CN114040985A - 用于对多核苷酸进行测序的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对高通量核酸测序方法的改进，并且特别是涉及对在成对测序期间进行延伸反应的方法的改进。本发明涉及一种在成对测序期间进行链再合成延伸反应的方法，其中所述链再合成延伸反应在第一测序读取与第二测序读取之间进行，并且其中所述链再合成延伸反应延伸一种或多种固定化引物以拷贝第一模板链，从而生成第二固定化模板链；其特征在于，所述链再合成延伸反应使用非热稳定链置换聚合酶在小于55℃的温度处、优选地在38℃处进行。

Description

用于对多核苷酸进行测序的方法
技术领域
本发明涉及对高通量核酸测序方法的改进，并且特别是涉及对在成对测序期间进行延伸反应的方法的改进。
背景技术
核酸测序方法已在本领域中已知多年。一些此类方法基于荧光标记的核酸类似物的连续掺入循环。在此类“边合成边测序”或“循环测序”方法中，在每次核苷酸添加后通过检测荧光标记来确定所添加的碱基的身份。
特别地，US 5,302,509描述了一种用于对多核苷酸模板进行测序的方法，该方法涉及使用DNA聚合酶或DNA连接酶执行多个延伸反应，以连续地掺入与模板链互补的标记多核苷酸。在此类“边合成边测序”反应中，通过连续掺入与模板链互补的单个核苷酸，在5'至3'方向上构建与模板链碱基配对的新多核苷酸链。在测序反应中使用的底物三磷酸核苷在3'位置处用不同的3'标记进行标记，从而允许在添加连续核苷酸时确定所掺入的核苷酸的身份。
为了进行准确测序，可将可逆链终止结构修饰或“封闭基团”添加到底物核苷酸中，以确保核苷酸以受控方式一次一个地掺入。当掺入每个单核苷酸时，封闭基团防止任何另外的核苷酸掺入到多核苷酸链中。一旦已确定最后掺入的标记核苷酸的身份，就去除标记部分和封闭基团，从而允许下一个封闭的标记核苷酸在随后一轮测序中被掺入。
“配对末端”或“成对”测序(此类术语在本文中可互换使用)的技术通常是分子生物学领域已知的，特别是在全基因组鸟枪测序的背景中。配对末端测序允许确定来自单个多核苷酸双链体上两个位置的序列的两个“读取”。配对末端方法的优点是，与以随机方式对两个独立模板中的每个模板的“n”个碱基进行测序相比，对单个模板中各自具有“n”个碱基的两个片段进行测序获得的信息显著更多。通过使用适当的组装序列信息的软件工具，可能利用以下知识，即“配对末端”序列并非完全随机，而是已知发生在单个双链体上并且因此在基因组中连接或配对。这种信息已显示出极大地帮助将全基因组序列组装成一致的序列。
配对末端测序通常通过利用专门的环形鸟枪克隆载体来执行。在特定的单个位点处切割载体之后，将待测序的模板DNA(通常为基因组DNA)插入载体中并将末端再密封以形成新的构建体。侧接插入DNA的载体序列包含用于测序引物的结合位点，该测序引物允许对相反链上的插入DNA进行测序。然而，在模板片段的两端对测序引物的需要使得基于阵列的测序技术的使用极其困难。对于通常依赖于单链模板的基于阵列的技术，通常仅可从核苷酸模板的一端进行测序，因为互补链不附接到表面。
为了使核酸测序反应的通量最大化，能够对多个模板分子进行并行测序是有利的。可使用核酸阵列技术来实现多个模板的并行处理。这些阵列通常由固定在固体支持材料上的高密度多核苷酸矩阵组成，并且通常依赖于单链模板。
已报道了可在固体支持物上进行的多核苷酸模板的双末端测序的各种方法。例如，核酸扩增方法是已知的，该方法允许将扩增产物固定在固体支持物上，以便形成由簇或“集落”组成的阵列，该簇或“集落”由多个相同的固定化多核苷酸链和多个相同的固定化互补链形成。根据这些方法制备的簇阵列上的DNA集落中存在的核酸分子可提供用于测序反应的模板。
在WO 2008/041002中，描述了一种成对测序方法，该方法包括：(a)提供固体支持物，该固体支持物在其上固定有多个双链模板多核苷酸，每个双链模板多核苷酸由在其5'端连接到固体支持物的互补的第一模板链和第二模板链形成，并且一个或多个5'-端固定化引物的多个拷贝能够与第一模板链的3'端杂交；(b)处理该多个双链模板多核苷酸，使得第一模板链与5'-端固定化引物杂交；(c)进行第一测序读取以确定该模板多核苷酸的第一区域的序列；(d)进行延伸反应以延伸固定化引物中的一者或多者以拷贝第一模板链，从而生成第二固定化模板链；(e)处理该多个第一固定化模板链和第二固定化模板链，以从固体支持物去除第一模板链；以及(f)进行第二测序读取以确定该模板多核苷酸的第二区域的序列，其中确定靶标多核苷酸的第一区域和第二区域的序列实现所述靶标双链多核苷酸的所述第一区域和所述第二区域的成对测序。
仍然存在改进测序平台的持续需要，包括增加运行速度、提高效率、增加准确度和/或简化过程。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了一种用于在成对测序期间进行链再合成延伸反应的方法，其中所述链再合成延伸反应在第一测序读取与第二测序读取之间进行，并且其中所述链再合成延伸反应延伸一种或多种固定化引物以拷贝第一模板链，从而生成第二固定化模板链；其特征在于，所述链再合成延伸反应使用非热稳定链置换聚合酶在小于55℃的温度处进行。
根据本发明的一个方面，提供了一种用于在靶标多核苷酸的第一区域和第二区域的成对测序期间进行延伸反应的方法，其中所述第一区域和所述第二区域位于同一靶标多核苷酸中，所述成对测序包括以下步骤：
(a)提供固体支持物，该固体支持物在其上固定有多个第一双链模板多核苷酸和第二双链模板多核苷酸，每个双链模板多核苷酸由第一模板链及其互补物或第二模板链及其互补物形成，其中第一模板链和第二模板链在5'端连接到固体支持物，并且其中连接到固体支持物的第一模板链或第二模板链还包含5'固定化延伸引物；
(b)选择性地去除第一模板链互补物和第二模板链互补物，并选择性地去除第二模板链，以允许第一测序引物与第一模板链杂交；
(c)通过边合成边测序技术或通过边连接边测序技术进行第一测序读取以确定该模板多核苷酸的第一区域的序列；
(d)进行延伸反应以延伸固定化引物中的一者或多者以拷贝第一模板链，从而生成第二固定化模板链；
(e)选择性地去除第一模板链，以允许第二测序引物与步骤(d)中生成的第二模板链杂交；
(f)通过边合成边测序技术或通过边连接边测序技术进行第二测序读取以确定该模板多核苷酸的第二区域的序列，其中确定该靶标多核苷酸的第一区域和第二区域的序列实现所述靶标多核苷酸的所述第一区域和所述第二区域的成对测序；
其中步骤(d)延伸反应使用非热稳定链置换聚合酶在小于55℃的温度处进行。
已令人惊讶地发现，在第一序列读取后进行的延伸反应可用非热稳定链置换聚合酶在较低的温度处进行，并且仍然保持高水平的链再合成。使用非热稳定链置换聚合酶也可导致另外的优点，包括：更快的再生时间；包括减少的处理步骤的简化方案；减少所使用的不同试剂的数量和/或所使用的试剂的量；降低化学的复杂性；和/或降低用于进行该方法的盒的复杂性。
