CN107937985A - 一种微量碎片化dna甲基化检测文库的构建方法和检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种微量碎片化DNA高通量甲基化检测文库的构建方法和检测方法。本发明的文库构建方法包括：将碎片化DNA与甲基化接头连接，其中甲基化接头上所有的胞嘧啶均为甲基化胞嘧啶，甲基化接头包括长链和短链，长链和短链部分互补形成双链，长链包括测序平台通用序列、单分子标签序列、样本标签序列和测序引物结合序列；对连接了甲基化接头的DNA进行亚硫酸氢钠处理，以将非甲基化的CpG岛中的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U；使用特异性引物和通用引物对经过亚硫酸氢钠处理以后的、含有待测CpG位点的目标区域进行PCR扩增富集，得到可用于上机测序的文库。本发明能够对液体活检中取到的微量DNA进行甲基化检测，可以同时定量检测多个抑癌基因的多个调控区的CpG岛甲基化状态。
Description
技术领域
本发明涉及DNA甲基化检测技术领域，具体涉及一种微量碎片化DNA甲基化检测文库的构建方法和检测方法。
背景技术
表观遗传学的研究范畴主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重组等。DNA甲基化是指基因组DNA的5-胞嘧啶甲基化(5-mC)，它是一种在哺乳动物中稳定而且广泛存在的表观遗传修饰方式，也是目前研究最为深入透彻的表观遗传修饰形式。在DNA甲基化转移酶的作用下，基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位以共价键结合一个甲基基团。正常情况下，人类基因组中的“垃圾”序列的CpG二核苷酸相对稀少，并且总是处于甲基化状态；与之相反，人类基因组中大小为100-1000bp左右且富含CpG二核苷酸的CpG岛则总是处于未甲基化状态，并且与56％的人类基因组编码基因相关。人类基因组序列草图分析结果表明，人类基因组CpG岛约为28890个，大部分染色体每1Mb就有5-15个CpG岛，平均值为每Mb含10.5个CpG岛。
随着分子生物学的发展，越来越多的抑癌基因被发现和鉴定。这为肿瘤诊断治疗手段的开发提供了更多的机会。研究发现，与非肿瘤细胞不同，肿瘤细胞的抑癌基因启动子区CpG岛往往呈现高甲基化。因此这些区域成为了液体活检等新兴肿瘤细胞检测方法的很好的生物标志物。
现有的甲基化检测技术方案主要有甲基化特异性PCR(Methylation-specificPCR，MSP)。DNA经过亚硫酸氢钠处理后所有未甲基化的胞嘧啶变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。基于这种碱基的改变，然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR)扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。这种方法只能作定性研究，即只能明确是否存在甲基化；若要求定量，则需用其他的方法进行进一步检测。并且该方法检测目标区域的通量比较低，不方便同时对多个抑癌基因的启动子区CpG岛进行检测。两种基于高通量测序的方法是全基因组亚硫酸氢盐测序法(Whole-genome bisulfate sequencing，WGBS)，以及简化代表性亚硫酸氢盐测序法(Reduced representation bisulfite sequencing，RRBS)。此两种方法都是类似对全基因组进行甲基化检测。位点针对性不强，测序成本高昂，并且要求样本DNA量要足够大，无法对液体活检中得到的微量DNA进行检测。
发明内容
本发明提供一种微量碎片化DNA甲基化检测文库的构建方法和检测方法，能够对液体活检中取到的微量DNA(低至5-10ng)进行甲基化检测，可以同时定量检测多个抑癌基因的多个调控区的CpG岛甲基化状态，从而在液体活检中高灵敏地检测到肿瘤细胞或其它病变细胞的甲基化。
根据第一方面，一种实施例中提供一种微量碎片化DNA甲基化检测文库的构建方法，包括如下步骤：
