应试剂，进行扩增；扩增后加入磁珠纯化，即得纯化文库；
(5)文库质控：将步骤4得到的纯化文库进行质控，选择Qubit 3.0进行定量检测，Agilent2100或Agilent 4200进行定性检测，查看文库片段分布是否符合要求。
本发明上述的遗传性扩张型心肌病的基因检测文库构建方法，所述目标区域包含以下基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)：ANKRD1、BAG3、LDB3、LMNA、MYBPC3、MYH6、MYH7、RBM20、SCN5A、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、VCL。
上述步骤(1)中所述的核酸提取的样本类型包括但不限于外周血、组织器官样本等，优选核酸样本为新鲜外周血。
上述步骤(1)中所述的DNA质控标准为，DNA完整性较好，无蛋白RNA污染，DNA浓度≥20ng/μL；DNA纯度：OD260/280 1.8-2.0，OD260/230>2.0；DNA总起始量:0.1ug-1ug。
上述步骤(1)中所述的核酸提取方法、DNA质控方法均按照现有技术的操作规程进行。
上述步骤(2)中将符合标准的基因组DNA进行超声随机打断，超声打断的反应体系及反应条件见表1。
表1超声打断的反应体系及反应条件
上述步骤(2)中所述的末端补平加A的反应是指DNA随机片段化至180-220bp，通过5'→3'聚合酶及3'→5'外切酶作用，进行末端补平,同时5'端进行磷酸化，其次3'加A，以便和测序接头进行连接。反应体系及反应条件见表2。
表2末端补平加A的反应体系及反应条件
上述步骤(2)中所述连接接头反应包括连接接头反应、消化反应、及纯化反应。进一步说明，所述的接头是指在DNA片段两端连接通用接头，结构为发夹环状接头，以此来提高接头连接效率。
所述的消化反应是指连接接头反应后加入消化酶反应。
所述纯化反应是指消化后的DNA文库中加入AMpureXP纯化磁珠进行片段选择，先加入部分磁珠吸附后留取上清，磁珠吸附大片段丢弃，再加入部分磁珠正常纯化洗脱，即可。
所述步骤(2)的连接接头的反应体系及反应条件见表3
表3连接接头的反应体系及反应条件
测序接头序列：5′-/5Phos/GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT C/index/A CAC TCT TTC CCT ACA CGA CGC TCT TCC GAT C*T-3′
上述步骤(2)中所述的PCR扩增反应包括PCR扩增反应及磁珠纯化，修饰后的DNA片段经过纯化后，通过特定序列引物进行扩增，并引入样本标签。样本标签为6bp碱基组成，可作为样本的唯一标识。最后得到的DNA文库含有和illumina测序平台芯片结合的特定序列P5、P7以及测序引物序列，其中P7端含有样本标签，长度6bp，其测序模板具体结构如下：
P5+Read1测序引物+插入DNA+Read2测序引物+Index(6bp)+P7
具体序列一端为：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
另一端序列为：ATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC*NNNNNN*ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG,其中NNNNNN代表6bp碱基样本标签。具体反应体系及反应条件见表4
表4 PCR扩增的反应体系及反应条件
通用引物序列：5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′
含样本标签引物：
5‘-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′(XXXXXX表示样本标签，有6个碱基随机组合，具体如下表；-s-表示硫代磷酸修饰)见表5
表5样本标签引物序列
本发明上述步骤(3)所用探针为本发明关键之处，探针是根据与疾病相关的目标区域特异定制的，可以完整覆盖目标区域(外显子区域及外显子上下游各20碱基区域)，从而提高捕获目标片段的效率，达到检测相关疾病突变位点的目的。通过一系列封闭方法，例如利用COT DNA将基因组中重复序列封闭，利用特定引物序列封闭接头序列等，配制最优的杂交反应条件，反应16h-20h，进一步提高捕获目标区域的特异性，提高捕获效率。定制探针有生物素修饰，待杂交后，通过链霉亲和素标记的磁珠富集文库。
所述目标区域包含以下基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)：ANKRD1、BAG3、LDB3、LMNA、MYBPC3、MYH6、MYH7、RBM20、SCN5A、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、VCL。
进一步优选，本发明步骤(3)将步骤2得到的DNA文库进行文库混样(样品≤6)，总量至少1-1.5μg(优选1.25μg)。将不同样本标签的文库等量混合，加入样本标签对应的封闭引物试剂封闭DNA，浓缩烘干至干粉，再加入杂交缓冲液(Tris、EDTA、NaCl)，混匀孵育，然后加入定制探针反应，反应结束后，加入预先处理的特定磁珠纯化，富集捕获到的目的区域DNA片段，反应体系及反应条件见表6。该步骤将不同样本标签样本进行混样杂交捕获，在一定程度上节省成本。
本发明上述所述的杂交反应结束后(探针与目标区域片段特异性结合)，选用有链霉亲和素标记的特定磁珠，可特异性抓取有生物素标记的探针，进行纯化清洗，从而富集目标区域片段。
表6杂交反应体系组分及反应条件
所述封闭引物试剂为AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
标签封闭引物试剂：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT,NNNNNN于样本标签index碱基反向互补配对。
针对基因RBM20的定制探针的序列SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 7。
针对基因BAG3的定制探针的序列SEQ ID NO 8至SEQ ID NO 9.
针对基因VCL的定制探针的序列SEQ ID NO 10至SEQ ID NO 20。
针对基因LDB3的定制探针的序列SEQ ID NO 21至SEQ ID NO 27。
针对基因ANKRD1的定制探针的序列SEQ ID NO 28至SEQ ID NO 32。
针对基因MYBPC3的定制探针的序列SEQ ID NO 33至SEQ ID NO 41。
针对基因MYH6的定制探针的序列SEQ ID NO 42至SEQ ID NO 57.
针对基因MYH7的定制探针的序列SEQ ID NO58至SEQ ID NO 74
针对基因TPM1的定制探针的序列SEQ ID NO 75至SEQ ID NO 80.
针对基因TNNI3的定制探针的序列SEQ ID NO 81至SEQ ID NO 82.
针对基因LMNA的定制探针的序列SEQ ID NO 83至SEQ ID NO 87.
针对基因TPM1的定制探针的序列SEQ ID NO 87至SEQ ID NO 94.
针对基因TTN的定制探针的序列SEQ ID NO 95至SEQ ID NO 256.
针对基因SCN5A的定制探针的序列SEQ ID NO 257至SEQ ID NO 272
针对基因TNNC1的定制探针的序列SEQ ID NO 273至SEQ ID NO278。
针对基因TCAP的定制探针的序列SEQ IDNO 279至SEQ ID NO 281.
