ES2837437T3

ES2837437T3 - Usos diagnósticos, pronósticos y terapéuticos de ARN largos no codificantes para cardiopatías y medicina regenerativa

Info

Publication number: ES2837437T3
Application number: ES14828456T
Authority: ES
Inventors: Samir Ounzain; Thierry Pedrazzini
Original assignee: Universite de Lausanne
Current assignee: Universite de Lausanne
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-19
Publication date: 2021-06-30
Anticipated expiration: 2034-12-19
Also published as: WO2015092020A2; PT3083997T; PL3083997T3; SI3083997T1; US20220136054A1; EP3825419A3; IL246103B; IL285107A; EP3083997B1; DK3083997T3; IL272226B; IL285107B1; IL285107B2; HUE051159T2; IL272226A; EP3825419A2; IL246103A0; US20160312283A1; US11193171B2; WO2015092020A3

Abstract

Un procedimiento para diagnosticar una patología cardíaca en un sujeto, comprendiendo el procedimiento: a) medir, directa o indirectamente, los niveles de abundancia de ADNc, ARN o ADN amplificados, o cantidades o actividades de ARN, el nivel de una pluralidad de biomarcadores en una muestra biológica derivada del sujeto, en el que la pluralidad de biomarcadores comprende un biomarcador de ARNlnc que tiene una secuencia de ADNc seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 33 y una variante que comparte al menos un 90 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la misma; y b) analizar el nivel de dicho biomarcador de ARNlnc o variante que comparte al menos un 90 % de identidad de secuencia de nucleótidos con el mismo, junto con los respectivos intervalos de valores de referencia para dicho biomarcador de ARNlnc, en el que la expresión diferencial del biomarcador de ARNlnc en la muestra biológica en comparación con el biomarcador de ARNlnc en una muestra de control de un sujeto normal indica que el sujeto tiene una patología cardíaca.

Description

DESCRIPCIÓN

Usos diagnósticos, pronósticos y terapéuticos de ARN largos no codificantes para cardiopatías y medicina regenerativa

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a ARNlnc y procedimientos para diagnosticar patologías cardíacas en un sujeto. La invención también proporciona procedimientos para tratar una patología cardíaca en un sujeto que comprenden administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de un modulador de uno o más ARNlnc.

Antecedentes de la invención

Las estadísticas recientes sobre cardiopatías de la Asociación Americana del Corazón informan de que uno de cada nueve certificados de defunción en Estados Unidos mencionó la insuficiencia cardíaca como la causa de la muerte en 2010. La carga de la cardiovasculopatía sigue siendo en particular alta, con una tasa global de muerte atribuible a cardiovasculopatía de 235 por cada 100.000. La arteriopatía coronaria es el trastorno cardiovascular más frecuente y típicamente da lugar a un infarto agudo de miocardio y, en última instancia, a insuficiencia cardíaca (IC). A pesar de los continuos avances, actualmente no existe un enfoque para revertir la pérdida de miocardio funcional y, por tanto, la IC está evolucionando rápidamente hacia una gran epidemia mundial que requiere novedosos enfoques terapéuticos. En vista de esto, la elucidación de novedosas vías y mecanismos implicados en la patogenia de la IC promete identificar nuevas posibilidades y dianas para esta enfermedad prevalente y mortal. En el corazón adulto, las señales hemodinámicas y neurohormonales patológicas dependientes del estrés inducen una respuesta de remodelación desadaptativa, un proceso caracterizado por un incremento del tamaño de los cardiomiocitos (hipertrofia celular), fibrosis intersticial y, en última instancia, disfunción celular que da como resultado un fallo contráctil y funcional. A nivel molecular, estas señales activan una red de cascadas de transducción de señales cardíacas que interactúan y que convergen en un conjunto definido de factores de transcripción (FT) cardíacos conservados evolutivamente. Estos FT cardíacos fundamentales (SRF, Nkx2.5, Mef2c, Gata4, TBox) interactúan de manera combinatoria para provocar programas específicos de expresión génica temporal y espacial. Esta modulación integrada de la expresión génica codificante de proteína es, en última instancia, responsable del destino celular y forma parte integral del proceso remodelación patológica.

El concepto de redes de regulación génica (RRG), que son principalmente sistemas reguladores basados en proteínas, ha sido algo prematuro. Varios estudios recientes han demostrado que la actividad de las RRG está bajo el control de una miríada de redes intercaladas de ARN no codificantes (ARNnc). Los ARN no codificantes controlan todos los aspectos de la actividad de las RRG, incluyendo el control transcripcional, el procesamiento postranscripcional y el enfoque epigenético (Ounzain et al., 2013). Los ARNnc mejor caracterizados en el corazón son los microARN (miARN) pequeños. Los miARN cardiovasculares ajustan redes funcionales completas de ARNm a través del silenciamiento génico postranscripcional, que implica a los miARN como importantes moduladores dependientes del estrés. Además de los ARNnc pequeños, estudios transcripcionales globales han identificado otras clases funcionales de transcritos, que son mayores de 200 nucleótidos, conocidos conjuntamente como ARN largos no codificantes (ARNlnc). Las funciones de la mayoría de los ARNlnc siguen siendo desconocidas; sin embargo, se ha demostrado que muchos ejercen funciones no redundantes en una diversa variedad de procesos biológicos que incluyen la inactivación del cromosoma X, el sellado genómico, el empalme y la regulación transcripcional. En particular, los ARNlnc parecen ser importantes para la modulación global de estados epigenómicos específicos de la célula dirigiendo los complejos de modificación de cromatina hacia sus sitios de acción. Además, los ARNlnc de mamíferos parecen expresarse de una manera altamente específica del contexto y del tipo de célula. Teniendo en cuenta la funcionalidad de estos transcritos, esto plantea la posibilidad de que los ARNlnc sean una clase importante de mediadores reguladores funciones celulares especializadas o de desarrollo específicas del linaje cardiogénico. La mayoría de los ARNlnc funcionalmente caracterizados hasta la fecha regulan procesos de desarrollo. Sin embargo, su papel potencial en el control de la homeostasis del tejido maduro y la adaptación al estrés permanece en gran parte sin explorar.

Song et al. (PLOS ONE, vol.8, p.377492, 2013) llevaron a cabo un análisis de transcriptoma de ARNlnc basado en micromatrices de tejidos cardiovasculares de corazones normales y afectados por comunicación interventricular. Grote et al. (Developmental Cell, vol.24, pp.206-214, 2013) mostraron que la expresión del ARNlnc Fendrr es esencial para el desarrollo adecuado de la pared del corazón y el cuerpo en el ratón. Klattenhoff et al. (Cell, vol.152, pp.570-583, 2013) mostraron que la expresión del ARNlnc Braveheart es importante para establecer el linaje cardiovascular durante el desarrollo de los mamíferos. Li et al. (PLOS ONE, vol.8, p.e77938, 2013) utilizaron análisis de micromatrices del transcriptoma de ARNlnc desregulados en el corazón, sangre completa y plasma durante la insuficiencia cardíaca en ratones.

La identificación de novedosas moléculas reguladoras y/o vías que participan en la adaptación del corazón al estrés es un paso importante hacia el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas destinadas a prevenir la progresión a insuficiencia cardíaca. Es importante destacar que el rasgo característico de la remodelación patológica en el corazón adulto es una reprogramación transcripcional global, que da como resultado la reactivación de un programa de genes cardíacos "fetales". Las propiedades intrínsecas de activación y orquestación epigenómica cis y trans de los ARNlnc justifican la necesidad de explorar y generar catálogos de ARNlnc específicos del corazón en tejidos adultos enfermos.

Sumario de la invención

La presente divulgación se refiere a un procedimiento para diagnosticar una patología cardíaca en un sujeto, comprendiendo el procedimiento: a) medir el nivel de una pluralidad de biomarcadores en una muestra biológica derivada del sujeto, en la que la pluralidad de biomarcadores comprende uno o más ARNlnc seleccionados del grupo que comprende uno o más ARNlnc seleccionados del grupo que comprende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO 10 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80 SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87 SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94 SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104, fragmentos de los mismos, isoformas de los mismos y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con los mismos; y b) analizar los niveles de los biomarcadores, fragmentos de los mismos, isoformas de los mismos y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con los mismos, junto con los respectivos intervalos de valores de referencia para dicha pluralidad de biomarcadores, en el que la expresión diferencial de uno o más biomarcadores en la muestra biológica en comparación con uno o más biomarcadores en una muestra de control de un sujeto normal indica que el sujeto tiene una patología cardíaca.

Un objetivo adicional de la presente divulgación es proporcionar un procedimiento para tratar una patología cardíaca en un sujeto que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de un modulador de uno o más ARNlnc de la invención, fragmentos de los mismos, isoformas de los mismos y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con los mismos.

La divulgación también contempla una composición que comprende un modulador de uno o más ARNlnc de la invención, en la que el modulador se selecciona del grupo que comprende un agente químico, un anticuerpo, una proteasa genomanipulada, una tecnología basada en CRISPR y un a Rn enzimáticamente activo.

Otro objetivo de la divulgación es proporcionar un procedimiento para modular uno o más ARNlnc de la invención en el que el modulador se selecciona del grupo que comprende un miARN, un ARNip, un piARN, un ARNnp y un oligonucleótido antisentido.

Otro objetivo de la divulgación es proporcionar una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un modulador de uno o más ARNlnc, en la que el modulador se selecciona del grupo que comprende un agente químico, un anticuerpo, una proteasa genomanipulada y un ARN enzimáticamente activo, opcionalmente en combinación con vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

También se contempla un kit que comprende las composiciones de la invención.

Otros objetivos de la divulgación se refieren a un procedimiento para diagnosticar una patología cardíaca en un sujeto, un procedimiento para monitorizar los efectos de un tratamiento sobre el tejido cardíaco en un sujeto, un procedimiento para monitorizar la eficacia de terapias cardíacas quirúrgicas y/o farmacológicas en un sujeto, un procedimiento para medir la regeneración de tejido cardíaco en un sujeto, un procedimiento para monitorizar la diferenciación de células cardiogénicas in vitro, un procedimiento para monitorizar la diferenciación de células cardiogénicas in vivo y un procedimiento para monitorizar la eficacia de agentes y/o moléculas pequeñas que pueden inducir la reprogramación cardíaca.

La divulgación también se refiere a una micromatriz que comprende una pluralidad de sondas que hibridan con uno o más ARNlnc divulgados en el presente documento, fragmentos de los mismos, isoformas de los mismos y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con los mismos.

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A-F muestran que el transcriptoma cardíaco codificante y no codificante está altamente correlacionado con rasgos fisiológicos cardíacos. La figura 1A muestra que los ARNm están altamente agrupados en sus correlaciones con rasgos fisiológicos cardíacos y que dichas agrupaciones se asocian con genes implicados en los procesos esperados. La figura 1B muestra que, para rasgos específicos, cada grupo globalmente se correlaciona o no se correlaciona con cada rasgo individual. La figura 1C muestra que los ARNlnc novedosos están altamente agrupados en sus correlaciones con rasgos fisiológicos y que los genes codificantes más cercanos a los ARNlnc en cada grupo se asocian con procesos biológicos específicos. La figura 1D muestra que los agrupamientos de ARNlnc novedosos identificados se correlacionan específicamente con rasgos fisiológicos individuales. La figura 1E muestra la especificidad por el corazón de los ARNm en los agrupamientos 1 a 4. La figura 1F muestra la especificidad por el corazón de los ARNlnc novedosos en los agrupamientos 1 a 4.

Las figuras 2A-G muestran la validación y manipulación de ARNlnc novedosos seleccionados in vivo e in vitro. La figura 5A muestra la validación de la expresión por medio de RT-PCR cuantitativa de ARNlnc novedosos en las zonas fronteriza y remota de corazones infartados uno y siete días después del infarto de miocardio. La figura 2B (izquierda) muestra la expresión relativa de ARNlnc novedosos candidatos en cardiomiocitos y fibroblastos de ratón aislados. La figura 2C (derecha) muestra el enriquecimiento nuclear y citoplásmico de ARNlnc novedosos candidatos en cardiomiocitos y fibroblastos. La figura 2D muestra la correlación de ARNlnc novedosos candidatos con rasgos fisiológicos. La figura 2E muestra la expresión de ARNlnc candidatos en células madre embrionarias de ratón que experimentan diferenciación cardiogénica. La figura 2F muestra los patrones de estado de la cromatina observados en promotores de ARNlnc novedosos durante la diferenciación cardiogénica de células madre embrionarias de ratón. La figura 2G muestra que la eliminación mediada por oligonucleótidos antisentido de ARNlnc novedosos específico (Novlnc6) da como resultado una modulación específica de un factor de transcripción cardíaco clave, Nkx2-5, en cardiomiocitos de ratón aislados.

Las figuras 3A-C muestran la caracterización y validación de ortólogos humanos en patología cardíaca. La figura 3A muestra un ejemplo de una secuencia ortogonal de ARNlnc humano transmapeado (Novlnc6). La figura 3B muestra la expresión de ARNlnc humanos ortólogos novedosos en pacientes que padecen miocardiopatía congestiva (MCC) o estenosis aórtica (EA). La figura 3C muestra la expresión de biomarcadores cardíacos validados, ANF y Col1a2, en pacientes con MCC y EA.

Las figuras 4 muestran la expresión in vitro de ARNlnc específica de células y los efectos de la regulación por disminución de ARNlnc en fibroblastos cardíacos y cardiomiocitos. La figura 4A muestra la expresión relativa de ARNlnc específicos en cardiomiocitos aislados frente a fibroblastos cardíacos. La figura 4B muestra la expresión relativa de Lnc-019010 en fibroblastos derivados del corazón, el pulmón y la cola. La figura 4C muestra el impacto de la pérdida de función de Lnc-019010 usando oligonucleótidos antisentido modificados en fibroblastos cardíacos en un panel de genes codificantes que controlan la respuesta fibrótica. La figura 4D muestra el impacto de la pérdida de función de Lnc-033521 sobre los genes diana esperados en cardiomiocitos aislados.

Las figuras 5 muestran la regulación por disminución de ARNlnc in vivo en ratones BL6/C7 de 12 semanas de edad que recibieron una inyección intraperitoneal de Gápmero (20 mg/kg). La figura 5A muestra el impacto de la pérdida de función de lnc-019010 sobre los parámetros funcionales cardíacos evaluados mediante ecocardiografía in vivo. La figura 5B muestra el impacto de la pérdida de función de lnc-033521 sobre los parámetros de conducción cardíaca evaluados mediante electrocardiograma in vivo.

Descripción detallada de la invención

Los autores de la invención propusieron caracterizar el transcriptoma no codificante largo cardíaco y, en particular, la fracción dinámicamente modulada después de un infarto de miocardio. Los autores de la invención combinaron la secuenciación profunda de ARN con reconstrucción de transcritos ab initio y conjuntos de datos integrados de todo el genoma para identificar y anotar sistemáticamente ARNlnc novedosos específicos del corazón.

De manera insospechada, demostraron que los ARNlnc divulgados en el presente documento son altamente específicos del contexto y del corazón, y se correlacionan con la fisiología cardíaca, lo que sugiere un papel como moduladores de la respuesta patológica y un papel crítico en la homeostasis fisiológica. Usando la inferencia funcional basada en las transiciones del estado de desarrollo de la cromatina, los autores de la invención realizaron anotaciones funcionales de estos ARNlnc novedosos, demostrando que están implicados predominantemente con programas génicos de función, estructura y desarrollo cardíaco. En particular, los ARNlnc novedosos se asocian predominantemente con estados potenciadores activos. Los autores de la invención validaron varios ARNlnc novedosos en modelos patológicos y de desarrollo in vitro e in vivo e identificaron cientos de ortólogos humanos esperados y validaron su expresión en muestras humanas. Un cierto número de estos ortólogos humanos validados se expresaron diferencialmente en estados cardíacos patológicos humanos, lo que respalda funciones conservadas en la remodelación cardíaca. Conjuntamente, los autores de la invención han descrito una novedosa clase de ARNlnc específicos del corazón de mamíferos con características reguladoras y funcionales únicas, relevante para la remodelación patológica desadaptativa, la función cardíaca y, potencialmente, la regeneración.

En consecuencia, en el presente documento se divulga un procedimiento para diagnosticar una patología cardíaca en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

a) medir, directa o indirectamente, el nivel de una pluralidad de biomarcadores en una muestra biológica derivada del sujeto, en el que la pluralidad de biomarcadores comprende uno o más ARNlnc que tienen una secuencia de ADNc seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO 10 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100 , SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104, fragmentos de las mismas, isoformas de las mismas y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las mismas; y

b) analizar los niveles de dichos biomarcadores, fragmentos de los mismos, isoformas de los mismos y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con los mismos, junto con los respectivos intervalos de valores de referencia para dicha pluralidad de biomarcadores, en el que la expresión diferencial de uno o más biomarcadores en la muestra biológica en comparación con uno o más biomarcadores en una muestra de control de un sujeto normal indica que el sujeto tiene una patología cardíaca.

Preferentemente, la muestra biológica derivada del sujeto se selecciona del grupo que comprende sangre completa, suero, plasma, semen, saliva, lágrimas, orina, materia fecal, sudor, frotis bucales, piel, tejido cardíaco, hígado, tejido cerebral, líquido amniótico, tejido nervioso y cabello. Más preferentemente, la muestra biológica es tejido cardíaco.

Normalmente, la patología cardíaca se selecciona del grupo que comprende engrosamiento del tabique interventricular (TIV), insuficiencia cardíaca, FE, DIVI, IM, ICFEr, miocarditis vírica, braquicardia, arritmia, irregularidades cardíacas congénitas, miocardiopatía diabética, miocardiopatía idiopática y congestiva, patologías caracterizadas por anomalías tales como cardiopatía congénita y cardiopatía hereditaria; por remodelación tisular tales como miocardiopatías hipertróficas, miocardiopatías congestivas, miocardiopatías hipertensivas, cardiopatía isquémica, cardiopatía coronaria, infarto de miocardio y fibrosis cardíaca; por función afectada, tales como disfunción sistólica, disfunción diastólica, insuficiencia cardíaca con fracción de eyección reducida e insuficiencia cardíaca con fracción de eyección conservada; por trastornos del hemicardio derecho tales como insuficiencia cardíaca del ventrículo derecho, hipertensión pulmonar y embolia pulmonar; por arritmias tales como arritmias cardíacas, fibrilación, canalopatías, síncope y muerte súbita; por disfunción valvular tales como valvulopatía, estenosis valvular e insuficiencia valvular; por inflamación tales como infección vírica, bacteriana, protozoica y metazoica del corazón, miocarditis, pericarditis, endocarditis, cardiopatía asociada a infección por VIH, enfermedad de Chagas y miocardiopatías infiltrativas restrictivas; por intoxicación tales como cardiopatía inducida por toxinas, cardiopatía inducida por drogas, cardiopatía alcohólica, cardiopatía medicamentosa, cardiopatía inducida por sustancias químicas, cardiopatía después de la exposición a metales pesados y complicaciones cardíacas de tratamientos contra el cáncer; por cáncer, tales como miocardiopatías infiltrativas neoplásicas, cardiopatía carcinoide y tumores primarios del corazón; por trastornos neurológicos tales como distrofias musculares; por trastornos neurovegetativos; por estrés emocional tal como cardiopatía asociada a estrés psicológico agudo y crónico; por enfermedad metabólica tales como miocardiopatía diabética, cardiopatía asociada a trastornos endocrinos y trastornos mitocondriales; por traumatismos tales como cardiopatía traumática, consecuencias de cirugía cardíaca y angioplastia; por un cambio en la hemodinámica tales como nefropatía, trombosis y enfermedad reumática. Lo más preferentemente, la insuficiencia cardíaca es insuficiencia cardíaca con fracción de eyección conservada o reducida.

En el presente documento también se divulga un procedimiento para tratar una patología cardíaca en un sujeto que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de un modulador de uno o más ARNlnc que tienen una secuencia de ADNc seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID No : 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SE Q ID No 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104, fragmentos de las mismas, ¡soformas de las mismas y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las mismas.

Normalmente, el modulador de uno o más ARNlnc se selecciona del grupo que comprende un agente químico, un mimético de ARN, un anticuerpo, una proteasa genomanipulada, una tecnología basada en CRISPR y un ARN enzimáticamente activo.

Lo más preferentemente, el ARN enzimáticamente activo se selecciona del grupo que comprende un miARN, un ARNip, un piARN, un ARNnh, un ARNnp, ARNip por endoribonucleasas, ARNhp, señuelos, aptámeros de ARN y un oligonucleótido antisentido. Se apreciará que se engloba cualquier compuesto con diferentes formulaciones capaces de inhibir una o más acciones fisiológicas efectuadas por ARNlnc.

El ARNip puede comprender, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 105, fragmentos de la misma, isoformas de la misma y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la misma.

Otro aspecto se refiere a una composición que comprende un modulador de uno o más ARNlnc en la que el modulador se selecciona del grupo que comprende un agente químico, un anticuerpo, una proteasa genomanipulada y un ARN enzimáticamente activo.

En el presente documento también se divulga un procedimiento para modular uno o más ARNlnc, en el que el modulador se selecciona del grupo que comprende el modulador de uno o más ARNlnc que se selecciona del grupo que comprende un agente químico, un mimético de ARN, un anticuerpo, una proteasa genomanipulada y a Rn enzimáticamente activo.

Preferentemente, el modulador modula la fibrosis cardíaca, miopatía, hipertrofia, apoptosis, inflamación, remodelación extracelular, regeneración cardíaca, ciclo celular de CM y FC y activación de CPC endógenas, reprogramación directa de FC, CE, reprogramación in vitro y diferenciación de tipos celulares para la generación de células cardíacas para tratamiento celular, enfoque epigenómico cardíaco de complejos de remodelación de cromatina ubicua, fisiología cardíaca y frecuencia cardíaca.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un modulador de uno o más ARNlnc en la que el modulador se selecciona del grupo que comprende el modulador de uno o más ARNlnc que se selecciona del grupo que comprende un agente químico, un mimético de ARN, un anticuerpo, una proteasa genomanipulada y ARN enzimáticamente activo, opcionalmente en combinación con vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

Otro aspecto de la divulgación se refiere a un kit que comprende i) una composición que comprende un modulador de uno o más ARNlnc, en la que el modulador se selecciona del grupo que comprende un agente químico, un mimético de ARN, un anticuerpo, una proteasa genomanipulada y un ARN enzimáticamente activo o ii) una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un modulador de uno o más ARNlnc, en la que el modulador se selecciona del grupo que comprende el modulador de uno o más ARNlnc que se selecciona del grupo que comprende un agente químico, un mimético de ARN, un anticuerpo, una proteasa genomanipulada y ARN enzimáticamente activo, opcionalmente en combinación con vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

En el presente documento también se divulga un procedimiento para diagnosticar una patología cardíaca en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

a) medir, directa o indirectamente, el nivel de una pluralidad de biomarcadores en una muestra biológica derivada del sujeto, en el que la pluralidad de biomarcadores comprende uno o más ARNlnc seleccionados del grupo que comprende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14 SEQ ID NO 15 SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO 71 SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84 SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104, fragmentos de los mismos, isoformas de los mismos y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con los mismos; y

b) analizar los niveles de dichos biomarcadores, fragmentos de los mismos, isoformas de los mismos y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con los mismos, junto con los respectivos intervalos de valores de referencia para dicha pluralidad de biomarcadores, en el que la expresión diferencial de uno o más biomarcadores en la muestra biológica en comparación con uno o más biomarcadores en una muestra de control de un sujeto normal indica que el sujeto tiene una patología cardíaca y/o una patología cardíaca aliviando de este modo la necesidad de realizar una ecocardiografía.

La presente divulgación también se refiere a un procedimiento para monitorizar los efectos de un tratamiento en el tejido cardíaco de un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

a) medir, directa o indirectamente, el nivel de una pluralidad de biomarcadores en una muestra biológica derivada del sujeto, en el que la pluralidad de biomarcadores comprende uno o más ARNlnc seleccionados del grupo que comprende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 71 SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84 SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91 SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104, fragmentos de los mismos, isoformas de los mismos y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con los mismos; y

b) analizar los niveles de dichos biomarcadores, fragmentos de los mismos, isoformas de los mismos y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con los mismos, junto con los respectivos intervalos de valores de referencia para dicha pluralidad de biomarcadores, en el que la expresión diferencial de uno o más biomarcadores en la muestra biológica en comparación con uno o más biomarcadores en una muestra de control de un sujeto normal da una indicación de los efectos de un tratamiento en el tejido cardíaco.

Se engloba además un procedimiento para monitorizar la eficacia de los tratamientos cardíacos quirúrgicos y/o farmacológicos en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

b) analizar los niveles de dichos biomarcadores, fragmentos de los mismos, ¡soformas de los mismos y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con los mismos, junto con los respectivos intervalos de valores de referencia para dicha pluralidad de biomarcadores, en el que la expresión diferencial de uno o más biomarcadores en la muestra biológica en comparación con uno o más biomarcadores en una muestra de control de un sujeto normal da una indicación de la eficacia de tratamientos cardíacos quirúrgicos y/o farmacológicos.

En el presente documento también se divulga un procedimiento para medir la regeneración de tejido cardíaco en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

a) medir, directa o indirectamente, el nivel de una pluralidad de biomarcadores en una muestra biológica derivada del sujeto, en el que la pluralidad de biomarcadores comprende uno o más ARNlnc seleccionados del grupo que comprende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14 SEQ ID NO 15 SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO 71 SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84 SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91 SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104, fragmentos de los mismos, isoformas de los mismos y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con los mismos; y

b) analizar los niveles de dichos biomarcadores, fragmentos de los mismos, isoformas de los mismos y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con los mismos, junto con los respectivos intervalos de valores de referencia para dicha pluralidad de biomarcadores, en el que la expresión diferencial de uno o más biomarcadores en la muestra biológica en comparación con uno o más biomarcadores en una muestra de control de un sujeto normal da una indicación de la regeneración del tejido cardíaco.

En el presente documento también se divulga un procedimiento para monitorizar la diferenciación cardiogénica de células in vitro, comprendiendo el procedimiento:

a) medir, directa o indirectamente, el nivel de una pluralidad de biomarcadores en una muestra biológica derivada de un cultivo celular, en el que la pluralidad de biomarcadores comprende uno o más ARNlnc seleccionados del grupo que comprende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO 12 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO 15 SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO 71 SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104, fragmentos de los mismos, isoformas de los mismos y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con los mismos; y

b) analizar los niveles de dichos biomarcadores, fragmentos de los mismos, isoformas de los mismos y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con los mismos, junto con los respectivos intervalos de valores de referencia para dicha pluralidad de biomarcadores, en el que la expresión diferencial de uno o más biomarcadores en la muestra biológica en comparación con uno o más biomarcadores en una muestra de control de un sujeto normal da una indicación de la diferenciación cardiogénica de las células.

Otro aspecto de la divulgación se refiere a un procedimiento para monitorizar la diferenciación cardiogénica de células in vitro, comprendiendo el procedimiento:

a) medir, directa o indirectamente, el nivel de una pluralidad de biomarcadores en una muestra biológica derivada de un cultivo celular, en el que la pluralidad de biomarcadores comprende uno o más ARNlnc seleccionados del grupo que comprende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99 , SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104, fragmentos de los mismos, isoformas de los mismos y variantes que comparten a menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con los mismos; y

Otro aspecto de la divulgación se refiere a un procedimiento para controlar la eficacia de agentes y/o moléculas pequeñas que pueden inducir la reprogramación celular, comprendiendo el procedimiento:

a) medir, directa o indirectamente, el nivel de una pluralidad de biomarcadores en una muestra biológica derivada de un sujeto o un cultivo celular, en el que la pluralidad de biomarcadores comprende uno o más ARNlnc seleccionados del grupo que comprende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO 51 SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO 61, SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76 SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90 SEQ ID NO: 91 SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97 SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104, fragmentos de los mismos, isoformas de los mismos y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con los mismos; y

b) analizar los niveles de dichos biomarcadores, fragmentos de los mismos, isoformas de los mismos y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con los mismos, junto con los respectivos intervalos de valores de referencia para dicha pluralidad de biomarcadores, en el que la expresión diferencial de uno o más biomarcadores en la muestra biológica en comparación con uno o más biomarcadores en una muestra de control de un sujeto normal da una indicación de la eficacia de los agentes y/o moléculas pequeñas que pueden inducir la reprogramación cardíaca.

Otro aspecto de la divulgación se refiere a una micromatriz que comprende una pluralidad de sondas que hibridan con uno o más ARNlnc seleccionados del grupo que comprende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88 SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95 SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104, fragmentos de los mismos, ¡soformas de los mismos y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con los mismos.

En la descripción de la presente invención se emplearán los siguientes términos, y se pretende que se definan como se indica a continuación.

Cabe señalar que, como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno/a" y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contenido lo indique claramente de otro modo. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "un ARNlnc" incluye una mezcla de dos o más ARNlnc, y similares.

El término "aproximadamente", en particular en referencia a una cantidad dada, pretende englobar desviaciones de más o menos un diez por ciento.

Los términos "microARN", "miARN" y MiR "son intercambiables y se refieren a ARN endógenos o artificiales no codificantes que pueden regular la expresión génica. Se cree que los miARN funcionan por medio de la interferencia de ARN. Los términos "ARNip" y "ARN de interferencia pequeño" son intercambiables y se refieren a moléculas de ARN monocatenarias o bicatenarias que pueden inducir interferencia de ARN. Las moléculas de ARNip tienen típicamente una región dúplex que tiene una longitud de entre 18 y 30 pares de bases.

Los términos “piARN” y “ARN que interactúa con Piwi” son intercambiables y se refieren a una clase de RNA pequeños implicados en el silenciamiento de genes. Las moléculas de piARN tienen típicamente una longitud de entre 26 y 31 nucleótidos.

Los términos "ARNnp" y "ARN nuclear pequeño" son intercambiables y se refieren a una clase de ARN pequeños implicados en una variedad de procesos, incluyendo el empalme de ARN y la regulación de factores de transcripción. También se incluye la subclase de ARN nucleolares pequeños (ARNnop). El término también pretende incluir ARNnp artificiales, tales como derivados antisentido de ARNnp que comprenden secuencias antisentido dirigidas contra uno o más ARNlnc.

Los términos "polinucleótido", "oligonucleótido", "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" se utilizan en el presente documento para incluir una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Este término se refiere solo a la estructura primaria de la molécula. Por tanto, el término incluye ADN de cadena triple, bicatenario y monocatenario, así como ARN de cadena triple, bicatenario y monocatenario. También incluye modificaciones, tales como por metilación y/o protección, y formas no modificadas del polinucleótido. Más en particular, los términos "polinucleótido", "oligonucleótido", "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" incluyen polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa), cualquier otro tipo de polinucleótido que es un N- o C-glucósido de una base de purina o pirimidina, y otros polímeros que contienen cadenas principales no nucleotídicas, por ejemplo, polímeros de poliamida (por ejemplo, ácidos peptidonucleicos (APN)) y de polimorfolino (disponible comercialmente de Anti-Virals, Inc., Corvallis, Oreg., como Neugene) y otros polímeros sintéticos de ácido nucleico específicos de secuencia, siempre que los polímeros contengan bases nitrogenadas en una configuración que permita el emparejamiento de bases y el apilamiento de bases, tal como se encuentra en el ADN y el ARN. No existe una distinción intencionada de longitud entre los términos "polinucleótido", "oligonucleótido", "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico", y estos términos se utilizarán de manera intercambiable. Por tanto, estos términos incluyen, por ejemplo, 3'-desoxi-2',5'-ADN, oligodesoxirribonucleótidos N3' P5' fosforamidatos, ARN 2'-O-alquil-sustituido, ADN bicatenario y monocatenario, así como ARN bicatenario y monocatenario, microARN, híbridos ADN:ARN e híbridos entre APN y a Dn o ARN, y también incluyen tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, marcadores que son conocidos en la técnica, metilación, "tapones", sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil adenosina, C5-prop¡n¡lc¡t¡d¡na, C5-prop¡n¡lur¡d¡na, C5-bromouridina, C5-fluoruridina, C5-yodouridina, C5-met¡lc¡t¡d¡na, 7-desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina y 2-tiocitidina), modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), con enlaces cargados negativamente (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.) y con enlaces cargados positivamente (por ejemplo, aminoalquilfosforamidatos, aminoalquilfosfotriésteres), aquellos que contienen restos colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (incluidas nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), aquellos que tienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquilantes, aquellos que tienen enlaces modificados (por ejemplo, alfa-ácidos nucleicos anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido u oligonucleótido. El término también incluye ácidos nucleicos bloqueados (por ejemplo, que comprenden un ribonucleótido que tiene un puente de metileno entre el átomo de oxígeno 2' y el átomo de carbono 4'). Véase, por ejemplo, Kurreck et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30: 1911-1918.

El término "complementario" y "complementariedad" son intercambiables y se refieren a la capacidad de los polinucleótidos para formar pares de bases entre sí. Los pares de bases se forman típicamente mediante enlaces de hidrógeno entre unidades de nucleótidos de cadenas o regiones polinucleotídicas antiparalelas. Las cadenas o regiones polinucleotídicas complementarias pueden formar pares de bases a la manera de Watson-Crick (por ejemplo, A a T, A a U, C a G). 100 % complementario se refiere a la situación en la que cada unidad de nucleótidos de una hebra o región polinucleotídica se puede unir por enlaces de hidrógeno con cada unidad de nucleótido de una segunda hebra o región polinucleotídica. La complementariedad menos que perfecta se refiere a la situación en la que algunas, pero no todas, las unidades de nucleótidos de dos cadenas o dos regiones pueden formar enlaces de hidrógeno entre sí y se pueden expresar como un porcentaje.

"Administrar", como se aplica en la presente invención, se refiere al contacto de una cantidad eficaz de un modulador de uno o más ARNlnc divulgados en el presente documento, con el sujeto.

Administrar un ácido nucleico, tal como un microARN, ARNip, piARN, ARNnp, ácido nucleico antisentido o ARNlnc, a una célula comprende procedimientos de transducción, transfección, electroporación, translocación, fusión, fagocitación, de disparo o balísticos, etc., es decir, cualquier medio mediante el cual se puede transportar un ácido nucleico a través de una membrana celular.

"Excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente que se puede incluir opcionalmente en las composiciones de la invención y que no causa efectos toxicológicos adversos significativos en el paciente.

"Sal farmacéuticamente aceptable" incluye, pero no se limita a, sales de aminoácidos, sales preparadas con ácidos inorgánicos, tales como sales de cloruro, sulfato, fosfato, difosfato, bromuro y nitrato, o sales preparadas a partir de la forma de ácido inorgánico correspondiente de cualquier de los anteriores, por ejemplo, clorhidrato, etc., o sales preparadas con un ácido orgánico, tal como malato, maleato, fumarato, tartrato, succinato, etilsuccinato, citrato, acetato, lactato, metanosulfonato, benzoato, ascorbato, p-toluenosulfonato, palmoato, salicilato y estearato, así como sales de estolato, gluceptato y lactobionato. De forma similar, las sales que contienen cationes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sodio, potasio, calcio, aluminio, litio y amonio (incluido el amonio sustituido).

Una "cantidad eficaz" de modulador de uno o más ARNlnc divulgados en el presente documento (por ejemplo, microRNA, ARNip, piARN, ARNnp, ácido nucleico antisentido, ribozima o inhibidor de molécula pequeña, CRISPR, etc.) es una cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados. tal como una cantidad que inhibe la actividad de un ARNlnc, por ejemplo al interferir con la transcripción. Se puede administrar una cantidad eficaz en una o más administraciones, aplicaciones o dosis.

Por "dosis o cantidad terapéuticamente eficaz" de un modulador de uno o más ARNlnc divulgados en el presente documento se entiende una cantidad que, cuando se administra como se describe en el presente documento, provoca una respuesta terapéutica positiva. La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, la gravedad del estado que se está tratando, el fármaco o fármacos particulares empleados, el modo de administración y similares. Una cantidad "eficaz" apropiada en cualquier caso individual puede ser determinada por un experto en la técnica usando experimentación de rutina, basándose en la información proporcionada en el presente documento.

"Homología" se refiere al porcentaje de identidad entre dos polinucleótidos o dos restos polipeptídicos. Dos secuencias de ácido nucleico o dos secuencias de polipéptido son "sustancialmente homólogas" entre sí cuando las secuencias presentan al menos aproximadamente un 50 % de identidad de secuencia, preferentemente al menos aproximadamente un 75 % de identidad de secuencia, más preferentemente al menos aproximadamente un 80 %-85 % de identidad de secuencia, más preferentemente al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia, y lo más preferentemente al menos aproximadamente un 95 %-98 % de identidad de secuencia con respecto a una longitud definida de las moléculas. Como se usa en el presente documento, sustancialmente homólogo también se refiere a secuencias que muestran una identidad completa con la secuencia especificada.

En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido de dos polinucleótidos o secuencias polipeptídicas, respectivamente. El porcentaje de identidad se puede determinar mediante una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas alineando las secuencias, contando el número exacto de coincidencias entre las dos secuencias alineadas, dividiendo por la longitud de la secuencia más corta y multiplicando el resultado por 100.

De forma alternativa, la homología se puede determinar mediante programas informáticos fácilmente disponibles o mediante hibridación de polinucleótidos en condiciones que forman dúplex estables entre regiones homólogas, seguido de digestión con nucleasa(s) específica(s) de cadena sencilla y determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Las secuencias de ADN que son sustancialmente homólogas se pueden identificar en un experimento de hibridación de Southern, por ejemplo, en condiciones rigurosas, como se define para ese sistema particular. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas está dentro del conocimiento de la técnica.

"Recombinante", como se usa en el presente documento para describir una molécula de ácido nucleico, significa un polinucleótido de origen genómico, ADNc, vírico, semisintético o sintético que, en virtud de su origen o manipulación, no se asocia con la totalidad o una parte del polinucleótido con el que se asocia en la naturaleza. El término "recombinante", tal como se usa con respecto a una proteína o polipéptido, significa un polipéptido producido por expresión de un polinucleótido recombinante. En general, el gen de interés se clona y a continuación se expresa en organismos transformados, como se describe más adelante. El organismo huésped expresa el gen extraño para producir la proteína en condiciones de expresión.

El término "transformación" se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del procedimiento utilizado para la inserción. Por ejemplo, se incluyen la captación directa, la transducción o el apareamiento f. El polinucleótido exógeno se puede mantener como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido, o de forma alternativa, se puede integrar en el genoma del huésped.

"Células huésped recombinantes", "células huésped", "células", "líneas celulares", "cultivos celulares" y otros términos que denotan microorganismos o líneas celulares eucariotas superiores cultivadas como entidades unicelulares se refieren a células que pueden ser, o han sido, utilizadas como receptores para el vector recombinante u otro ADN transferido, e incluyen la progenie original de la célula original que ha sido transfectada.

"Polinucleótido purificado" se refiere a un polinucleótido de interés o un fragmento del mismo que es esencialmente libre, por ejemplo, que contiene menos de aproximadamente un 50 %, preferentemente menos de aproximadamente un 70 %, y más preferentemente menos de aproximadamente al menos un 90 % de la proteína con la que el polinucleótido se asocia de forma natural. Las técnicas para purificar polinucleótidos de interés son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, la rotura de la célula que contiene el polinucleótido con un agente caotrópico y la separación del polinucleótido o polinucleótidos y de las proteínas mediante cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y sedimentación de acuerdo con la densidad.

Un "vector" puede transferir secuencias de ácido nucleico a células diana (por ejemplo, vectores víricos, vectores no víricos, portadores particulados y liposomas). Normalmente, "construcción de vector', "vector de expresión" y "vector de transferencia génica" significan cualquier construcción de ácido nucleico que puede dirigir la expresión de un ácido nucleico de interés y que puede transferir secuencias de ácido nucleico a células diana. Por tanto, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores víricos.

