CN115820380B - 微流控芯片及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微流控芯片及其制备方法和应用，所述微流控芯片表面修饰有引物P5和引物P7，所述引物P5和引物P7的其中一种的末端缺少1～3个碱基，或所述引物P5和引物P7的其中一种连接有可逆阻断基团。本发明的微流控芯片，引物P5和P7中的其中一种为可逆阻断的寡核苷酸引物，在文库杂交时，源自同一插入片段的一对互补序列，只有其中的一条能够在DNA聚合酶作用下进行延伸，并在桥式扩增过程中保留下来，因此，减少了DNA簇的生成，从而有效移除由互补文库模板扩增造成的测序重复率，提高了测序仪下机数据通量。
Description
技术领域
本发明属于基因测序技术领域，更具体地，本发明涉及一种微流控芯片及其制备方法和应用。
背景技术
第二代测序技术又称下一代测序技术(next generation sequencing,NGS)，由于通量高——一次测序能读取成千上万个短DNA片段(Sanger测序一次只能测一条DNA片段)，又被称为高通量测序技术(high throughput sequencing,HTSeq)。目前市场上主流的二代测序仪有很多，最为常见的是Illumina测序仪，其测序步骤主要包括文库制备、桥式PCR扩增、测序三个步骤。
在基因测序结果的生物信息学分析中，多个测序reads(读长)比对到完全相同位置的情况被称为重复。重复率是指在一组测序数据中被标记为重复的reads的比例。与重叠的reads不同，重复的reads不提供额外的信息，因此，在生物信息学分析时会被去除，称为去重。因此，测序结果的高重复率会导致测序仪下机数据量的降低，即有效数据量的减少。
导致重复reads产生的原因有很多，包括PCR过程中低文库复杂度和DNA投入量不足，过度测序，过度PCR等。上述问题可以通过探索合适的实验流程而得到优化。然而，相同或互补的插入片段在测序过程中产生了多个DNA簇(cluster)也可以造成高重复率。这种重复率常常是测序平台固有的，无法通过优化实验流程降低。
Illumina测序使用的微流控芯片其是基于传统桥式扩增而实现测序目的，在芯片表面固定了无数条寡核苷酸链引物(P5,P7)，分别可以与样品文库末端连接的接头序列P5'、P7'互补结合。含有插入片段的文库DNA在变性后，可以以单链的形式，通过接头序列P5'和P7'(P5和P7的互补序列)与芯片表面引物进行杂交。在聚合酶的作用下，芯片上的P5和P7序列将以插入片段为模板进行延伸，从而将插入片段的DNA信息转移到芯片的引物上，并在后续的桥式扩增中保留下来。相同或互补的插入片段通过传统桥式扩增芯片产生了多个相同的DNA簇，从而造成了测序过程中的高重复率。
因此，如何减少测序平台在测序过程中相同DNA簇的生成来降低高重复率，非常有意义。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种微流控芯片及其制备方法和应用，所述微流控芯片可以减少测序过程中相同DNA簇的生成，降低重复率。
实现上述发明目的的技术方案包括如下。
本发明的第一个方面，是提供一种微流控芯片，所述微流控芯片表面修饰有引物P5和引物P7，所述引物P5和引物P7的其中一种的末端缺少1～3个碱基，或所述引物P5和引物P7的其中一种连接有可逆阻断基团。
在本发明的第二个方面，是提供了一种微流控芯片的制备方法，其包括以下步骤：在带有叠氮基团修饰的微流控芯片上修饰引物P5和引物P7，所述引物P5和引物P7的其中一种的末端缺少1～3个碱基，或所述引物P5和引物P7的其中一种连接有可逆阻断基团。
在本发明的第三个方面，是提供了一种微流控芯片在二代测序中的应用。
在本发明的第四个方面，是提供了一种二代测序方法，其包括以下步骤：以上述微流控芯片为测序平台，对待测样本文库进行测序。