本发明步骤(4)中利用LMPCR将捕获的目的区域片段进行PCR扩增以使文库总量能够满足上机测序要求，其反应体系及条件见表6：反应结束后进行磁珠纯化得到最终的上机文库。
所述的磁珠纯化方法：将DNA文库加入纯化磁珠，置于磁力架上，直到溶液澄清后弃掉上清，使用乙醇清洗磁珠，离心，吸尽残余液体，干燥，加入TRIS-EDTA缓冲液,吹吸混匀，室温放置，澄清后即得纯化文库；
表7 LMPCR扩增反应体系
所述P5引物序列：5'-AATGATACGGCGACCACCGA
所述P7引物序列：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
上述步骤(5)所述文库质控，要先进行定量检测，可选择Qubit3.0仪器，得到文库浓度总量≥0.5ug，其次进行定性质控，可选择Agilent2100/4200仪器，要求片段范围在150-500bp之间；上机测序前可进行实时荧光定量PCR进行文库定量，用与P5、P7引物特异扩增满足测序要求的文库，绘制标准曲线，确定合适的文库上机浓度。具体反应体系及反应条件按照下表8(配套仪器ABI 7500/7300standard)。
表8 P5、P7引物扩增体系及条件
上游引物序列5'-AATGATACGGCGACCACCGA下游引物序列5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
本发明的构建方法还包括上机测序过程及数据分析过程。
本发明的一种实施方式，一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特包括如下步骤：
(1)核酸提取及质检：外周血样本经过核酸提取、质检后，要求其符合一定质控标准：DNA完整性较好，无蛋白RNA污染，DNA浓度≥20ng/μL；DNA纯度：OD260/280 1.8-2.0，OD260/230>2.0；DNA总起始量:0.1μg-1μg；
(2)文库制备：利用上述DNA，取样后用TRIS-EDTA补至52.5μl，于covaris仪器上根据相应参数，进行超声打断，将基因组DNA随机打断至180-220bp短片段；然后进行末端补平加A,反应体系为：Tris-EDTA稀释的DNA 50μl，末端补平加A反应缓冲液7μl，末端补平加A酶混合液3μl，合计60μl，反应条件为：20℃保持30min，65℃保持30min，最后保持4℃；再进行接头连接，反应体系为末端补平的DNA60μl，连接反应缓冲液及连接酶30μl，测序接头2.5μl，高浓度Mg2+缓冲液1μl，合计93.5μl，反应条件：20℃保持15min，并保持20℃；反应结束后，加入3μl USER消化酶，37℃保持15min；反应结束后，加入AMpureXP纯化磁珠进行片段选择，先加入45μl磁珠吸附后留取上清，磁珠吸附大片段丢弃，再加入15μl磁珠正常纯化洗脱；最后以纯化的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为：DNA模板20μl，2XPCR扩增反应酶及缓冲液25μl，通用引物2.5μl，含样本标签引物2.5μl，合计50μl，反应条件为：98℃保持30s，然后进行4个循环，每个循环为98℃保持10s，65℃保持75s，然后65℃保持5min，最后保持在10℃；结束后加入90μl磁珠进行纯化；
(3)杂交捕获：进行文库混样，将带有不同样本标签的文库，等量进行混合(不超过6个样本)，总量需要达到1.25ug；混匀后取样1ug，加入样本标签对应的封闭引物试剂2μl，封闭DNA5ug，真空浓缩仪60℃浓缩烘干至干粉；再加入2x杂交缓冲液7.5μl，杂交试剂A 3μl，混匀95℃孵育10min，然后加入定制探针4.5μl，混匀后热盖57℃，反应47℃孵育16h-20h；反应结束后，加入100μl预先处理的特定磁珠，富集捕获到的目的区域DNA片段；
(4)LMPCR扩增：将步骤(3)获得的杂交捕获富集的DNA作为模板，配制反应体系：模板20μl，2Xpcr反应酶及缓冲液25μl，P5P7引物5μl，反应条件：98℃保持45s，然后进行14个循环，每个循环为98℃保持15s，60℃保持30s，72℃保持30s，然后72℃保持1min，最后保持在4℃；反应结束后加入90μl磁珠纯化得到最终上机测序文库；
(5)将步骤(4)中获得的最终文库按照以下方法进行质控：取样1μl，使用Qubit HSdsDNA试剂盒定量，得到文库浓度；根据定量浓度进行合理稀释，在Agilent2100或者4200仪器，选择合适的试剂进行检测，核查文库片段分布范围；上机前，使用荧光定量PCR方法进行有效模板定量，梯度稀释标准品分别是20pM，2pM,0.2pM,0.002pM,0.0002pM，0.00002pM；将样本文库稀释至2-10pM，按照下述配制试剂：2×SybrGreen Master Mix 25μL、P5P7引物2μl、无核酸酶水4μl，样本标准品4μL；反应条件(ABI7500)：95℃保持5min，然后35个循环，每个循环95℃保持30sec，60℃保持45s，熔解曲线95℃保持15s，60℃保持60s，95℃15s；
(6)上机测序：根据定量浓度，确定上机最终浓度，于Nextseq550AR测序仪上上机，按照仪器操作规程进行测序，使用NextSeq 500/550Mid Output Kit v2(300cycles)；然后将数据上传服务器，由遗传咨询师对得到的数据进行分析及解读。
本发明的另一技术方案是该方法获得的遗传性扩张型心肌病的基因检测文库。
本发明的另一技术方案是所述文库制备的遗传性扩张型心肌病的基因检测试剂盒，其包括文库构建试剂、杂交探针序列、引物序列。
本发明所述的构架试剂包括：Tris-EDTA稀释液、末端补平加A反应缓冲液、末端补平加A酶混合液、连接反应缓冲液及连接酶、高浓度Mg2+缓冲液、PCR扩增反应酶及缓冲液、封闭引物试剂、杂交缓冲液、杂交试剂A。
所述的杂交探针序列包括SEQ ID No 1至SEQ ID No 281。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明的文库采用高通量测序探针杂交捕获的方法检测ANKRD1、BAG3、LDB3、LMNA、MYBPC3、MYH6、MYH7、RBM20、SCN5A、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、VCL的基因突变，探针针对目标区域进行定制，充分考虑目标区域的覆盖比例，保证突变的有效捕获，使之变异类型全面，准确率高，灵敏度高。同时可以选择一捕多个样本，节省了成本。
2、该文库涵盖了心律失常的相关基因，结合illumina高通量测序仪，可快速准确得到相关基因变异，对遗传性扩张型心肌病有重要意义。
3、所用探针为本发明关键之处，探针是根据与疾病相关的目标区域特异定制的，可以完整覆盖目标区域(外显子区域及外显子上下游各20碱基区域)，从而提高捕获目标片段的效率，达到检测相关疾病突变位点的目的。通过一系列封闭方法，例如利用COT DNA将基因组中重复序列封闭，利用特定引物序列封闭接头序列等，配制最优的杂交反应条件，反应16h-20h，进一步提高捕获目标区域的特异性，提高捕获效率。定制探针有生物素修饰，待杂交后，通过链霉亲和素标记的磁珠富集文库。
4、本发明的文库避免了多重PCR法扩增目标区域，避免PCR引入的碱基错配，同时通用于不同的复杂DNA样本。
5、本发明的文库依托于illumina高通量测序平台，检测通量大大提高。
附图说明
图1是根据本发明的方法构建的外周血DNA文库2100生物分析仪检测结果。
图2是根据本发明的文库构建及测定流程图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1
采用4个外周血样本样本进行文库构建，采用包含ANKRD1、BAG3、LDB3、LMNA、MYBPC3、MYH6、MYH7、RBM20、SCN5A、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、VCL基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)作为目标区域的引物池进行多重反应PCR，并结合高通量测序平台Miseq进行DNA测序，然后检测点突变(SNP)、小片段插入缺失(InDel)。具体操作流程如下：
(1)核酸提取及质检：外周血样本经过核酸提取、质检后，要求其符合一定质控标准：DNA完整性较好，无蛋白RNA污染，DNA浓度≥20ng/μL；DNA纯度：OD260/280 1.8-2.0，OD260/230>2.0；DNA总起始量:0.1μg-1μg。
(2)文库制备：利用上述DNA，取样后用TRIS-EDTA补至52.5μl，于covaris仪器上根据相应参数，进行超声打断，将基因组DNA随机打断至180-220bp短片段。然后进行末端补平加A,反应体系为：Tris-EDTA稀释的DNA 50μl，末端补平加A反应缓冲液7μl，末端补平加A酶混合液3μl，合计60μl，反应条件为：20℃保持30min，65℃保持30min，最后保持4℃；再进行接头连接，反应体系为末端补平的DNA60μl，连接反应缓冲液及连接酶30μl，测序接头2.5μl，高浓度Mg2+缓冲液1μl，合计93.5μl，反应条件：20℃保持15min，并保持20℃；反应结束后，加入3μl USER消化酶，37℃保持15min；反应结束后，加入AMpureXP纯化磁珠进行片段选择，先加入45μl磁珠吸附后留取上清(磁珠吸附大片段丢弃)，再加入15μl磁珠正常纯化洗脱。最后以纯化的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为：DNA模板20μl，2XPCR扩增反应酶及缓冲液25μl，通用引物2.5μl，含样本标签引物2.5μl，合计50μl。反应条件为：98℃保持30s；然后进行4个循环，每个循环为98℃保持10s，65℃保持75s；然后65℃保持5min；最后保持在10℃。结束后加入90μl磁珠进行纯化。
(3)杂交捕获：进行文库混样，将带有不同样本标签的文库，等量进行混合(不超过6个样本)，总量需要达到1.25ug。混匀后取样1ug，加入样本标签对应的封闭引物试剂2μl，封闭DNA5ug，真空浓缩仪60℃浓缩烘干至干粉。再加入2x杂交缓冲液7.5μl，杂交试剂A 3μl，混匀95℃孵育10min，然后加入定制探针4.5μl，混匀后热盖57℃，反应47℃孵育16h-20h。反应结束后，加入100μl预先处理的特定磁珠，富集捕获到的目的区域DNA片段。
(4)LMPCR扩增：将步骤(3)获得的杂交捕获富集的DNA作为模板，配制反应体系：模板20μl，2Xpcr反应酶及缓冲液25μl，P5P7引物5μl。反应条件：98℃保持45s；然后进行14个循环，每个循环为98℃保持15s，60℃保持30s，72℃保持30s；然后72℃保持1min；最后保持在4℃。反应结束后加入90μl磁珠纯化得到最终上机测序文库。
(5)将步骤(4)中获得的最终文库按照以下方法进行质控：取样1μl，使用Qubit HSdsDNA试剂盒定量，得到文库浓度。根据定量浓度进行合理稀释，在Agilent2100或者4200仪器，选择合适的试剂进行检测，核查文库片段分布范围。上机前，使用荧光定量PCR方法进行有效模板定量，梯度稀释标准品分别是20pM，2pM,0.2pM,0.002pM,0.0002pM，0.00002pM。将样本文库稀释至2-10pM，按照下述配制试剂：2×SybrGreen Master Mix 25μL、P5P7引物2μl、无核酸酶水4μl，样本(标准品)4μL。反应条件(ABI7500)：95℃保持5min；然后35个循环，每个循环95℃保持30sec，60℃保持45s；熔解曲线95℃保持15s，60℃保持60s，95℃15s。
(6)上机测序：根据定量浓度，确定上机最终浓度，于Miseq测序仪上上机，按照仪器操作规程进行测序，使用MiSeq Reagent Micro Kit(300cycles)。然后将数据上传服务器，由遗传咨询师对得到的数据进行分析及解读。数据见下表9。
表9 4个样本的测序结果与已知结果100％一致
实施例2
采用16个口腔拭子样本进行文库构建，采用包含ANKRD1、BAG3、LDB3、LMNA、MYBPC3、MYH6、MYH7、RBM20、SCN5A、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、VCL基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)作为目标区域的引物池进行多重反应PCR，并结合高通量测序平台Nextseq550AR进行DNA测序，然后检测点突变(SNP)、小片段插入缺失(InDel)。具体操作流程如下：
(1)核酸提取及质检：外周血样本经过核酸提取、质检后，要求其符合一定质控标准：DNA完整性较好，无蛋白RNA污染，DNA浓度≥20ng/μL；DNA纯度：OD260/280 1.8-2.0，OD260/230>2.0；DNA总起始量:0.1μg-1μg。
(2)文库制备：利用上述DNA，取样后用TRIS-EDTA补至52.5μl，于covaris仪器上根据相应参数，进行超声打断，将基因组DNA随机打断至180-220bp短片段。然后进行末端补平加A,反应体系为：Tris-EDTA稀释的DNA 50μl，末端补平加A反应缓冲液7μl，末端补平加A酶混合液3μl，合计60μl，反应条件为：20℃保持30min，65℃保持30min，最后保持4℃；再进行接头连接，反应体系为末端补平的DNA60μl，连接反应缓冲液及连接酶30μl，测序接头2.5μl，高浓度Mg2+缓冲液1μl，合计93.5μl，反应条件：20℃保持15min，并保持20℃；反应结束后，加入3μl USER消化酶，37℃保持15min；反应结束后，加入AMpureXP纯化磁珠进行片段选择，先加入45μl磁珠吸附后留取上清(磁珠吸附大片段丢弃)，再加入15μl磁珠正常纯化洗脱。最后以纯化的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为：DNA模板20μl，2XPCR扩增反应酶及缓冲液25μl，通用引物2.5μl，含样本标签引物2.5μl，合计50μl。反应条件为：98℃保持30s；然后进行4个循环，每个循环为98℃保持10s，65℃保持75s；然后65℃保持5min；最后保持在10℃。结束后加入90μl磁珠进行纯化。
(3)杂交捕获：进行文库混样，将带有不同样本标签的文库，等量进行混合(不超过6个样本)，总量需要达到1.25ug。混匀后取样1ug，加入样本标签对应的封闭引物试剂2μl，封闭DNA5ug，真空浓缩仪60℃浓缩烘干至干粉。再加入2x杂交缓冲液7.5μl，杂交试剂A 3μl，混匀95℃孵育10min，然后加入定制探针4.5μl，混匀后热盖57℃，反应47℃孵育16h-20h。反应结束后，加入100μl预先处理的特定磁珠，富集捕获到的目的区域DNA片段。
(4)LMPCR扩增：将步骤(3)获得的杂交捕获富集的DNA作为模板，配制反应体系：模板20μl，2Xpcr反应酶及缓冲液25μl，P5P7引物5μl。反应条件：98℃保持45s；然后进行14个循环，每个循环为98℃保持15s，60℃保持30s，72℃保持30s；然后72℃保持1min；最后保持在4℃。反应结束后加入90μl磁珠纯化得到最终上机测序文库。
(5)将步骤(4)中获得的最终文库按照以下方法进行质控：取样1μl，使用Qubit HSdsDNA试剂盒定量，得到文库浓度。根据定量浓度进行合理稀释，在Agilent2100或者4200仪器，选择合适的试剂进行检测，核查文库片段分布范围。上机前，使用荧光定量PCR方法进行有效模板定量，梯度稀释标准品分别是20pM，2pM,0.2pM,0.002pM,0.0002pM，0.00002pM。将样本文库稀释至2-10pM，按照下述配制试剂：2×SybrGreen Master Mix 25μL、P5P7引物2μl、无核酸酶水4μl，样本(标准品)4μL。反应条件(ABI7500)：95℃保持5min；然后35个循环，每个循环95℃保持30sec，60℃保持45s；熔解曲线95℃保持15s，60℃保持60s，95℃15s。
(6)上机测序：根据定量浓度，确定上机最终浓度，于Nextseq550AR测序仪上上机，按照仪器操作规程进行测序，使用NextSeq 500/550Mid Output Kit v2(300cycles)。然后将数据上传服务器，由遗传咨询师对得到的数据进行分析及解读。数据见下表10。
表10 16个样本的测序结果与已知结果100％一致
样本编号 基因 核酸改变 氨基酸改变 Sanger验证结果
HJ36 LDB3 c.793C>T p.Arg265Cys 一致
HJ37 BAG3 c.181G>A p.Glu61Lys 一致
HJ39 TNNT2 c.259C>T p.Arg87Trp 一致
PLN c.2T>C p.Met1Thr 一致
HJ41 LMNA c.232C>T p.Arg78Trp 一致
HJ43 TNNT2 c.415C>T p.Arg139Trp 一致
TTN c.67910T>C p.Met22637Thr 一致
TTN c.31675C>T p.Arg10559Term 一致
