CN109486937A - 一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法及其试剂盒 - Google Patents
一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法及其试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109486937A CN109486937A CN201811493190.XA CN201811493190A CN109486937A CN 109486937 A CN109486937 A CN 109486937A CN 201811493190 A CN201811493190 A CN 201811493190A CN 109486937 A CN109486937 A CN 109486937A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- library
- sequence
- artifial
- artificial sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法及其试剂盒，涉及ACTC1、ACTN2、MYBPC3、MYH7、MYL2、MYL3、TNNI3、TNNT2、TPM1基因的突变，目标区域为以上9基因的编码氨基酸的外显子区域及外显子上下游各20碱基区域，为保证目标区域全部覆盖，采用制备文库后，杂交探针捕获的方法获得目标区域文库，而后采用LMPCR方法扩增文库，文库纯化后，得到测序用样本文库。该建库方法步骤简单快速，有效降低了文库构建的成本，且涵盖了肥厚型心肌病的相关基因，结合illumina高通量测序仪，可快速准确得到相关基因变异，对遗传性肥厚型心肌病有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法和试剂盒。
背景技术
遗传性肥厚型心肌病(Hypertrophic Cardiomyopathy，HCM)是一种较为常见的单基因心血管疾病，也是青少年发生猝死的主要原因之一，以无其他诱因的心肌肥厚为特征，且伴有舒张功能的损伤。遗传性肥厚型心肌病的发病率约为1/500，但由于存在无症状的HCM致病变异携带者，因此，其实际患病率可能高达1/200。
HCM的主要临床症状包括呼吸短促、胸闷、心慌、心悸、黒朦以及晕厥等。大多数患者在青春期和中年期出现心肌肥厚，但也存在发生于婴幼儿期和老年期的情况。HCM为进行性疾病，具有不同的临床阶段，从无症状到极其严重的左心室重构、心衰及心源性猝死；而且其临床表型复杂，同一家庭内不同成员间的发病时间和疾病严重程度都存在显著差异。因此，对于HCM患者来说，早发现、早诊断和早治疗都可以有效的降低疾病的危害、减少猝死的发生。
此外，HCM的遗传因素主要是编码心肌肌小节及其相关蛋白的基因变异，约占已找到致病变异的HCM患者的90％以上；非肌小节基因变异占极少数，主要导致一些伴有心肌肥厚拟表型的综合征和代谢性疾病。这些相对罕见拟表型有时会伴有心脏外的临床表现，比如伴有发育迟缓的noonan综合征患者，以及伴有代谢异常的Fabry病和庞贝氏病(Pompedisease),而在未出现其他系统异常前与单纯的HCM在临床表型上有时很难区分，尤其对于相关经验不足的医生来说。这种情况下，基因检测就显示出无可比拟的优势，可在患者症状表现完全之前就明确诊断，且可以提供一定程度上的临床指导。
ACTC1(actin,alpha,cardiac muscle 1)是一种编码心肌肌动蛋白基因。ACTC1基因逐渐被认识，在心脏发育过程中起着重要作用。该基因产物是由377个氨基酸组成的42.0KDa高度保守的蛋白质。以两种形式存在，即单体和多聚体。单体的肌动蛋白是由一条多肽链构成的球形分子，又称球状肌动蛋白。多聚体则形成肌动蛋白丝，成为纤维状肌动蛋白。该蛋白单体有两个不对称域，其中较大内部的域由子域3和4组成，较小外部的域由子域1和2组成，氨基和羧基末端都位于子域1中。心肌肌动蛋白存在于肌肉组织中，是收缩装置的主要组成部分。有研究发现该基因突变可导致多种心脏结构及功能异常，已被证实是肥厚型心肌病及扩张型心肌病的重要病因。
ACTN2(actinin alpha 2)是一种编码肌动蛋白的基因。辅肌动蛋白α2由894个氨基酸组成，大小为103.8KDa。每个分子呈棒状，结构特征为反向平行的二聚体，并具有N末端肌动蛋白结合结构域(ABD)、血影蛋白样中央重复结构域和C末端"EF手"结构域.作为细胞骨架中一种重要的肌动蛋白交联蛋白,辅肌动蛋白通过与其相关蛋白包括整合素(integrins)、钙粘素(cadherin)以及细胞信号传导通路中的信号分子等。在稳定细胞粘附、调节细胞形状及细胞运动中发挥着重要作用。因此,肿瘤的发生、发展和恶化与辅肌动蛋白的结构、功能密切相关。
MYBPC3(myosin binding protein C,cardiac)是一种编码心肌肌球蛋白结合蛋白的基因。心肌肌球蛋白结合蛋白-C位于心肌肌小节中的C区，约占肌原纤维中蛋白总数的2％。该蛋白属于免疫球蛋白超家族，只在心脏中表达。其编码基因MYBPC3位于染色体11p11.2，含35个外显子，表达1274个氨基酸残基。其蛋白由11个主要子域构成，编号C0-C10。心肌肌球蛋白结合蛋白属细胞内球蛋白超家族，与肌球蛋白结合位点位于C8～C10结构域。结合了MyBP-C的肌凝蛋白和肌联蛋白，有更加稳定的肌小节结构。心肌肌球蛋白结合蛋白在C1、C2结构域之间有1个特有的N末端模序，作为cAMP依赖的蛋白激酶以及钙调蛋白依赖的蛋白激酶的作用位点。磷酸化心肌特定的模序调节心肌收缩力，故MyBP-C不仅参与心肌结构的维持，还参与细胞内信息传递，影响肌丝的舒缩运动。MYBPC3基因突变多为缺失、插入、重复等，导致产生一种缺少肌球蛋白和肌蛋白集合位点的平截蛋白，从而造成肌小节结构和功能损害。
MYH7(myosin heavy chain 7)是一种编码心脏β-肌球蛋白重链的基因。MYH7是肥厚型心肌病(HCM)最重要的致病基因，约30％-50％的HCM患者主要是由MYH7基因突变所致。心脏β-肌球蛋白重链是人心室肌球蛋白的主要成分，在心肌细胞的能量供应和维持心肌细胞内外钙离子的浓度起到非常重要的作用。MYH7基因定位于14q12，含有40个外显子，其中38个外显子参与编码含1935个氨基酸残基的蛋白质。编码的蛋白具有3个功能区：球状头部区S1、头杆结合S2和杆状尾部区，头部区包含ATP酶活性位点和与肌动蛋白结合位点以及与必须链(ELC，essentiallightchain)结合的界面，是肌球蛋白的重要功能区域。国内外已报道超过200多种单碱基突变，某些突变可表现出外显率高、症状出现早、进展快、心肌肥厚重、已出现心力衰竭甚至猝死等恶性表现。总体来说该基因的突变与家族性肥厚型心肌病、肌球蛋白贮存性肌病、扩张型心肌病和Laing早期远端肌病有关。
MYL3(myosin light chain 3)、MYL2(myosin light chain 2)是一种编码肌球蛋白轻链的基因。肌球蛋白轻链分为肌球蛋白必需轻链(essential light chain,ELC)和调节轻链(regulatory light chain,RLC)2种,是肌小节粗肌丝肌球蛋白六聚体的重要组成部分,在心肌收缩中起到重要的调节作用.前者由195个氨基酸残基构成,后者由166个氨基酸残基构成.氨基末端均被METTL 11A/NTM1甲基化而封闭.其编码基因分别为位于染色体3p21.3-p21.2的MYL3及位于染色体12q24.11的MYL2.ELC没有结合Ca2+的能力,在维持肌球蛋白头部α-螺旋构成的杠杆区的稳定性中发挥重要作用，其氨基末端可以和肌动蛋白直接作用并对肌球蛋白机动性能进行精细调节。已有研究报道，该基因突变可能会造成肥厚型心肌病的发生。
TNNI3(troponin I3)是一种编码心脏肌钙蛋白I的基因。肌钙蛋白I(TnI)与肌钙蛋白T(TnT)、肌钙蛋白C(TnC)是构成横纹肌细丝肌钙蛋白复合体的三个亚基。TnI是抑制亚单位，阻断肌动蛋白-肌球蛋白的相互作用，从而调节横纹肌松弛。该基因编码TnI-心脏蛋白，在心肌组织中唯一表达。cTnI基因全长612kb，含8个外显子，该基因突变导致家族性肥厚型型心肌病和家族性限制性心肌病。
TNNT2(troponin T2,cardiac type)是一种编码心脏肌钙蛋白T的基因，位于染色体1q32，约17kb，由17个外显子组成。肌钙蛋白T能与肌钙蛋白C、肌钙蛋白I、原肌球蛋白结合，在Ca2+调节细肌丝的活动过程中起关键作用。目前已经发现了TNNT2的30种不同的突变。在各种TNNT2基因突变(错义突变、剪接信号突变、小片段缺失)导致的HCM约占所有HCM的15％。
TPM1(tropomyosin 1)是一种编码α原肌球蛋白的基因。该基因位于染色体15q22，大小为32.7KDa，含284个氨基酸。该基因编码的产物属于原肌球蛋白家族，属于高度保守、分布广泛的肌动蛋白结合蛋白，存在于收缩系统的横纹肌和平滑肌，以及非肌肉细胞的细胞骨架。原肌球蛋白由两条平行的多肽链组成α螺旋构型，每条原肌球蛋白首尾相接形成一条连续的链同肌动蛋白细肌丝结合,正好位于双螺旋的沟(grooves)中。该基因编码的产物结构是α螺旋链，是形成横纹肌的主要原肌球蛋白，具有调节肌动蛋白和肌球蛋白之间的钙依赖相互作用的功能。该基因突变已报道与3型家族性肥厚型心肌病有关。
传统的Sanger测序技术检测ACTC1、ACTN2、MYBPC3、MYH7、MYL2、MYL3、TNNI3、TNNT2、TPM1基因的编码氨基酸的外显子区域及附近内含子区域的基因突变存在很大局限性，表现在：检测通量受到限制，该方法仅适用于少数明确突变热点的检测，而对于候选基因数量多且为候选基因的全部编码区段时难以实现的。需要消耗大量时间，且对于待检测样本的基因组DNA消耗巨大，在实践中同一样本难以获得满足检测需求的足量DNA。因而在日常实践中难以采用Sanger方法进行多基因全部编码区段的检测需求。
采用高通量基因测序技术检测ACTC1、ACTN2、MYBPC3、MYH7、MYL2、MYL3、TNNI3、TNNT2、TPM1的基因突变，需要进行测序前样本文库的制备。如在样本文库制备过程中采用多重PCR方法进行目标区域扩增，会存在扩增偏向性，导致目标区域扩增不均，而对后续测序数据产生偏向性影响。
因此，有必要寻找一种新的检测遗传性肥厚型心肌病的基因突变的方法，提高诊断准确率，降低成本和劳动强度。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法，该方法建库步骤简便快速，变异类型全面、待测目标区域覆盖完全、测序数据无偏向性、可同时对多个样本进行检测通量高。
本发明的另一目的是提供该方法获得的遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库。
本发明的另一目的是提供所述文库制备的遗传性肥厚型心肌病的基因检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供了一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库，涉及ACTC1、ACTN2、MYBPC3、MYH7、MYL2、MYL3、TNNI3、TNNT2、TPM1的基因突变。为保证目标区域全部覆盖，制备文库后采用杂交探针捕获的方法获得目标区域文库，而后采用LMPCR方法扩增文库，再进行文库纯化得到测序基因检测文库。
本发明的一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法，包括如下步骤：
(1)DNA质量标准：提供受试者样本的基因组DNA，经过核酸提取、质检后，要求DNA符合一定质控标准；
(2)文库制备：将上述符合标准基因组DNA，超声随机打断至180bp-220bp短片段，然后进行末端补平加A,连接接头，并通过PCR扩增达到一定总量的DNA文库，该文库满足illumina测序平台专用测序要求；
(3)杂交捕获：将步骤2得到的DNA文库，与疾病相关定制探针进行特异性杂交，捕获含目的区域的文库，再通过磁珠抓取、富集留下含目的区域的DNA文库，即得目标区域文库；
(4)LMPCR扩增：将步骤3得到的目标区域文库，作为LMPCR模板，加入与测序接头匹配的引物及相应试剂，进行扩增；扩增后加入磁珠纯化，即得纯化文库；
(5)文库质控：将步骤4得到的纯化文库进行质控，选择Qubit 3.0进行定量检测，Agilent2100或Agilent 4200进行定性检测，查看文库片段分布是否符合要求。
上述步骤(1)中所述的核酸提取的样本类型包括但不限于外周血、组织器官样本等，优选核酸样本为新鲜外周血。
上述步骤(1)中所述的DNA质控标准为，DNA完整性较好，无蛋白RNA污染，DNA浓度≥20ng/μL；DNA纯度：OD260/280 1.8-2.0，OD260/230>2.0；DNA总起始量:0.1ug-1ug。
上述步骤(1)中所述的核酸提取方法、DNA质控方法均按照现有技术的操作规程进行。
上述步骤(2)中将符合标准的基因组DNA进行超声随机打断，超声打断的反应体系及反应条件见表1。
表1超声打断的反应体系及反应条件
上述步骤(2)中所述的末端补平加A的反应是指DNA随机片段化至180-220bp，通过5'→3'聚合酶及3'→5'外切酶作用，进行末端补平,同时5'端进行磷酸化，其次3'加A，以便和测序接头进行连接。反应体系及反应条件见表2。
表2末端补平加A的反应体系及反应条件
上述步骤(2)中所述连接接头反应包括连接接头反应、消化反应、及纯化反应。进一步说明，所述的接头是指在DNA片段两端连接通用接头，结构为发夹环状接头，以此来提高接头连接效率。
所述的消化反应是指连接接头反应后加入消化酶反应。
所述纯化反应是指消化后的DNA文库中加入AMpureXP纯化磁珠进行片段选择，先加入部分磁珠吸附后留取上清，磁珠吸附大片段丢弃，再加入部分磁珠正常纯化洗脱，即可。
所述步骤(2)的连接接头的反应体系及反应条件件表3
表3连接接头的反应体系及反应条件
测序接头序列：5′-/5Phos/GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT C/index/A CAC TCT TTC CCT ACA CGA CGC TCT TCC GAT C*T-3′
