CN106048009A - 一种用于超低频基因突变检测的标签接头及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于超低频基因突变检测的标签接头及其应用，其中该标签接头包括：第一链，所述第一链从5'端至3'端依次包括第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列，其中，第一核酸序列为通用引物结合靶点区；第二核酸序列为随机单分子标签序列，用于区分各DNA片段；第三核酸序列为样本标签序列，用于区分各文库样本；第四核酸序列为测序引物结合靶点区；以及第二链，所述第二链为与第一链3’端反向互补为双链的序列。在受检样本中引入本发明的标签接头，能够有效提高受检样本的突变检测灵敏度，甚至可以检测突变频率低至0.1％的突变位点，并且，本发明的标签接头制备简单，实际应用价值非常高。
Description
技术领域
本发明涉及测序技术领域，具体地，涉及一种用于超低频基因突变检测的标签接头及其应用。
背景技术
现阶段的文库构建和测序中，将受检样本连接标签接头，可以区分来源不同的样本，但是对样本突变的检测灵敏度较低。
因而，目前的标签接头仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够提高样本低频率突变检测灵敏度的标签接头。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现和工作而完成的：
发明人在进行高通量测序的过程中发现了一种特殊的单分子标签设计和读取方法，受检样本通过连接随机单分子标签，可以检测突变频率低至0.1％的突变位点，也即通过在样本中引入随机单分子标签能够有效提高检测灵敏度。并且，发明人还发现，为避免文库构建及测序过程中淹没掉低至0.1％的突变位点，在测序的结果中要把带有同样单分子标签的测序Reads只计数为1，通过统计不同的随机单分子标签的个数来还原原样本中的真实EGFR突变位点频率。
具体地，在本发明的第一方面，本发明提供了一种标签接头。根据本发明的实施例，该标签接头包括：
第一链，所述第一链从5'端至3'端依次包括第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列，
其中，第一核酸序列为通用引物结合靶点区；第二核酸序列为随机单分子标签序列，用于区分各DNA片段；第三核酸序列为样本标签序列，用于区分各文库样本；第四核酸序列为测序引物结合靶点区；以及
第二链，所述第二链为与第一链3’端反向互补为双链的序列。
发明人惊奇地发现，在受检样本中引入本发明的标签接头，能够有效提高受检样本的突变检测灵敏度，甚至可以检测突变频率低至0.1％的突变位点，并且，本发明的标签接头制备简单，实际应用价值非常高。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种构建待测样本测序文库的方法。根据本发明的实施例，该方法利用前面所述的标签接头作为测序文库的接头。由此，可以有效在受检样本中引入本发明的标签接头，进而后续利用该测序文库进行测序和分析时，能够有效提高受检样本的突变检测灵敏度，甚至可以检测突变频率低至0.1％的突变位点。
在本发明的第三方面，本发明还提供了一种对多个待测样本进行测序的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
针对所述多个待测样本的每一个，分别根据前面所述的构建待测样本测序文库的方法构建测序文库，以便获得多个测序文库，并将所述多个测序文库混合，以便获得混合测序文库，其中，同一个待测样本采用的标签接头的第三核酸序列相同，不同待测样本采用的标签接头的第三核酸序列相互不同；
对所述混合测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及
基于所述测序结果，确定各待测样本的序列信息，其中，针对所述测序结果，利用标签接头的第三核酸序列区分各待测样本的测序文库，并利用所述标签接头的第二核酸序列区分每个测序文库的各DNA片段，去除冗余，还原并精确计算原始DNA片段中各分子数目。
由此，能够有效在多个受检样本中引入本发明的标签接头，从而一次性实现对多个受检样本的高灵敏度的突变检测，尤其是突变频率低至0.1％的突变位点的检测，且检测结果准确。另外，本发明的标签接头制备简单，从而本发明的测序方法操作简单，实施容易。
在本发明的第四方面，本发明还提供了一种对多个待测样本进行测序的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：