本发明的微流控芯片，是将传统的微流控芯片(表面修饰有引物P5和P7)，改变成引物P5和P7中的其中一种为可逆阻断的寡核苷酸引物(缺失几个碱基或连接有可逆阻断基团)，这样，在文库杂交时，源自同一插入片段的一对互补序列，虽然可能通过与引物P5和引物P7杂交到芯片表面，但是只有其中的一条能够在DNA聚合酶作用下进行延伸，并在桥式扩增过程中保留下来，而另一条序列，则只能在特定条件下可逆延伸，无法于芯片表面形成共价连接，在桥式扩增过程中，会受到变性试剂的影响而脱离芯片表面，因此，减少了DNA簇(cluster)的生成，从而有效移除由互补文库模板扩增造成的测序重复率，提高了测序仪下机数据通量。
附图说明
图1为传统桥式扩增芯片扩增测序的原理图。
图2为本发明的微流控芯片扩增测序的原理图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
在本发明的其中一些实施例中，公开了一种微流控芯片，所述微流控芯片表面修饰有引物P5和引物P7，所述引物P5和引物P7的其中一种的末端缺少1～3个碱基，或所述引物P5和引物P7的其中一种连接有可逆阻断基团。
在其中一些实施例中，所述引物P5和引物P7的其中一种的末端缺少1个碱基。
在其中一些实施例中，所述引物P5和引物P7的其中一种的末端缺少一个碱基T。
在其中一些实施例中，所述可逆阻断基团连接在引物P5或引物P7的末端。在其中一些实施例中，所述可逆阻断基团为磷酸基团。磷酸基团作为阻断基团，阻止DNA聚合酶延伸，在磷酸酶的作用下水解，可以恢复引物的可延伸性。含有磷酸基团的引物可以通过DNA固相合成的方法制备。
在其中一些实施例中，所述可逆阻断基团为官能团—CH2—CH＝CH2(切除条件：Pd，加热)、—CH2—N3(切除条件：TCEP,THPP)、—CH2—S—S—tBu(DTT)、—CH2—S—Me(切除条件：酸)或—CH2—O—CH2—CH2—CN(切除条件：TBAF/THF)。这些官能团作为阻断基团，阻止DNA聚合酶延伸，在前述切除条件下，可以恢复引物的可延伸性。含有这些官能团的引物可以通过DNA固相合成的方法制备。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：在带有叠氮基团修饰的微流控芯片上修饰引物P5和引物P7，所述引物P5和引物P7的其中一种的末端缺少1～3个碱基，或所述引物P5和引物P7的其中一种连接有可逆阻断基团。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种微流控芯片在二代测序中的应用。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种二代测序方法，其包括以下步骤：以上述微流控芯片为测序平台，对待测样本文库进行测序。本发明的二代测序方法除了需要使用切除试剂去除可逆阻断基团外，与基于桥式扩增的二代测序方法高度兼容，简言之，文库制备方法与现行illumina的商品化试剂盒的文库制备方法完全一致，文库杂交可以完全按照现有的杂交流程，测序过程，除后处理时增加一步切除外，其余可以完全按照现有的测序流程。
请参考图1和图2，分别为传统桥式扩增芯片扩增测序的原理图及本发明的微流控芯片扩增测序的原理图。传统桥式扩增芯片表面修饰有两种引物——P5和P7。含有插入片段的文库DNA(两端连接接头序列P5’或P7’——P5和P7的互补序列)在变性后，可以以单链的形式，通过接头序列与芯片表面的引物进行杂交，插入片段及其互补序列被杂交到芯片表面。在聚合酶的作用下，芯片上的P5和P7序列将以插入片段或插入片段互补链为模板进行延伸，从而将插入片段的DNA信息转移到芯片的引物上，通过桥式扩增后，得到两个序列重复的DNA簇。
而本发明的微流控芯片表面修饰有两种引物——P5和P7，P5和P7中的其中一种带有可逆阻断基团。以P7引物带有可逆阻断基团为例进行说明。含有插入片段的文库DNA(两端连接接头序列P5’或P7’——P5和P7的互补序列)在变性后，可以以单链的形式，通过接头序列与芯片表面的引物进行杂交，插入片段及其互补序列杂交到芯片表面。在聚合酶的作用下，芯片上的P5序列将以插入片段或插入片段互补链为模板进行延伸，从而将插入片段的DNA信息转移到芯片的引物上，而P7序列由于有可逆阻断基团的存在，无法进行延伸，从而无法将插入片段的DNA信息转移到芯片的引物上。通过桥式扩增、切除阻断基团后，在芯片上仅能得到一个DNA簇。