MYH6 c.2353C>T p.Arg785Cys 一致
HJ45 MYH6 c.5071C>T p.Arg1691Cys 一致
HCMS50 LMNA c.794G>T p.Arg265Leu 一致
HCMS15 MYBPC3 c.2702T>C p.Leu901Pro 一致
HJ24 MYH7 c.2051T>G p.Met684Arg 一致
MYH7 c.77C>T p.Ala26Val 一致
HTS508 LMNA c.C232T p.R78W 一致
RBM20 c.G305A p.R102Q 一致
HJ10-1 LMNA c.936+1G>T — 一致
HJ12-1 MYH7 c.2981A p.Lys994Arg 一致
HJ8 TTN c.31558C>T p.Gln10520Term 一致
HJ11-1 TNNC1 c.A430G p.N144D 一致
TTN c.G67553A p.R22518H 一致
MYH6 c.C1210T p.R404W 一致
Ebstein5159 TTN c.T50407C p.Y16803H 一致
VCL c.C1225T p.R409X 一致
LDB3 c.G415A p.E139K 一致
HJ52* ANKRD1 c.527G>A p.Gly176Glu 一致
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 北京安智因生物技术有限公司
<120> 一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法及其试剂盒
<160> 281
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 1
ttctttcctt ctgacctagg actgggagct gcatgtgaaa gggaagctgc acgctcagaa 60
at 62
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 2
aaatcttgga acatcatacg tgcccattcc agcaaggtca ttcactcagt caagccccac 60
atttcc 66
<210> 3
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 3
acagaagctg cacaggccat ggtccagtat tatcaagaaa aatctgctgt gatcaatggt 60
gagaagttgc tcattcggat gtccaaga 88
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 4
tgtgaagatt ctaaatcctg ctccttggct ccctcacaga tatggcccag aaaggccg 58
<210> 5
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 5
atcagtgggc agacaggaga aagaagcaga gttctctgat ccggaaaaca caaggacaaa 60
gaag 64
<210> 6
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 6
aaatctctgg aggtgaggtc accagagtac actgaagtgg aactgaaaca gcccctttct 60
ttgcc 65
<210> 7
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 7
ccacgcttcg aaaggaaaaa gctctgatgc ttctgcttct gctgctactg ctgctgctgc 60
a 61
<210> 8
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 8
ttcacttccc agtttctaac cagcctgtgt ttctccactt tttatttcag gagactccat 60
cctctgccaa tgg 73
<210> 9
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 9
acctgatgat cgaagagtat ttgaccaaag agctgctggc cctggattca gtggac 56
<210> 10
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 10
ttctgtgtgg ttctgccggt gtgttaacct gtgttcttcc ctatagggtt gagaatgctt 60
gcaccaagct tg 72
<210> 11
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 11
aactcgatga acaccgtgaa agagttgctg ccagttctca tttcaggtac ttcctgcctg 60
tactttattt tataggg 77
<210> 12
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 12
tgcaaagaaa ataatggtgg gatttcttcc caaaaggaca ctgaagccat gaagagagca 60
ttggcctcca tagactccaa actga 85
<210> 13
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 13
ccaactcaaa gcagagcatt gcaaagaaga tcgatgctgc tcaggtagtc acagtgattt 60
tcaggagggg tgggaaatat ttcataaata tc 92
<210> 14
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 14
aatgtaaata gtgtttatgt gtgacaggat ggctgtcttt ttctctgtag ggggaaagga 60
gattctccag aggctcg 77
<210> 15
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 15
aattgtctcc tctgggtctt gtaagtttca ttgtttttct cttggtccag gtcaggctgc 60
catcc 65
<210> 16
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 16
tgaagacggc ccgagaactc acaccccagg ttgggttttg ctcattcctc atacagtgtt 60
cagtaaagaa a 71
<210> 17
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 17
ccgaggatcc caagttccgt gaggctgtga aagctgcctc tgatgaattg agcaaaacca 60
<210> 18
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 18
atgatggctg ccagacagct ccatgatgaa gctcgcaaat ggtccagcaa ggtaagtagt 60
gaagcttttc ttg 73
<210> 19
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 19
actgtatctt tgcttccctc tagggcaatg acatcattgc agcagccaag cgcatggctc 60
tg 62
<210> 20
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 20
aacataccaa attaaacttt ctctttaggt atgtgagcga atcccaacca taagcaccca 60
gctcaaaatc ctgtccacag tgaaggcc 88
<210> 21
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 21
agatcaagtc tgccagctac aacttgagcc tcaccctgca gaagtaggtg ggagctc 57
<210> 22
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 22
tctttgccct tttcctcccc aggtggtagt caactctcca gccaagttag tatcaaagg 59
<210> 23
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 23
tctaccaggc tgtgattaag agccagaaca agccagaaga tgaggctgac gagtg 55
<210> 24
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 24
atgttaaaag ctaaaaggct gcctggaatc cccccacccc aacaggctgg actcc 55
<210> 25
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 25
ctgtgcctac tgcaagactt ccctggcaga tgtgtgcttt gtggaagagc agaacaacgt 60
ttac 64
<210> 26
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 26
tttatcgaag ccctgggcca cacttggcac gacacctgct tcatttgcgc agtat 55
<210> 27
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 27
ctactccaag aaggacagac ccctgtgcaa gaagcacgca cacaccatca acttgta 57
<210> 28
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 28
aatcaggagt cggatcatct tatagcggtt cagtctcacc gcatcatgca acggggta 58
<210> 29
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 29
tcctttattc agcaacaatt ttaaaacatc caggtttcct ccacggcttg cccagtggat 60
ggctgtggat tca 73
<210> 30
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 30
attcgatctg ggctccagct tccattaact tctccacaat tgccaaatgt ccttccaagc 60
atgctctatg aagagctgtc cgttta 86
<210> 31
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 31
actagtggat tccacagatg gctctcacct ctgcctctcg ttgtttctcg cttttccact 60
gttgc 65
<210> 32
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 32
acataccagt tcctctactt tcagtaccat catgttggct gaaggagtct tgtatgtttt 60
tctgtcgtgg aaggaatccc 80
<210> 33
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 33
agtccagggc cttatagttg ggtggctcat aggtgatgcc tgttggtgac aggactt 57
<210> 34
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 34
acctggaaag ggatgagaag gttcacaggc tccccgacct tcttctgaat ggtct 55
<210> 35
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 35
acgagcctcc tcctgacctc agtctcactc accttcttgt caaacaccca ctcatc 56
<210> 36
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 36
taccctgcct gggtacgaag tcaatcttga cctctgcaag agaaggaaga gcaagtagca 60
<210> 37
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 37
attcttcagc cacacacccc gaacattctc atctgagacc tcacatttga acaccgcct 59
<210> 38
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 38
ccagagggga acttacttgc tgtagaacag aaggggccgt tgaagtgttc ccgacg 56
<210> 39
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 39
cagcagtgag ctgaagtcca gaatcccagt gtcctcatgg ctatcactat ggagag 56
<210> 40
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 40
cagtcaaatt tgtccttggt ggacacctca cagcggtagc tgccagtgaa ggcag 55
<210> 41
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 41
ctgatcagga tcttacctgc ctctatgacc ttgaggtcga acttgacctt ggaggagcca 60
<210> 42
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 42
aaatagtagg tgtgttgatg agaaagggaa gaaagctctg aactcaccgc ctcctcgg 58
<210> 43
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 43
tgagctggat ctccatctca ttgaggtctc cttccatctt cttcttcacc ctcaggac 58
<210> 44
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 44
ttcttgttct cccgcttgaa ggtctctagg tgctccaggg actcctcgta ggcgtt 56
<210> 45
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 45
tggtgaaatc attgagggag cgttgggcct cttctagctt cacgcggtac tcatt 55
<210> 46
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 46
tcttactgtt ctgctgatta atgtcaaact ccttcctgca ggagaagggt gggggtgggg 60
g 61
<210> 47
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 47
tttcttctcc ttggtcagct tagcgatgat ttcatccagc ccagccatct cctctgttag 60
gt 62
<210> 48
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 48
ttggagctgc aggtcattct tctcctgcag cagggacacc atcttctcct ccagct 56
<210> 49
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 49