文库构建装置，所述文库构建装置用于针对所述多个待测样本的每一个，分别根据前面所述的构建待测样本测序文库的方法构建测序文库，以便获得多个测序文库，并将所述多个测序文库混合，以便获得混合测序文库，其中，同一个待测样本采用的标签接头的第三核酸序列相同，不同待测样本采用的标签接头的第三核酸序列相互不同；
测序装置，所述测序装置与所述文库构建装置相连，用于对所述混合测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及
序列确定装置，所述序列确定装置与所述测序装置相连，用于基于所述测序结果，确定各待测样本的序列信息，并且适于针对所述测序结果，利用标签接头的第三核酸序列区分各待测样本的测序文库，并利用所述标签接头的第二核酸序列区分每个测序文库的各DNA片段，去除冗余，还原并精确计算原始DNA片段中各分子数目。
由此，能够有效在多个受检样本中引入本发明的标签接头，从而一次性实现对多个受检样本的高灵敏度的突变检测，尤其是突变频率低至0.1％的突变位点的检测，且检测结果准确。另外，本发明的标签接头制备简单，从而本发明的测序系统操作简单，实施容易。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了实施例1的电泳检测结果；
图2显示了实施例2的电泳检测结果；
图3显示了根据本发明实施例的对多个待测样本进行测序的系统的结构示意图；
图4显示了现有的不带随机单分子标签的illumina二代高通量测序文库的结构示意图；
图5显示了现有的一种含有随机单分子标签的illumina二代高通量测序文库的结构示意图；以及
图6显示了根据本发明实施例，本发明的测序文库(含有随机单分子标签)的结构示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的第一方面，本发明提供了一种标签接头。根据本发明的实施例，该标签接头包括：
第一链，所述第一链从5'端至3'端依次包括第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列，
其中，第一核酸序列为通用引物结合靶点区；第二核酸序列为随机单分子标签序列，用于区分各DNA片段；第三核酸序列为样本标签序列，用于区分各文库样本；第四核酸序列为测序引物结合靶点区；以及
第二链，所述第二链为与第一链3’端反向互补为双链的序列。
发明人惊奇地发现，在受检样本中引入本发明的标签接头，能够有效提高受检样本的突变检测灵敏度，甚至可以检测突变频率低至0.1％的突变位点，并且，现有的单分子标签接头的制作方法比较繁琐，而本发明的标签接头制备简单，实际应用价值非常高。
其中，第二核酸序列也即随机单分子标签序列的长度不受限定，只要能够有效标记样本的各DNA片段，且不影响后续扩增、测序效果即可。根据本发明的一些优选示例，第二核酸序列为8bp的NNNNNNNN。其中，这里的“N”即表示ATCG四种碱基的任意一种。
同理，第三核酸序列即样本标签序列的长度也不受限定，根据本发明的一些优选示例，第三核酸序列为7bp的IIIIIII。这里的“IIIIIII”表示长度为7bp分子标签。
根据本发明的一些具体示例，本发明的标签接头序列为：
第一链为：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNIIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，
第二链为：pGATCGGAAGAGC(也即第二链的5’端使用磷酸基团修饰)。
由此，利用该标签接头连接的受检样本，突变检测灵敏度高，且检测结果准确可靠，可重复性好。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种构建待测样本测序文库的方法。根据本发明的实施例，该方法利用前面所述的标签接头作为测序文库的接头。由此，可以有效在受检样本中引入本发明的标签接头，进而后续利用该测序文库进行测序和分析时，能够有效提高受检样本的突变检测灵敏度，甚至可以检测突变频率低至0.1％的突变位点。
在本发明的第三方面，本发明还提供了一种对多个待测样本进行测序的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
首先，针对所述多个待测样本的每一个，分别根据前面所述的构建待测样本测序文库的方法构建测序文库，以便获得多个测序文库，并将所述多个测序文库混合，以便获得混合测序文库，其中，同一个待测样本采用的标签接头的第三核酸序列相同，不同待测样本采用的标签接头的第三核酸序列相互不同。
接着，对所述混合测序文库进行测序，以便获得测序结果。
然后，基于所述测序结果，确定各待测样本的序列信息，其中，针对所述测序结果，利用标签接头的第三核酸序列区分各待测样本的测序文库，并利用所述标签接头的第二核酸序列区分每个测序文库的各DNA片段，去除冗余，还原并精确计算原始DNA片段中各分子数目。