将碎片化DNA与甲基化接头连接，其中上述甲基化接头上所有的胞嘧啶均为甲基化胞嘧啶，上述甲基化接头包括长链和短链，上述长链和上述短链部分互补形成双链，上述长链包括测序平台通用序列、单分子标签序列、样本标签序列和测序引物结合序列，其中上述单分子标签序列用于在测序后计算甲基化比率，上述样本标签序列用于区分不同样本，上述测序引物结合序列用于提供测序引物的结合位点；
对连接了甲基化接头的DNA进行亚硫酸氢钠处理，以将非甲基化的CpG岛中的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U；
使用特异性引物和通用引物对经过亚硫酸氢钠处理以后的、含有待测CpG位点的目标区域进行PCR扩增富集，得到可用于上机测序的文库，其中上述特异性引物的结合位点位于上述待测CpG位点下游。
进一步地，上述甲基化接头中含有生物素标记，用于通过生物素链霉亲和素结合作用来回收亚硫酸氢钠处理后的单链DNA。
进一步地，上述生物素标记位于上述甲基化接头的长链的5’端。
进一步地，上述目标区域内包含多个待测CpG位点。
进一步地，上述特异性引物的设计区域距离最近的待测CpG位点1-10个碱基。
进一步地，上述特异性引物的设计区域的长度基本上是25-45bp碱基。
进一步地，上述特异性引物的设计区域的3’端前10-30bp碱基不含CpG位点，优选前30bp以上碱基不含CpG位点。
进一步地，上述单分子标签序列是一段长度基本上是6-10个的随机碱基，每个位点上的随机碱基可以是A、T、G、C中的任一种。
进一步地，上述特异性引物包括两条嵌套式引物，其中一个比另一个更靠近上述待测CpG位点。
进一步地，上述碎片化DNA经末端修复后在3’端有A碱基；上述甲基化接头在3’端有T碱基；上述A碱基和上述T碱基形成配对连接。
根据第二方面，一种实施例中提供一种微量碎片化DNA甲基化检测方法，包括如下步骤：
将碎片化DNA与甲基化接头连接，其中上述甲基化接头上所有的胞嘧啶均为甲基化胞嘧啶，上述甲基化接头包括长链和短链，上述长链和上述短链部分互补形成双链，上述长链包括测序平台通用序列、单分子标签序列、样本标签序列和测序引物结合序列，其中上述单分子标签序列用于在测序后计算甲基化比率，上述样本标签序列用于区分不同样本，上述测序引物结合序列用于提供测序引物的结合位点；
对连接了甲基化接头的DNA进行亚硫酸氢钠处理，以将非甲基化的CpG岛中的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U；
使用特异性引物和通用引物对经过亚硫酸氢钠处理以后的、含有待测CpG位点的目标区域进行PCR扩增富集，得到可用于上机测序的文库，其中上述特异性引物的结合位点位于上述待测CpG位点下游；
对上述文库进行上机测序和数据分析，得到上述碎片化DNA的DNA甲基化信息。
本发明实施例的微量碎片化DNA甲基化检测文库的构建方法和检测方法，能够对液体活检中取到的微量DNA(低至5-10ng)进行甲基化检测，微量DNA可以来自于诸如唾液、血浆、血清、胸水、脑脊液、尿液、粪便等各种体液或排泄物。本发明可以同时定量检测多个抑癌基因的多个调控区的CpG岛甲基化状态，从而在液体活检中高灵敏地检测到肿瘤细胞或其它病变细胞的甲基化。
附图说明
图1为本发明实施例的微量碎片化DNA甲基化检测方法的流程示意图；
图2为本发明实施例的特异性引物设计的示意图；
图3为本发明实施例的甲基化接头的结构示意图；
图4为本发明实施例的微量碎片化DNA甲基化检测文库的构建方法的原理示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本发明相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本发明的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
如图1所示，本发明实施例的微量碎片化DNA甲基化检测方法包括如下流程：
针对目标区域进行特异性引物设计；对碎片化DNA进行甲基化接头连接；对连接了接头的DNA进行亚硫酸氢钠处理；目标区域富集以及对富集产物进行检测(上机测序和数据分析)。