上述步骤(2)中所述的PCR扩增反应包括PCR扩增反应及磁珠纯化，修饰后的DNA片段经过纯化后，通过特定序列引物进行扩增，并引入样本标签。样本标签为6bp碱基组成，可作为样本的唯一标识。最后得到的DNA文库含有和illumina测序平台芯片结合的特定序列P5、P7以及测序引物序列，其中P7端含有样本标签，长度6bp，其测序模板具体结构如下：
P5+Read1测序引物+插入DNA+Read2测序引物+Index(6bp)+P7
具体序列一端为：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；
另一端序列为：ATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC*XXXXXX*ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG,其中XXXXXX代表6bp碱基样本标签。具体反应体系及反应条件见表4
表4PCR扩增的反应体系及反应条件
通用引物序列：5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′
含样本标签引物：5‘-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′
(XXXXXX表示样本标签，有6个碱基随机组合，具体如下表；-s-表示硫代磷酸修饰)见表5
表5样本标签引物序列
| 编号 | 序列 |
| 1 | ATCACG |
| 2 | CGATGT |
| 3 | TTAGGC |
| 4 | TGACCA |
| 5 | ACAGTG |
| 6 | GCCAAT |
| 7 | CAGATC |
| 8 | ACTTGA |
| 9 | GATCAG |
| 10 | TAGCTT |
| 11 | GGCTAC |
| 12 | CTTGTA |
| 13 | AGTCAA |
| 14 | AGTTCC |
| 15 | ATGTCA |
| 16 | CCGTCC |
| 18 | GTCCGC |
| 19 | GTGAAA |
| 20 | GTGGCC |
本发明上述步骤(3)所用探针为本发明关键之处，探针是根据与疾病相关的目标区域特异定制的，可以完整覆盖目标区域(外显子区域及外显子上下游各20碱基区域)，从而提高捕获目标片段的效率，达到检测相关疾病突变位点的目的。通过一系列封闭方法，例如利用COT DNA将基因组中重复序列封闭，利用特定引物序列封闭接头序列等，配制最优的杂交反应条件，反应16h-20h，进一步提高捕获目标区域的特异性，提高捕获效率。定制探针有生物素修饰，待杂交后，通过链霉亲和素标记的磁珠富集文库。
所述目标区域包含以下基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)：ACTC1、ACTN2、MYBPC3、MYH7、MYL2、MYL3、TNNI3、TNNT2、TPM1。
进一步优选，本发明步骤(3)将步骤2得到的DNA文库进行文库混样(样品≤6)，总量至少1-1.5μg(优选1.25μg)。将不同样本标签的文库等量混合，加入样本标签对应的封闭引物试剂封闭DNA，浓缩烘干至干粉，再加入杂交缓冲液(Tris、EDTA、NaCl)，杂交增强剂(高浓度Mg2+缓冲液)混匀孵育，然后加入定制探针反应，反应结束后，加入预先处理的特定磁珠纯化，富集捕获到的目的区域DNA片段，反应体系及反应条件见表6。该步骤将不同样本标签样本进行混样杂交捕获，在一定程度上节省成本。
本发明上述所述的杂交反应结束后(探针与目标区域片段特异性结合)，选用有链霉亲和素标记的特定磁珠，可特异性抓取有生物素标记的探针，进行纯化清洗，从而富集目标区域片段。
表6杂交反应体系组分及反应条件
通用引物封闭试剂：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
标签封闭引物试剂：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT,NNNNNN于样本标签index碱基反向互补配对。
针对基因MYBPC3的定制探针的序列SEQ ID No1至SEQ ID No26。
针对基因MYL2的定制探针的序列SEQ ID No 27至SEQ ID No38。
针对基因MYH7的定制探针的序列SEQ ID No 39至SEQ ID No 89。
针对基因ACTC1的定制探针的序列SEQ ID No 90至SEQ ID No 96。
针对基因TPM1的定制探针的序列SEQ ID No 97至SEQ ID No 115。
针对基因TNNI3的定制探针的序列SEQ ID No 116至SEQ ID No 121。
针对基因TNNT2的定制探针的序列SEQ ID No 122至SEQ ID No 141。
针对基因ACTN2的定制探针的序列SEQ ID No 142至SEQ ID No 176。
针对基因MYL3的定制探针的序列SEQ ID No 177至SEQ ID No 185。
本发明步骤(4)中利用LMPCR将捕获的目的区域片段进行PCR扩增以使文库总量能够满足上机测序要求，其反应体系及条件见表7：反应结束后进行磁珠纯化得到最终的上机文库。
所述的磁珠纯化方法：将DNA文库加入纯化磁珠，置于磁力架上，直到溶液澄清后弃掉上清，使用乙醇清洗磁珠，离心，吸尽残余液体，干燥，加入TRIS-EDTA缓冲液,吹吸混匀，室温放置，澄清后即得纯化文库；
表7LMPCR扩增反应体系
所述P5引物序列：5'-AATGATACGGCGACCACCGA。
所述P7引物序列：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA。
上述步骤(5)所述文库质控，要先进行定量检测，可选择Qubit3.0仪器，得到文库浓度总量≥0.5ug，其次进行定性质控，可选择Agilent2100/4200仪器，要求片段范围在150-500bp之间；上机测序前可进行实时荧光定量PCR进行文库定量，用与P5、P7引物特异扩增满足测序要求的文库，绘制标准曲线，确定合适的文库上机浓度。具体反应体系及反应条件按照下表8(配套仪器ABI 7500/7300standard)。
表8QPCR扩增体系及条件
本发明的构建方法还包括上机测序过程及数据分析过程。
本发明的一种实施方式，一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特包括如下步骤：
(1)核酸提取及质检：外周血样本经过核酸提取、质检后，要求其符合一定质控标准：DNA完整性较好，无蛋白RNA污染，DNA浓度≥20ng/μL；DNA纯度：OD260/280 1.8-2.0，OD260/230>2.0；DNA总起始量:0.1μg-1μg；
(2)文库制备：利用上述DNA，取样后用TRIS-EDTA补至52.5μl，于covaris仪器上根据相应参数，进行超声打断，将基因组DNA随机打断至180-220bp短片段；然后进行末端补平加A,反应体系为：Tris-EDTA稀释的DNA 50μl，末端补平加A反应缓冲液7μl，末端补平加A酶混合液3μl，合计60μl，反应条件为：20℃保持30min，65℃保持30min，最后保持4℃；再进行接头连接，反应体系为末端补平的DNA60μl，连接反应缓冲液及连接酶30μl，测序接头2.5μl，高浓度Mg2+缓冲液1μl，合计93.5μl，反应条件：20℃保持15min，并保持20℃；反应结束后，加入3μl USER消化酶，37℃保持15min；反应结束后，加入AMpureXP纯化磁珠进行片段选择，先加入45μl磁珠吸附后留取上清，磁珠吸附大片段丢弃，再加入15μl磁珠正常纯化洗脱；最后以纯化的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为：DNA模板20μl，2XPCR扩增反应酶及缓冲液25μl，通用引物2.5μl，含样本标签引物2.5μl，合计50μl，反应条件为：98℃保持30s，然后进行4个循环，每个循环为98℃保持10s，65℃保持75s，然后65℃保持5min，最后保持在10℃；结束后加入90μl磁珠进行纯化；
(3)杂交捕获：进行文库混样，将带有不同样本标签的文库，等量进行混合(不超过6个样本)，总量需要达到1.25ug；混匀后取样1ug，加入样本标签对应的封闭引物试剂2μl，封闭DNA5ug，真空浓缩仪60℃浓缩烘干至干粉；再加入2x杂交缓冲液7.5μl，杂交试剂A 3μl，混匀95℃孵育10min，然后加入定制探针4.5μl，混匀后热盖57℃，反应47℃孵育16h-20h；反应结束后，加入100μl预先处理的特定磁珠，富集捕获到的目的区域DNA片段；
(4)LMPCR扩增：将步骤(3)获得的杂交捕获富集的DNA作为模板，配制反应体系：模板20μl，2Xpcr反应酶及缓冲液25μl，P5P7引物5μl，反应条件：98℃保持45s，然后进行14个循环，每个循环为98℃保持15s，60℃保持30s，72℃保持30s，然后72℃保持1min，最后保持在4℃；反应结束后加入90μl磁珠纯化得到最终上机测序文库；
(5)将步骤(4)中获得的最终文库按照以下方法进行质控：取样1μl，使用Qubit HSdsDNA试剂盒定量，得到文库浓度；根据定量浓度进行合理稀释，在Agilent2100或者4200仪器，选择合适的试剂进行检测，核查文库片段分布范围；上机前，使用荧光定量PCR方法进行有效模板定量，梯度稀释标准品分别是20pM，2pM,0.2pM,0.002pM,0.0002pM，0.00002pM；将样本文库稀释至2-10pM，按照下述配制试剂：2×SybrGreen Master Mix 25μL、P5P7引物2μl、无核酸酶水4μl，样本标准品4μL；反应条件(ABI7500)：95℃保持5min，然后35个循环，每个循环95℃保持30sec，60℃保持45s，熔解曲线95℃保持15s，60℃保持60s，95℃15s；
(6)上机测序：根据定量浓度，确定上机最终浓度，于Nextseq550AR测序仪上上机，按照仪器操作规程进行测序，使用NextSeq 500/550Mid Output Kit v2(300cycles)；然后将数据上传服务器，由遗传咨询师对得到的数据进行分析及解读。
本发明的另一技术方案是该方法获得的遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库。
本发明的另一技术方案是所述文库制备的遗传性肥厚型心肌病的基因检测试剂盒，其包括文库建库试剂、接头和标签引物序列、探针序列、P5P7引物序列、文库纯化磁珠，所述的探针序列SEQ ID No 1至SEQ ID No 185。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明的文库采用高通量测序探针杂交捕获的方法检测ACTC1、ACTN2、MYBPC3、MYH7、MYL2、MYL3、TNNI3、TNNT2、TPM1的基因突变，探针针对目标区域进行定制，充分考虑目标区域的覆盖比例，保证突变的有效捕获，使之变异类型全面，准确率高，灵敏度高。同时可以选择一捕多个样本，节省了成本。
2、该文库涵盖了肥厚型心肌病的相关基因，结合illumina高通量测序仪，可快速准确得到相关基因变异，对遗传性肥厚型心肌病有重要意义。
3、所用探针为本发明关键之处，探针是根据与疾病相关的目标区域特异定制的，可以完整覆盖目标区域(外显子区域及外显子上下游各20碱基区域)，从而提高捕获目标片段的效率，达到检测相关疾病突变位点的目的。通过一系列封闭方法，例如利用COT DNA将基因组中重复序列封闭，利用特定引物序列封闭接头序列等，配制最优的杂交反应条件，反应16h-20h，进一步提高捕获目标区域的特异性，提高捕获效率。定制探针有生物素修饰，待杂交后，通过链霉亲和素标记的磁珠富集文库。
4、本发明的文库避免了多重PCR法扩增目标区域，避免PCR引入的碱基错配，同时通用于不同的复杂DNA样本。
5、本发明的文库依托于illumina高通量测序平台，检测通量大大提高。
附图说明
图1是根据本发明的方法构建的外周血DNA文库2100生物分析仪检测结果。
图2是根据本发明的文库构建及测定流程图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1
采用4个外周血样本样本进行文库构建，采用包含ACTC1、ACTN2、MYBPC3、MYH7、MYL2、MYL3、TNNI3、TNNT2、TPM1基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)作为目标区域的引物池进行多重反应PCR，并结合高通量测序平台Miseq进行DNA测序，然后检测点突变(SNP)、小片段插入缺失(InDel)。具体操作流程如下：
(1)核酸提取及质检：外周血样本经过核酸提取、质检后，要求其符合一定质控标准：DNA完整性较好，无蛋白RNA污染，DNA浓度≥20ng/μL；DNA纯度：OD260/280 1.8-2.0，OD260/230>2.0；DNA总起始量:0.1μg-1μg。
(2)文库制备：利用上述DNA，取样后用TRIS-EDTA补至52.5μl，于covaris仪器上根据相应参数，进行超声打断，将基因组DNA随机打断至180-220bp短片段。然后进行末端补平加A,反应体系为：Tris-EDTA稀释的DNA 50μl，末端补平加A反应缓冲液7μl，末端补平加A酶混合液3μl，合计60μl，反应条件为：20℃保持30min，65℃保持30min，最后保持4℃；再进行接头连接，反应体系为末端补平的DNA60μl，连接反应缓冲液及连接酶30μl，测序接头2.5μl，高浓度Mg2+缓冲液1μl，合计93.5μl，反应条件：20℃保持15min，并保持20℃；反应结束后，加入3μl USER消化酶，37℃保持15min；反应结束后，加入AMpureXP纯化磁珠进行片段选择，先加入45μl磁珠吸附后留取上清(磁珠吸附大片段丢弃)，再加入15μl磁珠正常纯化洗脱。最后以纯化的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为：DNA模板20μl，2XPCR扩增反应酶及缓冲液25μl，通用引物2.5μl，含样本标签引物2.5μl，合计50μl。反应条件为：98℃保持30s；然后进行4个循环，每个循环为98℃保持10s，65℃保持75s；然后65℃保持5min；最后保持在10℃。结束后加入90μl磁珠进行纯化。