由此，能够有效在多个受检样本中引入本发明的标签接头，从而一次性实现对多个受检样本的高灵敏度的突变检测，尤其是突变频率低至0.1％的突变位点的检测，且检测结果准确。另外，本发明的标签接头制备简单，从而本发明的测序方法操作简单，实施容易。
此外，还需要说明的是，本发明的随机单分子标签(即第二核酸序列)在标签接头的位置决定了测序过程中特殊的单分子标签读取方法。具体地，其读取方法为：在读取7个用于区分样本的分子标签序列(即第三核酸序列)后继续向后读取8个随机单分子标签序列(即第二核酸序列)。由此，随机单分子标签序列的读取不占用待测序列读取的读长，在测序读长固定的情况下不会造成读长的浪费。
进一步，为方便理解，现结合图4-图6，从得到的测序文库的结构和测序读段的读取方法方面，将利用本发明的标签接头的测序方法与现有的相似技术进行比较分析：
图4显示了现有的不带随机单分子标签的illumina二代高通量测序的测序文库的结构示意图(本发明实施例1中的对照组文库即为该种构型的文库)。如图4所示，“Read1”为测序引物1的靶点，“Read2”为测序引物2的靶点，同时“Read2”也是标签引物靶点(向后读取)，该标签引物为区分不同文库的标签，作用同本发明接头的第三核酸序列(即样本标签序列)。该种文库由于不含有用于区分不同DNA分子的随机单分子标签，因而无法精确检测超低频突变。
图5显示了现有的一种含有随机单分子标签的illumina二代高通量测序的测序文库的结构示意图(本发明实施例2中的对照组文库即为该种构型的文库)。如图5所示，其中“Read1”为测序引物1的靶点，“Read2”为测序引物2的靶点，同时“Read2”也是标签引物靶点(向后读取)，该标签为区分不同文库的标签，作用同本发明接头的第三核酸序列(即样本标签序列)。文库中8个碱基的NNNNNNNN表示随机单分子标签，该标签为区分不同DNA分子的标签，作用同本发明接头的第二核酸序列(即随机单分子标签序列)。该种文库的测序引物1对未知序列进行测序之前先要对8个NNNNNNNN进行测序。举例说明：假设测序引物1总读长为36bp，则去掉8个碱基N的读取以后待测序列只测到了28个碱基。
图6显示了本发明的测序方法中构建的测序文库(含有随机单分子标签)的结构示意图。如图6所示，其中“Read1”为测序引物1的靶点，“Read2”为测序引物2的靶点。同时“Read2”也是标签引物靶点(向后读取)，该引物的读取共读两部分，其中标签IIIIIII为区分不同文库的标签，即为本发明接头的第三核酸序列；标签NNNNNNNN为区分不同DNA分子的随机单分子标签，即为本发明接头的第二核酸序列。本发明的测序文库的测序引物1所测的序列全部为待测序列。也即，在测序读长相同、数据量相同的情况下，与具有图5所示的测序文库结构的测序方法相比，本发明能够得到更多的有效数据。
在本发明的第四方面，本发明还提供了一种对多个待测样本进行测序的系统。根据本发明的实施例，参照图3，该系统1000包括：文库构建装置100、测序装置200和序列确定装置300。
具体地，根据本发明的实施例，文库构建装置100用于针对所述多个待测样本的每一个，分别根据前面所述的构建待测样本测序文库的方法构建测序文库，以便获得多个测序文库，并将所述多个测序文库混合，以便获得混合测序文库，其中，同一个待测样本采用的标签接头的第三核酸序列相同，不同待测样本采用的标签接头的第三核酸序列相互不同；测序装置200与文库构建装置100相连，用于对所述混合测序文库进行测序，以便获得测序结果；序列确定装置300与测序装置200相连，用于基于所述测序结果，确定各待测样本的序列信息，并且适于针对所述测序结果，利用标签接头的第三核酸序列区分各待测样本的测序文库，并利用所述标签接头的第二核酸序列区分每个测序文库的各DNA片段，去除冗余，还原并精确计算原始DNA片段中各分子数目。
由此，能够有效在多个受检样本中引入本发明的标签接头，从而一次性实现对多个受检样本的高灵敏度的突变检测，尤其是突变频率低至0.1％的突变位点的检测，且检测结果准确。另外，本发明的标签接头制备简单，从而本发明的测序系统操作简单，实施容易。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。
实施例1
采用本发明的标签接头(以illumina Truseq接头为对照)对样本进行文库构建和EGFR基因21号外显子L858R突变检测，具体如下：
1.本发明的标签接头设计
Prelib-ADT1-S：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNggaattaGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO：1)，
