CN108866174A - 一种循环肿瘤dna低频突变的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种循环肿瘤DNA(以下简称ctDNA)低频突变的检测方法。该方法包括以下步骤:S1,从血浆中提取cfDNA;S2,对所提取的cfDNA进行末端修复和3’端加“A”;S3,对末端修复产物进行接头连接,该接头含有随机分子标签序列,同时含有用于区分不同样本的index序列;S4,对接头连接产物进行PCR扩增;S5,探针捕获目的文库;S6,通过illumina Miseq、illumina Nextseq、illumina Hiseq平台进行测序,并对下机数据进行分析。该方法适用于探针靶向捕获测序,能够降低下机数据重复率,去除PCR及测序过程中产生的错误,提高ctDNA检测灵敏度和特异性,降低假阳性率。
Description
技术领域
本发明涉及高通量测序领域,具体而言,涉及一种循环肿瘤DNA低频突变的检测方法。
背景技术
cfDNA是指以单链或双链DNA或DNA蛋白复合物形式存在于血液、脑脊液中的一种胞外DNA。1948年,Mandel和Metais首次发现人体血液中存在游离DNA。在肿瘤患者体内,由肿瘤细胞坏死、凋亡后释放入血液中的游离DNA片段称为循环肿瘤DNA(ctDNA)。ctDNA片段大小一般为160-180bp左右,半衰期为16min-2h不等。
由于ctDNA携带了肿瘤细胞的全部变异信息,且这些基因突变仅存在于癌前细胞或癌细胞基因组中,不会在同一机体的其他正常细胞DNA中出现,因此,ctDNA相对于传统的组织学样本能够更好的体现肿瘤异质性。此外,ctDNA无需侵入性取材,只需取一管血即可检测,能够方便地监测肿瘤进程、监测靶向治疗动态。因此,基于ctDNA的肿瘤基因检测技术逐渐成为临床应用的热点,具有广泛前景。
虽然ctDNA检测技术具有很大潜力,但要将其广泛应用于临床还需克服诸多障碍。首先,血液中游离DNA含量很少,平均1ml血浆中只能提取到约10ng左右总游离DNA,而ctDNA占总游离DNA比例较低,一般只有0.1%-10%。所以,低频突变位点检测是目前ctDNA检测技术遇到的一个瓶颈。其次,在高通量测序文库构建和探针捕获过程中要进行PCR反应,而PCR过程不可避免地会引入错配碱基,即使是高保真酶,其碱基错配率仍在10-6左右,并且扩增循环数越多,错误率越高。此外,目前最常用的测序仪Hiseq和Nextseq在测序过程中产生的单碱基错误率在0.01%-1%之间。因此,PCR和测序过程中产生的错误会对低频ctDNA突变检测产生强烈的背景噪音,当模板突变频率低于0.1%时,很难区分模板突变和PCR或测序过程产生的错误,导致检测特异性降低。为了提高检测灵敏度和特异性,目前最常见的做法则是提高测序深度,但由于起始cfDNA模板量量少,在后续实验过程中需要增加扩增循环数,导致下机数据重复率过高,不仅浪费了数据量,增加了成本,检测限也并没有相应地成比例提高。
为了解决这一问题,学者们发明了一种cSMART检测技术,在每一条起始cfDNA模板3’端加上带有分子标签的测序接头,再针对特异性检测位点设计PCR下游引物,上游引物则为与测序接头相同的序列,通过多重PCR方法直接获得目的文库,在后续下机数据分析时可通过聚类分析除去PCR和测序过程中产生的错误,节约了数据量,并且使检测灵敏度达到0.03%。但该方法最大不足则在于其原理为多重PCR建库,因此只能对少量区域或位点进行检测,检测范围远远少于探针捕获测序技术。此外,目前通用的分子标签是由ATCG四种碱基随机组合而成,长度一般8-12bp,理论上四种碱基完全随机分布,但实际在引物合成过程中,由于四种碱基合成所需能量和合成效率不同,导致每个位置出现ATCG的频率并不完全一样。可能会出现连续多个相同碱基的情况,例如8个A或C,从而使实际得到的分子标签数量少于理论值。并且,连续多个相同的碱基还会增加测序错误的可能性,增加优势分子序列的比例。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足,本发明提供了一种循环肿瘤DNA低频突变的检测方法,旨在提高现有探针捕获测序法检测ctDNA低频突变的灵敏度和特异性。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明提供了一种循环肿瘤DNA低频突变的检测方法,该方法包括以下步骤:1)从血浆中提取cfDNA;2)对所提取的cfDNA进行末端修复和3’端加“A”;3)对末端修复产物进行接头连接,该接头含有随机分子标签序列,同时含有用于区分不同样本的index序列;4)对接头连接产物进行PCR扩增;5)探针捕获目的文库;6)通过illumina Miseq、illumina Nextseq、illumina Hiseq平台进行测序,并对下机数据进行分析。