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
实施例1微流控芯片及制备方法
本实施例提供了一种用于微流控芯片，其芯片表面修饰有引物P5和末端缺少一个碱基T的P7(实现可逆阻断)。
本实施例的用于微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
1、参考现有方法，制备带有叠氮基团修饰的微流控芯片；
2、在上述微流控芯片表面修饰引物P5和末端缺少一个碱基T的P7；具体方法为：
a、向微流控芯片中通入含10uM DBCO-P5(上海生工合成)和10uM DBCO-P7-T(P7-T为P7序列末端少一个碱基T，上海生工合成)的3xSSC(缓冲液，pH 8.0)，将芯片真空密封好，置于37℃烘箱内反应过夜；
b、反应结束后，用甲酰胺将未反应的引物去除，再用3xSSC清洗芯片表面2遍，氮气吹干；
c、再向芯片中通入P7的互补链P7'，37℃孵育10分钟杂交，用3xSSC清洗芯片表面2遍，氮气吹干；
d、向芯片中通入含有Bst酶和叠氮阻断dNTP的反应液(salus pro测序试剂盒)，55℃反应5分钟；
e、用新鲜的反应液重复上一步骤一次；
f、最后用甲酰胺和3xSSC反复清洗芯片，吹干，真空密封后备用。
使用本实施例的微流控芯片进行二代测序，步骤如下：
1、文库制备
与现行illumina的商品化试剂盒的文库制备方法完全一致。
2、杂交
向芯片中通入含有Bst酶和叠氮阻断dNTP的反应液，55℃反应5分钟；用新鲜的反应液重复上一步骤一次；最后用甲酰胺和3xSSC清洗芯片。
3、扩增与测序
按照标准的桥式扩增和测序流程进行处理。
实施例2微流控芯片及制备方法
本实施例提供了一种用于微流控芯片，其芯片表面修饰有引物P5和带可逆阻断基团的P7。所述P7的可逆阻断基团为磷酸基团，即在P7的末端连接有磷酸基团。
本实施例的用于微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
1、参考现有方法，制备带有磷酸基团修饰的微流控芯片；
2、在上述微流控芯片表面修饰引物P5和3'端连接有磷酸基团的P7；具体方法为：
a、向微流控芯片中通入含10uM DBCO-P5和10uM DBCO-P7-PO4(上海生工合成)的3xSSC(缓冲液，pH 8.0)，将芯片真空密封好，置于37℃烘箱内反应过夜；
b、反应结束后，用甲酰胺将未反应的引物去除，再用3xSSC清洗芯片表面2遍，氮气吹干，真空密封后备用。
使用本实施例的微流控芯片进行二代测序，除了使用磷酸酶切除可逆阻断基团外，其他步骤都同实施例1。
实施例3微流控芯片及制备方法
本实施例提供了一种用于微流控芯片，其芯片表面修饰有引物P5和带可逆阻断基团的P7。所述P7的可逆阻断基团为—CH2—CH＝CH2，即在P7的末端连接有—CH2—CH＝CH2。
本实施例的用于微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
1、参考现有方法，制备带有—CH2—CH＝CH2基团修饰的微流控芯片；
2、在上述微流控芯片表面修饰引物P5和3'端连接有—CH2—CH＝CH2的P7；具体方法为：
a、向微流控芯片中通入含10uM DBCO-P5和10uM连接有官能团—CH2—CH＝CH2的DBCO-P7(上海生工合成)的3xSSC(缓冲液，pH 8.0)，将芯片真空密封好，置于37℃烘箱内反应过夜；
b、反应结束后，用甲酰胺将未反应的引物去除，再用3xSSC清洗芯片表面2遍，氮气吹干；
c、再向芯片中通入P7的互补链P7'，37℃孵育10分钟杂交，用3xSSC清洗芯片表面2遍，氮气吹干；
d、向芯片中通入含有Bst酶和—CH2—CH＝CH2阻断dNTP的反应液，55℃反应5分钟；
e、用新鲜的反应液重复上一步骤一次；
f、最后用甲酰胺和3xSSC反复清洗芯片，吹干，真空密封后备用。
使用本实施例的微流控芯片，采用常规的二代测序程序，即可实现样本测序。