Prelib-ADT2-S：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNatccggcGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO：2)，
Prelib-ADT3-S：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNcaggccgGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO：3)，
Prelib-ADT-AS：pGATCGGAAGAGC，
Prelib-ADT-AS序列5’端被磷酸基团修饰。
Prelib-ADT1-S、Prelib-ADT2-S、Prelib-ADT3-S(均为接头的第一链)分别与Prelib-ADT-AS序列退火成双链，构成本发明的三个接头Prelib-ADT1、Prelib-ADT2、Prelib-ADT3。
2.对照组的illumina Truseq接头设计
Truseq-index1：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACatcacgATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(SEQ ID NO：4)，
Truseq-index2：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACcgatgtaATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(SEQ ID NO：5)，
Truseq-index3：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACttaggcaATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(SEQ ID NO：6)，
其中，Truseq-index1、Truseq-index2、Truseq-index3的5’端被磷酸基团修饰。
Truseq-Universal-ADT：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT，其中，Truseq-Universal-ADT的3’端倒数第一个碱基与倒数第二个碱基之间硫代磷酯键修饰。
Truseq-index1、Truseq-index2、Truseq-index3分别与Truseq-Universal-ADT序列退火成双链，构成本实施例对照实验的illumina Truseq接头TruseqADT1、TruseqADT2、TruseqADT3。
3.针对EGFR的21号外显子L858R突变(第858氨基酸L突变为R)设计同向延伸特异性引物，
EGFR21号外显子序列如下：
GGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAA(SEQ ID NO：7)，
EGFR21号外显子及其上下游内含子区序列如下：
AGCCTGGCATGAACATGACCCTGAATTCGGATGCAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCCCTCACAGCAGGGTCTTCTCTGTTTCAGGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCCACTAGCTGTATTGTTTAACACATGCAGGGGAGGATGCTCTCCAG(SEQ ID NO：8)，
同向延伸特异性引物序列如下：
EGFR21-RSQ1-Primer：GTCTTCTCTGTTTCAGGGC(SEQ ID NO：9)，
EGFR21-Tn1-Primer：GGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTTCAGGGCATGAACTACTTG(SEQ ID NO：10)，
EGFR21-RSQ2-Primer：AACGTACTGGTGAAAACACCG(SEQ ID NO：11)，
EGFR21-Tn2-Primer：GGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACACCGCAGCATGTCAAGA(SEQ ID NO：12)，
通用引物序列如下：
Uni-Primer1：CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO：13)，
Uni-Primer2：AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID NO：14)。