根据另一方面，提供了一种用于对靶标多核苷酸的第一区域和第二区域进行成对测序的方法，其中所述第一区域和所述第二区域位于同一靶标多核苷酸中，所述成对测序包括如本文所述的延伸反应。
根据另一方面，提供了一种改善测序反应的数据质量的方法，该方法包括进行如本文所述的延伸反应。
附图说明
图1至图4示出了根据本发明的示例性延伸反应工作流程。
图5示出了根据本发明的方案的再生效率。
图6A和图6B示出了根据本发明的方案的优化分析。
图7示出了配对末端再合成的桥式扩增的示意图。
具体实施方式
以下特征适用于本发明的所有方面。
测序一般包括四个核心步骤：1)文库制备以形成多个可用于测序的模板多核苷酸；2)簇生成以在固体支持物上形成扩增的单模板多核苷酸的阵列；3)对簇阵列进行测序；和4)数据分析以确定靶标序列。
本发明涉及在成对测序过程期间在第一测序步骤与第二测序步骤之间进行的再生步骤(在本文中也被称为链再合成延伸反应或簇再生)。本发明涉及在所述延伸反应期间使用非热稳定链置换聚合酶。
成对测序的典型步骤是已知的并且已描述于WO 2008/041002中，其内容以引用方式并入本文。然而，将简要描述关键步骤。适用于本发明的方法已描述于WO 08/041002、WO07/052006、WO 98/44151、WO 00/18957、WO 02/06456、WO 07/107710、WO05/068656、US 13/661,524和US 2012/0316086中，其内容以引用方式并入本文。另外的信息可见于US20060024681、US 200602926U、WO 06110855、WO 06135342、WO 03074734、WO07010252、WO07091077、WO 00179553和WO 98/44152中，其内容以引用方式并入本文。
可通过固相核酸扩增以产生核酸集落来制备用于测序的合适模板。待扩增(并且随后测序)的模板通常将包括侧接已知末端的未知区，该已知末端包含例如根据申请WO07052006中所述的方法制备的通用引物，其内容全文以引用方式并入本文。例如，模板可源自基因组DNA的样品或cDNA文库。扩增可使用类似于WO 98/44151、WO 00/18957、WO0206456或WO07107710中所述的程序进行，其内容以引用方式并入本文。如果模板核酸通过固相核酸扩增形成，则这些非靶标序列可源自用于扩增反应的引物。另选地，可将非靶标序列连接到片段化靶标序列以将它们掺入核酸分子中。
例如，待用通用引物扩增的合适核酸可通过修饰包含待扩增(和测序)的靶标区域的多核苷酸来制备，该修饰是通过向待扩增的靶标多核苷酸的5'端和3'端添加已知的衔接子序列来进行的。
衔接子通常是可通过常规手段合成的短寡核苷酸。衔接子可通过多种方式(例如亚克隆、连接等)附接到靶标核酸片段的5'端和3'端。更具体地，将两个不同的衔接子序列附接到待扩增的靶标核酸分子，使得一个衔接子附接在靶标核酸分子的一端(即5'端或3'端)，并且另一衔接子附接在靶标核酸分子的另一端(即，分别的3'端或5'端)。包含侧接衔接子的靶标核酸序列的所得构建体在本文中可被称为“底物核酸构建体”或“模板多核苷酸”或“模板构建体”。在用衔接子序列修饰之前，模板多核苷酸可有利地进行大小分级分离。
衔接子序列含有允许使用固定在固体支持物上的正向和反向引物(例如S1和S2)在固体支持物上扩增这些分子以形成簇的序列(这些的一般结构在下文进一步详细描述)。衔接子中的这些序列在本文中可被称为“引物结合序列”。为了用作核酸扩增的模板，模板构建体的单链必须含有与正向扩增引物(例如S1)互补的序列，使得正向引物分子可通过拷贝模板结合并引发互补链的合成，以及含有与反向扩增引物(例如S2)互补的序列，使得反向引物分子同样可结合并引发第二互补链的合成。允许与固定化引物分子杂交的衔接子中序列的长度通常为约20-40个核苷酸，尽管本发明不限于该长度的序列。
扩增引物中序列S1和S2的精确同一性，以及因此衔接子中的同源序列的精确同一性，对于本发明通常是不重要的，只要引物分子能够与衔接子序列相互作用以便指导PCR扩增即可。PCR引物的设计标准通常是本领域普通技术人员众所周知的。
模板多核苷酸也可被制备成还含有标签或索引序列。例如如在申请WO05068656中所述，标签序列的使用允许在同一测序运行中分析多个不同样品，同时保留每个样品的同一性，该申请的内容全文以引用方式并入本文。标签可在第一读取的结束和/或第二读取的开始(或结束)时读取。本发明不限于每簇两个读取，可简单地通过使第一延伸测序引物去杂交并且在链再合成延伸反应之前或之后再杂交第二引物来获得每簇三个或更多个读取。制备用于索引的合适样品的方法描述于例如US60/899221中。
在一个示例中，模板多核苷酸在5'至3'方向上包括第一引物结合序列(例如P5)、索引序列(例如i5)、第一测序结合位点(例如SBS3)、插入序列、第二测序结合位点(例如SBS12')、第二索引序列(例如i7')和第二引物结合序列(例如P7')。在另一个实施方案中，模板在3'至5'方向上包括第一引物结合位点(例如与P5互补的P5’)、索引序列(例如与I5互补的i5')、第一测序结合位点(例如与SBS3互补的SBS3')、插入序列、第二测序结合位点(例如与SBS12互补的SBS12)、第二索引序列(例如与I7互补的i7)和第二引物结合序列(例如与P7’互补的P7)。任一模板在本文中被称为“模板链”或“模板多核苷酸”。引物结合序列、索引序列和测序结合位点的组合在本文中可被称为衔接子序列，并且单个插入序列侧接5'衔接子序列和3'衔接子序列。
P5引物结合序列的序列可包括SEQ ID NO:1或其变体，P5'衔接子的序列可包括SEQ ID NO:3或其变体，P7衔接子的序列可包括SEQ ID NO:2或其变体，P7'衔接子的序列可包括SEQ ID NO:4或其变体。在实施方案中，变体与SEQ ID NO:1、2、3或4具有至少80％的序列同一性。更优选地，该变体与SEQ ID NO:1、2、3或4具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的总序列同一性。
SEQ ID NO:1：P5序列
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC
SEQ ID NO:2：P7序列
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
SEQ ID NO:3 P5'序列(与P5互补)
GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT
SEQ ID NO:4 P7'序列(与P7互补)
ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
文库制备后的下一个核心步骤是簇生成以在固体支持物上形成扩增的单模板多核苷酸的阵列。如上文所解释，为了进行模板多核苷酸的扩增，将至少两种扩增引物的混合物固定或“接枝”到合适的固体支持物的表面上。