(3)杂交捕获：进行文库混样，将带有不同样本标签的文库，等量进行混合(不超过6个样本)，总量需要达到1.25ug。混匀后取样1ug，加入样本标签对应的封闭引物试剂2μl，封闭DNA5ug，真空浓缩仪60℃浓缩烘干至干粉。再加入2x杂交缓冲液7.5μl，杂交试剂A 3μl，混匀95℃孵育10min，然后加入定制探针4.5μl，混匀后热盖57℃，反应47℃孵育16h-20h。反应结束后，加入100μl预先处理的特定磁珠，富集捕获到的目的区域DNA片段。
(4)LMPCR扩增：将步骤(3)获得的杂交捕获富集的DNA作为模板，配制反应体系：模板20μl，2Xpcr反应酶及缓冲液25μl，P5P7引物5μl。反应条件：98℃保持45s；然后进行14个循环，每个循环为98℃保持15s，60℃保持30s，72℃保持30s；然后72℃保持1min；最后保持在4℃。反应结束后加入90μl磁珠纯化得到最终上机测序文库。
(5)将步骤(4)中获得的最终文库按照以下方法进行质控：取样1μl，使用Qubit HSdsDNA试剂盒定量，得到文库浓度。根据定量浓度进行合理稀释，在Agilent2100或者4200仪器，选择合适的试剂进行检测，核查文库片段分布范围。上机前，使用荧光定量PCR方法进行有效模板定量，梯度稀释标准品分别是20pM，2pM,0.2pM,0.002pM,0.0002pM，0.00002pM。将样本文库稀释至2-10pM，按照下述配制试剂：2×SybrGreen Master Mix 25μL、P5P7引物2μl、无核酸酶水4μl，样本(标准品)4μL。反应条件(ABI7500)：95℃保持5min；然后35个循环，每个循环95℃保持30sec，60℃保持45s；熔解曲线95℃保持15s，60℃保持60s，95℃15s。
(6)上机测序：根据定量浓度，确定上机最终浓度，于Miseq测序仪上上机，按照仪器操作规程进行测序，使用MiSeq Reagent Micro Kit(300cycles)。然后将数据上传服务器，由遗传咨询师对得到的数据进行分析及解读。数据见下表9。
表9 4个样本的测序结果与已知结果100％一致
实施例2
采用16个口腔拭子样本进行文库构建，采用包含ACTC1、ACTN2、MYBPC3、MYH7、MYL2、MYL3、TNNI3、TNNT2、TPM1基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)作为目标区域的引物池进行多重反应PCR，并结合高通量测序平台Nextseq550AR进行DNA测序，然后检测点突变(SNP)、小片段插入缺失(InDel)。具体操作流程如下：
(1)核酸提取及质检：外周血样本经过核酸提取、质检后，要求其符合一定质控标准：DNA完整性较好，无蛋白RNA污染，DNA浓度≥20ng/μL；DNA纯度：OD260/280 1.8-2.0，OD260/230>2.0；DNA总起始量:0.1μg-1μg。
(2)文库制备：利用上述DNA，取样后用TRIS-EDTA补至52.5μl，于covaris仪器上根据相应参数，进行超声打断，将基因组DNA随机打断至180-220bp短片段。然后进行末端补平加A,反应体系为：Tris-EDTA稀释的DNA 50μl，末端补平加A反应缓冲液7μl，末端补平加A酶混合液3μl，合计60μl，反应条件为：20℃保持30min，65℃保持30min，最后保持4℃；再进行接头连接，反应体系为末端补平的DNA60μl，连接反应缓冲液及连接酶30μl，测序接头2.5μl，高浓度Mg2+缓冲液1μl，合计93.5μl，反应条件：20℃保持15min，并保持20℃；反应结束后，加入3μl USER消化酶，37℃保持15min；反应结束后，加入AMpureXP纯化磁珠进行片段选择，先加入45μl磁珠吸附后留取上清(磁珠吸附大片段丢弃)，再加入15μl磁珠正常纯化洗脱。最后以纯化的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为：DNA模板20μl，2XPCR扩增反应酶及缓冲液25μl，通用引物2.5μl，含样本标签引物2.5μl，合计50μl。反应条件为：98℃保持30s；然后进行4个循环，每个循环为98℃保持10s，65℃保持75s；然后65℃保持5min；最后保持在10℃。结束后加入90μl磁珠进行纯化。
(3)杂交捕获：进行文库混样，将带有不同样本标签的文库，等量进行混合(不超过6个样本)，总量需要达到1.25ug。混匀后取样1ug，加入样本标签对应的封闭引物试剂2μl，封闭DNA5ug，真空浓缩仪60℃浓缩烘干至干粉。再加入2x杂交缓冲液7.5μl，杂交试剂A 3μl，混匀95℃孵育10min，然后加入定制探针4.5μl，混匀后热盖57℃，反应47℃孵育16h-20h。反应结束后，加入100μl预先处理的特定磁珠，富集捕获到的目的区域DNA片段。
(4)LMPCR扩增：将步骤(3)获得的杂交捕获富集的DNA作为模板，配制反应体系：模板20μl，2Xpcr反应酶及缓冲液25μl，P5P7引物5μl。反应条件：98℃保持45s；然后进行14个循环，每个循环为98℃保持15s，60℃保持30s，72℃保持30s；然后72℃保持1min；最后保持在4℃。反应结束后加入90μl磁珠纯化得到最终上机测序文库。
(5)将步骤(4)中获得的最终文库按照以下方法进行质控：取样1μl，使用Qubit HSdsDNA试剂盒定量，得到文库浓度。根据定量浓度进行合理稀释，在Agilent2100或者4200仪器，选择合适的试剂进行检测，核查文库片段分布范围。上机前，使用荧光定量PCR方法进行有效模板定量，梯度稀释标准品分别是20pM，2pM,0.2pM,0.002pM,0.0002pM，0.00002pM。将样本文库稀释至2-10pM，按照下述配制试剂：2×SybrGreen Master Mix 25μL、P5P7引物2μl、无核酸酶水4μl，样本(标准品)4μL。反应条件(ABI7500)：95℃保持5min；然后35个循环，每个循环95℃保持30sec，60℃保持45s；熔解曲线95℃保持15s，60℃保持60s，95℃15s。
(6)上机测序：根据定量浓度，确定上机最终浓度，于Nextseq550AR测序仪上上机，按照仪器操作规程进行测序，使用NextSeq 500/550Mid Output Kit v2(300cycles)。然后将数据上传服务器，由遗传咨询师对得到的数据进行分析及解读。数据见下表10。
表10 16个样本的测序结果与已知结果100％一致
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 北京安智因生物技术有限公司
<120> 一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法及其试剂盒
<160> 185
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 1
aaaggggcag ggctttctaa tctccagagt caacactccc tgcttgctga acatgcggaa 60
g 61
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 2
ttatagttgg gtggctcata ggtgatgcct gttggtgaca ggacttggta ccgag 55
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 3
aagtccaggg ccttatagtt gggtggctca taggtgatgc ctgttggtga caggacttgg 60
tac 63
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 4
ccaaccatat tctggctgaa gacgcggaag tagtagccat tgccaatgat gagctctggc 60
<210> 5
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 5
tggccttgtc ctccatgttc tcaatgcgca ccgtcacctg gtaagtgcct gaatgc 56
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 6
agtcccacct ggaaagggat gagaaggttc acaggctccc cgaccttctt ctgaatggt 59
<210> 7
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 7
ctgaatcagg tcgaagttca gccgcatcca ccggtagctc ttcttcttct tgcgctc 57
<210> 8
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 8
tgatgaaaga caaacgagcc tcctcctgac ctcagtctca ctcaccttct tgtca 55
<210> 9
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 9
aaagacaaac gagcctcctc ctgacctcag tctcactcac cttcttgtca aacacccact 60
c 61
<210> 10
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 10
tagcttattt ccagctacaa ccacaatggt gtctggtatg cggcctgggc agtcc 55
<210> 11
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 11
agacttaccc tgcctgggta cgaagtcaat cttgacctct gcaagagaag gaagagcaa 59
<210> 12
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 12
tgggtacgaa gtcaatcttg acctctgcaa gagaaggaag agcaagtagc acgggggcaa 60
ag 62
<210> 13
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 13
aagctgtagt cagcctcgtc ggcaggtgtg acgtcgtcaa tggtcagttt gtggac 56
<210> 14
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 14
tctcatctga gacctcacat ttgaacaccg cctggtcctt tgcgcccacc atcaggt 57
<210> 15
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 15
ctcgttgatg atcaggtggt gtctctgccc gtccttcttg aaccggtatt tgaag 55
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 16
cttctggaac tcaccatttg acttgcgccc cctcctccga tacttcacac tcaaactcca 60
<210> 17
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 17
ccatccagag gggaacttac ttgctgtaga acagaagggg ccgttgaagt gttcc 55
<210> 18
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 18
tcatctggat ctcctggcca ttcttgagcc atttgacctc agcgtcatgg tcagcca 57
<210> 19
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 19
aagggctaac ctgtgctctt cttctcatcg cgcctcatgc ccttgagcct cttta 55
<210> 20
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 20
caaacaccca gaccccgatt cttactctct gggccacagc agcagcagcc ataatg 56
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 21
ctctttttca gcagtgagct gaagtccaga atcccagtgt cctcatggct atcactatgg 60
<210> 22
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 22
cctcaccgtg gacagtgaga ttgaagttgg agcagtcaaa tttgtccttg gtgga 55
<210> 23
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 23
agacaccagg gccccctcac cgtggacagt gagattgaag ttggagcagt caaatttgtc 60
<210> 24
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 24