4.用于本实施例的样本来自HORIZON DISCOVERY公司的商业化标准品MultiplexIcfDNAReferenceStandardSet(Catalogue#:HD780)，取该产品中在EGFR L858R位置突变频率分别为0％(野生型)、0.1％和1％的片段化DNA样本。每个频率的DNA样本取等量2份分别使用本发明的接头和illumina Truseq接头进行如下文库构建实验。
其中，各标签接头与样本的对应关系为：
| 样本 | 标签接头 |
| E21-0 | Prelib-ADT1 |
| ctl-0(对照组) | TruseqADT1 |
| E21-0.1 | Prelib-ADT1 |
| ctl-0.1(对照组) | TruseqADT2 |
| E21-1 | Prelib-ADT1 |
| ctl-1(对照组) | TruseqADT3 |
其中，ctl-0、E21-0均为EGFR L858R位置突变频率为0％(野生型)的片段化DNA样本，ctl-0.1、E21-0.1均为EGFR L858R位置突变频率为0.1％的片段化DNA样本，ctl-1、E21-1均为EGFR L858R位置突变频率为1％的片段化DNA样本。
5.游离DNA末端修复
配制如下反应：
表1
| 游离DNA溶液 | 75μl |
| T4DNA连接酶缓冲液 | 10μl |
| 10mM dNTP混合液 | 4μl |
| T4DNA聚合酶 | 5μl |
| T4DNA磷酸化酶 | 5μl |
| Klenow酶 | 1μl |
| 总体积 | 100μl |
PCR仪上20℃温浴30分钟。
使用120μl Ampure XP beads进行纯化，32μl Elution Buffer洗脱。
6.3’端加多聚腺嘌呤尾
配制如下反应：
表2
| 末端修复的DNA溶液 | 32μl |
| Klenow酶缓冲液 | 5μl |
| dATP | 10μl |
| Klenow exo-酶 | 3μl |
| 总体积 | 50μl |
PCR仪上37℃温浴30分钟。
使用60μl Ampure XP beads进行纯化，10μl Elution Buffer洗脱。
7.连接接头
配制如下反应：
表3
| 末端修复、3’加A的DNA溶液 | 10μl |
| T4DNA连接酶缓冲液 | 25μl |
| 2μM DNA接头 | 10μl |
| T4DNA连接酶 | 5μl |
| 总体积 | 50μl |
PCR仪上20℃温浴15分钟。
使用60μl Ampure XP beads进行纯化，22μl Elution Buffer洗脱。
8.预文库扩增
(1)配制如下反应：
表4
| 连接接头的DNA溶液 | 34.8μl |
| 5×Buffer A | 10μl |
| dNTP(2.5mM each) | 4μl |
| Pre-primer mix | 1μl |
| 2G Robust Enzyme | 0.2μl |
| 总体积 | 50μl |
Pre-primer1：GCTCTTCCGATC(SEQ ID NO：15)，
Pre-primer2：AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID NO：16)，
Pre-primer3：CAAGCAGAAGACGGCA(SEQ ID NO：17)。
其中，实验组样本E21-0、E21-0.1、E21-1使用的Pre-primer mix为：Pre-primer1和Pre-primer3的混合物。
对照组样本ctl-0、ctl-0.1、ctl-1使用的Pre-primer mix为：Pre-primer2和Pre-primer3的混合物。
(2)PCR程序如下：
a)95℃3分钟；
b)10循环程序如下：
95℃15秒
62℃30秒
72℃30秒
c)72℃5分钟
d)4℃保存。
9.第一PCR扩增
配制如下反应：
表5
EGFR21-RSQ-Primer mix：即EGFR21-RSQ1-Primer和EGFR21-RSQ2-Primer的混合物。
PCR程序如下：
a)95℃10分钟；
b)10循环程序如下：
95℃30秒
62℃30秒
72℃1分钟
c)72℃7分钟
d)4℃保存。
使用60μl Ampure XP beads进行纯化，20μl Elution Buffer洗脱。
10.第二PCR扩增
配制如下反应：
表6
EGFR21-Tn-Primer mix：即EGFR21-Tn1-Primer和EGFR21-Tn2-Primer的混合物。
PCR程序如下：
a)95℃10分钟；
b)10循环程序如下：
95℃30秒
62℃30秒
72℃1分钟
c)72℃7分钟
d)4℃保存。