本发明实施例中，所选目标区域可以是某基因的启动子区，也可以是其它待测CpG二核苷酸。所选目标区域的特异性引物设计的位置要求为基因的启动子区或所选CpG二核苷酸的下游。
本发明实施例中，所选目标区域的DNA可以来自于诸如唾液、血浆、血清、胸水、脑脊液、尿液、粪便等各种体液或排泄物。
如图2所示，在一个优选实施例中，特异性引物设计区域要求距离最近的待测CpG二核苷酸1-10个碱基，保证较短的测序读长(reads)就可以读到待测CpG位点，并能尽量多读到其上游的其它待测CpG位点。特异性引物设计在待测5’-CpG-3’二核苷酸的互补链上。在一个优选实施例中，整个特异性引物的设计区域的长度基本上是45bp碱基，在具体实施例中，特异性引物可以是一条30bp左右的引物；在其他实施例中，为了提高特异性，特异性引物可以包括两条，各30bp左右，该两条引物可以有15bp左右的重叠区，覆盖在45bp的区域内。在一个优选实施例中，特异性引物的设计区域的3’端前30bp碱基不含CpG位点，这是为了保证引物结合的效率。
本发明实施例中，甲基化接头上所有的胞嘧啶均为甲基化胞嘧啶，以防止其在后续亚硫酸氢钠处理过程中被转换为尿嘧啶。甲基化接头的具体制作方法为化学合成单链DNA，再人工退火成为部分双链DNA。如图3所示，在一个优选实施例中，甲基化接头包括长链和短链，长链和短链部分互补形成双链，长链包括测序平台通用序列(图3中P7序列)、单分子标签序列、样本标签序列和测序引物结合序列。单分子标签序列用于在测序后计算甲基化比率，在一个优选实施例中，单分子标签序列是一段长度基本上是6-10个(优选8个)随机碱基，每个位点上的随机碱基可以是A、T、G、C中的任一种。样本标签序列用于区分不同样本。测序引物结合序列用于提供测序引物的结合位点。在一个优选实施例中，甲基化接头中含有生物素标记，用以高效回收亚硫酸氢钠处理后的单链DNA，优选地，生物素标记位于甲基化接头的长链的5’端。
在一个优选实施例中，进行甲基化接头连接前，对于不同来源的碎片化DNA，可以进行末端修复和3’端加多聚腺嘌呤尾，因此，碎片化DNA经末端修复后在3’端有A碱基；甲基化接头在3’端有T碱基；A碱基和T碱基形成配对连接。
如图4所示，对连接了接头的DNA进行亚硫酸氢钠处理，其中甲基化的CpG岛中的胞嘧啶C仍然不变，非甲基化的CpG岛中的胞嘧啶C变为尿嘧啶U。所连接接头中含有的胞嘧啶C为甲基化的，所以仍然为C。
使用待测CpG位点下游的特异性引物进行目标区域富集。目标区域特异性富集可以使用一组特异性引物和通用引物进行富集，也可以使用两组特异性引物和通用引物进行两次富集以提高富集的特异性。此两组特异性引物组成嵌套式引物，其中一个比另一个更靠近待测CpG位点。目标区域富集的过程即完成了高通量测序文库构建的过程。
为了更加清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明进行进一步的说明，步骤中的条件为最优条件是说明性的，具体保护范围应该以权利要求为准。
实施例1
本实施例待检测区域位于SEPT9基因的启动子区或第一个外显子区附近。具体序列如下：AGCCAGGGGGCCTAGGGGCTCCTCCGGCGGCTAGCTCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCGGCGCCCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCGCCGCTGCCCTCCGCGCGACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGTCGGACCCCGCGGTCAACGCGCAGCTGGATGGGATCATTTCGGACTTCGAAGGTGGGTGCTGGGCTGGCTGCTGCGGCCGCGGACGTGCTGGAGAGGACCCTGCGGGTGGGCCTGGCGCGGGACGGGGGTGCGCTGAGGGGAGACGGGAGTGCGCTGAGGGGAGACGGGAC(SEQ ID NO：1)。
1.针对以上区域进行特异性引物设计：
SPT9-S：
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTCGAAATCCGAAATAATCCCATCCAACTA(SEQID NO：2)。