El término "variante" se refiere a derivados biológicamente activos de un biomarcador, es decir, uno o más ARNlnc. En general, el término "variante" se refiere a moléculas que tienen una secuencia y estructura naturales con una o más adiciones, sustituciones (en general, de naturaleza conservadora) y/o deleciones, en relación con la molécula natural, siempre y cuando las modificaciones no destruyan la actividad biológica y que sean "sustancialmente homólogas" a la molécula de referencia. En general, las secuencias de dichas variantes tendrán un alto grado de homología de secuencia con la secuencia de referencia, por ejemplo, una homología de secuencia de más de un 50 %, en general de más de un 60 %-70 %, incluso más en particular de un 80 %-85 % o más, tal como al menos un 90 %-95 % o más, cuando las dos secuencias están alineadas.

De forma alternativa, el término "variante" también se refiere a ARNlnc modificados postranscripcionalmente, es decir, metilación, fosforilación, etc.

Un "biomarcador", en el contexto de la presente invención, se refiere a un ARNlnc que se expresa diferencialmente en una muestra biológica (por ejemplo, una biopsia tomada de un sujeto que tiene una patología cardíaca o un tejido cardíaco sometido a regeneración o una célula madre sometida a diferenciación cardíaca o un tejido cardíaco sometido a tratamientos quirúrgicos y/o farmacológicos) en comparación con una muestra de control (por ejemplo, una muestra comparable tomada de una persona con un diagnóstico negativo, un sujeto normal o sano, o tejido o células normales no tratados). El biomarcador puede ser un ARNlnc que se puede detectar y/o cuantificar.

Se apreciará que la muestra de control puede variar dependiendo de la situación. Por ejemplo, la muestra de control puede incluir una célula o muestra de células que proporcionen un nivel de expresión de referencia del mismo gen. De forma alternativa, la muestra de control puede ser células sanas del mismo tejido fuente que la(s) célula(s) diana.

Como se usa en el presente documento, una "isoforma" de un ARNlnc es el resultado del empalme alternativo del gen que codifica dicho ARNlnc.

Como se usa en el presente documento, un "fragmento" de uno o más ARNlnc se refiere a una secuencia que contiene menos aminoácidos de longitud que el respectivo uno o más ARNlnc. Preferentemente, esta secuencia contiene menos de un 90 %, preferentemente menos de un 60 %, en particular menos de un 30 % de aminoácidos de longitud que el respectivo uno o más ARNlnc.

Los biomarcadores son uno o más ARNlnc seleccionados del grupo que comprende las secuencias de ADNc: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64 SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78 SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO 91, SEQ ID NO: 92 SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 95 SEQ ID NO: 96 SEQ ID NO: 97 SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99 SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104, fragmentos de las mismas, ¡soformas de las mismas y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las mismas. Lo más preferentemente, el uno o más ARNlnc se selecciona del grupo que comprende las secuencias de ADNc de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104, fragmentos de las mismas, isoformas de las mismas y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las mismas.

Tabla 1

Dentro de los transcritos identificados, los autores de la invención identificaron cuatro agrupamientos tanto para la codificación (Figura 1A) como para transcritos de ARNlnc novedosos (Figura 1B). En cada caso, estos consistieron en un agrupamiento que se correlacionó positivamente con la función cardíaca y negativamente con los parámetros de remodelación, un agrupamiento correlaciones inversas a las anteriores y dos agrupamientos con correlaciones intermedias no específicas. El análisis de ontología génica (OG) y de especificidad del corazón se ejecutó en agrupamientos individuales, con el análisis de OG ejecutándose en los genes codificantes más proximales con respecto a los ARNlnc novedosos. En el grupo de genes codificantes, el agrupamiento más específico del corazón fue el Agrupamiento 2 (figura 1E), que se correlacionó positivamente con los rasgos funcionales cardíacos y se asoció con genes involucrados en la biología mitocondrial (figura 1A). El agrupamiento menos específico del corazón (Agrupamiento 4) se correlacionó positivamente con la remodelación y se asoció con genes involucrados en la cicatrización y en la matriz extracelular (figura 1A). Dentro de los ARNlnc novedosos y, en particular, dentro de los 104 ARNlnc de la tabla 1, el agrupamiento más específico del corazón, es decir, el Agrupamiento 4 (figura 1F), se correlacionó de nuevo positivamente con rasgos asociados a la función cardíaca. Los genes codificantes proximales del ARNlnc novedoso del Agrupamiento 4 se enriquecieron con procesos asociados al desarrollo del corazón (figura 1C). Dado que es probable que los ARNlnc novedosos que se agrupan específicamente con rasgos fisiológicos particulares estén involucrados en procesos biológicos asociados con dichos rasgos, estos hallazgos indicaron que los ARNlnc novedosos dentro de este agrupamiento podrían representar una clase de reguladores cardíacos de programas génicos de desarrollo, que se reactivaron en el miocardio dañado. Finalmente, los agrupamientos menos específicos del corazón fueron uno y dos, lo que se correlacionó positivamente con rasgos de remodelación.

Estos datos demostraron que la agrupación no supervisada de transcritos pudo distinguir rasgos fisiológicos. Además, indicó que los ARNlnc podrían representar marcadores específicos de rasgos fisiológicos particulares. Para someter esto a prueba, los autores de la invención compararon las distribuciones de correlación para cada gen codificante de UCSC y el agrupamiento de ARNlnc novedosos con cada uno de los siguientes rasgos; fracción de eyección (FE), grosor del tabique interventricular (TIV) en sístole, trazado de infarto de miocardio (trazado IM) y diámetro interno del ventrículo izquierdo (DIVI) en sístole (figura 1B y D). Los Agolpamientos 2 y 4 de genes codificantes de UCSC se

correlacionaron fuertemente con todos estos rasgos en comparación con los agrupamientos no específicos

(Agolpamientos 1 y 3) (figura 1B). Se observó un patrón similar de correlación con los agrupamientos 2 y 4 de ARNlnc

novedosos (figura 1D). Sin embargo, el Agolpamiento 1 de ARNlnc novedosos fue en particular interesante, ya que

presentó una mala correlación con DIVI, FE y trazado IM, pero una buena correlación con TIV, que está típicamente

relacionado con FE. Esta característica única es probablemente una consecuencia del contexto exquisito y de la

expresión específica de tipo celular de los ARNlnc, y tiene implicaciones interesantes para la utilización de ARNlnc

novedosos como biomarcadores.

Preferentemente, de acuerdo con el procedimiento para diagnosticar una patología cardíaca descrito en el presente

documento, una expresión incrementada de uno o más ARNlnc que tienen una secuencia de ADNc seleccionada del

grupo que comprende SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO:

22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO:

29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO:

99, fragmentos de las mismas, isoformas de las mismas y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de

secuencia de nucleótidos con las mismas en la muestra biológica en comparación con los niveles de expresión de uno

o más de estos ARNlnc en una muestra de control de un sujeto normal indica que el sujeto sufrió un infarto de miocardio

o padece una patología cardíaca asociada con una remodelación desadaptativa del miocardio.

Preferentemente también, de acuerdo con el procedimiento para diagnosticar una patología cardíaca descrito en el

presente documento, una expresión disminuida de uno o más ARNlnc que tienen una secuencia de ADNc

seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, Se Q ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID

NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID

NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID

NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID

NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID

NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID

NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID

NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ

ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104, fragmentos de las mismas, isoformas de las mismas y variantes que comparten al

menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las mismas en la muestra biológica en comparación con

los niveles de expresión de uno o más de estos ARNlnc en una muestra de control de un sujeto normal indica que el

sujeto sufrió un infarto de miocardio.

También de acuerdo con el procedimiento para diagnosticar una patología cardíaca descrito en el presente documento,

en el que una expresión diferencial de uno o más ARNlnc que tienen una secuencia de ADNc seleccionada del grupo

que comprende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID

NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:

14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, fragmentos de las mismas, isoformas de las mismas y variantes que comparten

al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con las mismas en la muestra biológica en comparación

con los niveles de expresión de uno o más de estos ARNlnc en una muestra de control de un sujeto normal indica que

el sujeto sufrió una insuficiencia cardíaca con fracción de eyección conservada.

La frase "se expresa diferencialmente" se refiere a diferencias en la cantidad y/o frecuencia de un biomarcador

presente en una muestra tomada de pacientes que tienen, por ejemplo, una patología cardíaca o de un tejido cardíaco

sometido a regeneración o de una célula madre sometida a diferenciación cardíaca o de un tejido cardíaco sometido

a tratamientos quirúrgicos y/o farmacológicos en comparación con un sujeto de control. Por ejemplo, un biomarcador

puede ser un ARNlnc que está presente en un nivel elevado o en un nivel disminuido en muestras de pacientes con

una patología cardíaca o un tejido cardíaco sometido a regeneración o una célula madre sometida a diferenciación

cardíaca o un tejido cardíaco sometido a tratamientos quirúrgicos y/o farmacológicos en comparación con muestras

de sujetos de control. De forma alternativa, un biomarcador puede ser un ARNlnc que se detecta con una frecuencia

mayor o con una frecuencia menor en muestras de pacientes con una patología cardíaca o un tejido cardíaco sometido

a regeneración o una célula madre sometida a diferenciación cardíaca o un tejido cardíaco sometido a tratamientos

quirúrgicos y/o farmacológicos en comparación con muestras de sujetos de control o tejidos de control. Un biomarcador

puede estar presente de forma diferencial en términos de cantidad, frecuencia o ambos.

Un ARNlnc se expresa diferencialmente entre dos muestras si la cantidad del ARNlnc en una muestra es, desde el

punto de vista estadístico, significativamente diferente de la cantidad del ARNlnc en la otra muestra. Por ejemplo, un

ARNlnc se expresa diferencialmente en dos muestras si está presente al menos aproximadamente un 120 %, al menos

aproximadamente un 130 %, al menos aproximadamente un 150 %, al menos aproximadamente un 180 %,

aproximadamente un 200 %, al

menos aproximadamente un 300 %, al menos aproximadamente un 500 %,

aproximadamente un 700 %, al menos aproximadamente un 900 % o al menos aproximadamente un 1000 % m lo que está presente en la otra muestra, o si es detectable en una muestra y no es detectable en la otra.

De forma alternativa o adicionalmente, un ARNlnc se expresa diferencialmente en dos conjuntos de muestras si la

frecuencia de detección del ARNlnc en las muestras es, desde el punto de vista estadístico, significativamente mayor

o menor que en las muestras de control. Por ejemplo, un ARNlnc se expresa diferencialmente en dos conjuntos de

muestras si se detecta al menos aproximadamente un 120 %, al menos aproximadamente 130 %, al menos aproximadamente un 150 %, al menos aproximadamente un 180 %, al menos aproximadamente un 200 %, al menos aproximadamente un 300 %, al menos aproximadamente un 500 %, al menos aproximadamente un 700 %, al menos aproximadamente un 900 % o al menos aproximadamente un 1000 % más frecuentemente o menos frecuentemente en un conjunto de muestras que en el otro conjunto de muestras.

Los términos "sujeto", "individuo" y "paciente" se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a cualquier sujeto mamífero para el que se desea obtener un diagnóstico, pronóstico, tratamiento o terapia, en particular humanos. Otros sujetos pueden incluir ganado, perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, etc. En algunos casos, los procedimientos de la invención se usan en animales de experimentación, en aplicación veterinaria y en el desarrollo de modelos animales para enfermedades, incluyendo, pero sin limitarse a, roedores, incluyendo ratones, ratas, cobayas y hámsteres; conejos, primates y animales transgénicos.

Como se usa en el presente documento, una "muestra biológica" se refiere a una muestra de tejido o líquido aislado de un sujeto, incluyendo pero sin limitarse a orina, sangre, plasma, suero, heces, médula ósea, bilis, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, muestras de piel, secreciones externas de la piel, tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, glóbulos sanguíneos, órganos, biopsias y también muestras que contienen células o tejidos derivados del sujeto y cultivados y constituyentes de cultivo celular in vitro, incluyendo pero sin limitarse a medios acondicionados resultantes del crecimiento de células y tejidos en cultivo, células recombinantes, células madre y componentes celulares.

Los términos "cantidad", "número" y "nivel" se usan de manera intercambiable en el presente documento y se pueden referir a una cuantificación absoluta de una molécula o un analito en una muestra, o a una cuantificación relativa de una molécula o analito en una muestra, es decir, con respecto a otro valor tal como con respecto a un valor de referencia como se enseña en el presente documento, o a un intervalo de valores para el biomarcador. Estos valores o intervalos se pueden obtener de un solo paciente o de un grupo de pacientes.

"Diagnóstico", como se usa en el presente documento, incluye en general la determinación de si una enfermedad, trastorno o disfunción dados de la invención afectan probablemente a un sujeto. El experto en la técnica a menudo realiza un diagnóstico sobre la base de uno o más indicadores diagnósticos, es decir, un biomarcador, cuya presencia, ausencia o cantidad es indicativa de la presencia o ausencia de la enfermedad, trastorno o disfunción.

"Pronóstico", como se usa en el presente documento, se refiere en general a una predicción de la probable evolución y resultado de una afección clínica o enfermedad. El pronóstico de un paciente se realiza normalmente evaluando factores o síntomas de una enfermedad que son indicativos de una evolución o resultado favorable o desfavorable de la enfermedad. Se entiende que el término "pronóstico" no se refiere necesariamente a la capacidad de predecir la evolución o el resultado de una afección con una exactitud del 100 %. En cambio, el experto en la técnica comprenderá que el término "pronóstico" se refiere a una mayor probabilidad de que se produzca una determinada evolución o resultado; es decir, que es más probable que una evolución o resultado se produzca en un paciente que presenta una afección determinada, en comparación con aquellos individuos que no presentan la afección.

Al analizar los niveles de biomarcadores en una muestra biológica, los intervalos de valores de referencia usados para la comparación pueden representar el nivel de uno o más biomarcadores encontrados en una o más muestras de uno o más sujetos sin cardiopatía (es decir, muestras normales o de control). De forma alternativa, los valores de referencia pueden representar el nivel de uno o más biomarcadores encontrados en una o más muestras de uno o más sujetos con cardiopatía. Más específicamente, los intervalos de valores de referencia pueden representar el nivel de uno o más biomarcadores en fases particulares de la enfermedad para facilitar la determinación de la fase de progresión de la enfermedad en un individuo.

Una muestra de "control", como se usa en el presente documento, se refiere a una muestra biológica, tal como tejido o células que no presentan ninguna enfermedad. Es decir, una muestra de control se obtiene de un sujeto normal (por ejemplo, un individuo que se sabe que no padece una cardiopatía ni ninguna condición o síntoma asociado).

Se entiende que el nivel de expresión de los biomarcadores en una muestra se puede determinar mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. La medición del nivel de un biomarcador puede ser directa o indirecta. Por ejemplo, los niveles de abundancia de los ARNlnc se pueden cuantificar directamente. De forma alternativa, la cantidad de un biomarcador se puede determinar indirectamente midiendo los niveles de abundancia de ADNc, ARN o ADN amplificados, o midiendo las cantidades o actividades de ARN u otras moléculas que sean indicativas del nivel de expresión del biomarcador. Preferentemente, la cantidad de un biomarcador se determina indirectamente midiendo los niveles de abundancia de ADNc.

Los ARNlnc se pueden detectar y cuantificar mediante una variedad de procedimientos, incluyendo pero sin limitarse a análisis de micromatrices, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscriptasa (RT-PCR), transferencia Northern, análisis en serie de la expresión génica (SAGE), inmunoanálisis y espectrometría de masas, cualquier procedimiento basado en secuenciación conocido en la técnica.

En un modo de realización, se utilizan micromatrices para medir los niveles de biomarcadores. Una ventaja del análisis de micromatrices es que la expresión de cada uno de los biomarcadores se puede medir simultáneamente y que las micromatrices se pueden diseñar específicamente para proporcionar un perfil de expresión diagnóstico para una enfermedad o afección particular (por ejemplo, una patología cardíaca).

Las micromatrices se preparan seleccionando sondas que comprendan una secuencia de polinucleótidos y, a continuación, inmovilizando dichas sondas en un soporte sólido o superficie. Por ejemplo, las sondas pueden comprender secuencias de ADN, secuencias de ARN o secuencias de copolímeros de ADN y ARN. Las secuencias de polinucleótidos de las sondas también pueden comprender análogos de ADN y/o ARN, o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos de las sondas pueden ser fragmentos completos o parciales de ADN genómico. Las secuencias de polinucleótidos de las sondas también pueden ser secuencias de nucleótidos sintetizadas, tales como secuencias de oligonucleótidos sintéticos. Las secuencias de las sondas se pueden sintetizar enzimáticamente in vivo, enzimáticamente in vitro (por ejemplo, mediante PCR) o no enzimáticamente in vitro.

Las sondas usadas en los procedimientos de la invención se inmovilizan preferentemente en un soporte sólido que puede ser poroso o no poroso. Por ejemplo, las sondas pueden ser secuencias de polinucleótidos que se unen a una membrana o filtro de nitrocelulosa o nylon covalentemente en el extremo 3' o 5' del polinucleótido. Dichas sondas de hibridación son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook, J. et al., Molecular, Cloning: A Laboratory Manual (3a edición, 2001) De forma alternativa, el soporte sólido o la superficie pueden ser una superficie de vidrio o plástico. En un modo de realización, los niveles de hibridación se miden en micromatrices de sondas que consisten en una fase sólida en cuya superficie se inmoviliza una población de polinucleótidos, tal como una población de ADN o miméticos de ADN, o, de forma alternativa, una población de ARN o miméticos de ARN. La fase sólida puede ser un material no poroso u, opcionalmente, un material poroso tal como un gel.

En un modo de realización, la micromatriz comprende un soporte o superficie con una matriz ordenada de sitios de unión (por ejemplo, hibridación) o "sondas", cada uno de los cuales representa uno de los biomarcadores descritos en el presente documento. Preferentemente, las micromatrices son matrices direccionables, y más preferentemente matrices direccionables posicionalmente. Más específicamente, cada sonda de la matriz se localiza preferentemente en una posición predeterminada conocida en el soporte sólido de modo que la identidad (es decir, la secuencia) de cada sonda se pueda determinar a partir de su posición en la matriz (es decir, en el soporte o superficie). Preferentemente, cada sonda se une covalentemente al soporte sólido en un solo sitio.

Las micromatrices se pueden preparar de diversas formas, varias de las cuales se describen a continuación. Independientemente de cómo se produzcan, mas micromatrices comparten determinadas características. Las matrices son reproducibles, lo que permite producir múltiples copias de una matriz determinada y compararlas fácilmente entre sí. Preferentemente, las micromatrices se preparan a partir de materiales que son estables en condiciones de unión (por ejemplo, hibridación de ácido nucleico). Las micromatrices son en general pequeñas, por ejemplo, entre 1 cm2 y 25 cm2; sin embargo, también se pueden usar matrices más grandes, por ejemplo, en matrices de cribado. Preferentemente, un sitio de unión dado o un conjunto único de sitios de unión dado en la micromatriz se unirá (por ejemplo, hibridará) específicamente al producto de un solo gen en una célula (por ejemplo, a un ARNm específico, a un ARNlnc o a un ADNc específico derivado del mismo). Sin embargo, en general, otras secuencias relacionadas o similares hibridarán de forma cruzada con un sitio de unión dado.

Como se indica anteriormente, la "sonda" a la que hibrida específicamente una molécula polinucleotídica particular contiene una secuencia de polinucleótidos complementaria. Las sondas de la micromatriz consisten típicamente en secuencias de nucleótidos de no más de 1000 nucleótidos. En algunos modos de realización, las sondas de la matriz consisten en secuencias de nucleótidos de 10 a 1000 nucleótidos. En un modo de realización, las secuencias de nucleótidos de las sondas tienen una longitud en el intervalo de 10 a 200 nucleótidos y son secuencias genómicas de una especie de organismo, de modo que está presente una pluralidad de sondas diferentes, con secuencias complementarias y, por tanto, que pueden hibridar con el genoma de dicha especie de organismo, secuencialmente en mosaico en todo o en una parte del genoma. En otros modos de realización, las sondas tienen una longitud en el intervalo de 10 a 30 nucleótidos, una longitud en el intervalo de 10 a 40 nucleótidos, una longitud en el intervalo de 20 a 50 nucleótidos, una longitud en el intervalo de 40 a 80 nucleótidos, una longitud en el intervalo de 50 a 150 nucleótidos, una longitud en el intervalo de 80 a 120 nucleótidos o tienen una longitud de 60 nucleótidos. Las sondas pueden comprender ADN o "miméticos" de ADN (por ejemplo, derivados y análogos) correspondientes a una parte del genoma de un organismo. En otro modo de realización, las sondas de la micromatriz son ARN complementario o miméticos de ARN complementario. Los miméticos de ADN son polímeros compuestos de subunidades que pueden hibridar con ADN de forma específica similar a Watson-Crick o de hibridar con ARN de forma específica. Los ácidos nucleicos se pueden modificar en el resto de base, en el resto de azúcar o en la cadena principal de fosfato (por ejemplo, fosforotioatos).