使用60μl Ampure XP beads进行纯化，20μl Elution Buffer洗脱。
11.通用引物扩增
表7
PCR程序如下：
a)98℃45秒；
b)10循环程序如下：
98℃15秒
60℃30秒
72℃30秒
c)72℃1分钟
d)4℃保存。
使用60μl Ampure XP beads进行纯化，30μl Elution Buffer洗脱。
取其中5μl纯化产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1所示。
最终文库经过荧光定量PCR质控后，利用Illumina公司NextSeq500进行75bp双端测序。
12.样本及单分子标签识别
针对上述获得的测序数据，运行Illumina官方bcl2fastq2Conversion Softwarev2.15软件，并将样本信息表内容设为空，标签读长参数设为15，使测序信息(含有第二核酸序列和第三核酸序列信息的测序读段)全部流到Unditermined data中。在Unditermineddata中进行标签接头的第三核酸序列的识别，同时进行随机单分子标签(第二核酸序列)的识别，以便利用第三核酸序列区分各待测样本的测序文库，并利用第二核酸序列区分每个测序文库的各DNA片段，去除冗余，还原并精确计算原始DNA片段中各分子数目。
进一步，将高通量测序下机数据经过质控过滤后，进行BWA比对，分析各个样本中数据的特异性，结果见表8。
表8
通过唯一比对序列数进一步分析各个样本L858R的突变频率情况，分析结果见表9。
表9
上述结果表明，与对照的illumina Truseq接头(样本ctl-0、ctl-0.1、ctl-1)相比，使用本发明的随机单分子标签的接头进行检测(样本E21-0、E21-0.1、E21-1)具有更高的特异性优势。并且，通过本发明的随机单分子标签计算得到的突变比例更加准确。
实施例2
采用本发明的标签接头(以现有的含单分子标签接头为对照)对样本进行文库构建和KRAS基因2号外显子G12D点突变检测，具体如下：
1.本发明的标签接头设计
Prelib-ADT1-S：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNggaattaGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO：1)，
Prelib-ADT-AS：pGATCGGAAGAGC，也即Prelib-ADT-AS序列的5’端磷酸基团修饰。
Prelib-ADT1-S与Prelib-ADT-AS序列退火成双链，构成本发明的接头Prelib-ADT1。
2.对照组含随机单分子标签接头设计
依照下面文献中所述的方法设计制作含单分子标签接头：Scott R Kennedy,Michael W Schmitt.Detecting ultralow-frequency mutations by DuplexSequencing.nature protocols.2586-2605|VOL.9NO.11|2014(通过参照将其全文并入本文)。
单分子标签接头序列为：
DS-UNI：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQID NO：18)，
DS-8N-IDX3：TCTTCTACAGTCANNNNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACgtccggcATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(SEQ ID NO：19)，
以上两条序列退火形成双链。
其制备过程如下：
首先，配制如下反应：
表10
| 退火后的双链DNA溶液 | 199μl |
| 10X NEB Buffer#2 | 27.9μl |
| 10mM dNTP mix | 27.9μl |
| ddH2O | 11.6μl |
| Klenow exo-(5U/ul) | 11.6μl |
| 总体积 | 278μl |
PCR仪上37℃孵育1小时。
将以上反应后的DNA进行乙醇沉淀。
接着，配制如下反应：
表11
| 乙醇沉淀后的DNA溶液 | 200μl |
| 10X NEB CutSmart Buffer | 50μl |
| ddH2O | 235μl |
| HpyCH4III(5U/ul) | 15μl |
| 总体积 | 500μl |
PCR仪上37℃孵育16小时。
将以上反应后的DNA进行乙醇沉淀，得到最终含随机单分子标签的接头DS-ADT3。
3.针对KRAS的2号外显子G12D点突变设计同向延伸特异性引物，其中，
同向延伸特异性引物序列如下：