2.设计制作illumina测序平台接头序列：
ADT-S:GATCGGAAGAGC(SEQ ID NO：3)。
接头序列中所有的胞嘧啶C均为甲基化修饰。
ADT-AS：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNIIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQID NO：4；5’端使用生物素修饰；NNNNNNNN为单分子标签，用于准确计算甲基化比率；N代表A、T、C、G任何一种碱基；IIIIIII代表7个特定的序列，用以区分样本)。
接头序列中所有的胞嘧啶C均为甲基化修饰。
ADT-S和ADT-AS退火成双链使用。
3.本实施例使用的材料为两个健康人(编号分别为NM1、NM2)外周血。EDTA抗凝管采集两人外周血各5mL。1600g转速在4℃条件下离心10分钟并分离出血浆。血浆再16000g转速在室温下离心10分钟，冻存备用。取每个样本各2mL血浆，使用QIAamp CirculatingNucleic Acid Kit抽提出血浆游离DNA，使用荧光计Qubit定量，NM1抽提11.4ng。NM2抽提8.9ng。
4.游离DNA末端修复、加腺嘌呤尾：
配制如下表1的反应体系：
表1
在PCR仪中进行如下表2的反应：
表2
| 20℃ | 30分钟 |
| 65℃ | 30分钟 |
| 4℃ | 保存 |
5.游离DNA连接接头：
配制如下表3的反应体系：
表3
| 步骤4的产物 | 60μl |
| 连接缓冲液(Ligation Buffer) | 30μl |
| DNA连接酶(DNA Ligase) | 10μl |
| 接头(5uM) | 5μl |
| 无菌水 | 5μl |
| 总体积 | 110μl |
反应产物使用AmpureXP磁珠进行纯化。
6.步骤5的产物进行亚硫酸氢钠处理：
使用试剂盒为ZYMO RESEARCH公司的EZ-96 DNA Methylation-Gold MagPrep(Catalog Nos.D5042)。
7.与M270磁珠结合：
经亚硫酸氢钠处理过的DNA变为单链DNA。通过接头上的生物素修饰与M270磁珠结合。
8.目标区域富集：
配制如下表4的反应体系：
表4
以上反应体系把步骤7的磁珠悬浮起来，进行如下PCR反应。
Uni-primer7引物序列：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO：5)。
PCR程序如下表5所示：
表5
去掉磁珠后使用1X Ampure xp磁珠纯化步骤8的产物。
9.通用引物扩增：
配制如下表6的反应体系：
表6
Uni-primer5引物序列：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACG(SEQ ID NO：6)。
PCR程序如下表7：
表7
使用1X Ampure xp磁珠纯化步骤9的产物。
10.文库经过质控，并在illumina Nextseq500上进行上机测序，测序类型为PE75。经过数据基本分析及甲基化转换数据分析结果如下表8：
表8
该实施例结果表明，本发明的方法能够对相关的待检测甲基化区域进行有效的特异性富集并测序。
实施例2
1.本实施例待检测区域具体序列如下：
SEPT9基因的CpG岛区：
AGCCAGGGGGCCTAGGGGCTCCTCCGGCGGCTAGCTCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCGGCGCCCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCGCCGCTGCCCTCCGCGCGACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGTCGGACCCCGCGGTCAACGCGCAGCTGGATGGGATCATTTCGGACTTCGAAGGTGGGTGCTGGGCTGGCTGCTGCGGCCGCGGACGTGCTGGAGAGGACCCTGCGGGTGGGCCTGGCGCGGGACGGGGGTGCGCTGAGGGGAGACGGGAGTGCGCTGAGGGGAGACGGGAC(SEQ ID NO：7)。