ctccaggggt aggaccattg agagctgctg agcttgaccc tgtgagcaaa ggctttttct 60
gtt 63
<210> 25
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 25
attgagagct gctgagcttg accctgtgag caaaggcttt ttctgtttgt ttgagatgga 60
gtcttgc 67
<210> 26
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 26
cagggaaggc tgatcaggat cttacctgcc tctatgacct tgaggtcgaa cttgacc 57
<210> 27
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 27
cctagtcctt ctcttctccg tgggtgatga tgtgcaccag gttcttgtag tccaa 55
<210> 28
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 28
agtccttctc ttctccgtgg gtgatgatgt gcaccaggtt cttgtagtcc aagttgccag 60
tca 63
<210> 29
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 29
ttggaaaacc tctccgcctg cgtggtcagc atttcccgaa cgctgcagag aaaggaaa 58
<210> 30
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 30
acactttgaa tgcgttgaga atggtttcct cagggtccgc tcctgaaacg gaacaca 57
<210> 31
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 31
ttcagggtca aacactttga atgcgttgag aatggtttcc tcagggtccg ctcctgaaac 60
ggaaca 66
<210> 32
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 32
cacacacgac cttaccctta agtttctccc caaacattgt gaggaacaca gtaaagttaa 60
ttggacccgg agcctccttg 80
<210> 33
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 33
tttcatcaat ttcttcattt ttcacgttca ctcgccctag ggtaggaaac acacactcag 60
ggactcc 67
<210> 34
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 34
aagttaattg gacccggagc ctccttgatc atttcatcaa tttcttcatt tttcacgttc 60
actcgcccta gggtaggaaa cacacactca gg 92
<210> 35
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 35
ccatccctgt tctggtccat gatagtgaag gcctgtggaa gggaagtgat tggca 55
<210> 36
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 36
tgcacccacc tccttaaatt cctggatttg ggtctgttcg aacatggaga acacgttgg 59
<210> 37
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 37
attcaatagc tgcacccacc tccttaaatt cctggatttg ggtctgttcg aacatggaga 60
acacgttgga gtt 73
<210> 38
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 38
ttgtactcac catggtggaa aggacccagc actgcctccc gagaagaatt ccacact 57
<210> 39
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 39
agatgtggca aagctactcc tcattcaagc ccttttgaaa ggaaacaaag tccaatcagt 60
ccttggagag atggt 75
<210> 40
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 40
tgactagcaa agcccaaaag agggacccac cttcgtgcca atgtcacggc tcttg 55
<210> 41
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 41
ttcgtccagc cggtgctgca ggtccttaat ggtctgttcc atgttcttct tcatg 55
<210> 42
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 42
cggcttcgtc cagccggtgc tgcaggtcct taatggtctg ttccatgttc ttcttcatg 59
<210> 43
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 43
tgggacaggt cagcatccat cttcttcttc tggttgatga ggctggtgtt ctggg 55
<210> 44
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 44
atggcgatgt tctccttcag gtcgtcgttg gcacggactg catcgtccag ctgaat 56
<210> 45
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 45
cggttggcgt ggctgagctg gatctccatc tcattgaggt ctccttccat cttct 55
<210> 46
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 46
accttctcca gctcatggat agtctttccg ctggaaccca actgctcagt caagt 55
<210> 47
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 47
tggatagtct ttccgctgga acccaactgc tcagtcaagt cggagatctc ctctgtgtg 59
<210> 48
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 48
tttgttctcc cgcttgaagg tctccagatg ttccagggac tcctcatagg cgttc 55
<210> 49
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 49
atctcattct gtagccggtg cttggtcttc tccagcgagg agcacttggc attaa 55
<210> 50
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 50
aagtcctcga tctcattctg tagccggtgc ttggtcttct ccagcgagga gcacttggca 60
ttaaca 66
<210> 51
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 51
ccaaggtccg gcacatcttc tccaggttag cctgagaagg gaaggagagt tatat 55
<210> 52
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 52
ttcatctggt cttccaaggt ccggcacatc ttctccaggt tagcctgaga agggaaggag 60
agttatatga tggat 75
<210> 53
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 53
cttggccttg atgatctgct ccatgttgga ggtgacgtca tccagctcca gcttgaac 58
<210> 54
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 54
tgttcatcct caatccttgc gttgagagca ttcagctcaa agtcttttct gtggggaagg 60
aggg 64
<210> 55
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 55
cagtactttt tcagccgctc atccagctgc tgcttgtcat tctccaggtc catgat 56
<210> 56
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 56
aggggacaca gtactttttc agccgctcat ccagctgctg cttgtcattc tccaggtcca 60
t 61
<210> 57
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 57
atctaggccc cacaactctc aatctactca catcatccac ttgctgctcc agcttgact 59
<210> 58
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 58
catcgatgtc ccttttgagc tctgagcact catcttccag cttgcgcttc ttggc 55
<210> 59
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 59
atcagctgat cacagcgctc ctcagcatct gccaggttgt cttgttcctg aaggtg 56
<210> 60
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 60
tcttgaagta gagcttcatc cagggccaat tcttgacccc catgaaggcc cgaat 55
<210> 61
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 61
cttgaagtag agcttcatcc agggccaatt cttgaccccc atgaaggccc gaatgttcca 60
ctggatta 68
<210> 62
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 62
agcgggaaac ctcctcttga gatctctcac ctacgttcca gcagcttttt gtactccatt 60
ct 62
<210> 63
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 63
agatgtcttc ctttaattaa ttagtctcct ttcctcacct tggtgtggcc aaacttgtac 60
tggttgtgat caatgtcc 78
<210> 64
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 64
tcctttaatt aattagtctc ctttcctcac cttggtgtgg ccaaacttgt actggttgtg 60
atcaatgtcc agggagctga gcagcttctc 90
<210> 65
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 65
tccatcaccc ctgtggcaag aaggaagtag gaggagtctg tgagaacact ggactg 56
<210> 66
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 66
ctcattaggg atgatacaac gtacaaagtg gggatgggtg gagcgcaagt tggtc 55
<210> 67
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 67
tttgtctcat tagggatgat acaacgtaca aagtggggat gggtggagcg caagttggtc 60
atcagcttgt tcagattttc 80
<210> 68
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 68