上述接头序列包括下表1中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的两条序列。其中,N表示ATCG四种碱基中任意一种,位于Index2位置上,每两个随机碱基分别由一个A或T或C或G碱基隔开,共14bp,由此可得到的随机分子标签总共有410即1048576种,每一条原始游离DNA都将连接上带有不同随机分子标签的接头。其中,(INDEX)代表由6bp碱基组成的index序列。
上述PCR扩增引物为下表2中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的两条序列。
上述文库构建步骤还需用到末端修复酶及其buffer,接头连接酶及其buffer,PCR高保真聚合酶和纯化磁珠。
上述探针为大于1kb的任意商业化探针或定制探针。
上述探针捕获试剂为NimbleGen或IDT探针捕获试剂。
上述探针捕获过程中使用的blocking oligo包括下表3中SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示的两条序列,其中SEQ ID NO.6含有与所用接头中相同的index序列,合成SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6序列时,纯化方式均采用HPLA,且3’端均用Inverted dT修饰。
完成上述文库构建和探针捕获实验后,还应进行文库质检和qPCR文库定量,根据每个样本数据量要求,按比例进行混样,再用Illumina Miseq/Nextseq/Hiseq测序仪上机测序,测序仪参数设置时,Index2设置14bp,Index1设置6bp。
数据下机后,根据随机分子标签序列进行聚类分析,去除PCR及测序过程产生的错误数据,剩余的数据进行质控,再将质控合格的数据进行后续变异分析及注释。
上述聚类分析后的标签序列进行计数时,遵循以下原则:在同一标签中80%以上reads突变则计数,一个位点在所有标签中出现2次及其以上算作阳性位点。
与现有技术相比,本发明有以下进步和优势:
1)本发明采用携带随机分子标签的接头,通过后续对下机数据进行特殊分析,能够排除PCR及测序过程中产生的错误,提高真阳性率。同时,在无需增加测序深度的情况下,还能降低数据重复率,提高检测灵敏度和特异性。
2)本发明采用的分子标签接头,每隔两个随机碱基由A或T或C或G隔开,共14bp,总共有410种标签,不会降低分子标签种类,又避免了连续碱基的出现。
3)目前现有的分子标签多设计在接头3’端,即与目的序列相连接位置,因此,在合成接头的两条序列3’端均需要添加分子标签,导致测序时浪费较多数据量。本发明采用的随机分子标签设计在Index2位置,相对而言,节约了数据量。
本发明适用于目前肿瘤基因检测中最常见的探针捕获测序,可针对目的区域设计不同大小的探针,适用范围广。
附图说明
图1示出了本发明所提供的携带随机分子标签的接头结构
图2示出了本发明具体实施例中5例样本探针捕获后文库经Qsep生物分析仪检测的结果。
具体实施方式
下面将结合实例进一步说明本专利的有益效果。
实施例1
采集5例肺癌患者全血各10ml,采集管使用Streck Cell-Free DNA BCT® BloodCollection Tubes (10ml),常温保存和运输,时间不超过72h。采用两步法分离血浆,先将全血1600g室温离心10min,取出约4.5ml上清于15ml离心管中,再16000g 4℃离心10min,取出约4ml上清,分装于1.5ml离心管中,冻存于-80℃。采用QIAamp @ ciculiatiq NucleicAcid KIT提取血浆cfDNA,最终用50ul EB buffer洗脱,样本名称及提取cfDNA浓度、质量信息如下表4:
合成如上述表1所示的带有随机标签的接头,其中,N表示ATCG四种碱基中任意一种,每两个随机碱基分别由一个A或T或C或G碱基隔开,共14bp。本实施例采用index序列均为6bp,5种带index序列接头如下表5中SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.11所示。合成的引物采用TEbuffer溶解至浓度为100uM,再将SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.11分别按照等比例摩尔数混合,95℃加热5min,缓慢降温至室温完成退火。采用乙醇沉淀法将退火产物进行纯化,再用无酶水溶解至终浓度为30uM。