如本文所用，术语“固体支持物”是指不溶于含水液体的刚性基底(或至少足够刚性的，使得在吸收液体时基本上不膨胀并且在通过干燥除去液体时基本上不收缩)。本发明可利用由基底或基质(例如，载玻片、聚合物小珠等)组成的固体支持物，该基底或基质已例如通过施加包含反应性基团的中间材料层或涂层被官能化，这些反应性基团允许共价附接到生物分子诸如多核苷酸。固体支持物可以是平面基底。固体支持物可以是层状基底。固体支持物可以是小珠。可用于本公开的结构化基底或方法的材料的另外的示例描述于美国序列号13/661,524和美国专利申请公布2012/0316086 A1中，这些文献中的每一篇均以引用方式并入本文。
作为通过固相扩增的集落生成的第一步，可将正向和反向扩增引物的混合物固定或“接枝”到合适的固体支持物的表面上。
当提及将分子(例如，核酸)固定或附接到固体支持物时，术语“固定化”和“附接的”在本文中可互换使用，并且除非另外明确地或通过上下文指明，否则这两个术语旨在涵盖直接或间接、共价或非共价附接。在本发明的某些实施方案中，共价附接可以是优选的，但通常所需的是分子(例如，核酸)在旨在使用支持物的条件下(例如，在需要核酸扩增和/或测序的应用中)保持固定或附接到支持物。当提及核酸与其他核酸的附接时，本文使用术语“固定化”和“杂交的”，并且通常是指互补核酸之间的氢键。
在一个示例中，接枝步骤通常涉及将引物在5'端处或附近共价附接到支持物，留下3'端游离用于引物延伸。
扩增引物通常是具有以下结构的寡核苷酸分子：
正向引物：A-L-S1
反向引物：A-L-S2
其中A表示允许附接到固体支持物的任选部分，L表示任选的接头部分，并且S1和S2是允许包含期望(完全或部分)测序的靶标区域的底物核酸分子扩增的多核苷酸序列。扩增引物中的序列S1和S2可对期望扩增的特定靶标核酸具有特异性，但在其他实施方案中，序列S1和S2可以是“通用”引物序列，其使得任何已被修饰(例如，用如上所述的衔接子)以使得能够用通用引物扩增的已知或未知序列的靶标核酸能够扩增。
接枝到固体支持物上的引物的混合物通常将包含基本上等量的正向引物和反向引物。
基团A可以是能够(优选地共价)附接到固体支持物的任何部分(包括非核苷酸化学修饰)。基团A可包含存在于多核苷酸链的5'端的含硫亲核物质诸如硫代磷酸酯。另选地，当使用合适的化学方法将接头或核酸直接附接到固体支持物上时，可省略基团A。
L表示可被包含在内但不是严格必需的接头或间隔物。可包含接头以便确保作为扩增反应的结果生成的固定化多核苷酸分子中存在的切割位点定位在距固体支持物的最佳距离处，或者接头本身可含有切割位点。
接头可以是具有式(CH2)n的含碳链，其中“n”为1至约1500，例如小于约1000，优选地小于100，例如2-50，特别是5-25。然而，可采用多种其他接头，对它们的结构的唯一限制是接头在旨在随后使用多核苷酸的条件(例如用于DNA扩增和测序的条件)下是稳定的。
也可使用不仅由碳原子组成的接头。此类接头可包括聚乙二醇(PEG)
主要由碳原子链和PEG形成的接头可被修饰以便含有中断链的官能团。此类基团的示例包括酮、酯、胺、酰胺、醚、硫醚、亚砜、砜。可单独地或与此类官能团的存在组合地采用烯烃、炔烃、芳族或杂芳族部分或环状脂族部分(例如环己基)。环己基环或苯基环可例如通过它们的1-位和4-位连接到PEG或(CH2)n链。
作为上述接头的替代方案，其主要基于饱和碳原子的线性链，任选地被不饱和碳原子或杂原子中断，可设想基于核酸或单糖单元(例如右旋糖)的其他接头。利用肽作为接头也在本发明的范围内。
在另外的实施方案中，接头可包含一个或多个核苷酸。此类核苷酸在本文中也可被称为“间隔”核苷酸。通常，可包含1至20、更优选地1至15或1至10并且更特别地2、3、4、5、6、7、8、9或10个间隔核苷酸。最优选地，引物将包含10个间隔核苷酸。优选地使用多聚T间隔物，尽管也可使用其他核苷酸及其组合。在一个优选的实施方案中，引物可包含10T间隔核苷酸。
为了进行引物接枝反应，在允许部分A(如果存在)与支持物之间或核酸与支持物之间反应的条件下将扩增引物的混合物施加到固体支持物上。固体支持物可被合适地官能化以允许经由部分A共价附接。接枝反应的结果是引物基本上均匀地分布在固体支持物的至少一部分上。在固体支持物包括纳米孔的情况下，在优选的实施方案中，引物被限制在纳米孔的位置，并且不存在于固体支持物的间隙区域中。
在附接扩增引物后，在允许模板与固定化引物之间杂交的条件下使固体支持物与待扩增的模板多核苷酸接触。在上文给出的示例中，模板多核苷酸上的P5'和P7'引物结合序列与存在于固体支持物表面上的固定化引物(分别为P5和P7)互补。如本文所用，“'”表示互补链。
通常在合适的杂交条件下将模板添加到游离溶液中，这对于技术人员将是显而易见的。通常，杂交条件是例如在40℃处的5xSSC。然后可进行固相扩增(例如通过与WO 98/44151的方法类似的方法)，扩增的第一步是引物延伸步骤，其中将核苷酸添加到与模板杂交的固定化引物的3'端以产生完全延伸的固定化互补链(或多核苷酸双链体)。因此，该互补链在其3'端包含能够结合或“桥接”固定在固体支持物上的第二引物分子的序列—从而导致使用互补链作为模板从第二固定化引物的延伸开始的新一轮扩增。
然后，随后的扩增反应可基本上如WO 98/44151所述或WO 00/18957中的那些进行，这将导致产生由“桥式”扩增产物的集落组成的簇阵列。这里，扩增产物的两条链将在5'端处或附近被固定在固体支持物上，这种附接源自扩增引物的原始附接。通常，每个集落内的扩增产物将源自单个模板(靶标)分子的扩增。另选地，当生成簇时，可使用其他扩增程序，并且将是技术人员已知的。例如，扩增可以是使用链置换聚合酶的等温扩增；或者可以是如WO 2013/188582中所述的排除扩增。
使得桥式扩增产物能够随后切割所需的修饰可有利地包含在一种或两种扩增引物中。此类修饰可放在扩增引物中的任何位置，只要这不会在很大程度上影响扩增反应的效率。因此，能够切割的修饰可形成接头区域L的一部分或序列S1或S2中的一者或两者。以举例的方式，扩增引物可被修饰成尤其包含二醇键、尿嘧啶核苷酸、核糖核苷酸、甲基化核苷酸、肽接头、PCR终止物或限制性内切核酸酶的识别序列。因为通过固相扩增制备的所有核酸分子将最终含有源自扩增引物的序列，所以引物中的任何修饰都将被携带到扩增产物中。
在此上下文中，术语“固相扩增”是指类似于标准PCR的扩增反应，不同的是正向和/或反向扩增引物在5'端或其附近固定(例如共价附接)到固体支持物。因此，PCR反应的产物是通过扩增引物延伸得到的延伸链，该扩增引物在5'端或其附近固定在固体支持物上。固相扩增本身可例如使用类似于WO 98/44151和WO 00/18957中所述的那些程序进行。