KRAS-RSQ1：ACTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACC(SEQ ID NO：20)，
KRAS-TN1：GGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATG(SEQ ID NO：21)，
KRAS-RSQ2：TTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAA(SEQ ID NO：22)，
KRAS-TN2：GGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTT(SEQ ID NO：23)。
通用引物序列如下：
Uni-Primer1：CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO：13)，
Uni-Primer2：AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID NO：14)。
4.本实施例采用的血浆游离DNA样本(取样本来源的外周血10ml，分离4ml血浆，各使用2ml提取游离DNA2份)，已通过数字微滴PCR验证在该目标区域(KRAS基因2号外显子G12D突变)有2.73％的突变比率。
针对两份血浆游离DNA样本，分别使用本发明的随机单分子标签接头和对照组的随机单分子接头进行如下实验。
其中，各标签接头与样本的对应关系为：
5.游离DNA末端修复
配制如下反应：
表12
| 游离DNA溶液 | 75μl |
| T4DNA连接酶缓冲液 | 10μl |
| 10mM dNTP混合液 | 4μl |
| T4DNA聚合酶 | 5μl |
| T4DNA磷酸化酶 | 5μl |
| Klenow酶 | 1μl |
| 总体积 | 100μl |
PCR仪上20℃温浴30分钟。
使用120μl Ampure XP beads进行纯化，32μl Elution Buffer洗脱。
6.3’端加多聚腺嘌呤尾
配制如下反应：
表13
| 末端修复的DNA溶液 | 32μl |
| Klenow酶缓冲液 | 5μl |
| dATP | 10μl |
| Klenow exo-酶 | 3μl |
| 总体积 | 50μl |
PCR仪上37℃温浴30分钟。
使用60μl Ampure XP beads进行纯化，10μl Elution Buffer洗脱。
7.连接接头
配制如下反应：
表14
PCR仪上20℃温浴15分钟。
使用60μl Ampure XP beads进行纯化，22μl Elution Buffer洗脱。
8.预文库扩增
(1)配制如下反应：
表15
| 连接接头的DNA溶液 | 34.8μl |
| 5×Buffer A | 10μl |
| dNTP(2.5mM each) | 4μl |
| Pre-primer mix | 1μl |
| 2G Robust Enzyme | 0.2μl |
| 总体积 | 50μl |
Pre-primer1：GCTCTTCCGATC(SEQ ID NO：15)，
Pre-primer2：AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID NO：16)，
Pre-primer3：CAAGCAGAAGACGGCA(SEQ ID NO：17)。
其中，实验组样本KRAS2使用的Pre-primer mix为：Pre-primer1和Pre-primer3的混合物。
对照组样本ctl2使用的Pre-primer mix为：Pre-primer2和Pre-primer3的混合物。
(2)PCR程序如下：
a)95℃3分钟；
b)10循环程序如下：
95℃15秒
62℃30秒
72℃30秒
c)72℃5分钟
d)4℃保存。
9.第一PCR扩增
配制如下反应：
表16
KRAS-RSQ引物混合物：即KRAS-RSQ1和KRAS-RSQ2的混合物。
PCR程序如下：
a)95℃10分钟；
b)10循环程序如下：
95℃30秒
62℃30秒
72℃1分钟
c)72℃7分钟
d)4℃保存。
使用60μl Ampure XP beads进行纯化，20μl Elution Buffer洗脱。
10.第二PCR扩增
配制如下反应：
表17
KRAS-TN引物混合物：即KRAS-TN1和KRAS-TN2的混合物。
PCR程序如下：
a)95℃10分钟；
b)10循环程序如下：
95℃30秒
62℃30秒
72℃1分钟
c)72℃7分钟
d)4℃保存。
使用60μl Ampure XP beads进行纯化，20μl Elution Buffer洗脱。
11.通用引物扩增
表18
PCR程序如下：
a)98℃45秒；