ttgtgatcaa tgtccagaga gctgagcagc ttctctgtcc ccttcctgct atcaatg 57
<210> 50
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 50
ctggaaggat gagccctttt tcttgcctcc tttgctttta ccactgtccc ctaaacagcg 60
agag 64
<210> 51
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 51
cttctggaaa ttgttggact tgcccaggtg gttgtcgtac agcttggcct tgaag 55
<210> 52
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 52
aactcacgtc gaagatctcg aagccagcga tgtccaggac tcctatgaag tactg 55
<210> 53
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 53
cttctgcttg aacttcatgt tcccgtagtg catgatggct cccgtcagct tgtaga 56
<210> 54
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 54
caaagtggat cctaatgaat ttcccctggg gacgaatggg acagagtgag ggaac 55
<210> 55
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 55
ttggcattgt ccttcttgcc acggtcacct atggctgcaa tgctggcaaa gtactggatg 60
a 61
<210> 56
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 56
ctcacctgtc agcatgtact gataggcgtt gtcggagatg gagaagatgt ggggcg 56
<210> 57
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 57
ccgggacaaa atcttggctt tgacaaactc ttccttgtca tcgggcacga agcactcagt 60
gcgaatgt 68
<210> 58
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 58
ttcgtccagc cggtgctgca ggtccttaat ggtctgttcc atgttcttct tcatg 55
<210> 59
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 59
atggcgatgt tctccttcag gtcgtcgttg gcacggactg catcgtccag ctgaat 56
<210> 60
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 60
tggatagtct ttccgctgga acccaactgc tcagtcaagt cggagatctc ctctgtgtg 59
<210> 61
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 61
aagtcctcga tctcattctg tagccggtgc ttggtcttct ccagcgagga gcacttggca 60
ttaaca 66
<210> 62
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 62
cttggccttg atgatctgct ccatgttgga ggtgacgtca tccagctcca gcttgaac 58
<210> 63
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 63
aggggacaca gtactttttc agccgctcat ccagctgctg cttgtcattc tccaggtcca 60
t 61
<210> 64
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 64
atcagctgat cacagcgctc ctcagcatct gccaggttgt cttgttcctg aaggtg 56
<210> 65
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 65
agcgggaaac ctcctcttga gatctctcac ctacgttcca gcagcttttt gtactccatt 60
ct 62
<210> 66
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 66
tccatcaccc ctgtggcaag aaggaagtag gaggagtctg tgagaacact ggactg 56
<210> 67
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 67
ttagggatga tacaacgtac aaagtgggga tgggtggagc gcaagttggt catcagcttg 60
ttcagatttt cctgtggcca aaa 83
<210> 68
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 68
cagggtgctg agcagcttga gggaagactt ctgatacaag cccacgacag tctca 55
<210> 69
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 69
aactcacatc gaagatctcg aagccagcga tgtccaggac tcctatgaag tactggcg 58
<210> 70
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 70
tacatggagt ttttctcctc tgaagtgaag cccagcacat caaaagcgtt ctgtagggag 60
gccccatatt 70
<210> 71
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 71
atgtgataat ctctctctgc tttcagctgg aaaataactc tggatttttc cagaagatct 60
gtgaacaggt ggggaga 77
<210> 72
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 72
tccccaatgg ctgcaataac agcaaagtac tggatgaccc tcttggtgtt gactgtcttc 60
c 61
<210> 73
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 73
cttgtaaggg ttgacggtga cacagaagag gcccgagtag gtctggggat agaaa 55
<210> 74
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 74
ttggccttga caaactcctg tttgtcatca ggcacgaaga catccttctt gaggtcaaaa 60
ggc 63
<210> 75
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 75
atactctgag gctctcaaag atgcccagga gaagctggag ctggcagaga aaaaggccac 60
<210> 76
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 76
tcagctctaa atcttgggtt ttcttgcttg tctttctttt cagaggcatg aaagtcattg 60
agagtcgagc ccaaaaagat ga 82
<210> 77
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 77
aagaagaatt gaaaactgtg acgaacaact tgaagtcact ggaggctcag gctgagaagg 60
taggcc 66
<210> 78
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 78
ccacattgat acgctccttt gcacttgcac attcttcctg tgtgtcctct ggggt 55
<210> 79
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 79
tctgcatttg tctattctcc agctgaccct ggttctctct cttagcatcc tgccttag 58
<210> 80
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 80
agatgctgga tcagacttta ctggagttaa acaacatgtg aaaacctcct tagctgcgac 60
cacattcttt cg 72
<210> 81
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 81
tttttcttgc ggccctccat tccactcagt gcatcgatgt tcttgcgcca gtctccc 57
<210> 82
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 82
tcccacctcc gtgatgttct tggtgacttt tgcctctatg tcgtatctct cttcatcc 58
<210> 83
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 83
tcagacccct gccttgggtc acatttgcaa gtgccaactc tcatttctac cttattcttt 60
tcc 63
<210> 84
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 84
ctctcttctt tagcaatacc aagaaggagg gtgacctgat agctgctcag gctcgg 56
<210> 85
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 85
aggaactaat tctgattttg gtttctgtgt ccttcctcca acccttccag gagctgcgtg 60
agaccaa 67
<210> 86
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 86
atgggcaatt ggcagatcaa gcgccagaat ggagatgatc ccttgctgac ttaccggttc 60
c 61
<210> 87
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 87
agacaagaga tgggaatgag gtgggaggtg gaagaaggga gaagaaaggt gagtt 55
<210> 88
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 88
aatgacctca gacacttaca ctttctggtt atcgttgatc ctgtttcgga gaacattgat 60
ctgcaagaaa agtgggaagg acaaagagca a 91
<210> 89
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 89
tcagctgatc ttcattcagg tggtcaatgg ccagcacctt cctcctctca gccagaatct 60
tcttcttctt ttcc 74
<210> 90
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 90
tcctcctcct ctcgtcgagc cctctcttcc tgatttacag cagggaggaa gaaagcaaa 59
<210> 91
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 91
cttacatcaa agtccactct ctctccatcg gggatcttgg gaggcaccaa gttgg 55
<210> 92
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 92
cctttgcctc ccttgtacct ctctcctgat atccttacct tcagcctcct ttgcttcctc 60
ttcttcttc 69
<210> 93
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 93
ctggctctcc acctgcctga ggcacatacc ttcaacagct gcttctgctc agaagagaa 59
<210> 94
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 94
actcaggcaa gatgctccag atactcactc ctcctcgtac tcttccacca cctct 55
<210> 95
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 95
ttggaggcag acatttggac tgactgagac gagaagcttc cttgcaagct tgtgtcacca 60
cttgttctca atactacct 79
<210> 97
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 97
ctgtgatgtt ttagtgattt cctcatggac aatggatttt tccagggagg ttgctgctga 60
tttcttgact tcttcagaaa tcagaacct 89
<210> 98
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 98
tagtctgctt atacttgcgt ggctctggta catcataagg catccggagt tttctctcct 60
ccttctt 67
<210> 99
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 99
tgatgctgac cacttcacct cggagagcat gaactgctcc catgccttca agagttttag 60
g 61
<210> 100
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 100
tcactgagat ggctgaagac accaattgcc attcagcccc ctccttggcc tcacattttt 60
ccac 64
<210> 101
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 101
tagtctttat agacatagca gttctgcgag gtctgctcag cccagtctca ttctcagcaa 60
aaaccctgaa 70
<210> 102
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 102
tcgaggatgt agcctaagat gtcagcacca ccatcatcag caggaggtct ccagc 55
<210> 103
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 103
tctgtaatgt ttctgggggt ccaggaatac ctgcagcaag acagaggtta acacgatatg 60