多核苷酸双链体通常将由两条互补的多核苷酸链形成，该两条互补的多核苷酸链由通过磷酸二酯键接合的脱氧核糖核苷酸组成，但可另外包含一个或多个核糖核苷酸和/或非核苷酸化学部分和/或非天然存在的核苷酸和/或非天然存在的主链键。特别地，双链核酸可在一条或两条链的5'端处包含非核苷酸化学部分，例如接头或间隔物。作为非限制性示例，双链核酸可包含甲基化核苷酸、尿嘧啶碱基、硫代磷酸酯基团、核糖核苷酸、二醇键、二硫键、肽等。为了允许切割，或为了赋予一些其他期望的特性，例如为了能够共价附接到固体支持物，或为了充当间隔物以将切割位点定位在距固体支持物的最佳距离处，可包括此类非DNA或非天然修饰。
在多核苷酸链仅部分地与互补链杂交的情况下—例如，长多核苷酸链与短核苷酸引物杂交，其在本文中仍可被称为单链核酸。
下一个核心步骤是对簇阵列进行测序。
为了便于测序，优选将其中一条链从表面去除，以允许测序引物与剩余的固定化链有效杂交—例如去除第二条链，留下第一条链，或反之亦然。用于线性化的合适方法描述如下，并且在申请号WO07010251中更详细地描述，其内容全文以引用方式并入本文。
变性(和随后的切割链再退火)导致产生部分或基本上单链的测序模板。然后可通过将测序引物与模板的单链部分杂交来引发测序反应。在本发明的实施方案中，测序可使用如下所述的链置换聚合酶进行。
该方法可能需要执行两个测序反应。第一测序反应由从溶液中添加的第一测序引物引发并导致第一模板链的测序，或者可由从固定化双链体中释放的固定化引物的3'-羟基引发。第二测序反应由可固定或施加到溶液中的第二测序引物引发。溶液中的测序引物与(第一)模板链的杂交通过在促进引物与模板退火的条件下使引物和模板链接触来实现。此类条件将通常是分子生物学领域的技术人员众所周知的。然而，该方法允许通过从模板的一条链获得序列读取，使用固定化引物拷贝该链(如下文所解释)，释放第一条链并对第二条链即拷贝的链进行测序，来从模板多核苷酸的两端获得序列数据。这给出了来自原始片段的两端的序列读取。
因此，在一个示例中，本发明涉及用于对多核苷酸模板的区域进行测序的方法，这些区域在本文中被称为用于序列测定的第一区域和第二区域。用于序列测定的第一区域和第二区域位于多核苷酸模板的两端(模板及其互补物在本文中分别被称为第一模板链和第二模板链)。一旦已知链的序列，其互补链的序列也是已知的，因此术语两个区域可同样适用于单链模板的两端或双链模板的两端，其中第一区域和其互补物是已知的，并且第二区域及其互补物是已知的。
在一个示例中，第一测序读取可包括第一测序引物(读取1测序引物)与第一测序结合位点(例如SBS3’)的结合，随后是互补链的合成和测序。这导致插入序列的测序。在第二步中，索引测序引物(例如i7测序引物)结合到第二测序结合位点(例如SBS12)，从而导致索引序列的合成和测序(例如i7引物的测序)。簇再生(如本文所述)之后是第二序列读取。第二测序读取可包括索引测序引物(例如i5测序引物)与模板上的第一测序结合位点的互补序列(例如SBS3)的结合，以及索引序列(例如i5)的合成和测序。在第二步中，结合到引物(例如i7测序引物)的互补序列的第二测序引物(读取2测序引物)结合到第二测序结合位点(例如SBS12')，从而导致在反向方向上的插入序列的合成和测序。换句话讲，SBS3是读取1的测序引物，SBS12是读取2的测序引物，SBS3'是i5的测序引物，SBS12'是i7的测序引物。
测序可使用任何合适的“边合成边测序”技术进行，其中核苷酸或寡核苷酸被连续地添加到通常通过对测序引物进行退火来提供的游离3'羟基，从而导致在5'至3'方向上合成多核苷酸链。在一个具体实施方案中，在每次添加后确定所添加的核苷酸或寡核苷酸的性质。
一种特定的测序方法依赖于使用可充当可逆链终止子的经修饰的核苷酸。合适的核苷酸描述于WO04018497中。一旦将经修饰的核苷酸掺入与待测序模板的区域互补的生长的多核苷酸链中，就没有游离3'-OH基团可用于引导进一步的序列延伸，并且因此聚合酶不能添加另外的核苷酸。一旦已确定掺入生长链中的碱基的性质，就可去除3'封闭以允许添加下一个连续核苷酸。通过对使用这些修饰核苷酸得到的产物进行排序，可能推断出DNA模板的DNA序列。如果经修饰的核苷酸中的每一者具有附接到其上的不同标记，已知该标记对应于特定的碱基，这有助于区分在每个掺入步骤中添加的碱基，则可在单个实验中进行此类反应。合适的标记描述于PCT申请PCT/GB/2007/001770中，其内容全文以引用方式并入本文。另选地，可进行含有单独添加的经修饰的核苷酸中的每一者的单独反应。
经修饰的核苷酸还可携带便于其检测的标记。在一个具体实施方案中，标记是荧光标记。每种核苷酸类型可携带不同的荧光标记。然而，可检测标记不必是荧光标记。可使用允许检测核苷酸掺入DNA序列中的任何标记。
一种用于检测荧光标记的核苷酸的方法包括使用对标记的核苷酸具有特异性波长的激光，或使用其他合适的照明源。来自掺入的核苷酸上的标记的荧光可通过CCD相机或其他合适的检测方式来检测。合适的检测方式描述于PCT/US2007/007991中，其内容全文以引用方式并入本文。一旦完成第一测序读取，并且已确定了足够的读取长度，则可拷贝链的其余部分。如果3'-羟基最初是用切口酶产生的，则将可能在相同位置重新产生新的3'-羟基，并从该位置延伸，然而同样可能继续从掺入的核苷酸的3'-羟基拷贝第一模板链作为测序反应的一部分。这种用所有四种未标记的核苷酸和聚合酶的延伸反应将拷贝第一模板的所有碱基。固定化引物可含有切口酶的限制性位点，并且用限制性酶处理可缩短固定化引物或固定化模板双链体以释放未封闭的3'羟基。
在双链体的仅一条链中生成游离3'-羟基的方法包括用切口酶处理或化学处理以去除特定核苷酸。合适的切口酶是本领域众所周知的，并且优选地将在其结合位点3'远端的位点切割，以避免必须对源自已知切口位点的碱基进行测序。切口酶应仅切割其中最接近表面的末端处的一条链。合适的限制性酶的示例将包括Nt.BstNBI和Nt.AIwI，其除了释放的3'-羟基之外没有限定序列的碱基。
在第一测序运行之后，核苷酸经历再生步骤(如本文进一步讨论的)以使得能够进行第二测序运行。因此，核苷酸可被脱保护以允许复制模板链的进一步循环。如果核苷酸携带双脱氧修饰，则这可使用核酸外切酶或具有核酸外切酶活性的聚合酶去除。因此，可使用如所描述的两个接枝引物制备簇，在第一测序反应期间未使用的引物被封闭，然后去封闭以允许模板链的进一步复制。扩增引物的一部分可用封闭3'羟基防止在扩增循环中延伸的修饰附接到表面。这实际上意味着用三种或更多种扩增引物而不是两种扩增引物处理表面。扩增引物中的至少两种扩增引物应包含相同序列的区域，但至少一种引物将不易受线性化过程期间用于去除第二引物的条件的影响，并将含有3'-封闭部分。封闭部分可采取化学封闭的形式，诸如可用膦试剂去除的叠氮甲基、可用磷酸酶去除的酶促可移除的诸如磷酸酯基团，或者可以是可使用3'-5'核酸外切除去的核苷基团的形式。此类核苷修饰包括脱碱基位点，其可如所述被去除，或2',3'双脱氧核苷酸，其可通过具有核酸外切酶活性的聚合酶去除。另外的修饰包括使用可与限制性酶的识别序列形成自互补区的寡核苷酸序列。用限制性酶处理应切割发夹链并释放具有游离3'羟基的较短序列。在第一次测序运行完成后，对表面进行处理以使引物去封闭，这将允许剩余的第一链与脱保护的引物杂交，并重新拷贝已经测序的链。