ttagggatga tacaacgtac aaagtgggga tgggtggagc gcaagttggt catcagcttg 60
ttcagatttt cctgtggcca aaa 83
<210> 69
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 69
ctgaaaggac gagcctttct tggccttgcc tttgcccttc tcaatagctg caggaa 56
<210> 70
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 70
cctttcttgg ccttgccttt gcccttctca atagctgcag gaaggagagt caacaaaaga 60
agcatcagtg t 71
<210> 71
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 71
cagggtgctg agcagcttga gggaagactt ctgatacaag cccacgacag tctca 55
<210> 72
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 72
tccagcacaa acatgtggtg gttgaagaac tgctgcagct tctcgttggt gaagttgatg 60
<210> 73
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 73
ttcttgttgg gtgtgcaggg agaattcagg tggtaaggcc aaagaggcac cttctcgatg 60
a 61
<210> 74
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 74
aactcacatc gaagatctcg aagccagcga tgtccaggac tcctatgaag tactggcg 58
<210> 75
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 75
atgaggtagg cagacttgtc agcctctgga aggaaaaggc aagtagcaaa gttgg 55
<210> 76
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 76
tgaggtaggc agacttgtca gcctctggaa ggaaaaggca agtagcaaag ttggtaaaga 60
gatgactg 68
<210> 77
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 77
tacatggagt ttttctcctc tgaagtgaag cccagcacat caaaagcgtt ctgtagggag 60
gccccatatt 70
<210> 78
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 78
cgtcatcaat ggaggccacg gtggtctctc cttgggagat gaatgcataa tcgtaggg 58
<210> 79
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 79
catcaatgga ggccacggtg gtctctcctt gggagatgaa tgcataatcg taggggttgt 60
t 61
<210> 80
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 80
atgtgataat ctctctctgc tttcagctgg aaaataactc tggatttttc cagaagatct 60
gtgaacaggt ggggaga 77
<210> 81
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 81
attcatggca ctcacaggtc tctatgtctg cagatgccaa ctttcctgtt gccccaaaa 59
<210> 82
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 82
ccccaaaatg aattcgaatg aatttcccct ggagagatgg aagagagtgg tgatgagttg 60
ggggaaggct c 71
<210> 83
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 83
tccccaatgg ctgcaataac agcaaagtac tggatgaccc tcttggtgtt gactgtcttc 60
c 61
<210> 84
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 84
tgatcaggat ggactggttt tctctgtctg tggggagagg gtggggagga aaggtc 56
<210> 85
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 85
agattctgaa agggaataca gtagcagcta cactcacgtg atcaggatgg actggttttc 60
tctgtctgtg 70
<210> 86
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 86
cttgtaaggg ttgacggtga cacagaagag gcccgagtag gtctggggat agaaa 55
<210> 87
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 87
tgtcctcgat tttgtcgaac ttgggtgggt tctgctgcat cacctggtcc tcctt 55
<210> 88
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 88
atccttcttg aggtcaaaag gcctggtctg cgcttctagc cgctccttct ctgacttgc 59
<210> 89
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 89
ttggccttga caaactcctg tttgtcatca ggcacgaaga catccttctt gaggtcaaaa 60
ggc 63
<210> 90
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 90
caggatggag cccccaatcc agacagagta tttacgctca gggggagcaa taatctgcag 60
aa 62
<210> 91
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 91
tgtcacactt catgatgcta ttgtaagttg tttcatggat gccagcagat tccatacctg 60
ggaacgagtc ac 72
<210> 92
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 92
acaaaagttc tttaccttaa tcttcatggt gctaggagcc agagcagtga tttccttctg 60
catacgatca gcaataccag ggtacatagt 90
<210> 93
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 93
ccagggcgac atagcacagc ttctctttaa tgtcacggac aatttcacgt tcagctacag 60
aaa 63
<210> 94
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 94
accagtggtg acaaaggagt agccacgctc agtgaggatc ttcatgaggt agtcag 56
<210> 95
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 95
agtccagaac aatgcctgcc cggggaagta gacaagaaca aggtaaattc ctgaggacaa 60
<210> 96
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 96
cacggagctc attgtagaag gtgtggtgcc agatcttctc catgtcgtcc cagtt 55
<210> 97
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 97
aagaagaaga tgcagatgct gaagctcgac aaggagaacg ccttggatcg agctga 56
<210> 98
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 98
accatggacg ccatcaagaa gaagatgcag atgctgaagc tcgacaagga gaacgccttg 60
gat 63
<210> 99
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 99
caactcccag ctggaagatg agctggtgtc actgcaaaag aaactcaagg gcaccga 57
<210> 100
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 100
aagctggagg aagctgagaa ggcagcagat gagagtgaga ggtgagaatg cctcatc 57
<210> 101
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 101
aatgcttttc actctctacc taggctgaag ccgacgtagc ttctctgaac agacgcatcc 60
agctggt 67
<210> 102
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 102
atccaactga aagaggcaaa gcacattgct gaagatgccg accgcaaata tgaagaggtc 60
agatcctg 68
<210> 103
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 103
tgtgtgtgtt gtgtcttcct gctgcaggtg gcccgtaagc tggtcatcat tgaga 55
<210> 104
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 104
agcattaatg gctgcagagg ataaggtact gatggctcgt gtggttttta ggtttaactg 60
caacccagac atc 73
<210> 105
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 105
aatggatcag accttgaaag cattaatggc tgcagaggat aaggtactga tggctcgtgt 60
ggtttttagg tttaactgca acccagaca 89
<210> 106
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 106
ctctgatcga aaacattagc aaatgtgccg agcttgaaga agaattgaaa actgtgacga 60
acaacttgaa gtcactggag g 81
<210> 107
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 107
tcgcagaagg aagacagata tgaggaagag atcaaggtcc tttccgacaa gctgaaggag 60
gtaata 66
<210> 108
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 108
tcgcagaagg aagacagata tgaggaagag atcaaggtcc tttccgacaa gctgaaggag 60
gtaatatgag agttgtggat gaagcca 87
<210> 110
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 110
cttgcacatt cttcctgtgt gtcctctggg gtttttctct gtggctcttg aactcatgaa 60
cctaagtctt c 71
<210> 111
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 111
aacgatatga cttccatgta aacgttcatc cactctgcct gcttacaccc tgccctca 58
<210> 112
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 112
agaaactgaa gtacaaagcc atcagcgagg agctggacca cgctctcaac gatatgactt 60