使用本实施例的微流控芯片进行二代测序，除了使用0.05M水溶性Pd(II)催化剂(如醋酸钯(II))，40℃加热10min切除可逆阻断基团外，其他步骤都同实施例1。
试验例1本发明微流控芯片的测序数据重复率
利用本发明实施例1的微流控芯片对ecoli标准品(从ecoli菌液中提取核酸，然后通过标准illumina建库流程进行建库)进行SE100测序数据分析(4次重复)。其中，SE100测序数据分析流程如下：
1、原始下机数据质控(去除低质量序列、去除含N>5的序列、trim adaptor)，统计Total reads，Raw Q30，Clean Q30等指标；
2、将过滤后的数据与Ecoli标准品参考序列比对，标记并去除重复序列，统计Mapping rate，Unique mapping rate，Depth，Coverage，Errorrate等指标。
以采用传统的微流控芯片(传统桥式扩增方法)作为对照组。对比结果如表1所示。
表1
从表1结果可知，对近400M数据进行过滤后，得到clean reads数约75x4＝300M，使用本发明的微流控芯片进行二代测序的重复率约为54％(Duplication_rate％_of_Clean_reads)，而相同数据量的测序采用传统桥式扩增芯片得到的重复率平均为87.8％(对照组Duplication_rate％_of_Clean_reads)，因此，使用本发明的微流控芯片进行二代测序，能使重复率下降38.5％。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片用于桥式扩增；所述微流控芯片表面修饰有引物P5和引物P7，所述引物P5和引物P7的其中一种的末端缺少1~3个碱基，或所述引物P5和引物P7的其中一种的末端连接有可逆阻断基团；所述微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：在带有叠氮基团修饰的微流控芯片上修饰引物P5和引物P7，使所述引物P5和引物P7的其中一种的末端缺少1~3个碱基，或使所述引物P5和引物P7的其中一种的末端连接有可逆阻断基团。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述引物P5和引物P7的其中一种的末端缺少1个碱基。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述引物P5和引物P7的其中一种的末端缺少一个碱基T。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述可逆阻断基团为磷酸基团。
5.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述可逆阻断基团为官能团—CH2—CH=CH2、—CH2—N3、—CH2—S—S—tBu、—CH2—S—Me或—CH2—O—CH2—CH2—CN。
6.权利要求1~5任一项所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在带有叠氮基团修饰的微流控芯片上修饰引物P5和引物P7，所述引物P5和引物P7的其中一种的末端缺少1~3个碱基，或所述引物P5和引物P7的其中一种的末端连接有可逆阻断基团。
7.根据权利要求6所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述连接有可逆阻断基团的引物通过DNA固相合成的方法制备而得。
8.权利要求1所述的微流控芯片在桥式扩增中的应用，其特征在于，在进行桥式扩增时，末端缺少1~3个碱基、或末端连接有可逆阻断基团的引物无法进行延伸，从而无法将插入片段的DNA信息转移到该引物上。
9.一种二代测序方法，其特征在于，包括以下步骤：使用权利要求1所述的微流控芯片对待测样本文库进行桥式扩增，再进行测序；在进行桥式扩增时，末端缺少1~3个碱基、或末端连接有可逆阻断基团的引物无法进行延伸，从而无法将插入片段的DNA信息转移到该引物上。
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