一旦已去除第一测序读取的测序产物，第一模板链就将保持固定在固体支持物上。由于第一模板链在其3'端包括与固定在固体支持物上的第二引物互补的序列，所以它能够结合或“桥接”该第二引物分子。然后可如本文进一步所述的进行延伸反应，以延伸固定化引物中的一者或多者，从而拷贝第一模板链，并生成第二固定化模板链，随后在第二序列读取中对其进行测序。因此，可再生簇以使得能够进行第二序列读取。该步骤可重复多次以获得配对末端再合成。图7示出了该循环的一个示例。这里，桥式扩增需要三种试剂的循环来执行多轮扩增。首先，使用变性剂(LDR)使簇在55℃处变性。然后将H2O推过固体支持物(例如流通池)以促进变性剂的去除。然后使用链置换聚合酶来延伸可用的3'表面引物。可如下所述重复该循环用于配对末端再合成。
同样，这再生其中两条链都被固定的模板双链体。关于在成对测序期间(即第一测序读取与第二测序读取之间)的延伸反应，使用链置换聚合酶进行延伸。
在另外的步骤中，在开始测序前用多个碱基与模板互补地延伸游离3'-羟基引物可能是有利的。这既提高了固定化双链体的解链温度，又有助于防止模板链在测序期间与其他固定化引物再次杂交，这引起簇内的定相问题。在磷酸酶步骤已从固定化引物去除磷酸酯基团之后进行连接步骤。添加20-30个碱基的序列可通过与邻近游离3'-羟基杂交的5'-磷酸修饰引物的连接反应来执行。连接酶诸如T4 DNA连接酶可用于密封间隙。在去除U核苷酸的USER处理的情况下，引物的5'-碱基将是T，其替换被切除的U。为了有效地进行杂交步骤，必须通过如上所述的5'-3'核酸外切处理来去除5'-非固定化链。具有游离3'-羟基的此类固定化延伸引物被描述为延伸的5'-锚定或延伸的固定化引物，并且此类延伸引物的生成仅是处理多个模板多核苷酸使得第一模板链与在其5'-端固定在固体支持物上的引物杂交所涉及的步骤中的一个步骤。
在一个示例中，在进行上述延伸反应之前，延伸固定化引物可能是有利的。可使用具有延伸超过固定化引物的3'端的序列的杂交寡核苷酸来执行延伸，其序列也是与模板的末端处的对应区域相同的序列。该延伸部分可用作延伸固定化引物的基础，并且因此延伸的引物与固定化模板链互补。延伸的引物由于其长度增加而可提高链再合成步骤的效率。一旦生成第一链的互补序列，就可从表面去除第一链。
从表面去除第一模板允许同样从3'端对新的单链第二模板进行测序。因此，可对原始固定化模板的两端进行测序。第一链可通过合适的正交线性化处理步骤诸如二醇切割或去除8-氧代-G残基来去除，并且在第一模板链变性之后，第二测序引物可与第二模板链杂交，并且对第二模板链进行测序。这种正交线性化策略还允许从模板的两端进行读取。
第一模板链的选择性去除或线性化也可以多种其他方式实现。允许测序引物在溶液中杂交的线性化不必在模板链上留下功能性3'-羟基，并且可切割一条链或两条链。因此，如本文所用，术语“线性化”是指选择性去除互补链。如果扩增引物中的一种扩增引物被固定，使得其可从表面被切割，则所得的双链DNA可使用热或化学变性条件变成单链，从而得到含有引物杂交位点的单链分子。该单链分子可与溶液中的测序引物杂交，以允许对固定化模板链进行测序读取。所述切割位点是允许通过化学、酶促或光化学手段对第一模板链进行受控切割的位点。可使用任何合适的酶促、化学或光化学切割反应来切割。许多合适的方法描述于WO07010251中，其内容全文以引用方式并入本文。切割反应可导致被切割的链的一部分或全部被去除。合适的切割方式包括，例如，限制性酶消化，在这种情况下，切割位点是用于引导双链体模板的一条或两条链切割的酶的适当限制位点；脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸之间的键的RNA酶消化或化学切割，在这种情况下，切割位点可包括一个或多个核糖核苷酸；用还原剂(例如TCEP)化学还原二硫键，在这种情况下，切割位点应包括适当的二硫键；用高碘酸盐化学切割二醇键，在这种情况下，切割位点应包括二醇键；生成脱碱基位点并随后水解等。
在一个实施方案中，切割可发生在模板多核苷酸双链体的一条或两条链中的切割位点处，该模板多核苷酸双链体包含非天然核苷酸、核糖核苷酸或非核苷酸化学修饰中的一种或多种或任何组合。
用于本发明方法中的合适切割技术包括但不限于在WO2008041002中详细描述的以下技术：i)化学切割，ii)脱碱基位点切割，iii)核糖核苷酸切割，iv)光化学切割，v)PCR终止物，vi)肽接头切割，vii)酶消化。
然后将第二测序引物与模板的拷贝链杂交，并如上所述经由向第二测序引物中连续添加核苷酸进行测序反应，从而确定靶标多核苷酸的第二区域的序列。
本文所述的多核苷酸双链体形成由许多此类第一双链体和第二双链体组成的单个簇或集落的一部分，并且该簇或集落本身通常将形成许多此类簇或集落的阵列的一部分。术语“簇”和“集落”在全文中可互换使用并且是指由多个相同的固定化核酸链和多个相同的固定化互补核酸链组成的固体支持物上的离散位点。术语“簇阵列”是指由此类簇或集落形成的阵列。阵列上的每个多核苷酸双链体含有相同的通用引物识别区域，以允许使用相同的引物对每个簇进行测序。如上文所解释，然后将第一测序引物与第一模板链杂交，并经由向第一测序引物中连续掺入核苷酸或寡核苷酸进行测序反应，从而确定靶标多核苷酸的第一区域的序列。
关键特征是两个测序运行可在簇阵列上的同一簇或集落中发生。在此类阵列上，每个集落内的每个双链体将包含相同的双链靶标多核苷酸，而不同的集落可由包含不同双链靶标多核苷酸的双链体形成。在一个具体的实施方案中，给定簇阵列上的至少90％、更特别地至少95％的集落将由包含不同双链靶标多核苷酸的模板双链体形成，尽管在阵列上的每个单独集落内，所有模板双链体将包含相同的双链靶标多核苷酸。
上文概述的测序方法不是限制性的，并且基本上可使用依赖于将核苷酸连续掺入到多核苷酸链中的任何测序方法。合适的技术包括例如焦磷酸测序(TM)、FISSEQ(荧光原位测序)、MPSS(大规模平行签名测序)和通过基于连接的方法测序。待测序的靶标双链多核苷酸可以是任何期望进行测序的多核苷酸。靶标多核苷酸可以是已知的、未知的或部分已知的序列，诸如例如在重新测序应用中。使用下面详细描述的模板制备方法，可从基本上任何已知、未知或部分已知序列的双链靶标多核苷酸开始制备模板阵列。通过使用阵列，可并行对相同或不同序列的多个靶标进行测序。成对方法的特定应用是对基因组DNA片段的测序。该方法在鉴定基因组重排中提供了特别的优点，因为已知使用该方法针对每个靶标分子获得的序列的两个区域在基因组中在彼此的一定距离内连接，这取决于起始靶标分子的大小。
本发明已鉴定出在第一测序读取之后和在第二测序读取之前的再生步骤期间可有利地使用非热稳定链置换聚合酶。换句话讲，非热稳定链置换聚合酶可用于在第一模板链测序之后再合成该链的互补链。如上文所解释，这被称为配对末端再合成。
“非热稳定聚合酶”旨在涵盖被优化以在较低温度处操作并与热稳定聚合酶如BST形成对照的聚合酶。
“链置换聚合酶”描述置换合成期间遇到的下游DNA的能力。
在一个实施方案中，根据本发明的非热稳定聚合酶具有低于55℃的最佳温育温度。在另外的实施方案中，根据本发明的非热稳定聚合酶具有低于50℃、低于45℃、低于40℃、低于39℃、处于或低于38℃、约38℃或约37℃的最佳温育温度。特别优选的非热稳定聚合酶具有约38℃的最佳温育温度。
在另外的实施方案中，根据本发明的非热稳定聚合酶具有低于55℃的最佳活性温度。在另外的实施方案中，根据本发明的非热稳定聚合酶具有低于50℃、低于45℃、低于40℃、低于39℃、处于或低于38℃、约38℃或约37℃的最佳活性温度。特别优选的非热稳定聚合酶具有约38℃的最佳活性温度。
根据本发明的合适的非热稳定链置换聚合酶可以例如通过New EnglandBioLabs,Inc.发现，并且包括phi29、Bsu、Klenow和DNA聚合酶I(大肠杆菌)及其功能片段。特别优选的聚合酶是Bsu。在另选的实施方案中，聚合酶是Bsu大片段。
通过使用非热稳定聚合酶，延伸反应可在小于55℃、优选地小于50℃、优选地小于40℃、优选地38℃+/-2℃、优选地38℃+/-1℃、优选地38℃的温度处进行。
链置换聚合酶的使用也带来了优点并且可克服模板链与其自身再退火的挑战。链置换聚合酶的使用有助于确保模板链与相关引物退火以实现有效的延伸。
在第一测序读取之后，在再生步骤期间使用非热稳定聚合酶产生许多优点。以举例的方式，先前已在该再生步骤期间使用热稳定的BST，这需要12个再生循环以实现最佳再合成％。相比之下，非热稳定聚合酶已显示在仅三个循环后实现可接受的再合成。参见例如，实施例中的PETv2 3x5m方案，其在仅3个循环后实现79.4％的再合成。
在配对末端再合成期间使用非热稳定聚合酶是反直觉的，因为该步骤在两个测序步骤之间，这两个测序步骤均使用可在60℃或65℃处操作的合适SBS聚合酶在高温处进行。
如果在初始簇扩增期间使用相同的聚合酶以生成随后进行测序的簇阵列，则在配对末端再合成期间使用非热稳定聚合酶还可导致进一步的优点。以举例的方式，如果将ExAmp(包含非热稳定链置换聚合酶BSU的扩增混合物)用于初始簇生成步骤和配对末端再合成步骤两者，则减少了机器内使用的试剂总数并且还降低了盒复杂性。此类优点可导致COGS优化和方案简化。
在一个实施方案中，步骤(d)通过多个延伸和变性的循环重复。这可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个循环；优选地2至5个循环、2至4个循环、3至5个循环、3个循环或4个循环；最优选地3个循环。与需要更高循环数的聚合酶相比，本发明可有效地完成再生步骤。
在一个实施方案中，每个循环可持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或30分钟。特别优选的循环类型是5分钟。在具体实施方案中，步骤(d)可包括以下延伸和变性的循环：3×5min；3×30min；12×2min；6×4min；2×12min或3×5min。在具体实施方案中，优选3×5min。
在优选的实施方案中，成对测序期间的延伸反应包括延伸和变性的循环。
本发明涵盖任何合适的变性剂。合适的变性剂包括：酸性核酸变性剂，诸如乙酸、HCl或硝酸；碱性核酸变性剂，诸如NaOH；或其他核酸变性剂，诸如DMSO、甲酰胺、甜菜碱、胍、水杨酸钠、丙二醇或脲。优选的变性剂是甲酰胺和NaOH，优选地甲酰胺。
在一个实施方案中，变性基本上在延伸反应的温度处进行。
在一个特别优选的实施方案中，延伸/变性循环包括三个延伸循环，其间具有两个变性循环。在另外优选的实施方案中，变性循环在第一延伸循环之前进行。此类实施方案包括变性和延伸的三个交替循环。甲酰胺是最优选的变性剂。
在一个实施方案中，延伸反应(d)在比测序读取步骤低的温度处进行。测序步骤通常将使用被优化至更高温度的不同聚合酶(例如SBS聚合酶)。
在一个实施方案中，该多个双链模板多核苷酸通过使用与延伸反应步骤(d)中使用的聚合酶相同的聚合酶进行扩增反应生成。
在步骤(a)中固定在所述固体支持物上的多个双链模板多核苷酸可优选地是簇。本发明涵盖生成所述簇的任何方法，但一种优选的方法使用桥式扩增。在优选的实施方案中，生成簇的所述桥式扩增使用与用于步骤(d)延伸反应的相同的非热稳定链置换聚合酶。此类方法导致进一步的方法学流程化，因为它可使整个过程中使用的扩增混合物整体最小化。
因此，单个非热稳定链置换聚合酶可用于所有扩增步骤以生成或再生固定化模板多核苷酸。在测序步骤期间可使用第二聚合酶，这意味着整个过程可用两种聚合酶完成。此类流程化方法提供了各种过程优点、复杂性降低和COGS节省。
术语“簇”和“集落”在全文中可互换使用并且是指由多个相同的固定化核酸链和多个相同的固定化互补核酸链组成的固体支持物上的离散位点。术语“簇阵列”是指由此类簇或集落形成的阵列。
本发明提供了一种用于对靶标双链多核苷酸的第一区域和第二区域进行成对测序的方法，其中所述第一区域和所述第二区域位于同一靶标双链多核苷酸中，所述成对测序包括如本文所公开的步骤(a)至(f)。
该方法可用于从簇阵列上的双链模板中的每个双链模板获得测序信息的两个连接或配对的读取。
本发明提供了一种改善测序反应的数据质量的方法，该方法包括进行如本文所公开的延伸反应。
现在将通过以下非限制性实施例来描述本发明。
实施例
配对末端测序可按照WO 2008/041002中描述的方法(参见例如实施例13)进行，其中在靶标片段的第一测序步骤后进行下述修饰。成功完成读取1测序后：
1.使用再合成混合物酶促进行流动细胞表面结合的i5引物的脱保护，该再合成混合物包含缓冲液和T4多核苷酸激酶(诸如购自Illumina,Inc的JRM)。
2.接下来，用离子缓冲液(例如购自Illumina Inc的BB6缓冲液)洗涤流通池。
3.用低偏置变性试剂(LDR-100％甲酰胺)使簇变性，以从读取1中去除延伸的测序引物。
4.使流通池温度达到38℃。
5.为了再生双链簇(再合成)，将随后三轮的LDR(100％甲酰胺)和ExAmp(包含非热稳定链置换聚合酶BSU的扩增混合物)在38℃处如下等温循环。LDR和ExAmp购自Illumina,Inc。
5a.LDR以大的冲洗系数冲洗通过流通池，旨在完全置换流通池的内容物。
5b.接下来，保持大的冲洗系数将ExAmp冲洗通过流通池并温育5分钟。
5c.重复步骤5a和5b，共进行三轮扩增。
6.接下来，对新的双链簇进行线性化以用于读取2，并且如WO 2008/041002中进行引物杂交。
图1示出了根据本发明的工作流程的图形表示。工作流程PETv2示出了用JRM脱保护，随后用缓冲液洗涤。然后用LDR使簇变性，随后使热循环降至38℃。此后，使用ExAmp(含有BSU)和LDR(100％甲酰胺)进行三轮再生和变性。
图2示出了另选工作流程PETv1，其类似于图1工作流程，但其不包括在再生之间用LDR进行的变性，而是进行x3轮连续再生。图3和图4与图1和图2成镜像，但还包括线性化。
在实施方案中，SSC也可用于根据本发明的方案中。例如，簇可在用SSC再合成之前和/或之后洗涤。
针对其他潜在的工作流程评估这些工作流程的再生效率，并且结果示于图5中，其示出了由利用根据本发明的配对末端转变方案的HSX测序运行计算的再合成％，如下表1所述。
详细信息 再合成％ SD n
PETv1 3×5min 64 2.6 (n＝15)
PETv1(延伸)3×30min 84 NA (n＝1)
PETv2 12个循环-2min 101.2 4.9 (n＝3)
PETv2 6个循环-4min 81 NA (n＝1)
PETv2 2个循环-12min 76.5 NA (n＝2)
PETv2 3个循环-5min 79.4 1.3 (n＝3)
PETv2 12个循环-2min，无LDR 71 NA (n＝1)
表1
所测试的初始方案是PETv1，后接3×5min循环。这实现了64％的再合成，这被认为是可接受的，但不是最佳的。将温育时间增加至3×30min，将再合成％提高至84％，并且增加温育时间和化学循环次数两者也导致对再合成％的积极影响(“PETv2 12个循环-2min，无LDR”将再合成％提高至71％)。
在利用LDR的示例中使用连续的再生/变性循环，根据条件进一步提高再合成％至76.5％至101.2％。
可以看出，增加ExAmp温育时间、化学循环次数和/或LDR使用的频率导致对再合成％的积极影响。通常，所选择的方案将实现约80％的再合成或更多，但优选方案将是再合成％对时间对方案复杂性和试剂使用的权衡。
还考虑了使用基于iCbot的DOE的方案优化，并且结果示于图6A和图6B中。
图6A示出：i)包括LDR循环对再合成％具有显著影响；i)增加循环步骤的数量也提高了再合成％。当使用LDR循环时，这尤其可见；iii)增加温育时间对再合成％具有积极但较不明显的影响，表明较短的运行时间是可接受的。
图6B示出了鉴定优化参数的实验的模型拟合，该优化参数为：LDR＝是；4次推动；和8.7分钟的温育时间。如本文所讨论的，最终优化方案不仅考虑再合成％，而且还考虑了在速度、试剂使用和效率方面的总体优化。
总之，本发明已鉴定出用于在测序运行期间再生模板的成对测序期间的延伸反应可使用非热稳定链置换聚合酶在小于55℃的温度处进行。这导致过程优点。另外，如果相同的聚合酶用于延伸反应和初始簇生成两者，则可简化整个过程并且减少试剂和方案步骤的数量。
现在可参考以下条款来描述本发明的实施方案：
1.一种用于在靶标双链多核苷酸的第一区域和第二区域的成对测序期间进行延伸反应的方法，其中所述第一区域和所述第二区域位于同一靶标双链多核苷酸中，所述成对测序包括以下步骤：
(a)提供固体支持物，所述固体支持物在其上固定有多个双链模板多核苷酸，每个双链模板多核苷酸由在其5'端连接到所述固体支持物的互补的第一模板链和第二模板链形成，并且一种或多种5'-端固定化引物的多个拷贝能够与所述第一模板链的3'端杂交；
(b)选择性地去除所述多个双链模板多核苷酸的所述第二模板链，以允许所述第一模板链与所述5'-端固定化引物杂交；
(c)通过边合成边测序技术或通过边连接边测序技术进行第一测序读取以确定该模板多核苷酸的第一区域的序列；
(d)进行延伸反应以延伸固定化引物中的一者或多者以拷贝第一模板链，从而生成第二固定化模板链；
(e)选择性地去除所述多个双链模板多核苷酸的所述第一模板链，以允许测序引物与步骤(d)中生成的所述模板链杂交；
(f)通过边合成边测序技术或通过边连接边测序技术进行第二测序读取以确定所述模板多核苷酸的第二区域的序列，其中确定所述靶标多核苷酸的所述第一区域和所述第二区域的所述序列实现所述靶标双链多核苷酸的所述第一区域和所述第二区域的成对测序；
其中步骤(d)延伸反应使用非热稳定链置换聚合酶在小于55℃的温度处进行。
2.根据条款1所述的方法，其中所述非热稳定聚合酶具有低于55℃、优选地低于50℃、低于45℃、低于40℃、低于39℃、等于或低于38℃、约38℃或约37℃、特别优选地约38℃的最佳温育温度和/或最佳活性温度。
3.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述延伸反应在小于55℃、优选地小于50℃、优选地小于40℃、优选地38℃+/-2℃、优选地38℃+/-1℃、优选地38℃的温度处进行。
4.根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述非热稳定聚合酶是Bsu、phi29、Klenow和DNA聚合酶I(大肠杆菌)，优选地是Bsu。
5.根据前述条款中任一项所述的方法，其中步骤(d)通过多个延伸和变性的循环重复。
6.根据条款5所述的方法，其中步骤(d)通过多个延伸和变性的循环重复。
7.根据条款5或条款6所述的方法，所述方法包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个循环；优选地2至5个循环、2至4个循环、3至5个循环、3个循环或4个循环；最优选地3个循环。
8.根据条款5-7中任一项所述的方法，其中每个循环可持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或30分钟。
9.根据条款6所述的方法，所述方法包括以下延伸和变性的循环：3×5min；3×30min；12×2min；6×4min；2×12min或3×5min；优选地12×2min。
10.根据条款6所述的方法，其中变性基本上在所述延伸反应的所述温度处进行。
11.根据条款5至9中任一项所述的方法，其中变性使用以下试剂进行：酸性核酸变性剂，诸如乙酸、HCl或硝酸；碱性核酸变性剂，诸如NaOH；或其他核酸变性剂，诸如DMSO、甲酰胺、甜菜碱、胍、水杨酸钠、丙二醇或脲；优选地甲酰胺和NaOH，特别优选地甲酰胺。
12.根据任一前述条款所述的方法，其中所述延伸反应(d)在比所述测序读取步骤低的温度处进行。
13.根据任一前述条款所述的方法，其中在步骤(a)中固定在所述固体支持物上的所述多个双链模板多核苷酸是簇。
14.根据条款13所述的方法，其中所述簇通过桥式扩增生成。
15.根据条款14所述的方法，其中在初始簇生成和所述延伸反应步骤(d)期间使用相同的非热稳定链置换聚合酶。
16.根据任一前述条款所述的方法，其中所述多个双链模板多核苷酸通过使用与所述延伸反应步骤(d)中使用的所述聚合酶相同的聚合酶进行扩增反应生成。
17.根据任一前述条款所述的方法，其中所述固定化引物中的至少一种固定化引物在3'端被封闭，并且所述封闭在步骤(d)之前被去除。
18.根据条款17所述的方法，其中所述封闭是磷酸酯基团，并且用磷酸酶处理所述表面以去除所述封闭。
19.根据任一前述条款所述的方法，所述方法还包括在步骤(d)之前用限制性酶处理以缩短所述固定化引物并释放游离3'羟基用于延伸的步骤。
20.根据任一前述条款所述的方法，其中所述固定化引物在步骤(d)之前延伸。
21.根据条款20所述的方法，其中所述固定化引物通过与具有5'-突出端的未固定化互补序列杂交而延伸，并且所述固定化引物延伸以拷贝所述突出端。
22.一种用于对靶标双链多核苷酸的第一区域和第二区域进行成对测序的方法，其中所述第一区域和所述第二区域位于同一靶标双链多核苷酸中，所述成对测序包括如条款1至21中任一项所公开的步骤(a)至(f)。
23.根据条款22所述的方法用于从簇阵列上的双链模板中的每个双链模板获得测序信息的两个连接或配对的读取的用途。
24.一种改善测序反应的数据质量的方法，所述方法包括进行根据条款1至21中任一项所述的延伸反应。
序列表
<110> 因美纳有限公司
<120> 用于对多核苷酸进行测序的方法
<130> PC931329WO
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 2
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<220>
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<400> 2
caagcagaag acggcatacg agat 24
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<223> P5'序列（与P5互补）
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gtgtagatct cggtggtcgc cgtatcatt 29
<210> 4
<211> 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P7'序列（与P7互补）
<400> 4
atctcgtatg ccgtcttctg cttg 24

Claims (23)

1.一种在成对测序期间进行链再合成延伸反应的方法，其中所述链再合成延伸反应在第一测序读取与第二测序读取之间进行，并且其中所述链再合成延伸反应延伸一种或多种固定化引物以拷贝第一模板链，从而生成第二固定化模板链；其特征在于，所述链再合成延伸反应使用非热稳定链置换聚合酶在小于55℃的温度处进行。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述非热稳定聚合酶具有低于55℃、优选地低于50℃、低于45℃、低于40℃、低于39℃、等于或低于38℃、约38℃或约37℃、特别优选地约38℃的最佳温育温度和/或最佳活性温度。
3.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述延伸反应在小于55℃、优选地小于50℃、优选地小于40℃、优选地38℃+/-2℃、优选地38℃+/-1℃、优选地38℃的温度处进行。
4.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述非热稳定聚合酶是Bsu、phi29、Klenow和DNA聚合酶I(大肠杆菌)，优选地是Bsu或其功能片段。
5.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述链再合成延伸反应通过多个延伸和变性的循环重复。
6.根据权利要求5所述的方法，所述方法包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个循环；优选地2至5个循环、2至4个循环、3至5个循环、3个循环或4个循环；最优选地3个循环。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中每个循环可持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20或30分钟。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，所述方法包括以下延伸和变性的循环：3×5min；3×30min；12×2min；6×4min；2×12min或3×5min；优选地12×2min。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其中变性基本上在所述延伸反应的所述温度处进行。
10.根据权利要求5至10中任一项所述的方法，其中变性使用以下试剂进行：酸性核酸变性剂，诸如乙酸、HCl或硝酸；碱性核酸变性剂，诸如NaOH；或其他核酸变性剂，诸如DMSO、甲酰胺、甜菜碱、胍、水杨酸钠、丙二醇或脲；优选地甲酰胺和NaOH，特别优选地甲酰胺。
11.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述链再合成延伸反应在比所述测序读取步骤低的温度处进行。
12.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第一模板链是簇。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述簇最初通过桥式扩增生成。
14.根据权利要求13所述的方法，其中在初始簇生成和所述链再合成延伸反应期间使用相同的非热稳定链置换聚合酶。
15.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第一模板链通过使用与在所述链再合成延伸反应中使用的所述聚合酶相同的聚合酶的扩增反应生成。
16.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述固定化引物中的至少一种固定化引物在3'端被封闭，并且所述封闭在所述链再合成延伸反应之前被去除。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述封闭是磷酸酯基团并且用磷酸酶处理以去除所述封闭。
18.根据任一前述权利要求所述的方法，所述方法还包括在所述链再合成延伸反应之前用限制性酶处理以缩短所述固定化引物并释放游离3'羟基用于延伸的步骤。
19.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述固定化引物在所述链再合成延伸反应之前延伸。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述固定化引物通过与具有5'-突出端的未固定化互补序列杂交而延伸，并且所述固定化引物延伸以拷贝所述突出端。
21.一种用于对靶标双链多核苷酸的第一区域和第二区域进行成对测序的方法，其中所述第一区域和所述第二区域位于同一靶标双链多核苷酸中，所述成对测序包括如权利要求1至20中任一项所公开的步骤。
22.根据权利要求21所述的方法用于从簇阵列上的双链模板中的每个双链模板获得测序信息的两个连接或配对的读取的用途。
23.一种改善测序反应的数据质量的方法，所述方法包括进行根据权利要求1至20中任一项所述的延伸反应。
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