ccatgtaa 68
<210> 113
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 113
cgcagataag tttctttgct tcacttctcc caagactccc tcgtcgagct ggatgtccc 59
<210> 114
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 114
ctgctaacct gcttgctgac ctgtacagat caactctacc agcaacttga gcaaaatcgc 60
c 61
<210> 115
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 115
tcttttctgc taacctgctt gctgacctgt acagatcaac tctaccagca acttgagcaa 60
aatcgccgcc 70
<210> 116
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 116
cagagaaagt ggctcatgcc aaagaagaaa accttagtat gcatcagatg ctggatcaga 60
ctttactgga gttaaacaac atgtgaaaac ctcc 94
<210> 117
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 117
tttttcttgc ggccctccat tccactcagt gcatcgatgt tcttgcgcca gtctccc 57
<210> 118
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 118
acttgcctcg aaggtcaaag atcttctgag tcagatctgc aatctggggg cacacgag 58
<210> 119
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 119
taaacttgcc tcgaaggtca aagatcttct gagtcagatc tgcaatctgg gggcacacga 60
<210> 120
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 120
tcccacctcc gtgatgttct tggtgacttt tgcctctatg tcgtatctct cttcatcc 58
<210> 121
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 121
ccgcccgtcc tcaccttcag ctgcaatttt ctcgaggcgg agatcttaga ttttt 55
<210> 122
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 122
ctttcccagt cccgcccgtc ctcaccttca gctgcaattt tctcgaggcg gagatcttag 60
attttt 66
<210> 123
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 123
tttcggagaa cattgatctg caagaaaagt gggaaggaca aagagcaacg ctggagctga 60
ctg 63
<210> 124
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 124
aatgacctca gacacttaca ctttctggtt atcgttgatc ctgtttcgga gaacattgat 60
ctgcaagaaa agtgggaagg acaaagagca a 91
<210> 125
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 125
cctcatattt ctgctgcttg aacttctcct gcaggtcgaa cttctctgcc tccaagtta 59
<210> 126
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 126
agaatcttct tcttcttttc ccgctcagtc tgcctcttcc cacttttccg ctctgtc 57
<210> 127
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 127
tcagctgatc ttcattcagg tggtcaatgg ccagcacctt cctcctctca gccagaatct 60
tcttcttctt ttcc 74
<210> 128
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 128
atggggagga agaaggcttg aggtttttgg tacccacctg ggcctgctaa accgggaaa 59
<210> 129
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 129
ctgctcccta cctaccttct ggatgtaacc cccaaaatgc atcatgttgg acaaagcc 58
<210> 130
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 130
tcctcctcct ctcgtcgagc cctctcttcc tgatttacag cagggaggaa gaaagcaaa 59
<210> 131
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 131
agaatgttag gtgggcagac tggacaccta cgatcctgtc tttgagagaa acgagctcct 60
<210> 132
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 132
agagaatgtt aggtgggcag actggacacc tacgatcctg tctttgagag aaacgagctc 60
ctcctc 66
<210> 133
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 133
cttacatcaa agtccactct ctctccatcg gggatcttgg gaggcaccaa gttgg 55
<210> 134
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 134
tttggtttgg actcctccat tgggccatct ggaggagata gaagcacaca gccat 55
<210> 135
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 135
cctgggcttt ggtttggact cctccattgg gccatctgga ggagatagaa gcacac 56
<210> 136
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 136
cctttgcctc ccttgtacct ctctcctgat atccttacct tcagcctcct ttgcttcctc 60
ttcttcttc 69
<210> 137
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 137
tcttccgctg cctcctcctg ctctggagaa gtgaagcaga cagagtgaag aagca 55
<210> 138
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 138
acagaaggaa aggctgtact accgtcttcg tcctctctcc agtcctcctc ttctgag 57
<210> 139
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 139
ctggctctcc acctgcctga ggcacatacc ttcaacagct gcttctgctc agaagagaa 59
<210> 140
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 140
accttcctgc tccctgagag caacaggaaa cactgtcagt agctcgcaca caagcac 57
<210> 141
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 141
tccaaatgag tacacacgtt tacgcttacc ttcctgctcc ctgagagcaa caggaaacac 60
tgtc 64
<210> 142
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 142
actcaggcaa gatgctccag atactcactc ctcctcgtac tcttccacca cctct 55
<210> 143
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 143
agatagagcc cggcgtgcag tacaactacg tgtacgacga ggatgagtac atgat 55
<210> 144
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 144
ccatgaacca gatagagccc ggcgtgcagt acaactacgt gtacgacgag gatgagtaca 60
t 61
<210> 145
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 145
aactacgtgt acgacgagga tgagtacatg atccaggagg aggagtggga ccgcga 56
<210> 146
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 146
caggaatggc cttaagctca tgctgctttt ggaagtcatc tcaggttggt gttatatatc 60
ccatcct 67
<210> 147
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 147
cggggaaaaa tgcggttcca caaaattgct aatgtcaaca aagctttgga ttacatagcc 60
agcaaagggg tgaaac 76
<210> 148
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 148
atgtctgcat gattctcttt tcatccaaca ggggaaaggc tgcccaaacc tgaccgggga 60
aaaatgcggt tccacaaaat tgctaa 86
<210> 149
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 149
ttgttttctt acctgcagaa attgttgatg gcaatgtgaa aatgaccctg ggtatgatct 60
ggaccatcat ccttcgcttt gctattcagg atatt 95
<210> 150
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 150
tggtgtcaga ggaaaactgc tccttataga aatgtgaaca ttcagaactt ccatactagg 60
tgagcaccca gg 72
<210> 151
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 151
aaagaaggtc tgctgctttg gtgtcagagg aaaactgctc cttatagaaa tgtgaacatt 60
cagaacttcc atactaggtg agcaccc 87
<210> 152
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 152
cctgacctca ttgactactc aaagcttaac aaggttattc tgggtggcct ggcatgcag 59
<210> 153
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 153
ataggaaata ttaacctggc catggaaatc gctgagaagc acctggatat tcctaaaatg 60
ttggatgctg aaggtgag 78
<210> 154
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 154
acctggccat ggaaatcgct gagaagcacc tggatattcc taaaatgttg gatgctgaag 60
gtgagatgaa aattgtgttt gctgagttac 90
<210> 155
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 155
agaacatcca cgcggttaac cttcttttct ccacacagat ttagtataca ctgccagacc 60
cgatgaaaga gccata 76
<210> 156
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 156
ttttctcccc cttcagacat cgtsaacacc cctaaacccg atgaaagagc catca 55
<210> 157
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 157
tgttattttc tcccccttca gacatcgtsa acacccctaa acccgatgaa agagccatca 60
tgacgtacgt ctcttgcttc ta 82
<210> 158
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 158
cagagaattg tgtattacct caatgacttc tcatctaggt tagacaaagt cttaaagcac 60
actcagctct gtggaaggat ccccc 85
<210> 159
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 159
agaatatgag aggctagcga gtgaggtaaa ggaaactggt gacctgcagt tctgtcca 58
<210> 160
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 160
agacagcggc taacaggata tgtaaggttc ttgctgtgaa tcaagagaat gagaggctga 60
tggaagaata tgagaggcta gc 82
<210> 161
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 161
ttcagcagta tttttgtgtt tgcggagcag cttttggaat ggattcgtcg cacgatcccc 60
tggctg 66
<210> 161
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 161
tgagaagttc aggcagaagg cctcaacgca cgagacttgg gcttatggta agtagac 57
<210> 162
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 162
ctcaacgcac gagacttggg cttatggtaa gtagacagga gtcagattgg atttttgaaa 60
aaccagagtt g 71
<210> 163
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 163
cctcagcata ttcatacttt cttgctacca cctttgcagg caaagagcag atcttgctgc 60
agaaggatta c 71
<210> 164
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 164
tgggaacgct tactcagaag aggagagaag ccctagaggt gaagtattga agccacttg 59
<210> 165
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 165
ctgtgaatgt caatgatcgg tgccagaaaa tttgtgacca gtgggaccga ctgggaacgc 60
ttactcagaa gag 73
<210> 166
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 166
agaatggaga aattgctaga aaccattgat cagcttcacc tggagtttgc caagagggct 60
gctcctttca acaattggat ggagg 85
<210> 167
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 167
tacaacatca gaatcagctc aagcaacccg tacagcactg tcaccatgga tgagc 55
<210> 168
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 168
aagccacatt gtttttctcc acttgtgtct cgggtgtaga gtctgatcac tgcgcatgag 60
cagttcaagg 70
<210> 169
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 169
tttgctgccc aagccaatgc cattgggccc tggatccaga acaagatgga ggtaagcca 59
<210> 170
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 170
atcacaggag ccctggaaga ccagatgaac cagctgaagc agtatgagca caacatc 57
<210> 171
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 171
tgacaaccat cgccagaacc atcaatgagg tggagactca gatcctgacg agagatgcga 60
a 61
<210> 172
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 172
caggagcaga tgaatgagtt cagagcctcc ttcaaccact ttgacagggt accactctct 60
acttatttga aggg 74
<210> 173
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 173
ttgccctgtg ctcacctgct ctgtcctttg tttttgccaa cagaggaaga atggcctgat 60
ggatcatgag gatttc 76
<210> 174
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 174
tggtagatcc caacgggcaa ggcaccgtca ccttccaatc cttcatcgac ttcatg 56
<210> 175
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 175
ctccttccgg atcctggctt ctgataaggt ctgcattgac agatttcctt ctgctttagc 60
<210> 176
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 176
tccgcactct acggggagag cgatctgtga tgctgagctt ctgtaatcac tcatcccat 59
<210> 177
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 177
agggagtggg tgcctacctg ggcacgaggt ttagctggac atgatgtgct tcacaaatg 59
<210> 178
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 178
ctggacatga tgtgcttcac aaatgctgga aagaagagga gagtgagtgg caggagtgca 60
acat 64
<210> 179
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 179
cttcatagtt gatgcagcca ttggagtcct cttgcccagc catcaacttc tccacttcg 59
<210> 180
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 180
caaagtccat catcttggta ttgagctctg cagagaaatg gtcccaggtt ccaggg 56
<210> 181
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 181
aatgtgctgg agcataggca ggaaagtttc aaagtccatc atcttggtat tgagctctgc 60
agagaaatgg tcccag 76
<210> 182
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 182
acactgcccg taggtgatct tcatctcaca cttgggtgtg cggtcgaaca gcatgaa 57
<210> 183
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 183
tgctcaggtg tgaactcaat ctgaaaagag accccaaaga ctcagatgcc cggcttaaaa 60
<210> 184
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 184
cttcaatctg ctcaggtgtg aactcaatct gaaaagagac cccaaagact cagatgcccg 60
gcttaaaagg tggg 74
<210> 185
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 185
tggctttttg ggggccattg ggggctgtaa gtacagagag ggatgtggag agaag 55
Claims (10)
1.一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：经过illumina测序平台专用测序接头连接反应制备的DNA文库采用杂交探针捕获的方法获得目标区域文库，采用LMPCR方法扩增文库，再进行文库纯化，即得测序基因检测文库，所述的目标区域DNA为ACTC1、ACTN2、MYBPC3、MYH7、MYL2、MYL3、TNNI3、TNNT2、TPM1基因的突变及以上基因的编码氨基酸的外显子区域及外显子上下游各20碱基区域。
2.如权利要求1所述的一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)DNA质量标准：提供受试者样本的基因组DNA，经过核酸提取、质检后，要求DNA符合一定质控标准；
(2)文库制备：将上述复合标准的基因组DNA，超声随机打断至180bp-220bp短片段，然后进行末端补平加A,连接illumina测序平台专用测序接头，并通过PCR扩增达到一定总量的DNA文库；
(3)杂交捕获：将步骤2得到的文库，与疾病相关定制探针进行特异性杂交，捕获含目的区域的文库，再通过磁珠抓取、富集留下含目的区域的DNA文库，即得目标区域文库；
(4)LMPCR扩增：将步骤3得到的目标区域文库，作为LMPCR模板，加入与测序接头匹配的引物及相应试剂，进行扩增，扩增后加入磁珠纯化，即得纯化文库；
(5)文库质控：将步骤4得到的纯化文库进行质控，选择Qubit 3.0进行定量检测，Agilent2100或Agilent 4200进行定性检测，查看文库片段分布是否符合要求。
3.如权利要求2所述的一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，上述步骤(1)中所述的DNA质控标准为，DNA浓度≥20ng/μL；DNA纯度：OD260/280＝1.8-2.0，OD260/230>2.0；DNA总起始量:0.1μg-1μg。
4.如权利要求1所述的一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的末端补平加A的反应是指DNA随机片段化至180-220bp，通过5'→3'聚合酶及3'→5'外切酶作用，进行末端补平,同时5'端进行磷酸化，其次3'加A，以便和测序接头进行连接。
5.如权利要求1所述的一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述连接illumina测序平台专用测序接头反应包括连接接头反应、消化反应及纯化反应，所述的连接接头是指在DNA片段两端连接illumina平台专用的测序接头，含有和平台芯片结合的特定序列P5、P7以及测序引物序列，其中P7端含有样本标签，长度6bp，其测序模板具体结构如下：
P5+Read1测序引物+插入DNA+Read2测序引物+Index(6bp)+P7。
6.如权利要求5所述的一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，所述测序模板
序列一端为：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；
另一端序列为：
ATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC*NNNNNN*ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG,其中NNNNNN代表6bp碱基样本标签。
7.如权利要求1所述的一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，步骤(3)将步骤2得到的DNA文库进行文库混样，总量≥1-1.5μg，将不同样本标签的文库等量混合，加入样本标签对应的封闭引物试剂封闭DNA，浓缩烘干至干粉，再加入杂交缓冲液，混匀孵育，然后加入定制探针反应，反应结束后，加入预先处理的特定磁珠纯化，富集捕获到的目的区域DNA片段。
8.如权利要求1所述的一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述的探针杂交反应结束后，选用有链霉亲和素标记的特定磁珠，可特异性抓取有生物素标记的探针，进行纯化清洗，从而富集目标区域DNA片段。
9.如权利要求1所述的一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法，其特征在于，步骤(5)所述定量检测选择Qubit3.0仪器，得到文库浓度总量≥0.5ug，所述定性质控选择Agilent2100或Agilent4200仪器，片段范围在150-500bp之间；上机测序前进行实时荧光定量PCR进行文库定量，用与P5、P7引物特异扩增满足测序要求的文库，绘制标准曲线，确定合适的文库上机浓度。
10.一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-9任意一项中所述的基因检测文库的建库试剂、杂交探针序列、引物序列，所述的探针序列SEQ IDNo 1至SEQ ID No 185。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811493190.XA CN109486937A (zh) | 2018-12-07 | 2018-12-07 | 一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法及其试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811493190.XA CN109486937A (zh) | 2018-12-07 | 2018-12-07 | 一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法及其试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109486937A true CN109486937A (zh) | 2019-03-19 |
Family
ID=65709655
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811493190.XA Pending CN109486937A (zh) | 2018-12-07 | 2018-12-07 | 一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法及其试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109486937A (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112608994A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-04-06 | 南昌瑞因康生物科技有限公司 | 一种肥厚型心肌病及相关基因的检测方法、装置和存储介质 |
| CN113529176A (zh) * | 2021-08-02 | 2021-10-22 | 北京华瑞康源生物科技发展有限公司 | 一种遗传性肥厚型心肌病的通用基因检测文库的构建方法及其试剂盒 |
| CN114107312A (zh) * | 2021-11-12 | 2022-03-01 | 江苏百世诺医疗科技有限公司 | 突变的肥厚型心肌病致病基因mybpc3及其应用 |
| CN115011681A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-09-06 | 河南省人民医院 | 肥厚型心肌病相关的标志分子及其在诊断肥厚型心肌病中的应用 |
| CN115820380A (zh) * | 2023-01-04 | 2023-03-21 | 深圳赛陆医疗科技有限公司 | 微流控芯片及其制备方法和应用 |
| CN115896121A (zh) * | 2022-11-17 | 2023-04-04 | 百世诺（北京）医疗科技有限公司 | 肥厚型心肌病变异基因actn2及其应用 |
| RU2814821C1 (ru) * | 2023-06-08 | 2024-03-05 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" | Набор синтетических олигонуклеотидных проб для проведения амплификации полной нуклеотидной последовательности генов саркомерных белков MYH7, TPM1, TNNT2 и TNNI3 методом ПЦР длинных фрагментов ДНК |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102965428A (zh) * | 2011-09-30 | 2013-03-13 | 康旭基因技术（北京）有限公司 | 一种检验鉴别遗传性心肌肥厚相关基因突变的试剂盒 |
| WO2014191364A1 (en) * | 2013-05-25 | 2014-12-04 | University College Dublin, National University Of Ireland | Therapies for cardiomyopathy |
| CN105969843A (zh) * | 2016-04-16 | 2016-09-28 | 杨永臣 | 一种基于mlpa的基因拷贝数和突变的高通量测序检测方法 |
| CN108034717A (zh) * | 2018-01-31 | 2018-05-15 | 中国医学科学院阜外医院 | 一种心肌肥厚基因鉴别诊断试剂盒 |
| CN108179148A (zh) * | 2018-02-11 | 2018-06-19 | 北京乐普基因科技股份有限公司 | 一种检测遗传性心肌病的探针及其应用 |
| CN108424955A (zh) * | 2018-05-09 | 2018-08-21 | 合肥中科金臻生物医学有限公司 | 一种检测多种变异类型基因的高通量测序方法及其应用 |
-
2018
- 2018-12-07 CN CN201811493190.XA patent/CN109486937A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102965428A (zh) * | 2011-09-30 | 2013-03-13 | 康旭基因技术（北京）有限公司 | 一种检验鉴别遗传性心肌肥厚相关基因突变的试剂盒 |
| WO2014191364A1 (en) * | 2013-05-25 | 2014-12-04 | University College Dublin, National University Of Ireland | Therapies for cardiomyopathy |
| CN105969843A (zh) * | 2016-04-16 | 2016-09-28 | 杨永臣 | 一种基于mlpa的基因拷贝数和突变的高通量测序检测方法 |
| CN108034717A (zh) * | 2018-01-31 | 2018-05-15 | 中国医学科学院阜外医院 | 一种心肌肥厚基因鉴别诊断试剂盒 |
| CN108179148A (zh) * | 2018-02-11 | 2018-06-19 | 北京乐普基因科技股份有限公司 | 一种检测遗传性心肌病的探针及其应用 |
| CN108424955A (zh) * | 2018-05-09 | 2018-08-21 | 合肥中科金臻生物医学有限公司 | 一种检测多种变异类型基因的高通量测序方法及其应用 |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112608994A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-04-06 | 南昌瑞因康生物科技有限公司 | 一种肥厚型心肌病及相关基因的检测方法、装置和存储介质 |
| CN113529176A (zh) * | 2021-08-02 | 2021-10-22 | 北京华瑞康源生物科技发展有限公司 | 一种遗传性肥厚型心肌病的通用基因检测文库的构建方法及其试剂盒 |
| CN114107312A (zh) * | 2021-11-12 | 2022-03-01 | 江苏百世诺医疗科技有限公司 | 突变的肥厚型心肌病致病基因mybpc3及其应用 |
| CN114107312B (zh) * | 2021-11-12 | 2022-07-22 | 江苏百世诺医疗科技有限公司 | 突变的肥厚型心肌病致病基因mybpc3及其应用 |
| CN115011681A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-09-06 | 河南省人民医院 | 肥厚型心肌病相关的标志分子及其在诊断肥厚型心肌病中的应用 |
| CN115896121A (zh) * | 2022-11-17 | 2023-04-04 | 百世诺（北京）医疗科技有限公司 | 肥厚型心肌病变异基因actn2及其应用 |
| CN115820380A (zh) * | 2023-01-04 | 2023-03-21 | 深圳赛陆医疗科技有限公司 | 微流控芯片及其制备方法和应用 |
| CN115820380B (zh) * | 2023-01-04 | 2024-01-30 | 深圳赛陆医疗科技有限公司 | 微流控芯片及其制备方法和应用 |
| RU2814821C1 (ru) * | 2023-06-08 | 2024-03-05 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" | Набор синтетических олигонуклеотидных проб для проведения амплификации полной нуклеотидной последовательности генов саркомерных белков MYH7, TPM1, TNNT2 и TNNI3 методом ПЦР длинных фрагментов ДНК |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109486937A (zh) | 一种遗传性肥厚型心肌病的基因检测文库的构建方法及其试剂盒 | |
| CN109439729A (zh) | 检测低频变异用的接头、接头混合物及相应方法 | |
| JP6968894B2 (ja) | メチル化ｄｎａの多重検出方法 | |
| CN107058538B (zh) | 一种引物组合物及其组成的试剂盒和应用 | |
| KR20190053818A (ko) | 무세포 핵산의 다중-해상도 분석 방법 | |
| CN109576800A (zh) | 一种遗传性扩张型心肌病的基因检测文库的构建方法及其试剂盒 | |
| CN109593828A (zh) | 一种遗传性心律失常的基因检测文库的构建方法及其试剂盒 | |
| CN106319031A (zh) | 反复自然流产相关微小rna及其应用 | |
| CN111154762B (zh) | 与鸡脂肪代谢相关的lncRNA、其调控靶点及其应用 | |
| CN106995851A (zh) | 扩增pkd1外显子超长片段的pcr引物、检测pkd1基因突变的试剂盒及应用 | |
| CN109628558A (zh) | 一种用于高通量测序检测基因突变的捕获探针及其应用 | |
| KR101890350B1 (ko) | 돼지의 육질 예측용 snp 마커 및 이의 용도 | |
| JPH1099085A (ja) | ヒトミトコンドリアｄｎａの多形性 | |
| KR101767644B1 (ko) | 차등 발현 유전자를 이용한 돼지의 산자수 예측용 조성물 및 예측방법 | |
| CN109609617B (zh) | 用于检测肝豆状核变性病atp7b基因突变的引物组和试剂盒 | |
| CN110050074A (zh) | 用于体液鉴定的rna序列 | |
| TWI402502B (zh) | Genome detection system | |
| JP5229895B2 (ja) | 核酸標準物質 | |
| CN104745594B (zh) | Cyp4v2基因突变体及其应用 | |
| CN114438210B (zh) | 一种基于高通量测序子宫内膜癌分子分型的文库构建方法 | |
| CN113564162B (zh) | 同源重组修复基因捕获探针组、试剂盒及其应用 | |
| KR102439855B1 (ko) | 토종닭 또는 육계 신품종을 판별하기 위한 snp 마커 조성물 및 이의 용도 | |
| JP5301281B2 (ja) | 臓器特異的遺伝子、その同定方法およびその用途 | |
| KR102085663B1 (ko) | Wrb 유전자의 메틸화 수준을 이용한 소혈관폐색증의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 조성물 | |
| CN113529176A (zh) | 一种遗传性肥厚型心肌病的通用基因检测文库的构建方法及其试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190319 |