gcaatatgaa tac 73
<210> 104
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 104
aggaagtaac agtgtgctct aggactgtgg gttttaaggt gacaaccttc atccatctct 60
ctgt 64
<210> 105
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 105
tcgctgtatt cgctcatacc cttcacgttc acggcagcaa ctctgaagga atatttctgg 60
ccc 63
<210> 106
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 106
tggtaacgac ataggatagg gttgggcatt cgccttcaac aatcacccag ttgagc 56
<210> 107
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 107
aatgctgttg cctgttatgt tgctaggttc tggaatgcca ggggcatcag gaacagctgt 60
aaaacaaaaa ca 72
<210> 108
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 108
attctgaact catagcgatc cccaggactg agtcctgtaa ctgtgtactg acattcactg 60
acgtc 65
<210> 108
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 108
acagtaggtg gaggtctgcc tttaaaggga atcaacactt gtacatcttc accagctttg 60
gca 63
<210> 109
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 109
tcaaggaaat agccacttat atcactaccg ccatctgcaa ttggcctgct ccatacaaca 60
gtcatcgaat tcttggtaat cttt 84
<210> 110
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 110
tggctgaggc tgagcccatg gcattcctta gttttaattc atagcatcca ctattaaggc 60
gatc 64
<210> 111
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 111
caagcatcaa ttgccaagac tggttcagaa ggatggctag gttttccaac tccagcagca 60
tt 62
<210> 112
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 112
tctagtgctt caacgacata gtgtacaatt ctgcttccgc catcatgttc aggcttcagc 60
caggt 65
<210> 113
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 113
taagcttggt cactgtgaac tgctttcctt gtaatcctgt tggtggagtg caggttgtcc 60
attcatccgc 70
<210> 114
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 114
tctggtttca cagtaccagg aactgatgta gcctcaccta aaccaacttt gttgagggca 60
cagactc 67
<210> 115
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 115
atcacaagcc ttttggtaag cagaaggagg gcttggttca ctaagtccag cagcattct 59
<210> 116
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 116
tgacatcacc aacctctcct acaatgttcc ttgctgttaa tggatagggc ccactatcac 60
ttctgacac 69
<210> 117
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 117
aggactgtta ccttcacatg ttccaccttc gtgccaaaag gattggtagc agtgatggta 60
tattcacccg c 71
<210> 118
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 118
tctcgcaaca attggctccg atttcaggcc ttcccctaca ccatatttat tttcggcact 60
gaccc 65
<210> 119
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 119
atagtttatg atggggcttc cgccatcaat aatgggaggc tcccaggtaa cataagcaga 60
gtctttggat atttc 75
<210> 120
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 120
accaccggga aatgttccta ccatatgggt ttttggcaat tgctggttca gtgaagactg 60
gatcgcctac tccatattta 80
<210> 121
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 121
atagtcactg gatcagaagg ttcagaaggt gggctaatgt ttaccgcggt cctggcaata 60
gctctaaatt gatac 75
<210> 122
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 122
tagtaaccac tgtctttcct agtcacatct tttatgatca gaattgaaga gctgtctgct 60
ttatgcactg ccaggtggct ggatg 85
<210> 123
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 123
aagcactggt tttgggacat ctgttgggac gccagggcca tattcgttga cagcagttac 60
t 61
<210> 124
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 124
acgtgttact gtagtaccag gtgtcaagac agtagcagaa taggtagacc aaaccattcg 60
ctttgtctca catttttcta g 81
<210> 125
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 125
tggagaacca ccatcacgat ccggcttatt ccagactagg gagacttcag tcttgtcaac 60
atctaca 67
<210> 126
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 126
aatcttgctc ccaccatcat gacgtggtgg ctgccaagtt agatcgactg aattgcat 58
<210> 127
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 127
tgtggaactt ctcagtccca atgagccgac tttctaggac atagttaata atttctgacc 60
caccatcata cttagga 77
<210> 128
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 128
tggaggaggc tttccagaca cataggcaat gattcggatc acccctccag catggacaac 60
a 61
<210> 129
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 129
tcaaatttta tgggtcccac tggagggcca ggacgaccta aaatggttta aagaaggaac 60
cctttatcac tcagatgatt t 81
<210> 130
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 130
cagtacattg gtacttacat gtctggtctt tgacagtcac agggccaaca gtggctgaag 60
<210> 131
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 131
ttggttcaga ttcaccagct tcattgacag ctttcactct gaatctgtac ttcctgagct 60
ctttcagatt aggcaccaca 80
<210> 132
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 132
tcccggaccg ctttgggaat gctaagctca gtttttgcct cacttcggga tacctc 56
<210> 133
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 133
aacttgttct tggcaataac acggaactta tattcttgtc cctcaagcag acctgtgatg 60
tcacatttag atctctcagt ctctattggt 90
<210> 134
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 134
cggatttctt tgacggtgta ctgacggacc ttgatcatct tctctgtgca gcgtgaccat 60
tcatttgtg 69
<210> 135
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 135
cacactgaca gtacaaggag cttttgcaat accgtggtca ttttcaactt tgatcatata 60
cagaccatgg tcaggtcgga 80
<210> 136
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 136
agtggcaact ccatgaaaca aaacttacca atgggatcta cagctttggt tggaggagta 60
gcccga 66
<210> 137
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 137
aggctgttgc tgagccgagc ttattctcca gtgtaatggt ataaattccg gcatctgcac 60
ggacac 66
<210> 138
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 138
tcgttttgtc acatcaacca ctgccagggc gtagggtggt ccaggagtgg ctgaaaataa 60
aataaacaa 69
<210> 139
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 139
aaagcacagg gtcactgggt tcactgggtt cactttcccc agccttattc acagctctaa 60
ctcg 64
<210> 140
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 140
agtttgtatc cttgacggtg gatgagagct tgtgccacac ttcactatca gttgctcgtc 60
<210> 141
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 141
actaggagta cacatttact ctcatgccaa attaaaaacc tactttgttt ctgcaacagg 60
ttctccacag gcaacccatt tatcag 86
<210> 142
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 142
caggttcatc aacatatgca ggttctccag ggccacattt gttacgagca caaactttaa 60
ataagtactc ttttccttga acaagatcag gaac 94
<210> 143
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 143
agtctgatct gaggaagtta ggtttacagg aggacttggt ctctctggaa taaaagaagg 60
agttggagca taccattta 79
<210> 144
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 144
ctccttgctt ctacaggatt gtcagtttct actggctcac cagtgccaac tctgtttct 59
<210> 145
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 145
ttaatatgta ccttccacaa aaagtctagc acgagacttc ctgtcttcta ccccgcaagc 60
atattcacac tcatc 75
<210> 146
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 146
aagcaagaac aaacttacca atgactgtca agtgagctgc tgctctggcg gcccctac 58
<210> 147
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 147
cttcacaaag aatgacttta ctcttaccca gaactgtcag catgccagaa gttctcgctg 60
tccttacttc acaggaatat tcagct 86
<210> 148
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 148
cttgcttttg aggatttctg tcccattttt gaaccatttc accttagcat tttctctgga 60
gacttcacac tccagcactg cagtg 85
<210> 149
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 149
ccagaaaaag aacgggaaag acaaggcatg cctgcttttt accttatcgc tgggctctag 60
t 61
<210> 150
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 150
ttacgcttaa ctcggaggtg ggcactagat ttaacattgg cagcttggaa atccacccca 60
cccg 64
<210> 151
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 151
aatacagcac tttccttctc tttggcagtt acatctttga gaggggtgag gaatttgagc 60
cgg 63
<210> 152
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 152
agcagcctgg aaggaaacct ctcctgtcat acccagctga cagttatgaa ggatc 55
<210> 153
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 153
atttgccttg gtcttgtctg tgccacagtc acacacatat tcgcctttat ctttaaggtc 60
cgcctttttg atttttaaga tgc 83
<210> 154
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 154
ataacatttg cctctcgggt gaggacacat tcgaatcgag cctgtcgcct ttctggaaca 60
gtgacat 67
<210> 155
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 155
ctctattggt ttaagcagtt caacttcacg ctctgtattg gtcagggatg aagtaacata 60
atgctttaga caacccaacg a 81
<210> 156
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 156
acttttacgc aagatgaaca ctccaggttg ttggcgtttt ccacagtaac tgtgtatgtt 60
ccagcatctg tgtcatctgc atcgttgatg g 91
<210> 157
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 157
cagagtggaa ggttacaatg caagtactag aaaaatgaat ttcacctttg ataggacctt 60
ttggcttggc agcctcttcc ttaggtgctt tggc 94
<210> 158
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 158
tcggttcagg tgcagggaga ggtattgctg gcttgatttc aggcactgaa ataatttaga 60
gtagagggca gattattaca gga 83
<210> 159
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 159
cagcctgtga aatacctttc agaggtgtaa gctccacttt ttctggaacc tgaggttttt 60
caggaacttt cttctttgga atagc 85
<210> 160
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 160
taagtccact ggattgaata ccttttactg gtatttcttc aggctgtggt tcaggttcgg 60
gctcttcagg 70
<210> 161
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 161
ctttagctgc tggtgtttct ggcttcttaa cagttgggac cttcttcact ggaacaactt 60
tctttggc 68
<210> 162
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 162
tccgctcttt ctggaacagg aacagctggt ttctcttcca agacaggttt ctttggcact 60
tctggcactt t 71
<210> 163
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 163
tctggctttt tgggaaccac cagaggcacc ttcttttcag gaacaacctc cttggg 56
<210> 164
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 164
tcagcaggag gctcttctag ggcaacttcc tcaggctcct cgaacacttt aaagacatga 60
<210> 165
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 165
ttttaggagg agccgctggc actttctttt caggaacaac ttctttcgga gcctctggca 60
cttaaa 66
<210> 166
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 166
agccagtgac aaataccttt aacaggaggg acttcaggct ttttaggagg agccaagggc 60
attttctttt caggaacaac ct 82
<210> 167
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 167
aggagccaag ggcactttct tttcaaggac aacttctttg ggagcctctg gcacttaaaa 60
gatattagta aagttacatg 80
<210> 168
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 168
tctggttttg tgggaggagc cttaggaact ttcttttctg ggacaacttc ttgagcttca 60
ggcacttgaa aga 73
<210> 169
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 169
tctgcaggat aaggttgagc tgacatgtac ctgtaactgc gggggcttct ggttt 55
<210> 170
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 170
tctggctttt tggcaggagg caccggtact ttcttttctg ggaccacttc cttcggtg 58
<210> 171
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 171
ttcaggcttt ttaggaggag tcgagggcac tttcttttca aggacaactt ctttgggagc 60
ctctggc 67
<210> 172
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 172
atacctgtgg caggtggggc ttctggtttt gtgggaggag ccttaggaac tttcttttct 60
gg 62
<210> 173
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 173
agatttcttc tgcaggataa ggttgagctg acatgtacct gtaactgcgg gggcttctgg 60
tttt 64
<210> 174
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 174
tgtgtaatga tacctacctt taggaggtgg agcttctggc tttttggcag gaggcaccg 59
<210> 175
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 175
ctaaaatcag tgacaaatac ctttaacagg tgggacttca ggctttttag gaggagccga 60
gggca 65
<210> 176
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 176
acctgtggca ggtggggctt ctggttttgt gggaggagcc ttaggaactt tctttt 56
<210> 177
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 177
agagagattt cttctgcagg ataaggttga gctgacatgt acctgtaact gcgggggctt 60
c 61
<210> 178
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 178
ccccccgact gacaatgtgt aatgatacct acctttagga ggtggagctt ctggctttt 59
<210> 179
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 179
acacagcaac aagagggtgt ctaccttttg tgggtggcac ttcaggcttt ttaggag 57
<210> 180
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 180
agcaaaagaa tgagatctga agcctaaggt cagtggcaac tacctttaac aggtgggact 60
tcaggctctt taggaggag 79
<210> 181
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 181
taagaatgta cctttgacag gtacaacttc agccctttgg ggaggatgca ctttcttttc 60
cgggacaa 68
<210> 182
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 182
ctacaagagc tagttcttga ccctgagagc atggtgactt gtacctttaa ctgatggggg 60
ttctct 66
<210> 183
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 183
tccaacttgt acctgttggt gatggtgttt ttcttctttt aacaatagga gtttctccct 60
ctggaatgac ttccttgaag acttcaaact ct 92
<210> 184
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 184
tcagagtgga tcattggtgt tatatacctt ttgctagttt gggttttgtc ttttgaggtt 60
gagtcacaag tactttttct tctaggactg cttct 95
<210> 185
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 185
tttagttggt ggaactctgg gctcttcagg aacacgtact ttttcttcta ccacaatttt 60
cttaggcacc tccggtactt taaagataat agtaa 95
<210> 186
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 186
caggatcttt ccaaaaatac ctttagctgg gggaacagct tcctttttag gcacaaggac 60
tttcttttct gggactttct ttggtacttc aggca 95
<210> 187
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 187
tatctacctt caactggtag aacttcctct tctttaggga gaatgattcg tttttcttcc 60
accttcttag gcacctc 77
<210> 188
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 188
aatacctttg gcagggggag cctcctcttt cttgggaatg accactttct tctctgtcac 60
tttcttctta atttc 75
<210> 189
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 189
ttcaggtaga acttcctctt cttcaggtag aacttcctct tcctcaggta gaacttcctc 60
ttcctca 67
<210> 190
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 190
tgaaattatg taccttttgc aggtggagcc tccactttct taggagcagg aactggcacc 60
ttcttctcag 70
<210> 191
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 191
tgatggatta taaggatgta ccttttgctg gcggaggctt ctccttttta ggaataagca 60
caggaacttt ctcctctggc ttctta 86
<210> 192
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 192
catctacctt tgactggtat cactggcacc acttcttcct cagttatgaa ctcctcttct 60
tcatgaatgt actcttcttc t 81
<210> 193
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 193
catcagaaaa gatcacaatc gaggaaggaa atcattatac ctttagcagc gggttcagtc 60
acctgctctt tttcacgttt gg 82
<210> 194
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 194
cctttggttt tgtgggaact ggttcttctg ggacaggctt tacagggata ggcttctctg 60
gttc 64
<210> 195
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 195
tagggcaagt acaatattgt gcataatgga agggcggatg tacctcttgc ttttggaggc 60
g 61
<210> 196
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 196
aatccaatat acctttaggt gggggcacct tttccttttt aggaactgga gcaggaactt 60
tcttttctgg c 71
<210> 197
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 197
aattaaagag tcagcatacc ttcagctggc tcagcttcca ctctcttaga aataatgtgc 60
agcttttctt ccacaaca 78
<210> 198
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 198
aggaaacaca cacaaactca tttatcccct gacttccgat tatatacctt cgtgccgcgt 60
gacttccact c 71
<210> 199
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 199
actggaacat aaagacagtt cttgggaaga tggagaaaca ataccttttg gtggtggtgg 60
aacttcttcc tccttccgag gaa 83
<210> 200
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 200
aggcttgaag gaaagacaag gttatttcat ggagatggga ttaagtacct gctggtggtg 60
gagattcctc tctttgagtt acaatggtt 89
<210> 201
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 201
caggttcctt cttaggcaca ggaactggct ttttctcctc tggcacgggt ttcttgggaa 60
cctcaggaac tttaaagata caattgttga a 91
<210> 202
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 202
tacctgtgac tgacacctcc tcctctgtgt gagaagcaaa gaacatcttt tcttctgaaa 60
taaccatctt ctttgtatgc acagctg 87
<210> 203
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 203
ctttcttggt aagcctcttc ccactcttcc tccccttcgt catagccttc ttccctttca 60
tagtattctt gcccttcttc aa 82
<210> 204
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 204
tggtggcact gctctgatag gcatggttgg gattggaact ctggagtcag gaatatctgg 60
aaagggacat gtaata 76
<210> 205
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 205
taccatgtta caatggcatc atcaaaggac acttcacact caaaggtggc agactgatgc 60
tcactcacca cgatgtt 77
<210> 206
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 206
tagcgctagc gatgtgtgga ccacaaacca atcgataatt gccctggtct ttaagttgac 60
agtttttgac tctgagtgta tgtcg 85
<210> 207
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 207
tcttcttctt ggctttgctt gagcagttca aatgcttgaa gaagacctcg gaagtcagtg 60
attccataca tgcgggcata tttttcata 89
<210> 208
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 208
aaaaagagtc ttccatctac cgcagctttc ttggttgctg gggccacagc tggtttgtct 60
gaaa 64
<210> 209
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 209
ttttgtacca ggcaacagtt ataggttggg aaccagccac acgtccctca agtttgaaag 60
aattcccttc tgtttcttct actgtctc 88
<210> 210
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 210
taccaagaca cggagatagg ttctgatcca cttatggcac aatcaaaaac aactggcagt 60
ccaactgttt cttgaacatc tctcaattg 89
<210> 211
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 211
ctgctacctt tgaaccagct aacactgaaa ggaggtgttc cttttacgat acttgtgaaa 60
gttacattgg tcccagttaa aacatc 86
<210> 212
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 212
actccattac aactgaggag ccggatagac catttgtctc tttcaatttt cttgtgaatg 60
aaggaggaac ggttcggtct gaatgata 88
<210> 213
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 213
ttactaaccg agaacggata gcgtggcgaa gcactcttgc atcccagcat cgtttttgat 60
ctgacaagtg tattttcca 79
<210> 214
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 214
cattgtgggc ctcacaggtg tagtctccac tgtcttcaac actgagattg tgcatttcca 60
gcac 64
<210> 215
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 215
ctactgatac aggctttaga tcaaagaaag gaggcacttc atgctctgaa aagaatgaag 60
accaacatgg tgatttttat ttccatgctc tcac 94
<210> 216
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 216
ttcacacaca ctaggttaaa caacaccatc acctttgata acaagcacag ctgaagaagc 60
gactgccccc acact 75
<210> 217
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 217
ctccaacaag ctcagattca aagtacagac gttttccgaa aagctggact gacatttggg 60
cccactaaca atctcatttc catcc 85
<210> 218
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 218
ctgcagacaa ttctcttcca tctttgaacc acttggctga gagttctggt gttccagtca 60
ctacacactc taatgcaaaa ggatttccag ta 92
<210> 219
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 219
agataggagg aaggggcata tatttttgtg tccatgtata caaacctttg aacttgacag 60
agcaagaaca cgtgtcactt cccacct 87
<210> 220
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 220
caggacggat ctccttgtta tcttttgacc aagtgattcg catcggttga gcaccagtaa 60
catgacactc aaaatcagca ctttctcca 89
<210> 221
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 221
tgtggccaca ttgtttgtaa agtaggtcct gtattcagga gttggccgta atttggtatc 60
tcctttgtac caagacactg taatttctgg tgtcc 95
<210> 222
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 222
tgtcaatatt aaataattcc agttctgcca cagtgtcttc aaaatagatg ttgcaccggt 60
ctcctttcac tagttctctg gcacctctga ac 92
<210> 223
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 223
cttaaggaag agattttgtt gtagaagcta aatttgtgtt tttggctgct ggtcaacagc 60
tttccatcct tgtaccattc aacagagagt tcc 93
<210> 224
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 224
ctgagttgcc gcttgtcttt gtaccatacc acctcaaacg gtggtgttcc cgaaagttca 60
cattcaagac tgacttcagc atttttaagg gttt 94
<210> 225
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 225
cagtcagaca gaaacataaa ggaatcaaat ttgcacacct gtcacaagca acatcgtagt 60
acaagagtcg ctaccaacat ca 82
<210> 226
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 226
agcactctta agtaggcatc acagctactg cttccgaagt cattttccac cttgaaagtg 60
tactgac 67
<210> 227
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 227
cagaattttt atttgatagg ctgcttcttg tataactgac ctttcagggc aactctagta 60
ctgcatgagc agctgc 76
<210> 228
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 228
agagtggctt tgctggttgc tgtgccaaca tcattgctta gttggcaaat gtaggttcc 59
<210> 229
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 229
accatttggc tgtaatctcc ttagtccctg aaaatttaac ctgcaaagtg gctgggtctc 60
cttgggtgac atct 74
<210> 230
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 230
tattcctgca tcatttttgg cctgacagac atatttccca tcatgcttga cttcaatgcc 60
actgaggtac aaactggcca cattgttctc a 91
<210> 231
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 231
tgcttcccac ggaatttgtg gctcgacaag tgaaattccc tgcatcattc atgtctactc 60
tgatgatctc caaagag 77
<210> 232
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 232
atctcctgct gtcacctgga tcagttctgc tcgctcaatg attttggcag gttctacaat 60
ggtatgaaat agttagc 77
<210> 233
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 233
actgccgacg tcattcactg cttcacatga gtaactccca ctgtcttcaa cttttacatc 60
cgtaatatca agtatagcct cag 83
<210> 234
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 234
ttacctgtca cagttagtgt ggctgtacag ctgacactgc catactcatt ggaagctttg 60
catgtatact cgc 73
<210> 235
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 235
atgcaaagaa attccctggt gctttcagga gtgagcttgt cttgctccaa aatggattgc 60
aattcctgag ctcccaaa 78
<210> 236
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 236
attcctgatt tgtttgtagc tacacaccta tactctcctt catcactctt tactaagctt 60
gttataaaca ggttatggaa ccctgtgcca ct 92
<210> 237
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 237
ttgctttagg ttccagctcc tcagtttgaa acacttcttt agactcttta tcctgttctg 60
ggataggagt agctgctgtt ac 82
<210> 238
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 238
ctacacttag tactgctgac gttgtcctct ctccacagtc attgtgtaca atgcagctgt 60
atagtccttg gtct 74
<210> 239
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 239
tggcttgatt ttcttgtctt tgctgtacca cgacactttt agatctgcga cacaaaagaa 60
aagagatact tcaaccacaa aaacgagtgg a 91
<210> 240
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 240
actgccgcat cctctgggaa ggcttcaatt agcaaaagcg tgtactcttg cccatcatga 60
agaaatttgc act 73
<210> 241
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 241
tagcaagaca aaacaactga cctgtctgtg atctgcagtt cctggtcatc tttcatccac 60
tgtacagt 68
<210> 242
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 242
ttcagccaca tggaagggac attgaagtgg gacacctcac actcaaaaga ggcagttttg 60
gtctcaggca cctcgatatt tttcat 86
<210> 243
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 243
caactttgag tttggcagat gttttggagg tggccacctt gtaggtatat tctccaatgt 60
catctaattt ggtggcagca atgata 86
<210> 244
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 244
attccacagg acatcaattc cagagtggga cagctcaacc tcaaacacca cattttgagt 60
ttctgtacag gtaaggtca 79
<210> 245
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 245
ctttaattta caggttgtct ttttcccgtc gatgacaaag ctgtattctc cctggtcctc 60
cttggttaca tccttgaccg tg 82
<210> 246
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 246
cataggattc atccttcttt cgagacttga gctccacagc ggtaatggct tcataatagc 60