b)10循环程序如下：
98℃15秒
60℃30秒
72℃30秒
c)72℃1分钟
d)4℃保存。
使用60μl Ampure XP beads进行纯化，30μl Elution Buffer洗脱。
取其中5μl纯化产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2所示。
最终文库经过荧光定量PCR质控后，利用Illumina公司NextSeq500进行75bp双端测序。
12.样本及单分子标签识别
针对上述获得的测序数据，运行Illumina官方bcl2fastq Conversion Softwarev2.15软件，并将样本信息表内容设为空，标签读长参数设为15，使测序信息(含有第二核酸序列和第三核酸序列信息的测序读段)全部流到Unditermined data中。在Unditermineddata中进行标签接头的第三核酸序列的识别，同时进行随机单分子标签(第二核酸序列)的识别，以便利用第三核酸序列区分各待测样本的测序文库，并利用第二核酸序列区分每个测序文库的各DNA片段，去除冗余，还原并精确计算原始DNA片段中各分子数目。
进一步，将高通量测序下机数据经过质控过滤后，进行BWA比对，分析各个样本中数据的特异性，分析结果见表19。
表19
通过唯一比对序列数进一步分析两个样本G12D的突变频率情况，分析结果见表20。
表20
上述结果表明，与对照的单分子标签接头相比，本发明的随机单分子标签接头制备简单，并且由于随机单分子标签不占用测序读长，在目标区域序列数相同的情况下能够得到更多的有效碱基数，从而能够使检测突变比率更准确可靠。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种标签接头，其特征在于，包括：
第一链，所述第一链从5'端至3'端依次包括第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列和第四核酸序列，
其中，第一核酸序列为通用引物结合靶点区；第二核酸序列为随机单分子标签序列，用于区分各DNA片段；第三核酸序列为样本标签序列，用于区分各文库样本；第四核酸序列为测序引物结合靶点区；以及
第二链，所述第二链为与第一链3’端反向互补为双链的序列。
2.根据权利要求1所述的标签接头，其特征在于，第二核酸序列为8bp的NNNNNNNN。
3.根据权利要求1所述的标签接头，其特征在于，第三核酸序列为7bp的IIIIIII。
4.根据权利要求1所述的标签接头，其特征在于，
第一链为：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNIIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，
第二链为：pGATCGGAAGAGC。
5.一种构建待测样本测序文库的方法，其特征在于，
利用权利要求1-4任一项所述的标签接头作为测序文库的接头。
6.一种对多个待测样本进行测序的方法，其特征在于，包括：
针对所述多个待测样本的每一个，分别根据权利要求5所述的方法构建测序文库，以便获得多个测序文库，并将所述多个测序文库混合，以便获得混合测序文库，其中，同一个待测样本采用的标签接头的第三核酸序列相同，不同待测样本采用的标签接头的第三核酸序列相互不同；
对所述混合测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及
基于所述测序结果，确定各待测样本的序列信息，其中，针对所述测序结果，利用标签接头的第三核酸序列区分各待测样本的测序文库，并利用所述标签接头的第二核酸序列区分每个测序文库的各DNA片段，去除冗余，还原并精确计算原始DNA片段中各分子数目。
7.一种对多个待测样本进行测序的系统，其特征在于，包括：
文库构建装置，所述文库构建装置用于针对所述多个待测样本的每一个，分别根据权利要求5所述的方法构建测序文库，以便获得多个测序文库，并将所述多个测序文库混合，以便获得混合测序文库，其中，同一个待测样本采用的标签接头的第三核酸序列相同，不同待测样本采用的标签接头的第三核酸序列相互不同；
测序装置，所述测序装置与所述文库构建装置相连，用于对所述混合测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及
序列确定装置，所述序列确定装置与所述测序装置相连，用于基于所述测序结果，确定各待测样本的序列信息，并且适于针对所述测序结果，利用标签接头的第三核酸序列区分各待测样本的测序文库，并利用所述标签接头的第二核酸序列区分每个测序文库的各DNA片段，去除冗余，还原并精确计算原始DNA片段中各分子数目。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |