CN108070586A

CN108070586A - Pcr扩增引物及其应用

Info

Publication number: CN108070586A
Application number: CN201611020980.7A
Authority: CN
Inventors: 许谦; 陈璟; 王云霞
Original assignee: Hangzhou Tuhong Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Tuhong Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2016-11-18
Filing date: 2016-11-18
Publication date: 2018-05-25

Abstract

本发明公开了PCR扩增引物，该PCR扩增引物包括：上游引物和下游引物，所述上游引物为：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTXXXXXXAGGCCTGCTGAAAATGAC TGAA，所述下游引物为：CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTXXXXXXAAAGAATGGTCCTGCACCAG。该PCR扩增引物能够有效用于待测样品DNA尤其是粪便脱落细胞总DNA中Kras基因突变的检测，且检测结果准确可靠。

Description

PCR扩增引物及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及粪便脱落细胞总DNA中Kras基因突变的检测。

背景技术

粪便中脱落细胞DNA中Kras突变及其水平是无创大肠癌风险评估的一个重要指标。然而，现阶段粪便中脱落细胞总DNA中Kras突变的检测方法十分繁琐，且一些突变容易被遗漏。

因而，目前的粪便中脱落细胞总DNA中Kras突变的检测方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够准确检测粪便脱落细胞总DNA中Kras基因突变的手段。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发明构思和工作而完成的：

美国Exact Sciences Corporation公司开发了无创大肠癌筛查服务Cologuard，他们使用一种叫作Quantitative Allele-specific Real-time Target and SignalAmplification(QuARTS)的方法来检测有关突变水平。这种方法首先是基于一种常用的基因突变检测技术：扩增阻碍突变系统(amplificationrefractorymutationsystem,ARMS)PCR。ARMS-PCR的基本原理是将引物3’端设计在突变位置，这引起引物在此位置的区别性错配而实现特异性扩增阻碍，从而区分野生型片段与有突变碱基的片段。QuARTS用到的另一项技术是基于Taqman的荧光定量PCR(qPCR)技术，不同于一般的qPCR反应，Taqman-qPCR反应除两个引物之外又在扩增区间另外设计了能够结合模板的寡核苷酸探针，随着扩增反应延伸到探针结合区域，探针会被聚合酶的外切酶活性切割而释放出来，而这能够激发一个产生荧光的次级反应。这样，通过这两种技术的结合，QuARTS能够通过突变特异ARMS引物对各种Kras突变进行定量。目前，国内的诺辉健康等公司的大肠癌早筛也是使用相近的技术路线。

发明人经过多次实验研究认为，上述策略有两个潜在的问题：第一、qPCR本身是一种半定量的方法，而这种以qPCR为基础的、先释放探针片段然后激发荧光的二级反应的设计虽然可以放大信号，但存在信号扭曲的可能；第二、ARMS-PCR需要对每个SNP设计特定的引物，因而能检测的突变完全受限于对应的引物。迄今已报道的与肠癌相关的Kras突变有30个，而分别进行30个独立的qPCR反应是十分繁琐的。对此Exact Sciences的解决办法是检测七个最常见的Kras突变(12C、12D、12V、12S、13D、12A、12R)，但这导致其它致癌突变被遗漏。

基于以上论述，发明人设计了高通量测序分析Kras突变的检测方案，该方法的优势是通过高通量测序能够精确测定一个混合DNA样本中各Kras基因型的相对比例，从而解决上述办法的两个重要缺陷。但是，通过进一步的实验研究，发明人发现，该方案实施的难点在于很难从粪便DNA中将丰度极低的Kras片段扩增出来。也即，该方案的关键技术环节是如何把粪便DNA中丰度极低的Kras片段扩增出来。为此，发明人通过不同的引物设计方案，设计并验证了一系列的扩增引物。最终意外发现，用加上特定高通量测序接头序列的Kras引物进行PCR扩增能够有效实现对粪便DNA中极低丰度的Kras片段的稳定扩增；相反，用不带接头序列的几对正常引物均无法实现Kras的扩增。

进一步，发明人利用上述确定的特定PCR扩增引物对100例大肠癌病例与100例健康对照样本进行Kras片段扩增，以及扩增产物的高通量测序分析，得到了Kras基因突变检测结果；实验重复一次，并进一步采用ARMS-PCR法对上述待测样品进行Kras基因突变检测。结果显示，所有样本的两次独立实验结果均高度吻合，且均与ARMS-PCR法检测结果一致。

因而，在本发明的一个方面，本发明提供了一种PCR扩增引物。根据本发明的实施例，该PCR扩增引物包括：

上游引物和下游引物，

所述上游引物为：

AGGCCTGCTGAAAATGACTGAA，

所述下游引物为：

AAAGAATGGTCCTGCACCAG，

其中，引物序列中加粗标注部分为高通量测序接头，斜体标注的6个碱基为用于区别不同样品的标签序列，下划线标注部分为Kras扩增锚定序列。

发明人惊奇地发现，利用该PCR扩增引物能够从待测样品DNA例如粪便DNA(也即粪便脱落细胞总DNA)中成功扩增出丰度极低的Kras片段，且能够实现稳定的Kras扩增，进而扩增产物能够有效用于高通量测序分析，以便能够精确测定一个混合DNA样本中所有的Kras基因突变及其相应的比例，有效实现Kras突变的检测。换言之，该PCR扩增引物能够有效用于待测样品DNA尤其是粪便脱落细胞总DNA中Kras基因突变的检测，且检测结果准确可靠。

在本发明的另一方面，本发明提供了一种用于检测待测样品DNA中Kras基因突变的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：前面所述的PCR扩增引物。由此，采用该试剂盒，利用本发明的PCR扩增引物能够有效实现待测样品DNA尤其是粪便脱落细胞总DNA中Kras基因突变的检测，且检测结果准确可靠。

根据本发明的实施例，所述待测样品DNA为粪便脱落细胞总DNA。由此，能够有效检测确定粪便脱落细胞总DNA中Kras基因突变的种类及相应比例，例如大肠癌相关的几种Kras突变的比例，进而能够用于大肠癌风险评估。

在本发明的又一方面，本发明提供了一种检测待测样品DNA中Kras基因突变的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：

利用前面所述的PCR扩增引物对待测样品DNA进行PCR扩增，以便获得扩增产物；

对所述扩增产物进行高通量测序，以便获得测序结果；以及

基于所述测序结果，进行比对分析，以便确定所述待测样品DNA中Kras基因突变的种类，以及各种Kras基因突变的比例，

其中，当所述待测样品DNA多于1种时，对不同的待测样品DNA采用标签序列不同的PCR扩增引物分别进行所述PCR扩增，然后对扩增产物的混合物进行高通量测序，并以所述标签序列区分不同待测样品DNA的测序结果和Kras基因突变检测结果。

由此，采用本发明的方法，利用上述PCR扩增引物能够从待测样品DNA例如粪便DNA中成功扩增出丰度极低的Kras片段，且能够实现稳定的Kras扩增，进而将扩增产物用于高通量测序分析后，能够精确确定待测样品DNA中所有的Kras基因突变及其相应的比例，例如大肠癌相关的几种Kras突变的比例，有效实现Kras突变的检测，进而能够用于大肠癌风险评估。

需要说明的是，本发明的表达方式“对不同的待测样品DNA采用标签序列不同的PCR扩增引物分别进行所述PCR扩增，然后对扩增产物的混合物进行高通量测序，并以所述标签序列区分不同待测样品DNA的测序结果和Kras基因突变检测结果”是指，当所述待测样品DNA为多种，也即多于1种时，将不同的待测样品DNA分别进行PCR扩增，如前所述，各待测样品DNA的PCR扩增分别采用标签序列不同的PCR扩增引物，然后将各待测样品DNA的PCR扩增产物混合，一起进行高通量测序，进而，基于标签序列的不同，区分不同待测样品DNA的测序和分析结果，并分别确定各待测样品DNA的Kras基因突变检测结果。

此外，需要说明的是，本发明的方法检测方便，所需待测样品量少。例如无创大肠癌筛查服务Cologuard的基因检测需要10克粪便，而本发明仅需要500mg粪便样品即可。

根据本发明的实施例，所述Kras基因突变为大肠癌致病突变。由此，能够有效检测确定粪便脱落细胞总DNA中大肠癌相关的Kras突变的比例，进而能够用于大肠癌风险评估。

进一步，还可以对本发明的Kras基因突变检测结果进行ARMS-PCR法验证(也可视为实验对照)。也即，利用ARMS-PCR法，重新对待测样品DNA进行Kras基因突变检测，并对两次的检测结果进行比较验证，以确保检测结果的准确性。

在本发明的另一方面，本发明还提供了前面所述的PCR扩增引物、试剂盒在检测待测样品DNA中Kras基因突变中的用途。由此，采用本发明的试剂盒，利用该PCR扩增引物能够有效实现待测样品DNA尤其是粪便脱落细胞总DNA中Kras基因突变的检测，且检测结果准确可靠。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例，粪便总DNA提取样品的琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图2显示了根据本发明一个实施例，Kras扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果；以及

图3显示了根据本发明一个实施例，其中一个样本的各Kras致癌突变比例的柱状图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

实施例1

发明人利用加上特定高通量测序接头序列的Kras引物，对100例大肠癌病例与100例健康对照的粪便样本进行Kras片段扩增，以及高通量测序分析，得到了Kras基因突变检测结果；实验重复一次；进一步采用ARMS-PCR法对上述待测样品进行了Kras基因突变检测验证，具体如下：

一、粪便总DNA提取

针对100例大肠癌病例与100例健康对照的粪便样本的每一种，分别采用约500mg新鲜粪便，按照下述方法提取总DNA：

A.实验材料

Buffer Z(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0)；苯酚；10％SDS；氯仿-异戊醇(24:1)；酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)；醋酸钠(3M，pH 5.2)；ddH2O；70％乙醇；RNA酶。

B.实验方法

1.将1克粪便样本从冰箱中拿出后悬浮于2ml Eppendorf管内的1ml Buffer Z及150ul苯酚；

2.将悬浮液转移至含0.3g硅胶柱的破壁管中，Bead beater击打器击打震荡20s两次(4M/S,20s)；

3.放入-80冰箱中10min，60℃温浴2min，混匀，重复此步骤一次；

4.冻融后冰上放置1min；

5.向管中加入110ul 10％SDS，冰上放置10min；

6.向管中加入150ul氯仿-异戊醇(24:1)，混匀，13200rpm，10min；离心后取上清分成两管；

7.向管中加入等体积的酚、酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)、氯仿-异戊醇(24:1)各抽提1次，132000rpm，10min；

8.取上清加入1/10体积的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，-80沉淀过夜(或30min)；

9. 13200rpm，15min，弃上清，滤纸吸干；

10.向管中加入400ul ddH2O溶解DNA；

11.向管中加入40ul醋酸钠和2倍体积的无水乙醇于-20℃沉淀30min，13200rpm，15min，弃上清，滤纸吸干；

12.重复此步骤一次；

13.弃上清，滤纸吸干，37℃烘干30min；

14.向管中加入100ul TE溶解DNA；溶解后向管中加入2-3ul RNA酶，37℃消化30min；

15.进行浓度测定和琼脂糖凝胶电泳检测。取5ul DNA样品用于琼脂糖凝胶电泳分析。结果见图1(最左侧为MAKER，四条泳道均为DNA提取样品)，样本中Kras基因已经得到扩增。通过NanoDrop测定浓度，200-1000ng/μl合格，备用。

二、Kras的PCR扩增

用上面得到的粪便总DNA(100ng/50μl反应体系)为模板，用带高通量测序接头序列的Kras引物进行扩增，所得片段长度约为300bp。

Kras引物：

上游引物：

AGGCCTGCTGAAAATGACTGAA(SEQ ID NO：1)，

下游引物：

AAAGAATGGTCCTGCACCAG(SEQ ID NO：2)，

扩增反应用高保真聚合酶(Phanta Master Mix，诺唯赞生物科技)，PCR反应条件为：95℃5min；98℃10s；54℃10s；72℃15s；72℃5min；扩增30个循环。

取5ul扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

其中，使用下列的单纯Kras锚定序列的短引物作为对照：

KrasF：AGGCCTGCTGAAAATGACTGAA(SEQ ID NO：3)；

KrasR：AAAGAATGGTCCTGCACCAG(SEQ ID NO：4)；

KrasF1：TCTGTATCAAAGAATGGTCCTGC(SEQ ID NO：5)；

KrasR1：GCCTGCTGAAAATGACTGAATA(SEQ ID NO：6)，

多次重复上述实验(并取5ul扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析)，结果发现，无法从粪便DNA中扩增出Kras片段。

图2所示的琼脂糖凝胶电泳结果显示，上述的短引物无法得到扩增产物，而带高通量测序接头序列的长引物(如SEQ ID NO：1-2所示)得到了符合预期分子量的PCR产物。其中，图2中，(最左侧为MAKER，五条泳道从左至右，1-2道为带接头的长引物的扩增产物，3-5道为对照短引物的扩增产物)

三、高通量测序及数据分析

在Miseq平台上进行高通量测序。下机数据采用通用的分析软件进行数据分析。

四、ARMS-PCR验证

用如下引物对七个常见Kras突变(G12C、G12D、G12V、G12S、G13D、G12A、G12R)进行ARMS-PCR验证：

KRAS-G12C-F：CTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCCT(SEQ ID NO：7)；

KRAS-G12R-F：CTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCCC(SEQ ID NO：8)；

KRAS-G12V-F：TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCCAT(SEQ ID NO：9)；

KRAS-G12A-F：TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTAC(SEQ ID NO：10)；

KRAS-G12D-F：TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTCA(SEQ ID NO：11)；

KRAS-G12S-F：CTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCGA(SEQ ID NO：12)；

KRAS-G13D-F：ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGCCA(SEQ ID NO：13)；

KRAS-R：CTATTGTTGGATCATATTCGTCCACAAAAT(SEQ ID NO：14)。

其中，用KRAS-G12C-F与KRAS-R检测12C突变、KRAS-G12R-F与KRAS-R检测12R突变，以此类推，从而对高通量测序结果进行独立验证。

扩增反应用Taq聚合酶，PCR反应条件：95℃5min；98℃10s；60℃(不同突变的反应退火温度为：G12S：60℃；G12D：60℃；G12A：55℃；G12R：58℃；G12C：61℃；G12V：60℃；G13D：60℃)10s；72℃15s；72℃5min；扩增30个循环。

五、结果

如前所述，将约500mg受试者的新鲜粪便按上述实验步骤依次进行DNA提取、Kras扩增、测序及序列分析；重复上述实验一次；然后，对各样本进行ARMS-PCR验证。

结果显示，利用短引物无法得到扩增产物，而利用带高通量测序接头序列的长引物(如SEQ ID NO：1-2所示)，各样本中Kras基因均得到扩增，得到了符合预期分子量的PCR产物(见图2)。测序分析结果显示，大肠癌病例相对于健康对照，均存在七个常见Kras突变(G12C、G12D、G12V、G12S、G13D、G12A、G12R)。所有样本的两次独立实验结果均高度吻合，且均与ARMS-PCR法检测结果一致。

此外，其中一个受试者粪便DNA的Kras扩增子的高通量测序分析结果显示，该样本中的各Kras肠癌相关突变总比例高于2％，为大肠癌高风险水平。即分析可知受试者有较高的大肠癌罹患风险，而肠镜检测显示受试者罹患大肠癌，则检测结果与临床结果一致。而对该样本的七个常见Kras突变的ARMS-PCR分析结果同样显示该样本中12V与12D突变比例较高。另外，该样本中还有一定比例的13C、14I与13D突变，这些突变是Cologuard的QuARTS检测不覆盖的。由此，表明某受试者样本中有高比例的12D、12V及其它一些大肠癌相关突变，属高危人群。

其中，图3示例性地示出了上述该样本的各Kras致癌突变比例的柱状图。由图3可知，该样本中有高比例的大肠癌相关突变12D(1.38％)、12V(0.55％)，该受试者的各Kras致癌突变的累加比例超过2％。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种PCR扩增引物，其特征在于，包括：

上游引物和下游引物，

所述上游引物为：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTXXXXXXAGGCCTGCT GAAAATGACTGAA，

所述下游引物为：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTXXXXXXAAAGAATGG TCCTGCACCAG，

2.一种用于检测待测样品DNA中Kras基因突变的试剂盒，其特征在于，包括：

权利要求1所述的PCR扩增引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述待测样品DNA为粪便脱落细胞总DNA。

4.一种检测待测样品DNA中Kras基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用权利要求1所述的PCR扩增引物对待测样品DNA进行PCR扩增，以便获得扩增产物；

对所述扩增产物进行高通量测序，以便获得测序结果；以及

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待测样品DNA为粪便脱落细胞总DNA。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述Kras基因突变为大肠癌致病突变。

7.权利要求1所述的PCR扩增引物、权利要求2或3所述的试剂盒在检测待测样品DNA中Kras基因突变中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述待测样品DNA为粪便脱落细胞总DNA。