El ADN se puede obtener, por ejemplo, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de ADN genómico o secuencias clonadas. Los cebadores de PCR se eligen preferentemente en base a una secuencia conocida del genoma que dará como resultado la amplificación de fragmentos específicos de ADN genómico. Los programas informáticos que son bien conocidos en la técnica son útiles en el diseño de cebadores con la especificidad requerida y las propiedades óptimas de amplificación, tales como Oligo versión 5.0 (National Biosciences). Típicamente, cada sonda de la micromatriz tendrá una longitud de entre 10 bases y 50.000 bases, normalmente entre 300 bases y 1000 bases. Los procedimientos de PCR son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Innis et al., eds., PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990). Será evidente para un experto en la técnica que los sistemas robóticos controlados son útiles para aislar y amplificar ácidos nucleicos.

Un medio alternativo preferente para generar sondas polinucleotídicas es mediante la síntesis de polinucleótidos u oligonucleótidos sintéticos, por ejemplo, usando químicas de N-fosfonato o fosforamidita (Froehler et al., Nucleic Acid Res. 14:5399-5407 (1986); McBride et al., Tetrahedron Lett. 24:246-248 (1983)). Las secuencias sintéticas tienen típicamente una longitud de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 500 bases, más típicamente una longitud de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100 bases y lo más preferentemente de entre aproximadamente 40 y aproximadamente 70 bases. En algunos modos de realización, los ácidos nucleicos sintéticos incluyen bases no naturales, tales como, pero sin limitarse de ninguna manera a, inosina. Como se indica anteriormente, los análogos de ácido nucleico se pueden usar como sitios de unión para la hibridación. Un ejemplo de un análogo de ácido nucleico adecuado es el ácido peptidonucleico (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.539.083).

Las sondas se seleccionan preferentemente usando un algoritmo que tiene en cuenta las energías de unión, la composición de bases, la complejidad de la secuencia, las energías de unión de hibridación cruzada y la estructura secundaria. Véase la publicación de patente internacional WO 01/05935.

Un experto en la técnica también apreciará que en la matriz deben incluirse sondas de control positivo, por ejemplo, sondas que se sabe que son complementarias de e hibridables con secuencias de las moléculas de polinucleótidos diana, y sondas de control negativo, por ejemplo, sondas que se sabe que no son complementarias de ni hibridables con secuencias de las moléculas de polinucleótidos diana. En un modo de realización, los controles positivos se sintetizan a lo largo del perímetro de la matriz. En otro modo de realización, los controles positivos se sintetizan en franjas diagonales a lo largo de la matriz. En otro modo de realización más, el complemento inverso para cada sonda se sintetiza junto a la posición de la sonda para que sirva como control negativo. Aún en otro modo de realización, se utilizan secuencias de otras especies de organismos como controles negativos o como controles de "adición".

Las sondas se unen a un soporte sólido o superficie, que se pueden preparar, por ejemplo, a partir de vidrio, plástico (por ejemplo, polipropileno, nylon), poliacrilamida, nitrocelulosa, gel u otro material poroso o no poroso. Un procedimiento para unir ácidos nucleicos a una superficie es mediante la impresión sobre placas de vidrio, como se conoce en la técnica. Este procedimiento es especialmente útil para preparar micromatrices de ADNc. Un segundo procedimiento para preparar micromatrices produce matrices de oligonucleótidos de alta densidad. Se conocen técnicas para producir matrices que contienen miles de oligonucleótidos complementarios de secuencias definidas, en localizaciones definidas en una superficie utilizando técnicas fotolitográficas para síntesis in situ (véanse las patentes de EE. UU. n.° 5.578.832; 5.556.752 y 5.510.270) u otros procedimientos para síntesis y deposición rápidas de oligonucleótidos definidos. Cuando se utilizan estos procedimientos, los oligonucleótidos (por ejemplo, 60-meros) de secuencia conocida se sintetizan directamente sobre una superficie tal como un portaobjetos de vidrio derivatizado. Normalmente, la matriz producida es redundante, con varias moléculas de oligonucleótidos por ARN.

También se pueden usar otros procedimientos para preparar micromatrices, por ejemplo, mediante enmascaramiento. En principio, se podría usar cualquier tipo de matriz conocido en la técnica, por ejemplo, "dot blots" en una membrana de hibridación de nylon. Sin embargo, como reconocerán los expertos en la técnica, con frecuencia se preferirán matrices muy pequeñas, ya que los volúmenes de hibridación serán más pequeños.

Los micromatrices también se pueden fabricar por medio de un dispositivo de impresión por chorro de tinta para la síntesis de oligonucleótidos, por ejemplo, usando los procedimientos y sistemas descritos por Blanchard en la patente de EE. UU. n.° 6.028.189. Específicamente, las sondas de oligonucleótidos en dichas micromatrices se sintetizan en matrices, por ejemplo, en un portaobjetos de vidrio, depositando de manera seriada bases de nucleótidos individuales en "microgotículas" de un disolvente de alta tensión superficial tal como carbonato de propileno. Las microgotículas tienen volúmenes pequeños (por ejemplo, 100 pl o menos, más preferentemente 50 pl o menos) y están separadas entre sí en la micromatriz (por ejemplo, por dominios hidrófobos) para formar pocillos de tensión de superficie circular que definen las localizaciones de los elementos de la matriz (es decir, las diferentes sondas). Las micromatrices fabricadas mediante este procedimiento de chorro de tinta son típicamente de alta densidad, preferentemente con una densidad de al menos aproximadamente 2500 sondas diferentes por cada 1 cm2. Las sondas de polinucleótidos se unen al soporte de forma covalente en el extremo 3' o 5' del polinucleótido.

Los polinucleótidos de biomarcadores que se pueden medir mediante análisis de micromatrices pueden se ARNlnc expresados o un ácido nucleico derivado de los mismos (por ejemplo, ADNc o ARN amplificado derivado de ADNc que incorpora un promotor de RNA polimerasa), incluyendo moléculas de ácidos nucleicos naturales, así como moléculas de ácidos nucleicos sintéticos. En un modo de realización, las moléculas de polinucleótidos diana comprenden ARN, incluyendo, pero sin limitarse de ninguna manera a, ARN celular total, ARNlnc, ARN mensajero (ARNm) con poli(A) o una fracción del mismo, ARNm citoplásmico o ARN transcrito a partir de ADNc (es decir, ARNc, véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.545.522, 5.891.636 o 5.716.785). Los procedimientos para preparar ARN total y con poli(A) son bien conocidos en la técnica y se describen en general, por ejemplo, en Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edición, 2001) El ARN se puede extraer de una célula de interés usando lisis con tiocianato de guanidinio seguida de centrifugación con CsCl, una columna basada en gel de sílice (por ejemplo, RNeasy (Qiagen, Valencia, Calif.) o StrataPrep (Stratagene, La Jolla, Calif.)) o usando fenol y cloroformo, como se conoce en la técnica. El ARN con poli(A) se puede seleccionar, por ejemplo, mediante selección con oligodT celulosa o, de forma alternativa, mediante retrotranscripción cebada con oligo-dT del ARN celular total. El ARN se puede fragmentar mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante incubación con ZnCl2, para generar fragmentos de ARN.

En un modo de realización, el ARN total, los ARNlnc o los ácidos nucleicos derivados de los mismos (tal como ADNc) se aíslan de una muestra tomada de un paciente que tiene una patología cardíaca o un tejido cardíaco sometido a regeneración o una célula madre sometida a diferenciación cardíaca o un tejido cardíaco sometido a tratamientos quirúrgicos y/o farmacológicos. Los ARNlnc biomarcadores que se expresan débilmente en células particulares se pueden someter a enriquecimiento usando técnicas de normalización conocidas en la técnica.

Como se describe anteriormente, los polinucleótidos biomarcadores se pueden marcar de forma detectable en uno o más nucleótidos. Se puede usar cualquier procedimiento conocido en la técnica para marcar los polinucleótidos diana. Preferentemente, este marcado incorpora el marcador de manera uniforme a lo largo de la longitud del ARN y, más preferentemente, el marcado se lleva a cabo con un alto grado de eficacia. Por ejemplo, los polinucleótidos se pueden marcar mediante retrotranscripción cebada con oligo-dT. Se pueden usar cebadores aleatorios (por ejemplo, 9-meros) en retrotranscripción para incorporar de manera uniforme nucleótidos marcados en toda la longitud de los polinucleótidos. De forma alternativa, se pueden usar cebadores aleatorios junto con procedimientos de PCR o procedimientos de transcripción in vitro basados en el promotor T7 para amplificar los polinucleótidos.

El marcador detectable puede ser un marcador luminiscente. Por ejemplo, en la práctica de la invención se pueden usar marcadores fluorescentes, marcadores bioluminiscentes, marcadores quimioluminiscentes y marcadores colorimétricos. Los marcadores fluorescentes que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína, un fósforo, una rodamina o un derivado de tinte polimetínico. Adicionalmente, se pueden usar marcadores fluorescentes disponibles comercialmente, incluyendo pero sin limitarse a fosforamiditas fluorescentes tales como FluorePrime (Amersham Pharmacia, Piscataway, N.J.), Fluoredite (Millipore, Bedford, Mass.), FAM (ABI, Foster City, Calif.) y Cy3 o Cy5 (Amersham Pharmacia, Piscataway, N.J.). De forma alternativa, el marcador detectable puede ser un nucleótido radiomarcado.

En un modo de realización, las moléculas de polinucleótidos biomarcadores de una muestra de un paciente se marcan de forma diferencial con respecto a las moléculas de polinucleótidos correspondientes de una muestra de referencia. La referencia puede comprender ARNlnc de una muestra biológica normal (es decir, muestra de control, por ejemplo, biopsia de un sujeto que no tiene una patología cardíaca o un tejido cardíaco sometido a regeneración o una célula madre sometida a diferenciación cardíaca o un tejido cardíaco sometido a tratamientos quirúrgicos y/o farmacológicos) o de una muestra biológica de referencia (por ejemplo, muestra de un sujeto que tiene una patología cardíaca o muestra de células de un tejido cardíaco sometido a regeneración o una célula madre sometida a diferenciación cardíaca o un tejido cardíaco sometido a tratamientos quirúrgicos y/o farmacológicos).

Las condiciones de hibridación y lavado de ácidos nucleicos se eligen de modo que las moléculas polinucleotídicas diana se unan específicamente a o hibriden específicamente con las secuencias polinucleotídicas complementarias de la matriz, preferentemente a un sitio específico de la matriz, en el que se localiza su ADN complementario. Las matrices que contienen sondas con ADN bicatenario situadas en ellas se someten preferentemente a condiciones de desnaturalización para convertir el ADN en monocatenario antes de ponerse en contacto con las moléculas polinucleotídicas diana. Las matrices que contienen sondas con ADN monocatenario (por ejemplo, ácidos oligodesoxirribonucleicos sintéticos) pueden necesitar desnaturalizarse antes de ponerse en contacto con las moléculas polinucleotídicas diana, por ejemplo, para eliminar horquillas o dímeros que se forman debido a secuencias autocomplementarias.

Las condiciones óptimas de hibridación dependerán de la longitud (por ejemplo, oligómero frente a polinucleótido mayor de 200 bases) y del tipo (por ejemplo, ARN o ADN) de la sonda y de los ácidos nucleicos diana. Un experto en la técnica apreciará que, a medida que los oligonucleótidos se hacen más cortos, puede resultar necesario ajustar su longitud para lograr una temperatura de fusión relativamente uniforme para obtener resultados de hibridación satisfactorios. Los parámetros generales para condiciones de hibridación específicas (es decir, rigurosas) para ácidos nucleicos se describen en Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edición, 2001). Las condiciones de hibridación típicas para las micromatrices de ADNc de Schena et al. son hibridación en 5 * SSC más SDS al 0,2 % a 65 °C durante cuatro horas, seguido de lavados a 25 °C en tampón de lavado de baja restricción (1 * SSC más SDS al 0,2 %), seguido de 10 minutos a 25 °C en tampón de lavado de mayor restricción (0,1 x SSC más SDS al 0,2 %). Las condiciones de hibridación en particular preferentes incluyen la hibridación a la temperatura de fusión media de las sondas o a una temperatura próxima a ella (por ejemplo, dentro de 51 °C, más preferentemente dentro de 21 °C) en NaCl 1 M, tampón MES 50 mM (pH 6,5), sarcosina sódica al 0,5 % y formamida al 30 %.

Cuando se usan productos génicos marcados fluorescentemente, las emisiones de fluorescencia en cada sitio de una micromatriz se pueden detectar, preferentemente, mediante microscopía láser confocal de barrido. En un modo de realización se lleva a cabo un barrido separado, usando la línea de excitación apropiada, para cada uno de los dos fluoróforos usados. De forma alternativa, se puede usar un láser que permita la iluminación simultánea de la muestra a longitudes de onda específicas para los dos fluoróforos y se pueden analizar simultáneamente las emisiones de los dos fluoróforos. Las matrices se pueden someter a barrido con un escáner láser de fluorescencia con una platina XY controlada por ordenador y un objetivo de microscopio. La excitación secuencial de los dos fluoróforos se logra con un láser de gas mixto de varias líneas y la luz emitida se divide por longitud de onda y se detecta con dos tubos fotomultiplicadores. Los dispositivos de barrido láser de fluorescencia son conocidos en la técnica. De forma alternativa, se puede usar un haz de fibra óptica para monitorizar los niveles de abundancia de ARNm en un gran número de sitios simultáneamente.

En el presente documento se describe una micromatriz que comprende una pluralidad de sondas que hibridan con uno o más ARNlnc seleccionados del grupo que comprende SEQ ID NO: 1, Se Q ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SE Q ID No 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104, fragmentos de los mismos, isoformas de los mismos y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con los mismos, lo más preferentemente del grupo que comprende SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104.

El análisis en serie de la expresión génica (SAGE) también se puede utilizar para determinar las abundancias de ARN (por ejemplo, ARNlnc) en una muestra de células. El análisis SAGE no requiere un dispositivo especial para la detección y es uno de los procedimientos analíticos preferentes para detectar simultáneamente la expresión de un gran número de productos de transcripción. En primer lugar, se extrae el ARN de las células. A continuación, el ARN se convierte en ADNc usando un cebador oligo(dT) biotinilado y se trata con una enzima de restricción de reconocimiento de cuatro bases (enzima de anclaje: EA) dando como resultado fragmentos tratados con EA que contienen un grupo biotina en su extremo 3'. A continuación, los fragmentos tratados con EA se incuban con estreptavidina para su unión. El ADNc unido se divide en dos fracciones, y cada fracción se une a continuación a un adaptador oligonucleotídico bicatenario diferente (conector) A o B. Estos conectores están compuestos por: (1) una parte monocatenaria sobresaliente que tiene una secuencia complementaria de la secuencia de la parte sobresaliente formada por la acción de la enzima de anclaje, (2) una secuencia de reconocimiento de nucleótidos 5' de la enzima de restricción de tipo IIS (se escinde en una localización predeterminada a no más de 20 posiciones del sitio de reconocimiento) que sirve como enzima de marcaje (EM, y (3) una secuencia adicional de longitud suficiente para construir un cebador específico de PCR. El ADNc unido al conector se escinde usando la enzima de marcaje, y solo queda la parte de la secuencia del ADNc que está unida al conector, que está presente en forma de una marca de secuencia de hebra corta. A continuación, se unen entre sí grupos de marcas de secuencia de hebra corta de los dos tipos diferentes de conectores, seguido de amplificación por p Cr usando cebadores específicos para los conectores A y B. Como resultado, el producto de amplificación se obtiene como una mezcla que comprende un sinfín de secuencias de dos marcas de secuencia contiguas ("ditags") unidas a los conectores A y B. El producto de amplificación se trata con la enzima de anclaje, y las partes "ditag" libres se unen a hebras en una reacción de unión estándar. A continuación, se clona el producto de amplificación. La determinación de la secuencia de nucleótidos del clon se puede usar para obtener una lectura de "ditags" consecutivas de longitud constante. La presencia de ARNm correspondiente a cada marca se puede identificar a continuación a partir de la secuencia de nucleótidos del clon y de la información sobre las marcas de secuencia.

La PCR cuantitativa con retrotranscriptasa (qRT-PCR) también se puede usar para determinar los perfiles de expresión de los biomarcadores (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2005/0048542A1). La primera etapa en la determinación del perfil de expresión génica mediante RT-PCR es la retrotranscripción del molde de ARN en ADNc, seguida de su amplificación exponencial en una reacción de PCR. Las dos retrotranscriptasas más comúnmente utilizadas son la retrotranscriptasa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV-RT) y la retrotranscriptasa del virus de la leucemia murina de Moloney (MLV-RT). La etapa de retrotranscripción se ceba típicamente utilizando cebadores específicos, hexámeros aleatorios u cebadores oligo-dT, dependiendo de las circunstancias y del objetivo de la determinación del perfil de expresión. Por ejemplo, el ARN extraído se puede retrotranscribir utilizando un kit GeneAmp RNA PCR (Perkin Elmer, Calif., EE. UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc derivado se puede utilizar a continuación como molde en la reacción de PCR posterior.

Aunque la etapa de PCR puede usar una variedad de ADN polimerasas termoestables dependientes de ADN, típicamente emplea la ADN polimerasa Taq, que tiene actividad nucleasa 5'-3' pero carece de actividad endonucleasa de corrección de errores 3'-5'. Por tanto, la PCR TAQMAN utiliza típicamente la actividad nucleasa 5' de la polimerasa Taq o Tth para hidrolizar una sonda de hibridación unida a su amplicón diana, pero se puede usar cualquier enzima con actividad nucleasa 5' equivalente. Se utilizan dos cebadores de oligonucleótidos para generar un amplicón típico de una reacción de PCR. Un tercer oligonucleótido, o sonda, se diseña para detectar la secuencia de nucleótidos localizada entre los dos cebadores de PCR. La sonda no es extensible por la enzima ADN polimerasa Taq y está marcada con un tinte fluorescente indicador y un tinte fluorescente de extinción. Cualquier emisión inducida por láser del tinte indicador es extinguida por el tinte de extinción cuando los dos tintes se localizan muy cerca uno del otro como están en la sonda. Durante la reacción de amplificación, la enzima ADN polimerasa Taq escinde la sonda de una manera dependiente del molde. Los fragmentos de sonda resultantes se disocian en solución y la señal del tinte indicador liberado está libre del efecto de extinción del segundo fluoróforo. Se libera una molécula de tinte indicador por cada nueva molécula sintetizada, y la detección del tinte indicador no extinguido proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.

La RT-PCR TAQMAN se puede realizar utilizando equipos disponibles comercialmente, tales como, por ejemplo, el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7700 (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, Calif., EE. UU.) o Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). En un modo de realización preferente, el procedimiento de nucleasa 5' se ejecuta en un dispositivo de PCR cuantitativa en tiempo real tal como el sistema de detección de secuencias ABI PRISm 7700. El sistema consta de un termociclador, un láser, un dispositivo de carga acoplada (CCD), una cámara y un ordenador. El sistema incluye programas informáticos para utilizar el instrumento y analizar los datos. Los datos del ensayo de nucleasa 5' se expresan inicialmente como Ct, o el ciclo umbral. Los valores de fluorescencia se registran durante cada ciclo y representan la cantidad de producto amplificado hasta ese punto temporal en la reacción de amplificación. El punto temporal en el que la señal fluorescente se registra por primera vez como estadísticamente significativa es el ciclo umbral (Ct).

Para minimizar los errores y el efecto de la variación entre muestras, la RT-PCR se realiza normalmente usando un estándar interno. El estándar interno ideal se expresa a un nivel constante en diferentes tejidos y no se ve afectado por el tratamiento experimental. Los ARN que se utilizan con más frecuencia para normalizar los patrones de expresión génica son ARNm de los genes constitutivos gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) y beta-actina.

Una variación más reciente de la técnica de RT-PCR es la PCR cuantitativa en tiempo real, que mide la acumulación de producto de PCR a través de una sonda fluorigénica de doble marcaje (es decir, sonda TAQMAN). La PCR en tiempo real es compatible tanto con la PCR competitiva cuantitativa, que utiliza un competidor interno para cada secuencia diana para la normalización, como con la PCR comparativa cuantitativa que utiliza un gen de normalización contenido en la muestra, o un gen constitutivo para la RT-PCR.

La espectrometría de masas y, en particular, la espectrometría de masas SELDI, es un procedimiento en particular útil para la detección de biomarcadores. El espectrómetro de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser se puede usar en modos de realización de la invención. En la espectrometría de masas con desorción por láser, se introduce un sustrato o una sonda que comprende biomarcadores en un sistema de entrada. El láser desorbe e ioniza los biomarcadores en fase gaseosa desde la fuente de ionización. Los iones generados son recogidos por un sistema óptico de iones y, a continuación, en un analizador de masas de tiempo de vuelo, los iones se aceleran a través de un campo corto de alta tensión y se dejan pasar a una cámara de alto vacío. En el extremo más alejado de la cámara de alto vacío, los iones acelerados chocan contra una superficie sensible del detector en un momento diferente. Dado que el tiempo de vuelo es una función de la masa de los iones, el tiempo transcurrido entre la formación de los iones y el impacto en el detector de iones se puede utilizar para identificar la presencia o ausencia de marcadores de relación masa/carga específica.

La espectrometría de masas con desorción/ionización por láser asistida por matrices (MALDI-MS) también se puede utilizar para detectar los biomarcadores. MALDI-MS es un procedimiento de espectrometría de masas que implica el uso de una molécula absorbente de energía, con frecuencia denominada matriz, para desorber proteínas intactas de la superficie de una sonda. MALDI se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 5.118.937 y la patente de EE. UU. n.° 5.045.694. En MALDI-MS, la muestra se mezcla típicamente con un material de matriz y se coloca sobre la superficie de una sonda inerte. Las moléculas absorbentes de energía ejemplares incluyen derivados del ácido cinámico, ácido sinapínico ("SPA"), ácido cianohidroxicinámico ("CHCA") y ácido dihidroxibenzoico. Los expertos en esta técnica conocen otras moléculas absorbentes de energía adecuadas. La matriz se seca, formando cristales que encapsulan las moléculas de analito. A continuación, las moléculas de analito se detectan mediante espectrometría de masas con desorción/ionización por láser.

La espectrometría de masas de desorción/ionización por láser con superficie potenciad, o SELDI-MS, representa una mejora con respecto a MALDI para el fraccionamiento y detección de biomoléculas, tales como ARNlnc, en mezclas complejas. SELDI es un procedimiento de espectrometría de masas en el que las biomoléculas, tales como ARNlnc, se capturan en la superficie de un biochip utilizando reactivos de captura que se unen allí. Típicamente, las moléculas no unidas se eliminan mediante lavado de la superficie de la sonda antes de la consulta. SELDI se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 5.719.060 y en la patente de EE. UU. n.° 6.225.047.

Los biomarcadores sobre la superficie del sustrato se pueden desorber e ionizar usando espectrometría de iones en fase gaseosa. Se puede usar cualquier espectrómetro de iones en fase gaseosa adecuado, siempre que permita la resolución de los biomarcadores en el sustrato. Preferentemente, los espectrómetros de iones en fase gaseosa permiten la cuantificación de biomarcadores. En un modo de realización, un espectrómetro de iones en fase gaseosa es un espectrómetro de masas. En un espectrómetro de masas típico, un sustrato o una sonda que comprende biomarcadores en su superficie se introduce en un sistema de entrada del espectrómetro de masas. A continuación, los biomarcadores se desorben en una fuente de desorción tal como un láser, un sistema de bombardeo con átomos rápidos, plasma de alta energía, ionización por electronebulización, ionización por termonebulización, EM de iones secundarios en líquido, desorción de campo, etc. Las especies desorbidas y volatilizadas generadas consisten en especies iónicas preformadas o especies neutras que se ionizan como consecuencia directa del acontecimiento de desorción. Los iones generados son recogidos por un sistema óptico de iones y, a continuación, un analizador de masas dispersa y analiza los iones que pasan. Los iones que salen del analizador de masas son detectados por un detector. A continuación, el detector traduce la información de los iones detectados en relaciones masa/carga. La detección de la presencia de biomarcadores u otras sustancias implicará típicamente la detección de la intensidad de la señal. Esto, a su vez, puede reflejar la cantidad y el carácter de los biomarcadores unidos al sustrato. Cualquiera de los componentes de un espectrómetro de masas (por ejemplo, una fuente de desorción, un analizador de masas, un detector, etc.) se puede combinar con otros componentes adecuados descritos en el presente documento u otros conocidos en la técnica en modos de realización de la invención.

Los biomarcadores también se pueden detectar con ensayos basados en el uso de anticuerpos que reconocen específicamente los biomarcadores de ARNlnc o fragmentos polinucleotídicos u oligonucleotídicos de los biomarcadores. Dichos ensayos incluyen, pero no se limitan a, ensayos de inmunohistoquímica (IHC), ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), radioinmunoanálisis (RIA), inmunoanálisis de tipo "sándwich", fluoroinmunoanálisis, ensayos de inmunoprecipitación, cuyos procedimientos son bien conocidos en la técnica. .

Los biomarcadores también se pueden detectar con cualquier tecnología basada en secuenciación conocida en la técnica.

Aún en otro aspecto, la divulgación proporciona kits para su uso en el diagnóstico de una patología cardíaca o un tejido cardíaco sometido a regeneración o una célula madre sometida a diferenciación cardíaca o un tejido cardíaco sometido a tratamientos quirúrgicos y/o farmacológicos, en los que los kits se pueden usar para detectar los biomarcadores de ARNlnc divulgados en el presente documento. Por ejemplo, los kits se pueden usar para detectar uno cualquiera o más de los biomarcadores descritos en el presente documento, que se expresan diferencialmente en muestras de un paciente con una patología cardíaca o un tejido cardíaco sometido a regeneración o una célula madre sometida a diferenciación cardíaca o un tejido cardíaco sometido a tratamientos quirúrgicos y/o farmacológicos. El kit puede incluir uno o más agentes para la detección de biomarcadores de ARNlnc, un recipiente para mantener una muestra biológica aislada de un sujeto humano; e instrucciones impresas para hacer reaccionar los agentes con la muestra biológica o una parte de la muestra biológica para detectar la presencia o cantidad de al menos un biomarcador de ARNlnc en la muestra biológica. Los agentes se pueden envasar en recipientes separados. El kit puede comprender además una o más muestras de referencia de control y reactivos para realizar un inmunoanálisis, una transferencia Northern, PCR, análisis de micromatrices o SAGE, secuenciación de ADN/ARN.

En determinados modos de realización, el kit contiene al menos una sonda que hibrida selectivamente con un biomarcador, o al menos un anticuerpo que se une selectivamente a un biomarcador, o al menos un conjunto de cebadores de PCR para amplificar un biomarcador. En un modo de realización, el kit comprende al menos un agente para medir el nivel de un biomarcador.

El kit puede comprender uno o más recipientes para las composiciones contenidas en el kit. Las composiciones pueden estar en forma líquida o pueden estar liofilizadas. Los recipientes adecuados para las composiciones incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales, incluidos vidrio o plástico. El kit también puede comprender un prospecto que contiene instrucciones escritas para realizar procedimientos de diagnóstico de una patología cardíaca o monitorización de tratamientos con células madre o tratamientos médicos regenerativos.

Los kits tienen varias aplicaciones. Por ejemplo, los kits se pueden usar para diagnosticar una patología cardíaca o para monitorizar y/o evaluar la eficacia de un tratamiento para una patología cardíaca, tratamiento con células madre o medicina cardíaca regenerativa. En otro ejemplo, los kits se pueden usar para identificar compuestos que modulan la expresión de uno o más de los biomarcadores en modelos animales in vitro o in vivo para determinar los efectos del tratamiento.

Por "dosis o cantidad terapéuticamente eficaz" de cada uno de los moduladores de la invención se entiende una cantidad que, cuando se administra en combinación, provoca una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento de una patología cardíaca en un individuo.

Por tanto, por ejemplo, una "respuesta terapéutica positiva" sería una mejora en la enfermedad en asociación con la politerapia y/o una mejora en uno o más síntomas de la enfermedad en asociación con la politerapia.

La dosis real que se va a administrar variará dependiendo de la edad, el peso y el estado general del sujeto, así como de la gravedad de la afección que se está tratando, el criterio del profesional sanitario y el conjugado que se está administrando. Los expertos en la técnica pueden determinar las cantidades terapéuticamente eficaces, y se ajustarán a los requisitos particulares de cada caso particular. En general, una cantidad terapéuticamente eficaz variará de aproximadamente 0,50 mg a 5 gramos diarios, más preferentemente de aproximadamente 5 mg a 2 gramos diarios, incluso más preferentemente de aproximadamente 7 mg a 1,5 gramos diarios.

En determinados modos de realización, se administrarán múltiples dosis terapéuticamente eficaces de cada uno de al menos un ARNlnc y al menos un agente terapéutico adicional de acuerdo con una pauta posológica diaria, o de forma intermitente. Por ejemplo, se puede administrar una dosis terapéuticamente eficaz un día a la semana, dos días a la semana, tres días a la semana, cuatro días a la semana o cinco días a la semana, etc. Por administración "intermitente" se entiende que la dosis terapéuticamente eficaz se puede administrar, por ejemplo, en días alternos, cada dos días, cada tres días, etc. Por "dos veces por semana" se entiende que se administran al sujeto dos dosis terapéuticamente eficaces del agente en cuestión dentro de un período de 7 días, comenzando el día 1 de la primera semana de administración, con un mínimo de 72 horas entre las dosis y un máximo de 96 horas entre las dosis. Por "tres veces por semana" se entiende que se administran al sujeto tres dosis terapéuticamente eficaces dentro de un período de 7 días, permitiendo un mínimo de 48 horas entre las dosis y un máximo de 72 horas entre las dosis. Para los propósitos de la presente invención, este tipo de dosificación se denomina tratamiento "intermitente". De acuerdo con los procedimientos de la presente invención, un sujeto puede recibir tratamiento intermitente (es decir, administración dos veces por semana o tres veces por semana de una dosis terapéuticamente eficaz) durante uno o más ciclos semanales hasta que se logre la respuesta terapéutica deseada. Los agentes se pueden administrar mediante cualquier vía de administración aceptable, como se indica a continuación en el presente documento.

Un modulador de ARNlnc de la invención se puede administrar antes de, de forma concurrente con o después de al menos un agente terapéutico adicional. Si se proporciona al mismo tiempo que el agente terapéutico adicional, el modulador de ARNlnc se puede proporcionar en la misma composición o en una composición diferente. Por tanto, los agentes se pueden presentar al individuo mediante tratamiento concurrente. Por "tratamiento concurrente" se entiende la administración a un sujeto humano de modo que el efecto terapéutico de la combinación de las sustancias se produzca en el sujeto que se está sometiendo a tratamiento. Por ejemplo, el tratamiento concurrente se puede lograr administrando al menos una dosis terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un modulador de ARNlnc y al menos una dosis terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende al menos un agente terapéutico adicional de acuerdo con una pauta posológica particular. La administración de las composiciones farmacéuticas separadas se puede realizar al mismo tiempo (es decir, simultáneamente) o en momentos diferentes (es decir, secuencialmente, en cualquier orden, el mismo día o en días diferentes), siempre que el efecto terapéutico de la combinación de estas sustancias se produzca en el sujeto que se está sometiendo a tratamiento.

En otros modos de realización de la invención, la composición farmacéutica de la invención es una formulación de liberación sostenida o una formulación que se administra usando un dispositivo de liberación sostenida. Dichos dispositivos son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, parches transdérmicos y bombas implantables en miniatura que pueden proporcionar la administración del fármaco a lo largo del tiempo de manera continua y en estado estacionario en una variedad de dosis para lograr un efecto de liberación sostenida con una composición farmacéutica de liberación no sostenida. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar usando la misma o diferentes vías de administración de acuerdo con cualquier procedimiento médicamente aceptable conocido en la técnica. Las vías de administración adecuadas incluyen la administración parenteral, tal como la administración subcutánea (s.c.), intraperitoneal (i.p.), intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.) o por infusión, oral y pulmonar, nasal, tópica, transdérmica y supositorios. Cuando la composición se administra por vía pulmonar, la dosis terapéuticamente eficaz se ajusta de modo que el nivel soluble del agente, tal como el modulador de ARNlnc, en la circulación sanguínea sea equivalente al obtenido con una dosis terapéuticamente eficaz que se administra por vía parenteral, por ejemplo s.c., i.p., i.m. o i.v. En algunos modos de realización de la invención, la composición farmacéutica que comprende el modulador de ARNlnc se administra mediante inyección i.m. o s.c., en particular mediante inyección i.m. o s.c. localmente en la región donde se administran el agente o agentes terapéuticos usados en el protocolo de tratamiento cardíaco.

Los factores que influyen en la cantidad respectiva de las diversas composiciones que se van a administrar incluyen, pero no se limitan a, el modo de administración, la frecuencia de administración (es decir, administración diaria o intermitente, tal como dos o tres veces por semana), la enfermedad particular que se somete a tratamiento, la gravedad de la enfermedad, el historial de la enfermedad, si el individuo está recibiendo tratamiento concurrente con otro agente terapéutico y la edad, altura, peso, salud y estado físico del individuo sometido a tratamiento. En general, es preferente el uso de una dosis mayor de este agente a medida que incrementa el peso del sujeto sometido a tratamiento. Los ejemplos a continuación solo se proporcionan con propósitos ilustrativos y no están destinados a limitar el alcance de la presente invención de manera alguna.

La presente divulgación también se refiere a un procedimiento para incrementar y/o mejorar la función cardíaca que comprende administrar una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un modulador de lnc_019010, en el que el modulador se selecciona del grupo que comprende un agente químico, un anticuerpo, una proteasa genomanipulada y ARN enzimáticamente activo, opcionalmente en combinación con vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Preferentemente, el modulador de lnc_019010 es un ARN enzimáticamente activo que consiste en uno o más oligonucleótidos antisentido dirigidos a dicho lnc_019010. Lo más preferentemente, dicho uno o más oligonucleótidos antisentido dirigidos a dicho lnc_019010 es un oligonucleótido antisentido modificado (Gápmero) que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 148.

También se prevé un procedimiento para incrementar y/o mejorar el sistema de conducción en el corazón que comprende administrar una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un modulador de lnc_033521, en el que el modulador se selecciona del grupo que comprende un agente químico, un anticuerpo, una proteasa genomanipulada y ARN enzimáticamente activo, opcionalmente en combinación con vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

Se divulga además un procedimiento para regular la frecuencia cardíaca que comprende administrar una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un modulador de lnc_033521, en el que el modulador se selecciona del grupo que comprende un agente químico, un anticuerpo, una proteasa genomanipulada y ARN enzimáticamente activo, opcionalmente en combinación con vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

Preferentemente, el modulador de lnc_033521 es un ARN enzimáticamente activo que consiste en uno o más oligonucleótidos antisentido dirigidos a dicho lnc_033521. Lo más preferentemente, dicho uno o más oligonucleótidos antisentido dirigidos a dicho lnc_033521 es un oligonucleótido antisentido modificado (Gápmero) que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 147.

Se divulga además un procedimiento para diagnosticar una miocardiopatía congestiva (MCC) en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

a) medir, directa o indirectamente, el nivel de Novlnc6 que tiene una secuencia de ADNc como se establece en SEQ ID NO: 48, fragmentos de la misma, isoformas de la misma y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la misma; y

b) analizar los niveles de dicho Novlnc6, fragmentos del mismo, isoformas del mismo y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con el mismo, junto con los respectivos intervalos de valores de referencia para dicho Novlnc6,

en el que un nivel de expresión disminuido de dicho Novlnc6 en la muestra biológica en comparación con una muestra de control de un sujeto normal indica que el sujeto tiene una miocardiopatía congestiva.

Se divulga además un procedimiento para diagnosticar una estenosis aórtica (EA) en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

a) medir, directa o indirectamente, el nivel de Novlnc44 que tiene una secuencia de ADNc como se establece en SEQ ID NO: 100, fragmentos de la misma, isoformas de la misma y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la misma; y

b) analizar los niveles de dicho Novlnc44, fragmentos del mismo, isoformas del mismo y variantes que comparten al menos un 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos con el mismo, junto con los respectivos intervalos de valores de referencia para dicho Novlnc44,

en el que un nivel de expresión disminuido de Novlnc44 en la muestra biológica en comparación con una muestra de control de un sujeto normal indica que el sujeto tiene una estenosis aórtica.

en el que un nivel de expresión disminuido de Novlnc44 en la muestra biológica en comparación con una muestra de control de un sujeto normal indica que el sujeto tiene una miocardiopatía congestiva.

Los expertos en la técnica apreciarán que la invención descrita en el presente documento es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente. Se debe entender que la invención incluye todas dichas variaciones y modificaciones sin apartarse del alcance de las reivindicaciones. Por lo tanto, la presente divulgación se debe considerar en todos los aspectos ilustrados y no de manera restrictiva, estando indicado el alcance de la invención mediante las reivindicaciones adjuntas.

La descripción anterior se entenderá más completamente con referencia a los siguientes ejemplos. Dichos ejemplos, sin embargo, son ejemplos de procedimientos para poner en práctica la presente invención y se pretende que limiten el alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

Procedimientos experimentales ampliados

Ensayo de potenciadores transgénicos de ratón

Los ensayos de potenciadores transgénicos de ratón se ejecutaron y describieron previamente en Ounzain S, et al., 2014. Las imágenes se pueden encontrar en http://enhancer.lbl.gov/.

Ratones

Los experimentos en animales fueron aprobados por la Oficina Veterinaria Gubernamental (Lausana, Suiza) y se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Lausana. Los experimentos en animales fueron aprobados por la Oficina Veterinaria Gubernamental (Lausana, Suiza) y se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Lausana.

Modelos de lesión cardíaca: ligadura de la arteria descendente anterior izquierda

El infarto de miocardio en ratones se indujo como se describe previamente (Ounzain S, et al., 2014). Se anestesió al ratón mediante inyección i.p. de una mezcla de ketamina / xilacina / acepromacina (65 / 15 / 2 mg/kg). Se colocó al ratón sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal. En posición supina, se realizó la intubación endotraqueal y se colocó al ratón en ventilación artificial con un miniventilador para roedores (volumen corriente = 0,2 ml, frecuencia = 120 respiraciones/min). El tórax del animal se afeitó y desinfectó con solución de Betadine. Se realizó una toracotomía izquierda. Los grupos de músculos pectorales se separaron transversalmente, exponiendo la parrilla costal. Se accedió al cuarto espacio intercostal usando tijeras y disección roma. Se abrió suavemente el pericardio y se aplicó presión en el tórax derecho para desplazar el corazón hacia la izquierda. Se colocó una ligadura de seda 7.0 cerca de la inserción de la orejuela auricular izquierda y se ató alrededor de la arteria coronaria descendente izquierda. La oclusión de la arteria se verificó mediante el rápido blanqueamiento del ventrículo izquierdo. En los animales sometidos a una intervención quirúrgica simulada (referencia), la ligadura se colocó en un lugar idéntico pero no se ató. Se volvieron a expandir los pulmones usando presión positiva al final de la espiración y las incisiones en el pecho y la piel se cerraron respectivamente con suturas de seda 6-0 y 5-0. Se desconectó gradualmente al ratón del respirador. Una vez que se reanudó la respiración espontánea, se retiró el tubo endotraqueal y se volvió a colocar al animal en su jaula.

Ecocardiografía

Las ecocardiografías transtorácicas se realizaron utilizando una sonda de 30 MHz y la máquina de ultrasonido Vevo 770 (VisualSonics, Toronto, ON, Canadá). Se anestesió ligeramente a los ratones con isoflurano al 1 %, manteniendo la frecuencia cardíaca a 400-500 latidos por minuto, y se les colocó en decúbito supino sobre una plataforma calentada a 37 °C. Se eliminó el vello con un agente depilatorio tópico. Se obtuvieron imágenes del corazón en el modo 2D en la vista del eje largo paraesternal. Desde esta vista, se colocó un cursor en modo M perpendicular al tabique interventricular y la pared posterior del ventrículo izquierdo (VI) al nivel de los músculos papilares. Se midió el grosor de la pared libre del VI en diástole (GPVID) y en sístole (GPVIS), así como el diámetro del VI en diástole (DVID) y en sístole (DVIS). Todas las mediciones se realizaron desde el borde de ataque hasta el borde de ataque de acuerdo con las directrices de la Sociedad Americana de Ecocardiografía. Las medidas se tomaron en 3 imágenes separadas en modo M y se promediaron. La fracción de eyección (FE) se calculó mediante la fórmula % FE = [(VVID - VVIS) / VVID] x 100, donde VVID y VVIS son el volumen del VI en diástole y en sístole, respectivamente.

Obtención y preparación de tejido de ratón

Se diseccionaron los corazones y testículos de los ratones testigo y de los ratones con IM uno y siete días después de la ligadura de la arteria. Los tejidos se lavaron en PBS tratado con pirocarbonato de dietilo (DEPC), se ultracongelaron con nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Cabe señalar que se tuvo especial cuidado en comprimir suavemente los corazones con fórceps en PBS tratado con DEPC para minimizar la contaminación de sangre residual.

Cultivo y diferenciación de células madre embrionarias

La línea de células madre embrionarias (ES) indicadoras Nkx2.5-EmGFP BAC (cepa 129/OlaHsd, sublínea E14Tg2A.4) fue proporcionada amablemente por Edward C Hsiao (Instituto Gladstone de Investigación Cardiovascular, San Francisco) y se mantuvo y cultivó como se describe previamente (Ounzain S, et al., 2014). Las células se cultivaron en alimentadores de fibroblastos embrionarios de ratón o en placas gelatinizadas en medio de células ES estándar complementado con 1000 U/ml de LIF. La diferenciación cardíaca de las células ES se indujo agregando alícuotas que contenían 1000 células en gotas colgantes para formar cuerpos embrioides. (Ounzain S, et al., 2014).

Cultivos y transfecciones de células primarias

Se sacrificaron ratones C57B6 recién nacidos dentro de las primeras 24 h posteriores al nacimiento. Se retiraron los corazones que latían, se disecaron cuidadosamente las aurículas y los grandes vasos y se colocaron en hielo en tampón ADS (H2O, NaCl 116 mM, HEPES 20 mM, NaH2PO4 1 mM, KCl 5,4 mM, MgSO40,8 mM, glucosa 5,5 mM). Los corazones se trituraron con una cuchilla de afeitar afilada y estéril, y se colocaron en tubos de 1,5 ml (5-6 corazones por tubo) que contenían 1 ml de tampón de digestión PIB (tampón ADS 0,05 mg/ml de colagenasa tipo II (Worthington) 1 mg/ml de pancreatina (Sigma). Colocar los tubos a 37 °C con agitación a 1000 rpm durante 15 minutos, recoger los sobrenadantes en tubos que contengan un volumen de medio completo (DMEM al 75 %, M199 al 25 %, penicilina/estreptavidina 1x, L-glutamina 1x, suero de caballo al 10 %, suero bovino fetal al 5 %) igual a la suma de todos los sobrenadantes de los tubos de digestión. Añadir 1 ml de tampón PIB a los fragmentos de tejido no digeridos que aún queden en los tubos y repetir el proceso de digestión otras 2 veces. Después de las 3 etapas de digestión, agitar las células por centrifugación a 800 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en un volumen adecuado de medio completo (2 ml cada 5-6 corazones). Sembrar las células en una placa de 10 cm y cultivarlas durante 45 minutos en una incubadora a 37 °C, CO2 al 10 % (precultivo 1); después de esta etapa, las células no miocitos se adherirán y los cardiomiocitos permanecerán en suspensión. Transferir el sobrenadante a una nueva placa de 10 cm para repetir esta etapa otra vez (precultivo 2). Añadir medio completo recién preparado a la placa de precultivo para cultivar las células no miocitos. Después del segundo precultivo, recoger el sobrenadante en un tubo nuevo, hacer un recuento de células y sembrar 300.000 cardiomiocitos en placas de 3,5 cm recubiertas con gelatina. Un día después del aislamiento, se transfectó una concentración final de 100 nM de LNATM longRNA GapmeRs (Exiqon) a cardiomiocitos usando FuGene 6 (Promega). Después de 72 h, se extrajo el ARN usando el kit miRNeasy (Qiagen) y se confirmó la eliminación mediante qPCR. Secuencias de Gápmeros, revueltas; TCATACTATATGACAG (SEQ ID NO: 106), Anti-Novlnc6 TACAACCTGCTTACT (SEQ ID NO: 105).

Aislamientos de fracciones de ARN nuclear y citoplásmico

Se aislaron fracciones de ARN nuclear y citoplásmico usando el kit de purificación de ARN citoplásmico y nuclear (Norgen Biotek Corp, CA, ref.: 37400) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Aislamiento de ARN, retrotranscripción, PCR de punto final y PCR cuantitativa

Las secuencias de cebadores para qRT-PCR se proporcionan a continuación. Para la qRT-PCR basada en la sonda TaqMan, la expresión se analizó utilizando sondas TaqMan marcadas con fluorescencia (ABI). El análisis se llevó a cabo utilizando un ciclador ABI Prism 7500 y la expresión relativa se cuantificó utilizando el procedimiento de ^{A A}CT. Para la PCR de punto final, se tomaron alícuotas de mezclas de PCR durante diferentes ciclos para el análisis en gel de agarosa para determinar el intervalo lineal de amplificación. Todas las reacciones se realizaron en un gel de agarosa al 1,5 % teñido con bromuro de etidio. Las secuencias de cebador fueron las siguientes (Fw, Rv).

Novlnc6; GTGGGGAGGTCAGCTACAAA; CGGAAATGGTTTGAAATGCT, (SEQ ID NO: 107, 108)

Novlnc11; ACAGACCTGCAGCAGTGAGA; GCTAGGGAACGCAGAACAAG, (SEQ ID NO: 109, 110) Novlnc15; AAGGCTTCCCAGAGAAGGAG; ACTGGGTGAGTCTCGCTGTT, (SEQ ID NO:111, 112)

Novlnc23; TGGGACAGCAGAGCTAAGGT; AGATTCCAGCACGCACTTCT, (SEQ ID NO: 113, 114) Novlnc32; AAAGGGAAGAGGGAAAACGA; CGTCTAGAACCAGCCCAGAG, (SEQ ID NO: 115, 116) Novlnc35; CAGCCCTGCTTTAGTTCCTG; TTCGTTGGGGATTTTACTGC, (SEQ ID NO: 117, 118)

Novlnc44; TTTGGAGATGGAACCTGGAG; TCTGGTATGGGGGAGACTTG, (SEQ ID NO: 119, 120) Novlnc49; AGCTCTGGGTTGGACTGAGA; TGCATACATTCTGGCAGAGC, (SEQ ID NO: 121, 122)

Novlnc61; GGTTGGGTGCCTATTAAACG; GGTTCATGAGCCTTTGGAAG, (SEQ ID NO: 123, 124)

Novlnc76; TGTTAATTCAGGGGCACACA; GGTGGAGAGCCACTGAAGAG, (SEQ ID NO: 125, 126) Novlnc86; TCTCTGTCCCTTGTGTGTGC; CTTGGAGGTGTGGGCATAGT, (SEQ ID NO: 127, 128)

Novlnc90; GAGCCAAGTGCACACAGAAA; TGGTCTGTTCCTGGCCTTAG, (SEQ ID NO: 129, 130)

Novlnc95; GTGGACGACAAGGGAGGTTA; CGGAATGGCTCCTACAACAT, (SEQ ID NO: 131, 132) Novlnc96; GAGGCTCCTGGATCTCTGTG; TTGGGAGGCAAAGGTAGATG, (SEQ ID NO: 133, 134) Novlnc103; GAAATGAGTGGTGGCAGTGA; CTTAGGTCTGCGCCTAATGG, (SEQ ID NO: 135, 136) Novlnc174; GCACAGATGCATAGCCTCAA; GCAGCCTGGACTTTTCTCAC, (SEQ ID NO: 137, 138) Novlnc333; TCACCTCCAAGTGGGTCTTC; AGCTCGGTCTGTCGTGAGTT, (SEQ ID NO: 139, 140) MmMyocardin; CAAGGCTTAATACCGCCACTG; AATGTGCATAGTAACCAGGCTG, (SEQ ID NO: 141, 142) MmBMP10; ATGGGGTCTCTGGTTCTGC; CAATACCATCTTGCTCCGTGAA, (SEQ ID NO: 143, 144) MmTbx20; AAGAGATACCGCTATGCCTACC; GCTGCTCGCCAGTAAAGGG, (SEQ ID NO: 145, 146) Col1a1; Mm_00801666_g1, CTGF; Mm_01192931_g1, NPPA; Mm_01255747_g1, TGFb2; Mm_00436955_m1, Nkx2-5; Mm_00657783_m1, GATA4; Mm_00484689_m1, Tbx5; Mm_00803521_m1, Myh6; Mm_00440354_m1, Myh7; Mm_00600555_m1, NPPB; Mm_00435304_g1.

Secuenciación y análisis de ARN

Se aisló el ARN total de corazones de ratones adultos usando el kit de aislamiento RNeasy (Qiagen). Las colecciones de secuenciación se prepararon de acuerdo con las instrucciones del kit de colecciones Illumina RNA-Seq con selección de poli(A). Las colecciones se secuenciaron con un equipo Illumina HiSeq2000 (2x100 pb).

Análisis de secuencia de lecturas de ARN largo

Las lecturas de extremos emparejados (100 nucleótidos) de 8 muestras (4 referencia, 4 LAD) se cotejaron con el genoma de referencia mm9 utilizando el programa informático Tophat versión 2.0.5 (Trapnell et al., 2012) con la opción "Modelo genético" -G, utilizando el formato GTF de genes de referencia mm9 de UCSc (Karolchik et al., 2003). Se realizó una reconstrucción de los transcritos ab initio utilizando Cufflinks, versión 2.0.2 (Trapnell et al., 2012). Se utilizó la opción “enmascaramiento” (-G), utilizando el formato GTF de genes de referencia mm9 de UCSC. El resto de los parámetros fueron los predeterminados. Los GTF resultantes se fusionaron utilizando Cuffmerge, versión 2.0.2, utilizando la opción "-g" con GTF de ratones mm9 de UCSC como referencia, lo que permite distinguir entre los transcritos conocidos y los novedosos.

Clasificación de ARNlnc

Utilizando los datos de Cuffmerge, los transcritos se clasificaron en 3 categorías: ARNm conocidos, ARNlnc conocidos (UCSC como referencia) y ARNlnc novedosos. Los transcritos novedosos se filtraron para obtener una longitud mínima de 200 pb y al menos 2 exones. A continuación, se calcularon los valores de lectura por gen a partir de los archivos BAM de alineación utilizando HTSeq (v0.5.4p2) con las opciones "-m union" "--stranded no". A continuación, los genes se filtraron para obtener una expresión mínima (valores medios >= 5 en todas las condiciones). Los genes de ARNlnc se clasificaron en varias categorías comparando las coordenadas de los genes y exones de ARNlnc con las coordenadas de genes codificantes de proteínas conocidos. Las categorías fueron las siguientes: "Intergénica de la misma hebra" era donde todos los exones del gen de ARNlnc estaban entre dos genes codificantes de proteínas; "Intergénica convergente" era donde un gen codificante de proteína y un gen de ARNlnc se transcriben en hebras opuestas pero apuntando uno hacia el otro; "Intergénica divergente" era donde un gen codificante de proteína y un gen de ARNlnc se transcriben en hebras opuestas pero apuntando en sentidos opuestos; "Exónica sentido" era donde al menos un exón de un ARNlnc se solapaba con un exón de un gen codificante de proteína en la misma dirección; "Exónica antisentido" era el mismo que para "Exónica sentido" pero con los genes codificantes de proteínas y de ARNlnc en hebras opuestas; "Intrónico sentido" e "Intrónico antisentido" eran donde un ARNc estaba completamente contenido dentro del intrón de un gen codificante de proteína en la misma hebra o en la hebra opuesta, respectivamente; "Superpuesta sentido" y "Superpuesta antisentido" era donde las coordenadas de un gen ARNlnc se superponían con las de un gen codificante de proteína en la misma hebra o en la hebra opuesta, respectivamente.

Análisis de expresión diferencial de ARNlnc

Los datos de los recuentos se ajustaron a un modelo estadístico basado en la distribución binomial negativa utilizando el paquete R DESeq, que es útil para detectar una variación significativa de RNA-Seq con un número bajo de réplicas biológicas. Para realizar el análisis de normalización y expresión diferencial, los valores de las lecturas sin procesar por gen se normalizaron al tamaño relativo de cada colección. La dispersión empírica (el coeficiente de variación al cuadrado para cada gen) se estimó utilizando el procedimiento combinado. Aquí, las muestras de todas las condiciones con réplicas se utilizan para estimar un único valor de dispersión agrupado, que se aplica a todas las muestras. A continuación, se ajustó la relación dispersión-media utilizando el procedimiento local y solo se utilizó el valor ajustado en los cálculos posteriores. La diferencia entre las medias de las muestras tratadas y no tratadas se calculó a continuación usando una prueba binomial negativa y los valores de p se ajustaron para múltiples comparaciones usando el procedimiento de Benjamini-Hochberg. Los genes con un valor de p ajustado < 0,01 se consideraron expresados diferencialmente.

Análisis de ARNlnc

Potencial de codificación: El potencial de codificación de proteínas de los transcritos se evaluó utilizando el programa GeneID, versión v1.4.4, aplicado a secuencias de transcritos en formato FASTA, con parámetros adaptados para vertebrados proporcionados por los autores en el archivo GeneID.human.070123.param, y con las opciones "-s" y G".

Puntuación de PhastCons: las puntuaciones de PhastCons (calculadas sobre múltiples alineaciones de 30 genomas de vertebrados con el genoma de ratón mm9) por cromosoma se descargaron del sitio web de UCSC. Para cada gen, se sumaron las puntuaciones por base de exones, intrones y promotores (definidas como 1000 pb en dirección 5' de TSS) y se dividieron por la longitud del fragmento. Este resultado se utilizó como la puntuación por fragmento. Se generaron 50.000 regiones intergénicas aleatorias (tamaño = 3400 pb ± 20 %) y se calculó la misma puntuación. El log10 de las puntuaciones se representó por categoría utilizando la estructura de rejilla del paquete R. Las puntuaciones de las regiones intergénicas se agregaron a las 3 gráficas (exón, intrón, promotor) como comparación.

Niveles de marcadores de cromatina

Para el análisis de los niveles de marcadores de cromatina en promotores, se utilizaron los datos publicados por Wamstad et al. (Wamstad et al., 2012) observados en líneas celulares representativas de etapas sucesivas a lo largo de la diferenciación cardíaca (ESC, MES, CP, CM) (descargados del banco de datos del Consorcio de Desarrollo Cardiovascular (CvDC), que forma parte del Programa Bench to Bassinet del NHLBI). Se evaluaron los niveles de cinco marcadores (H3K4me1, H3K4me3, H3K27ac, H3K27me3 y RNAP Ser5P) dentro de regiones de 2 kb centradas en el TSS de cada transcrito, utilizando el comando "map" del programa BEDTools, versión 2.17.0, con parámetros predeterminados. Estos niveles se normalizaron calculando la proporción de ChIP respecto a ADN WCE dentro de la misma región. En base a los perfiles resultantes, los transcritos se distribuyeron entre los 31 agrupamientos de ChIP identificados por Wamstad et al. (Wamstad et al., 2012). Cada transcrito t se atribuyó al agrupamiento más cercano, medido por una distancia d(t,C) basada en la correlación de Spearman S(t,c) de perfiles entre el transcrito t y los n miembros c del agrupamiento C:

Estados de cromatina

Para analizar la presencia de picos de marcadores de cromatina en los promotores, se utilizaron los datos publicados por Wamstad et al. (Wamstad et al., 2012), observados en líneas celulares de diferenciación cardíaca, y los datos observados en tejido adulto (corazón, riñón, hígado, bazo, testículos) publicados como parte del proyecto ENCODE (The ENCODE Project Consortium, 2011), generados y analizados en el laboratorio de Bing Ren en el Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer, UCSC. Se consideraron cuatro marcadores: H3K4me1, H3K4me3, H3K27ac y H3K27me3. Dependiendo de la presencia de estos marcadores, cada transcrito se atribuyó a uno de los ocho estados de cromatina distintos: H3K4me1, H3K4me3 o H3K27me3 solos, combinación de H3K4me3 y H3K27me3, H3K4me3 y H3K27ac, H3K27me3 y H3K4me1, H3K27ac y H3K4me1, o ninguna de estas combinaciones previas. Se consideró que un marcador estaba presente si se podía detectar una intersección no vacía entre la región TSS y un pico de marcador, en cualquiera de las réplicas. Las intersecciones se detectaron usando el comando de ventana del programa BEDTools (Quinlan and Hall, 2010), versión 2.17.0, con la opción "-w 1000".

Gráficas de mosaico

Se utilizaron gráficas de mosaico para visualizar distribuciones de frecuencias conjuntas (por ejemplo, a través de agrupamientos de ChIP, categorías de genes o estado de expresión diferencial). Estas gráficas se generaron utilizando el paquete cdv R. En algunas de estas gráficas se aplicó un sombreado basado en residuos para visualizar el patrón de desviación de la independencia. La mayor parte del procesamiento de datos, del análisis estadístico y de la generación de gráficos se realizó utilizando el lenguaje R (R core team, 2013).

Expresión génica en tejidos: matrices cromáticas de expresión

La expresión de los genes (RefSeq ARNlnc novedosos) en 18 tejidos de ratón (suprarrenal, vejiga, colon, duodeno, corazón, riñón, intestino grueso, hígado, pulmón, glándula mamaria, ovario, placenta, tejido adiposo subcutáneo, intestino delgado, bazo, estómago, testículo, timo) se midió en datos públicos de ENCODE (CSHL Long RNA-seq, PI Gingeras, Lab CSHL-m) (The ENCODE Project Consortium, 2011). Se sumaron los recuentos en hebras positivas y negativas y se tomaron los recuentos medios de las dos réplicas por tejido. También se midió la expresión de los mismos genes en las 8 muestras LAD/referencia. La normalización entre muestras se realizó usando DESeq (función "estimateSizeFactors". Solo se mantuvieron los genes con expresión mínima (recuentos medios >= 5 en todas las condiciones). La puntuación de especificidad cardíaca (HS) (por gen) se definió como:

, Pcardíaca

Puntuación HS = -------------------------------Pno cardíaca 2 *CTno cardíaca

donde pcardíaca es la expresión promedio por gen en las 8 muestras de la invención, pno cardíaca es la expresión promedio por gen en muestras de ENCODE no cardíacas, y CTno cardíaca es la desviación estándar por gen en muestras de ENCODE no cardíacas. (adaptado de (Anders and Huber, 2010b)). Un gen se consideró específico del corazón si tenía una puntuación de HS > 1. Las matrices cromáticas se generaron utilizando heatmap.2 del paquete gplots en R, versión 2.11.0. El agrupamiento se realizó usando hclust, versión 1.3.1, usando correlación de Spearman y distancia euclidiana, agrupamiento de ligamiento promedio. Se aplicó una escala por fila. Se utilizó el mismo orden de muestras para todas las matrices cromáticas para permitir la comparación. Las barras HS se generaron utilizando la puntuación HS definida anteriormente. El filtro para genes expresados diferencialmente es el valor de p ajustado para la expresión diferencial < 0,01. Los valores de p para la significación de la diferencia entre los porcentajes de HS entre los grupos se calcularon mediante la prueba de chi cuadrado de Pearson.

Correlación de la expresión entre ARNInc novedosos y los genes codificantes más cercanos

Las coordenadas de los ARNlnc novedosos se compararon con la referencia de genes codificantes de RefSeq. Si las coordenadas del ARNlnc se superponían con un gen conocido (al menos 1 pb), este gen se consideraba el gen superpuesto más cercano. Si no había superposición con un gen conocido, se seleccionaba el gen más cercano y se clasificaba como en sentido 5' o en sentido 3' dependiendo de su posición. Para la expresión génica se utilizaron los mismos datos que en las matrices cromáticas de expresión. La correlación de la expresión se calculó entre el ARNlnc y el gen codificante más cercano usando la correlación de Pearson. Esto se hizo para ARNlnc novedosos y ARNlnc en UCSC. A modo de comparación, se aplicó el mismo procedimiento en 2000 pares aleatorios no redundantes de genes codificantes más cercanos. Para generar un conjunto de correlaciones entre pares de ARNm aleatorios, se calculó una matriz de correlación de Pearson por pares entre todos los genes, y se seleccionaron 100 k pares aleatorios de ella (excluyendo los redundantes).

Correlación entre la expresión génica y los rasgos fisiológicos

Todas las matrices cromáticas se generaron utilizando la función heatmap.2 de R, del paquete gplots. No se aplicó ninguna escala. Todo el agrupamiento se realizó utilizando la función de R hclust. Los rasgos fisiológicos se correlacionaron usando el procedimiento de Spearman, y el agrupamiento se realizó usando la distancia euclidiana y el agrupamiento de ligamiento completo. La correlación entre los rasgos fisiológicos y la expresión génica se calculó usando el procedimiento de Spearman, comparando 2 vectores que contenían 8 valores de expresión génica y 8 valores de medida de rasgos, respectivamente. Se realizaron agrupamientos horizontales y verticales de los valores de expresión y de rasgos, utilizando el procedimiento de Spearman para la correlación y agrupamiento de ligamiento promedio. Las gráficas de densidad de la especificidad cardíaca por categoría utilizaron las mismas puntuaciones HS descritas anteriormente y se realizaron utilizando el paquete de R gplots, función ggplot.

TransMap

El archivo GTF que contiene los ARNlnc novedosos para transmapear de ratón a humano se convirtió a un archivo psl utilizando las utilidades gtfToGenePred y genePredToPsl. A continuación, se utilizó la utilidad pslMap con el nuevo archivo psl y la alineación de cadena de ENCODE hg19.mm9.all.chain descargada del sitio web de UCSC. Los ortólogos descubiertos por pslMap se filtraron a continuación usando pslCDnaFilter con la opción -globalNearBest = 0,005 y -minCover = 0,2. Los 4 programas independientes utilizados anteriormente se descargaron de los servicios de UCSC.

Visualización en UCSC

Los archivos Bigwig se generaron utilizando el paquete BEDtools, versión 2.17.0 a partir de los archivos BAM generados por Tophat. La herramienta utilizada fue genomeCoverageBed, con las opciones "-bg", "-ibam" y "-scale". Los factores de tamaño utilizados para escalar se calcularon utilizando DESeq (como se describe anteriormente). Los archivos Bigwig se cargaron a continuación en un servidor ftp y el enlace se cargó en el navegador genómico UCSC.

Análisis de OG: enriquecimiento para temas biológicos

Las listas de genes se enviaron en línea a la herramienta de agrupación de anotaciones funcionales DAVID utilizando parámetros y bases de datos predeterminados.

Procedimientos en humanos

Todo el material humano se obtuvo durante un muestreo de rutina utilizado con propósitos clínicos y se almacenó de forma codificada y disponible para propósitos de investigación de acuerdo con la Declaración de Helsinki y el comité ético del Centro Médico de la Universidad de Maastricht. Se obtuvieron biopsias del tabique ventricular derecho durante el muestreo clínico de rutina de pacientes con miocardiopatía congestiva (MCC) idiopática y fracción de eyección disminuida sin inflamación cardíaca. Los controles (n = 6) consistieron en pacientes con taquiarritmias ventriculares idiopático pero con una fracción de eyección normal y ausencia de inflamación sistémica o cardíaca en el momento de la biopsia. Se obtuvieron biopsias del ventrículo izquierdo de pacientes con estenosis aórtica (EA) y de pacientes control sometidos a injerto de derivación aortocoronaria (IDAC) (tabla Y compl.). Las biopsias cardíacas se ultracongelaron inmediatamente para el aislamiento del ARN total con el kit de aislamiento de miARN miRVana (Ambion, Austin, TX). El ARN total se retrotranscribió usando iSCript (Bio-Rad, Hercules, CA) y se realizó PCR cuantitativa con SYBR Green en un iCycler de Bio-Rad.

Análisis estadístico

Los datos de todo el documento se expresan como media ± EEM. Se utilizó un ANOVA unidireccional para someter a prueba la significación de las comparaciones de datos entre grupos experimentales, con valores de p < 0,05 considerados como significativos.

Resultados

Identificación global de ARNInc expresados en el corazón y regulados durante el infarto de miocardio

En primer lugar, los autores de la invención se propusieron caracterizar la regulación transcripcional global durante la adaptación del miocardio al estrés tanto para el transcriptoma codificante como para el no codificante. Los autores de la invención utilizaron un modelo fisiopatológico bien caracterizado de estrés cardíaco en el ratón, a saber, infarto de miocardio obtenido por ligadura de la arteria descendente anterior izquierda. Los autores de la invención identificaron ARNlnc expresados en el corazón de ratón adulto infartado empleando un enfoque de secuenciación de ARN (PolyA RNA-Seq) y reconstrucción ab initio del transcriptoma. Se utilizó la secuenciación masivamente paralela basada en Illumina para obtener lecturas de extremos emparejados (2 x 100 pb) de colecciones experimentales y se utilizó Cufflinks () para realizar el ensamblaje de transcritos ab initio en lecturas de extremos emparejados cotejadas.

Este análisis reconstruyó 17.584 transcritos multiexónicos, de los cuales 15.075 (2204 reguladas por incremento y 1338 reguladas por disminución) corresponden a genes codificantes de proteínas anotadas de la Universidad de California Santa Cruz (UCSC) (véase Ounzain S, et al., 2014). La cartera de anotaciones de ARNlnc de la invención identificó 2509 ARNlnc multiexónicos (> 200 pb). Había 988 (67 regulados por incremento y 66 regulados por disminución) ARNlnc anotados en UCSC y 1521 (86 regulados por incremento y 225 regulados por disminución) ARNlnc novedosos sin anotaciones previas, que englobaban todos los tipos de locus de ARNlnc conocidos (los datos se muestran ahora). Para verificar la naturaleza no codificante de los ARNlnc candidatos novedosos de la invención, los autores de la invención utilizaron el algoritmo de puntuación potencial de codificación de GeneID y encontraron que estos transcritos novedosos tienen un potencial mínimo de codificación de proteínas comparable a los ARNlnc anotados en UCSC (véase Ounzain S, et al., 2014). Además, los ARNlnc novedosos y ARNlnc de UCSC se expresaron en niveles significativamente más bajos que los genes codificantes (figura 1B). Los exones de ARNlnc de UCSC estaban menos conservados que los exones codificantes, aunque los promotores estaban igualmente conservados (figura 1B).

Los ARNlnc novedosos son específicos del corazón y próximos a los genes del desarrollo cardíaco

La mayoría de los ARNlnc identificados en el análisis de la invención representan ARNlnc novedosos que han escapado previamente a la anotación. Los autores de la invención alinearon 17 conjuntos de datos de RNA-Seq de ENCODE no cardíacos de ratón (Mouse et al., 2012) y encontraron que un 16 % de los ARNm de UCSC y un 23 % de los ARNlnc de UCSC se clasificaron como específicos del corazón (véase Ounzain S, et al., 2014). Por el contrario, un 38 % de los ARNlnc novedosos eran específicos del corazón, un enriquecimiento significativo frente a los ARNm y ARNlnc de UCSC. Además, los ARNlnc novedosos expresados diferencialmente eran significativamente más específicos del corazón que todas las clases de transcritos, y un 60 % de estos ARNlnc novedosos se clasificaban como específicos del corazón (véase Ounzain S, et al., 2014). Se ha demostrado que los ARNlnc regulan la expresión génica codificante tanto en cis como en trans. Si la regulación en cis fuera común, cabría esperar que los genes codificantes proximales también fueran más específicos del corazón. Respaldando esta idea, los autores de la invención encontraron que los genes codificantes proximales superpuestos situados en dirección 5' o 3' eran significativamente más específicos del corazón que toda la colección de genes codificantes. Además, el análisis de ontología génica de estos genes codificantes proximales reveló un enriquecimiento significativo de los procesos biológicos asociados con el desarrollo del corazón, la función cardíaca y la regulación transcripcional. De forma interesante, los ARNlnc novedosos expresados diferencialmente se asociaron más con el control transcripcional, lo que sugiere que los ARNlnc novedosos expresados modulados pueden estar implicados en la reprogramación transcripcional observada en la remodelación del corazón.

El transcriptoma cardíaco está altamente correlacionado con los rasgos fisiológicos cardíacos

Los autores de la invención correlacionaron el transcriptoma cardíaco con rasgos fisiológicos derivados de la ecocardiografía. Tanto el transcriptoma codificante como el no codificante se correlacionan estrechamente con la fisiología cardíaca (figuras 1). Globalmente, los ARNlnc novedosos presentaron mejor correlación que los ARNlnc de UCSC con todos los rasgos fisiológicos evaluados. Para obtener una visión molecular más profunda y potencialmente identificar las vías moleculares asociadas con los rasgos fisiológicos, los autores de la invención ejecutaron un agrupamiento no supervisado y posterior análisis adicional de los genes codificantes de UCSC y de los ARNlnc novedosos. Los autores de la invención identificaron cuatro agrupamientos tanto para transcritos codificantes (figura 1A-B) como para transcritos de ARNlnc novedosos (figura 1C-D). En cada caso, estos consistieron en un agrupamiento que se correlacionó positivamente con la función cardíaca y negativamente con los parámetros de remodelación, un agrupamiento correlaciones inversas a las anteriores y dos agrupamientos con correlaciones intermedias no específicas. El análisis de ontología génica (OG) y de especificidad del corazón se ejecutó en agrupamientos individuales, con el análisis de OG ejecutándose en los genes codificantes más proximales con respecto a los ARNInc novedosos. En el grupo de genes codificantes, el agolpamiento más específico del corazón fue el Agolpamiento 2 (figura 1E), que se correlacionó positivamente con los rasgos funcionales cardíacos y se asoció con genes involucrados en la biología mitocondrial (figura 1A). El agrupamiento menos específico del corazón (Agrupamiento 4) se correlacionó positivamente con la remodelación y se asoció con genes involucrados en la cicatrización y en la matriz extracelular (figura 1A). Dentro de los ARNlnc novedosos, el agrupamiento más específico del corazón, es decir, el Agrupamiento 4 (figura 1F), se correlacionó de nuevo positivamente con rasgos asociados a la función cardíaca. Los genes codificantes proximales del ARNlnc novedoso del Agrupamiento 4 se enriquecieron con procesos asociados al desarrollo del corazón (figura 1C). Dado que es probable que los ARNlnc novedosos que se agrupan específicamente con rasgos fisiológicos particulares estén involucrados en procesos biológicos asociados con dichos rasgos, estos hallazgos indicaron que los ARNlnc novedosos dentro de este agrupamiento podrían representar una clase de reguladores cardíacos de programas génicos de desarrollo, que se reactivaron en el miocardio dañado. Finalmente, los agrupamientos menos específicos del corazón fueron uno y dos, lo que se correlacionó positivamente con rasgos de remodelación.

Estos datos demostraron que la agrupación no supervisada de transcritos pudo distinguir rasgos fisiológicos. Además, indicó que los ARNlnc podrían representar marcadores específicos de rasgos fisiológicos particulares. Para someter esto a prueba, los autores de la invención compararon las distribuciones de correlación para cada gen codificante de UCSC y el agrupamiento de ARNlnc novedosos con cada uno de los siguientes rasgos; fracción de eyección (FE), grosor del tabique interventricular (TIV) en sístole, trazado de infarto de miocardio (trazado IM) y diámetro interno del ventrículo izquierdo (DIVI) en sístole (figura 1B y D). Los Agrupamientos 2 y 4 de genes codificantes de UCSC se correlacionaron fuertemente con todos estos rasgos en comparación con los agrupamientos no específicos (Agrupamientos 1 y 3) (figura 1B). Se observó un patrón similar de correlación con los agrupamientos 2 y 4 de ARNlnc novedosos (figura 1D). Sin embargo, el Agrupamiento 1 de ARNlnc novedosos fue en particular interesante, ya que presentó una mala correlación con DIVI, FE y trazado IM, pero una buena correlación con TIV, que está típicamente relacionado con FE3. Esta característica única es probablemente una consecuencia del contexto exquisito y de la expresión específica de tipo celular de los ARNlnc, y tiene implicaciones interesantes para la utilización de ARNlnc novedosos como biomarcadores.

Inferir funciones para ARNlnc novedosos en base a patrones de estado de cromatina de desarrollo

La remodelación cardíaca patológica se asocia con la reactivación global del programa génico fetal. Los autores de la invención razonaron que muchos ARNlnc novedosos probablemente representan genes "fetales" con funciones importantes durante la cardiogénesis. Para investigar esto, los autores de la invención utilizaron datos de ChIP-Seq generados en un sistema de diferenciación dirigida que recapituló la diferenciación progresiva de células madre embrionarias (ESC) de ratón en cardiomiocitos (CM) diferenciados (Wamstad et al., 2012).

Un estudio previo demostró que los genes coexpresados durante la diferenciación cardíaca se podrían agrupar funcionalmente en base a diferentes patrones de estado de cromatina (Wamstad et al., 2012). Cada subgrupo de genes parecía estar involucrado en distintos procesos biológicos, incluyendo la señalización, el metabolismo y la contracción del músculo cardíaco. Los autores de la invención razonaron que era probable que los ARNlnc novedosos que compartían patrones de cromatina específicos como los descritos para los genes codificantes estuvieran involucrados en procesos biológicos comparables, proporcionando por tanto una medida indirecta basada en cromatina no sesgada para anotar funcionalmente ARNlnc novedosos. Los autores de la invención cotejaron los patrones de cromatina predeterminados (agrupamientos de ChIP 1 a 34) con los promotores de ARNlnc novedosos (y genes anotados en UCSC) durante la diferenciación de células ES. Los autores de la invención clasificaron los ARNlnc novedosos en base al patrón de cromatina con el que estaban asociados e infirieron una función biológica basada en los genes codificantes y los procesos biológicos previamente vinculados a cada agrupamiento (véase Ounzain S, et al., 2014). Para mayor claridad, los autores de la invención presentaron nueve agrupamientos de ChIP e infirieron procesos biológicos asociados con cada una de las clases de transcritos de la invención. Los agrupamientos de ChIP 1 y 3 se asocian con procesos de desarrollo no cardíacos y constitutivos ubicuos (véase Ounzain S, et al., 2014). Los genes codificantes y ARNlnc de UCSC se enriquecieron dentro de estos agrupamientos, mientras que los ARNlnc novedosos disminuyeron. Por otra parte, los ARNlnc novedosos se enriquecieron en agrupamientos de ChIP 23, 24, 25 y 26 que se asocian con procesos funcionales y de desarrollo cardíacos, incluyendo términos de fibra contráctil, disco Z y desarrollo cardíaco (véase Ounzain S, et al., 2014).

Los autores de la invención también identificaron agrupamientos de ChIP que se enriquecieron o agotaron en ARNlnc novedosos regulados por incremento y por disminución después de un infarto de miocardio, proporcionando una visión funcional del papel que desempeñan los ARNlnc novedosos en esta respuesta (véase Ounzain S, et al., 2014). Los ARNlnc novedosos de los agrupamientos de ChIP 23 y 24 se enriquecieron en ARNlnc regulados por disminución después del infarto. Estos agrupamientos se asocian con la maduración de cardiomiocitos y genes sarcoméricos (por ejemplo, Myoz2, Myl2). El enriquecimiento de ARNlnc novedosos de los agrupamientos de ChIP 23 y 24 en ARNlnc regulados por disminución podría ser indicativo de la reactivación del programa génico fetal en la zona fronteriza tras el infarto y/o de una pérdida de cardiomiocitos maduros. Además, los agrupamientos de ChIP enriquecidos en ARNlnc novedosos regulados por incremento incluyeron el agrupamiento 18, que se asocia con respuestas inmunitarias e inflamatorias (por ejemplo, IL17b), y el agrupamiento 28, que se asocia con la homeostasis del calcio y la señalización del receptor acoplado a proteína G (por ejemplo, Gnb3), procesos que normalmente se activan en la zona fronteriza del corazón infartado. Finalmente, respaldando aún más la idea de que los ARNlnc novedosos de la invención pueden ser transcritos asociados al desarrollo cardíaco, los autores de la invención los cotejaron de buena fe con una lista de potenciadores validados in vivo específicamente activos dentro del corazón de ratón E11.5. Los autores de la invención encontraron que siete de los ARNlnc novedosos de la invención se corresponden con potenciadores cardíacos validados, incluyendo Novlnc6 (véase más abajo) que se corresponde con mm77, un potenciador cardíaco específicamente activo dentro del ventrículo izquierdo embrionario (véase Ounzain S, et al., 2014).

Validación de ARNlnc novedosos

Para confirmar los transcritos candidatos de la invención, los autores de la invención validaron múltiples transcritos novedosas no anotados mediante PCR cuantitativa ultrarrápida (qPCR). Se seleccionaron 17 candidatos novedosos de alta prioridad, y se cuantificó su expresión en las zonas fronteriza (ZF) y remota (ZR), uno y siete días después del infarto. Los ARNlnc novedosos presentaron diversas cinéticas de expresión tanto en ZF como en ZR durante las fases aguda y crónica (figura 2A). Muchos ARNlnc se regularon por disminución; por ejemplo, Novlnc6 (SEQ ID NO: 48) y 15 (SEQ ID NO: 97), algunos fueron inducidos transitoriamente el día 1 tanto en ZR como en ZF (Novlnc35), mientras que otros se incrementaron gradualmente en ZF y ZR (Novlnc74). Estos distintos patrones cinéticos y espaciales de expresión demuestran que los ARNlnc novedosos se regulan dinámicamente en respuesta al infarto de miocardio, y sugieren que probablemente desempeñen papeles importantes en el proceso de adaptación.

Los dos tipos de células principales dentro del corazón adulto son los cardiomiocitos (CM) y los fibroblastos (FB) cardíacos y ambos son importantes en la remodelación desadaptativa. Para caracterizar mejor los ARNlnc novedosos, los autores de la invención cuantificaron su expresión en CM y FB aislados del corazón de ratones recién nacidos. Los ARNlnc seleccionados eran altamente específicos de CM (Novlnc35; SEQ ID NO: 99), se expresaban igualmente en ambos tipos de células (Novlnc61, SEQ ID NO: 101) o se expresaban principalmente en FB (figura 2B). La función de ARNlnc también depende de la localización subcelular. Los ARNlnc que actúan en cis (es decir, los a Rn asociados a potenciadores) tienden a estar más enriquecidos en el núcleo, mientras que los ARNlnc implicados en procesos postranscripcionales y de traducción tienden a ser más citoplásmicos. Por lo tanto, se aislaron fracciones de ARN nuclear y citoplásmico de CM y FB neonatales (figura 2C). Los ARNlnc validados se enriquecieron en fracciones nucleares (Novlnc174; SEQ ID NO: 28) o citoplásmicas (Novlnc61; SEQ ID NO: 101), además de estar igualmente presentes en ambas (Novlnc15). De forma interesante, algunos ARNlnc mostraron enriquecimiento nuclear frente a citoplásmico diferencial en CM y FB (Novlnc90, -49, -11; SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 25). Esto puede tener relevancia funcional para los roles desempeñados en estos diferentes tipos de células. Los autores de la invención también correlacionaron la expresión de estos ARNlnc validados con rasgos fisiológicos el día 1 y el día 7 de muestras de control y muestras de tejido IM (figura 2D). La mayoría de los ARNlnc mostraron una buena correlación con rasgos fisiológicos tanto en la zona fronteriza como en la remota. De forma interesante, algunos de los ARNlnc novedosos de la invención mostraron mejor correlación que los genes de estrés con la función cardíaca y la remodelación.

Muchos de los ARNlnc novedosos validados se asociaron con cambios dinámicos en los estados de cromatina durante la cardiogénesis en células ES, lo que sugiere que pueden desempeñar funciones como genes de desarrollo "fetales" (figura 2F). Para confirmar esto, las células ES de ratón se diferenciaron a través de la formación de cuerpos embrioides utilizando el modelo de gotículas colgantes que recapitula el desarrollo cardíaco embrionario in vitro. Los ARNlnc novedosos se expresaron dinámicamente durante la diferenciación cardíaca, con correlación de la expresión con los cambios dinámicos en los estados de cromatina observados en sus promotores (figura 2E y F). Algunos ARNlnc se indujeron tarde durante la diferenciación en la etapa de CM (Novlnc44, -11, -32; SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 98, figura 2E y F) y, por lo tanto, es probable que estén implicados en la diferenciación de CM terminal y la maduración. Los ARNlnc novedosos que presentan este perfil se cotejaron con los agrupamientos de ChIP 24 y 25, que se prevé que se asocien con el desarrollo del corazón, el disco Z y la función del sarcómero y los procesos asociados a la maduración cardíaca. Otros ARNlnc se expresaron al máximo en las etapas MES y CPC (Novlnc49, SEQ ID NO: 103) y es probable que estén implicados en un proceso de desarrollo más específico.

Para evaluar si los ARNlnc novedosos se podrían asociar a una función específica que implique la regulación de genes codificantes de proteínas cardíacas, los autores de la invención se centraron en Novlnc6, que cumple varios criterios y presenta características únicas prototípicas de los ARNlnc identificados en este estudio. Además, Novlnc6 (SEQ ID NO: 48) comparte un patrón de cromatina en células ES diferenciadas con el ligando de señalización cardíaca clave BMP10, lo que sugiere que Novlnc6 podría estar implicado en vías reguladoras similares. Como modelo experimental, los autores de la invención utilizaron CM de ratones recién nacidos primarios aislados que expresan niveles elevados de Novlnc6. Las células se transfectaron con oligonucleótidos antisentido modificados (Gápmeros) dirigidos a Novlnc6 (figura 2G). Se examinaron FT cardíacos clave y genes diana cardíacos posteriores involucrados en la señalización del estrés, el aparato contráctil y la señalización de BMP10. Esta cribado permitió identificar el ARNm Nkx2.5 como una diana potencial de la regulación mediada por Novlnc6. Nkx2.5 codifica un FT cardíaco fundamental, situado en una posición elevada en la jerarquía reguladora de las RRG cardíacas y crítico para la regulación de otros FT cardíacos y genes de diferenciación, estructurales y de maduración cardíacos posteriores (Bruneau, 2002). Además, se ha demostrado que Nkx2-5 está corriente abajo de la señalización de BMP10 durante el desarrollo cardíaco (Huang et al., 2012). Novlnc6 reguló positivamente Nkx2.5, lo que respalda la idea de que la colección de ARNInc novedosos de la invención contiene transcritos reguladores funcionalmente importantes.

Regulación incorrecta de ortólogos humanos en patología cardíaca

Teniendo en cuenta las características únicas asociadas con los ARNlnc novedosos, los autores de la invención buscaron ortólogos humanos. Por lo tanto, los autores de la invención cotejaron el catálogo de ARNlnc novedosos de la invención con el genoma humano utilizando TransMap, una herramienta de alineación de ARNm entre especies. T ransMap coteja las secuencias de ARNlnc novedosos de ratón de la invención con todo el genoma humano utilizando alineaciones BLASTZ sinténicas que consideran la conservación del orden de genes y la sintenia. De los 311 ARNlnc novedosos modulados, aproximadamente un 72 % se cotejaron con seguridad con el genoma humano. Para validar y caracterizar los ortólogos esperados, los autores de la invención diseñaron cebadores englobados dentro de los supuestos exones de tres ortólogos humanos, correspondientes a Novlnc6, -23 y -44 (SEQ ID NO: 48, 84, 100; figura 3A) de ratones. Se ejecutó una RT-PCR cuantitativa en ARN aislado del ventrículo izquierdo de un macho sano. Los tres supuestos ortólogos humanos se amplificaron y expresaron fácilmente a niveles relativamente altos (figura 3A). Para determinar las potenciales funciones de estos ortólogos en la patología cardíaca, los autores de la invención examinaron su expresión cardíaca en dos patologías cardíacas humanas independientes. Se evaluaron pacientes con miocardiopatía congestiva (MCC) y con estenosis aórtica (EA). Estas dos cohortes presentaron funciones cardíacas alteradas y remodelación desadaptativa asociada como se esperaba para dichas patologías. Además, los genes marcadores de estrés cardíaco también se expresaron diferencialmente (figura 3C). En pacientes con MCC, los tres ortólogos humanos se modularon significativamente con Novlnc6, se regularon por disminución con Novlnc44 y se regularon por incremento con Novlnc23 (figura 3B). De forma interesante, el gen diana esperado de Novlnc6, es decir, el FT cardíaco clave Nkx2-5, también se reguló significativamente por disminución en pacientes con MCC. En contraste con la MCC, los pacientes con EA no se asociaron con la expresión diferencial de Novlnc6 o Novlnc23 ni con el gen diana esperado de Novlnc6, Nkx2-5. Novlnc44, sin embargo, se reguló significativamente por disminución (figura 3B), de forma comparable a su modulación en MCC.

Ejemplo 2

Expresión de ARNlnc específica de células y efectos de la regulación por disminución de ARNlnc en fibroblastos cardíacos y cardiomiocitos in vitro

Se obtuvo ARN de cardiomiocitos y fibroblastos cardíacos aislados de corazones de ratones recién nacidos. La expresión de ARNlnc novedosos se cuantificó mediante RT-PCR en las dos poblaciones de células. Se presentan las proporciones en escala logarítmica de la expresión de cardiomiocitos frente a fibroblastos cardíacos de ARNlnc (los valores inferiores a 1 corresponden al enriquecimiento en fibroblastos; los valores superiores 1 corresponden al enriquecimiento en cardiomiocitos). Las barras representan la media ± EEM (n = 3) *p < 0,05. Los dos ARNlnc resaltados, lnc_019010 (enriquecido en fibroblastos) y lnc_033521 (también llamado Lnc-Dedbt) (enriquecido en cardiomiocitos), se han estudiado más extensamente (figura 4A).

La expresión de ARNlnc novedosos en fibroblastos aislados de la cola, el pulmón y el corazón de ratones recién nacidos se ha cuantificado mediante RT-PCR. La expresión de lnc_019010 en fibroblastos cardíacos se enriquece en aproximadamente 60 veces en comparación con las otras fuentes de fibroblastos. Estos datos muestran la alta especificidad celular de este ARNlnc (figura 4B).

Fibroblastos cardíacos aislados de ratones recién nacidos se transfectaron con oligonucleótidos antisentido modificados (Gápmero, 5'-AGGTGTGCGATAGAG-3') dirigidos a lnc_019010 para su degradación. Los Gápmeros se transfectaron a una concentración de 50 nM y el ARN se recogió 24 h después de la transfección. En comparación con las células transfectadas de Gápmeros de control (secuencia revuelta) (barras negras), las células de Gápmeros específicas de lnc_019010 (barras grises) muestran una fuerte reducción de la expresión de ARNlnc diana y también del gen codificante más cercano. De forma interesante, la regulación por disminución de este ARNlnc específico de fibroblastos cardíacos afecta a la expresión de genes codificantes de fibroblastos importantes tales como a-actina del músculo liso (a-SMA), colágeno I y III (Col1a1, Col3a1), fibronectina (Fn1) y periostina (Pstn) y factor de crecimiento transformante p1 y p2 (Tgfpl, Tgfp2) y factor de crecimiento del tejido conjuntivo (Ctgf). Estos datos, mostrados en la figura 4C, sugieren que lnc_019010 está involucrado en la diferenciación de fibroblastos cardíacos y representa una diana terapéutica para limitar la fibrosis. Las barras representan la media ± EEM (n = 4) *p < 0,05.

Cardiomiocitos aislados de ratones recién nacidos se transfectaron con oligonucleótidos antisentido modificados (Gápmero) (SEQ ID NO: 147: 5'-TGCTTGCTAGTGTGGT-3') dirigidos a lnc_033521 para su degradación. Los Gápmeros se transfectaron a una concentración de 50 nM y el ARN se recogió 24 h después de la transfección. En comparación con el Gápmero de control (secuencia revuelta) (barras negras), las células de Gápmeros específicas de lnc_033521 (barras grises) muestran una fuerte reducción de la expresión de ARNlnc diana. Además, la regulación por disminución de este ARNlnc afecta a la expresión de un gen importante que codifica el canal cardíaco fundamental, tal como Scn5a (canal de sodio controlado por voltaje de tipo V, subunidad alfa) y Kcnq1 (canal de potasio controlado por voltaje). Estos datos muestran que lnc_033521 tiene una función importante en el sistema de conducción del corazón. Figura 4D; las barras representan la media ± EEM (n = 4) *p < 0,05.

Regulación por disminución de ARNInc in vivo

Ratones BL6/C7 de 12 semanas de edad recibieron una inyección intraperitoneal de Gápmero (20 mg/kg).

Las imágenes ecocardiográficas (eje de visión largo) de los corazones de los ratones 4 días después de la inyección de Gápmero se muestran en la figura 5A. Panel izquierdo, corazón de un ratón que recibió una inyección de Gápmero de control (secuencia revuelta). Panel derecho, corazón de un ratón que recibió una inyección de Gápmero dirigido contra lnc_019010. El gráfico de barras muestra un incremento significativo en el grosor del TIV (tabique intraventricular) y la PPVI (pared posterior del ventrículo izquierdo), y una disminución significativa del DIVI (diámetro interno del ventrículo izquierdo) y del volumen del VI (volumen del ventrículo izquierdo) en ratones que recibieron una inyección de Gápmero dirigido a lnc_019010 (SEQ ID NO: 148: 5'-AGGTGTGCGATAGAG-3') (barras grises) en comparación con el Gápmero de control (secuencia revuelta) (barras negras). Estos datos muestran que la disminución de lnc_019010 en el corazón in vivo indujo un incremento significativo de la masa cardíaca. La fracción de eyección (FE) y la fracción de acortamiento (FA) se incrementan en los ratones que reciben el Gápmero dirigido a lnc_019010, lo que indica que la función cardíaca se incrementa en este caso.

Se obtuvo ARN del corazón de ratones que recibieron una inyección de Gápmero dirigido a lnc_033521 o de Gápmero de control (secuencia revuelta). El gráfico representado en la figura 5B, a la izquierda, muestra la regulación por disminución de la expresión de lnc_033521 en ratones que recibieron una inyección de Gápmero dirigido a lnc_033521 (barra gris) en comparación con los ratones que recibieron una inyección de Gápmero de control (secuencia revuelta) (barra negra). Paneles superiores: parámetros electrocardiográficos que muestran el efecto de la regulación por disminución de lnc_033521 sobre la electrofisiología cardíaca. La frecuencia cardíaca se reduce después de la regulación por disminución de lnc_033521. Paneles inferiores: correlación entre la expresión de lnc_033521 y las mediciones electrocardiográficas de la frecuencia cardíaca (izquierda) y del área de la onda P (derecha), medida en 22 cepas de ratón diferentes. Estos datos muestran que lnc_33521 desempeña un papel en la regulación de importantes parámetros electrofisiológicos cardíacos.

Referencias

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McBride et al., (1983) Tetrahedron Lett. 24:246-248

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para diagnosticar una patología cardíaca en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

a) medir, directa o indirectamente, los niveles de abundancia de ADNc, ARN o ADN amplificados, o cantidades o actividades de ARN, el nivel de una pluralidad de biomarcadores en una muestra biológica derivada del sujeto, en el que la pluralidad de biomarcadores comprende un biomarcador de ARNlnc que tiene una secuencia de ADNc seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 33 y una variante que comparte al menos un 90 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la misma; y

b) analizar el nivel de dicho biomarcador de ARNlnc o variante que comparte al menos un 90 % de identidad de secuencia de nucleótidos con el mismo, junto con los respectivos intervalos de valores de referencia para dicho biomarcador de ARNlnc,

en el que la expresión diferencial del biomarcador de ARNlnc en la muestra biológica en comparación con el biomarcador de ARNlnc en una muestra de control de un sujeto normal indica que el sujeto tiene una patología cardíaca.

2. El procedimiento para diagnosticar una patología cardíaca de la reivindicación 1, en el que los niveles de dicho biomarcador de ARNlnc o variante que comparte al menos un 90 % de identidad de secuencia de nucleótidos con el mismo se detectan usando un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en análisis de micromatrices , secuenciación de ADN/ARN, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscriptasa (RT-PCR), transferencia Northern, análisis en serie de la expresión génica (SAGE), inmunoanálisis y espectrometría de masas.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la muestra biológica derivada del sujeto se selecciona del grupo que consiste en sangre completa, suero, plasma, semen, saliva, lágrimas, orina, materia fecal, sudor, frotis bucales, piel, tejido cardíaco, hígado, tejido cerebral, líquido amniótico, tejido nervioso y cabello.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la patología cardíaca se selecciona del grupo que consiste en engrosamiento del tabique interventricular (TIV), insuficiencia cardíaca, FE, DIVI, IM, ICFEr, miocarditis vírica, braquicardia, arritmia, irregularidades cardíacas congénitas, miocardiopatía diabética, miocardiopatía idiopática y congestiva, patologías caracterizadas por anomalías, patologías caracterizadas por remodelación tisular, patologías caracterizadas por función afectada, patologías caracterizadas por trastornos del hemicardio derecho, patologías caracterizadas por arritmias, patologías caracterizadas por intoxicación, patologías caracterizadas por cáncer, patologías caracterizados por trastornos neurológicos, patologías caracterizadas por traumatismos, patologías caracterizadas por un cambio en la hemodinámica.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que una expresión incrementada del ARNlnc que tiene una secuencia de ADNc seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 33 y una variante que comparte al menos un 90 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la misma en la muestra biológica en comparación con los niveles de expresión de dichos ARNlnc en una muestra de control de un sujeto normal indica que el sujeto sufrió un infarto de miocardio o padece una patología cardíaca asociada con una remodelación desadaptativa del miocardio.

6. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la insuficiencia cardíaca es una insuficiencia cardíaca con fracción de eyección conservada o reducida.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el sujeto es un humano.

8. Una composición que comprende un modulador de un ARNlnc que tiene una secuencia de ADNc seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 33 y una variante que comparte al menos un 90 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la misma, en el que el modulador es un anticuerpo que se une a dicho ARNlnc o variante del mismo o un RNA enzimáticamente activo dirigido a dicho ARNlnc o variante del mismo y seleccionados del grupo que consiste en un miARN, un ARNip bicatenario, un piARN, un ARNnh, un ARNnp, ARNip por endoribonucleasas, ARNhp, aptámeros de ARN y un Gápmero.

9. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un modulador de un ARNlnc que tiene una secuencia de ADNc seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 33 y una variante que comparte al menos un 90 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la misma, en el que el modulador es un anticuerpo que se une a dicho ARNlnc o variante del mismo o un RNA enzimáticamente activo dirigido a dicho ARNlnc o variante del mismo y seleccionados del grupo que consiste en un miARN, un ARNip bicatenario, un piARN, un ARNnh, un ARNnp, ARNip por endoribonucleasas, ARNhp, aptámeros de ARN y un Gápmero, opcionalmente en combinación con vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

10. La composición de la reivindicación 8 o la composición farmacéutica de la reivindicación 9, en la que el Gápmero es un oligonucleótido Gápmero antisentido modificado que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 148.

11. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un modulador de un ARNlnc que tiene una secuencia de ADNc seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 33 y una variante que comparte al menos un 90 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la misma, en el que el modulador es un anticuerpo que se une a dicho ARNlnc o variante del mismo o un RNA enzimáticamente activo dirigido a dicho ARNlnc o variante del mismo y seleccionados del grupo que consiste en un miARN, un ARNip, un piARN, un ARNnh, un ARNnp, ARNip por endoribonucleasas, ARNhp, aptámeros de ARN y un oligonucleótido antisentido, opcionalmente en combinación con vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables para su uso en la tratamiento de una patología cardíaca.

12. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 11, en la que el modulador es un ARN enzimáticamente activo que es un oligonucleótido Gápmero antisentido modificado que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 148.

13. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 11 o 12, en la que la patología cardíaca se selecciona del grupo que consiste en engrosamiento del tabique interventricular (TIV), insuficiencia cardíaca, FE, DIVI, IM, ICFEr, miocarditis vírica, braquicardia, arritmia, irregularidades cardíacas congénitas, miocardiopatía diabética, miocardiopatía idiopática y congestiva, patologías caracterizadas por anomalías, patologías caracterizadas por remodelación tisular, patologías caracterizadas por función afectada, patologías caracterizadas por trastornos del hemicardio derecho, patologías caracterizadas por arritmias, patologías caracterizadas por intoxicación, patologías caracterizadas por cáncer, patologías caracterizados por trastornos neurológicos, patologías caracterizadas por traumatismos, patologías caracterizadas por un cambio en la hemodinámica.

14. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 9-10 o la composición farmacéutica para su uso de las reivindicaciones 11 a 13, en las que la vía de administración de dicha composición farmacéutica se selecciona del grupo que consiste en administración parenteral, tal como subcutánea (SC), intraperitoneal (IP), intramuscular (IM), intravenosa (IV) o por infusión, oral y pulmonar, nasal, tópica, transdérmica y supositorios.

15. Un kit que comprende

i) la composición de la reivindicación 8, o

ii) la composición farmacéutica de las reivindicaciones 9-10 o 14, o

iii) al menos un anticuerpo que se une selectivamente a un biomarcador de ARNlnc que tiene una secuencia de ADNc como se establece en SEQ ID NO: 33, o al menos un conjunto de cebadores de PCR que hibrida selectivamente con el biomarcador de ARNlnc para amplificar dicho biomarcador de ARNlnc.

16. Una micromatriz que comprende una pluralidad de sondas que hibridan específicamente con uno o más ARNlnc que tienen una secuencia de ADNc seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 33 y una variante que comparte al menos un 90 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la misma.

17. Un ARNlnc que tiene una secuencia de ADNc seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 33 y una variante que comparte al menos un 90 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la misma.

18. Un procedimiento para medir la regeneración de tejido cardíaco en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

b) analizar el nivel de dicho biomarcador de ARNlnc o variante que comparte al menos un 90 % de identidad de secuencia de nucleótidos con el mismo, junto con los respectivos intervalos de valores de referencia para dicho biomarcador de ARNlnc, en el que la expresión diferencial del biomarcador de ARNlnc en la muestra biológica en comparación con el biomarcador de ARNlnc en una muestra de control de un sujeto normal da una indicación de la regeneración del tejido cardíaco.

19. Un procedimiento para controlar la eficacia de agentes y/o moléculas pequeñas que pueden inducir la reprogramación cardíaca, comprendiendo el procedimiento:

a) medir, directa o indirectamente, los niveles de abundancia de ADNc, ARN o ADN amplificados, o cantidades o actividades de ARN, el nivel de una pluralidad de biomarcadores en una muestra biológica derivada del sujeto o un cultivo celular, en el que la pluralidad de biomarcadores comprende un biomarcador de ARNlnc que tiene una secuencia de ADNc seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 33 y una variante que comparte al menos un 90 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la misma; y

b) analizar el nivel de dicho biomarcador de ARNlnc o variante que comparte al menos un 90 % de identidad de secuencia de nucleótidos con el mismo, junto con los respectivos intervalos de valores de referencia para dicho biomarcador de ARNlnc, en el que la expresión diferencial del biomarcador de ARNlnc en la muestra biológica en comparación con el biomarcador de ARNlnc en una muestra de control de un sujeto normal da una indicación de la eficacia de los agentes y/o moléculas pequeñas que pueden inducir la reprogramación cardíaca.