每个样本均按照下表6所示,在200ul低吸附管中配置末端修复反应液。
涡旋混匀,将管置于PCR仪上,20℃孵育30min。采用HighPrep™ PCR post PCR cleanup system磁珠按照1.7X比例进行纯化。
每个样本均按照下表7所示,配置加A反应混合液。
涡旋混匀,将管置于PCR仪上,30℃孵育30min。加入90ul PEG/NaCl Solution,使磁珠比例为1.8X,进行纯化。
每个样本均按照下表8所示,配置接头连接反应液。
涡旋混匀,将管置于PCR仪上,20℃孵育15min。加入50ul PEG/NaCl Solution,使磁珠比例为1X,进行纯化。
再次加入50ul PEG/NaCl Solution,使磁珠比例为1X,进行第二次纯化,纯化完用20ul EB buffer进行洗脱。
每个样本按照表9所示,配置PCR反应液,其中,p5 Primer和p7 Primer分别是上述表2中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4序列。
涡旋混匀,将管置于PCR仪上,设定如下反应程序:
加入50ul HighPrep™ PCR post PCR clean up system磁珠,按照1X比例进行纯化,最后用25ul无核酸酶水洗脱,采用nanodrop和Qubit检测文库浓度和纯度,每个样本文库信息如下表10所示。
将5个文库样本,每个取出200ng,共1000ng,混合于一低吸附1.5ml离心管中。向离心管中加入Cot-1 DNA 5μg,通用封闭引物10ul,其他各2ul,所用封闭引物序列如下表11所示,封闭引物合成后,用无核酸酶水稀释至终浓度100uM。
将离心管置于浓缩仪中浓缩干燥,直至管内液体蒸干,60℃约30min。
向浓缩干燥完的离心管中加入下表12所示试剂:
室温孵育5-10min,将所有液体转移至一0.2ml低吸附离心管中,置于PCR仪上95℃孵育10min。将离心管从PCR上取出,立即加入4μl Probe pool,涡旋混匀,置于PCR仪上65℃过夜(12h),热盖温度75℃。其中,探针捕获肺癌靶向用药相关11基因外显子,由IDT公司合成。
用链霉亲和素磁珠纯化杂交产物,纯化步骤参照Dynabeads® M-270Streptavidin说明书进行。
按照下表13配置PCR反应体系:
涡旋,短暂离心PCR管,保证beads在溶液中。将PCR管置于PCR仪上,设定以下程序,热盖温度105℃:
加入75ul HighPrep™ PCR post PCR clean up system磁珠,按照1.5X比例进行纯化,最后用25ul无核酸酶水洗脱。
文库定量和质检:采用nanodrop测定文库纯度,采用Qubit测定文库浓度,采用Qsep测定文库大小,文库片段分布如图2所示。
采用qPCR进行文库定量,采用Illumina Nextseq500测序仪进行测序,参数设置时,Index2设置14bp,Index1设置6bp,下机数据质控结果如下表14所示。
将质控合格数据进行变异分析,在同一标签中80%以上reads突变则计数,一个位点在所有标签中出现2次及其以上算作阳性位点。将检出的突变位点用annovar进行注释,再比对数据库找到靶向用药相关位点,本实施例中5例样本检测结果如下表15所示。
Claims (3)
1.一种ctDNA低频突变的检测方法,其特征在于,所使用的接头由SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示的两条序列退火而成;所述SEQ ID NO.1含有随机分子标签序列,该随机分子标签序列长14bp,序列为NNANNTNNCNNGNN,位于Index2位置上,其中,N表示ATCG四种碱基中任意一种,每两个随机碱基分别由一个A或T或C或G碱基隔开;所述SEQ ID NO.2序列含有用于区分不同样本的index序列,该index序列长6bp,由ATCG四种碱基组成。
2.一种ctDNA低频突变的检测方法,其特征在于,文库构建所用PCR扩增引物为SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示的两条序列。
3.一种ctDNA低频突变的检测方法,其特征在于,探针捕获过程中使用的blockingoligo包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6两条序列,其中SEQ ID NO.6含有与接头序列相同的index序列,两条序列的3’端均用Inverted dT修饰。
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