cctcttctgt tctgcgctt 79
<210> 247
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 247
cagtccattc cccagaatca ctgggtgtgg cagggacaat aattagtgat tgagtaccat 60
cttctttaat gactacttt 79
<210> 248
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 248
ccttcatctt ctggaagaac aacaggtata cgcagactag ctctgccatc ttgtagaaag 60
tccatttggt atct 74
<210> 249
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 249
tgcacataga aactggagtt gcacttacct tcttcaagca aggaagcaga tgcagaagtt 60
tctccatgct tattgcgaac aacaatagtg tat 93
<210> 250
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 250
atgcttcgcg aatcataaga cgagcaattc cactctggaa ggttatctgg aagtcaatgg 60
aactttcgat ttggtagtct 80
<210> 251
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 251
tctagtctca ctgggcttca cagtaggagc cttcaccgat ttggtgatct tctgagcaga 60
aga 63
<210> 252
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 252
agtctcagaa ggagcctgga ttactctagg cttgactgct ttagggacaa cgtggggt 58
<210> 253
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 253
ctcccgggac tgtttctagt tttgtggact ttgcagtggc aactaccacc atggat 56
<210> 254
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 254
tcactggttc tctcactctg gccatatcaa cggcagcaac aacagtcgca acagctgcac 60
<210> 255
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 255
tttttagcag gtacttcttc ttcacctgtg ggaagggaaa gatgaatgtt tgggaggggg 60
cacaatg 67
<210> 256
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 256
aagctcagca gtactagtcg cttgtccaga tccattggtg gctttcaggg aatatcgtc 59
<210> 257
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 257
tggtggctct agtgacactg tcataggagg gtgggaagga agtggaggag atgga 55
<210> 258
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 258
agatggccac aaagagcagg ttgatcttgg ccaagatgtt gattttctca ggactttggt 60
catctgtctc cacca 75
<210> 259
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 259
cttggagccc agcttcttca tggcattgta gtacttcttc tgctcctctg tcatgaagat 60
gtc 63
<210> 260
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 260
aaaatgacaa aatagatgta catgtagagg ttgtattccc actgaggctg ctcttcatac 60
tgcaagggag aaatcacaca gggagatc 88
<210> 261
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 261
aaagttgact ttcaccttgg tccagtacaa ttctccggtc aagttcaagg actcacactg 60
gctcttgttg ttcacgatgg 80
<210> 262
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 262
accttgatgg tcttccgctc ctctaggtag atgtcctcga aggcctgcag acaagg 56
<210> 263
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 263
acacaggctg ggattcctgc tgaaaagacc ccagcctatg agctgagtcc acaca 55
<210> 264
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 264
atggtgtgtg tgtggccctt ggccaactta ccacaaggtt gccaatgacc ataacaagca 60
agaaga 66
<210> 265
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 265
atgttgtagt gctccagcgc catgaagagt gtgttgagta cgatgcacat agtgatggtg 60
aggtcagtaa 70
<210> 266
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 266
caccctggaa aagctagaac cacagctggg attaccattg ctctgggacc atcttctgag 60
t 61
<210> 267
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 267
agtcctgcgt catcaggcgg aagagtgcaa gaaaggccca ggcaaaggaa tcgaa 55
<210> 268
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 268
agagcaagtt cgcacctgga tcactgaggt aaaggtccag ggattcccag accaag 56
<210> 269
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 269
ctgggcatct tacctgggat aactgaaata gtttttagag ctctcaggac tctgaaagtt 60
cgaagagccg acaaattgcc tagttttata ttt 93
<210> 270
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 270
tcagcttgtg cctggctcag aagtccttga aatcatgagg tggaggtggc ctgaatactc 60
attgg 65
<210> 271
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 271
tgcacatgat gagcatgttg aagagcgtgc gtggggtcaa ggaaagctga gcagcat 57
<210> 272
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 272
ccccgaggta ataggaagtt tgccatcttc tcatcctgct tctgggcaca ggctctcct 59
<210> 273
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 273
tcaagggtca cgtgctcact tgtcaaacat gcggaagagg tcagacagct cctcctcaga 60
tt 62
<210> 274
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 274
tcctcagatt tccctttgct gtcgtccttc atgcaccgaa ccatcatgac caggaactca 60
tc 62
<210> 275
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 275
accatttttc tgctcttctg tcagctgctc tacctagaaa ggaaagggaa tctcaaggct 60
cagactc 67
<210> 276
<211> 70
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 276
tctgctcttc tgtcagctgc tctacctaga aaggaaaggg aatctcaagg ctcagactca 60
ggtatagctg 70
<210> 277
<211> 58
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 277
ttaccatcat agtcgatgcg gccgtcgttg ttcttgtctc cgtccttcat gagctcct 58
<210> 278
<211> 56
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 278
acgaagatgt cgaaggctgc cttgaactct gtgttcaggg gttggggggc acagta 56
<210> 279
<211> 55
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 279
atttaaaggg cctgggaggg gagagagaat gaggagtgat catggctacc tcaga 55
<210> 280
<211> 58
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 280
atttaaaggg cctgggaggg gagagagaat gaggagtgat catggctacc tcagagct 58
<210> 281
<211> 57
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 281
aatgaggagt gatcatggct acctcagagc tgagctgcga ggtgtcggag gagaact 57

Claims (10)

1.一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：经过illumina测序平台专用测序接头连接反应制备的DNA文库采用杂交探针捕获的方法获得目标区域文库，采用LMPCR方法扩增文库，再进行文库纯化，即得测序基因检测文库；所述的目标区域DNA为ANKRD1、BAG3、LDB3、LMNA、MYBPC3、MYH6、MYH7、RBM20、SCN5A、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、VCL基因的突变及以上基因的编码氨基酸的外显子区域及外显子上下游各20碱基区域。
2.如权利要求1所述的一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)DNA质量标准：提供受试者样本的基因组DNA，经过核酸提取、质检后，要求DNA符合一定质控标准；
(2)文库制备：将上述符合标准的基因组DNA，超声随机打断至180bp-220bp短片段，然后进行末端补平加A,连接illumina测序平台专用测序接头，并通过PCR扩增达到一定总量的DNA文库；
(3)杂交捕获：将步骤2得到的文库，与疾病相关定制探针进行特异性杂交，捕获含目的区域的文库，再通过磁珠抓取、富集留下含目的区域的DNA文库，即得目标区域文库；
(4)LMPCR扩增：将步骤3得到的目标区域文库，作为LMPCR模板，加入与测序接头匹配的引物及相应试剂，进行扩增，扩增后加入磁珠纯化，即得纯化文库；
(5)文库质控：将步骤4得到的纯化文库进行质控，选择Qubit 3.0进行定量检测，Agilent2100或Agilent 4200进行定性检测，查看文库片段分布是否符合要求。
3.如权利要求2所述的一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，上述步骤(1)中所述的DNA质控标准为，DNA浓度≥20ng/μL；DNA纯度：OD260/280＝1.8-2.0，OD260/230>2.0；DNA总起始量:0.1μg-1μg。
4.如权利要求1所述的一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的末端补平加A的反应是指DNA随机片段化至180-220bp，通过5'→3'聚合酶及3'→5'外切酶作用，进行末端补平,同时5'端进行磷酸化，其次3'加A，以便和测序接头进行连接。
5.如权利要求1所述的一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述连接illumina测序平台专用测序接头反应包括连接接头反应、消化反应及纯化反应，所述的连接接头是指在DNA片段两端连接illumina平台专用的测序接头，含有和平台芯片结合的特定序列P5、P7以及测序引物序列，其中P7端含有样本标签，长度6bp，其测序模板具体结构如下：
P5+Read1测序引物+插入DNA+Read2测序引物+Index(6bp)+P7。
6.如权利要求5所述的一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，所述测序模板序列一端为：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；
另一端序列为：
ATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC*NNNNNN*ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG,其中NNNNNN代表6bp碱基样本标签。
7.如权利要求1所述的一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，步骤(3)将步骤2得到的DNA文库进行文库混样，总量≥1-1.5μg，将不同样本标签的文库等量混合，加入样本标签对应的封闭引物试剂封闭DNA，浓缩烘干至干粉，再加入杂交缓冲液，混匀孵育，然后加入定制探针反应，反应结束后，加入预先处理的特定磁珠纯化，富集捕获到的目的区域DNA片段。
8.如权利要求1所述的一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述的探针杂交反应结束后，选用有链霉亲和素标记的特定磁珠，可特异性抓取有生物素标记的探针，进行纯化清洗，从而富集目标区域DNA片段。
9.如权利要求1所述的一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，步骤(5)所述定量检测选择Qubit3.0仪器，得到文库浓度总量≥0.5ug，所述定性质控选择Agilent2100或Agilent4200仪器，片段范围在150-500bp之间；上机测序前进行实时荧光定量PCR进行文库定量，用与P5、P7引物特异扩增满足测序要求的文库，绘制标准曲线，确定合适的文库上机浓度。
10.一种遗传性扩张型心肌病的基因检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-9任意一项中所述的基因检测文库的建库试剂、杂交探针序列、引物序列，所述探针序列SEQ IDNo 1至SEQ ID No281。
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