NDRG4基因的CpG岛区：
TCTAAGGTTCCCCTTGGGAGTCTAAACAAAGACTACGGCAGCGCCGTCCCCTCCCCCGGGAACCCGACGCCGCGCGGCCACAGGGGGCCTGGAGGGGCGGGCAGGGCCTCGCAGCGCACCCAGCACAGTCCGCGCGGCGGAGCGGGTGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGACCGGGGTGTCCCCCAGGCTCCGCGTCGCGGTCCCCGCTCGCCCTCCCGCCCGCCCACCGGGCACCCCAGCCGCGCAGAAGGCGGAAGCCACGCGCGAGGGACCGCGGTCCGTCCGGGACTAGCCCCAGGCCCGGCACCGCCCCGCGGGCCGAGCGCCCACACCCGCCAAACCCACGCGGGCACGCCCCCGCGGCGCACCGCCCCCAGCCCGGCCTCCGCCCCTGCAGCCGCGGGCACGCGGAGGGGCTCCTGGCTGCCCGCACCTGCACCCGCGCGTCGGCGGC(SEQID NO：8)。
BMP3基因的CpG岛区：
CCGCGACCTACAGCTCTTTCTCAGCGTTGGAGTGGAGACGGCGCCCGCAGCGCCCTGCGCGGGTGAGGTCCGCGCAGCTGCTGGGGAAGAGCCCACCTGTCAGGCTGCGCTGGGTCAGCGCAGCAAGTGGGGCTGGCCGCTATCTCGCTGCACCCGGCCGCGTCCCGGGCTCCGTGCGCCCTCGCCCCAGCTGGTTTGGAGTTCAACCCTCGGCTCCGCCGCCGGCTCCTTGCGCCTTCGGAGTGTCCCGCAGCGACGCCGGGAGCCGACGCGCCGCGCGGGTACCTAGCCATGGCTGGGGCGAGCAGGCTGCTCTTTCTGTGGCTGGGCTGCTTCTGCGTGAGCCTGGCGCAGGGAGAGAGACCGAAGCCACCTTTCCCGGAGCTCCGCAAAGCTGTGCCAGGTGACCGCACGGCAGGTGGTGGCCCGGACTCCGAGCTGCAGCCGCAAGACAA(SEQ IDNO：9)。
MGMT基因的CpG岛区：
CGGAAGCTGGGAAGGCGCCGCCCGGCTTGTACCGGCCGAAGGGCCATCCGGGTCAGGCGCACAGGGCAGCGGCGCTGCCGGAGGACCAGGGCCGGCGTGCCGGCGTCCAGCGAGGATGCGCAGACTGCCTCAGGCCCGGCGCCGCCGCACTGGGCATGCGCCGACCCGGTCGGGCGGGAACACCCCGCCCCGCCCGGGCTCCGCCCCAGCTCCGCCCCCGCGCGCCCCGGCCCCGCCCCCGCGCGCTCTCTTGCTTTTCTCAGGTCCTCGGCTCCGCCCCGCTCTAGACCCCGCCCCACGCCGCCATCCCCGTGCCCCTCGGCCCCGCCCCCGCGCCCCGGATATGCTGGGACAGCCCGCGCCCCTAGAACGCTTTGCGTCCCGACGCCCGCAGGTCCTCGCGGTGCGCACCGTTTGCGACTTGGTGAGTGTCTGGGTCGCCTCGCTCCCGGAAGAGTGCGGAGCTC(SEQ ID NO：10)。
CDH1基因的CpG岛区：
AGTTCGAGACCAGGCTGGGCAATACAGGGAGACACAGCGCCCCCACTGCCCCTGTCCGCCCCGACTTGTCTCTCTACAAAAAGGCAAAAGAAAAAAAAATTAGCCTGGCGTGGTGGTGTGCACCTGTACTCCCAGCTACTAGAGAGGCTGGGGCCAGAGGACCGCTTGAGCCCAGGAGTTCGAGGCTGCAGTGAGCTGTGATCGCACCACTGCACTCCAGCTTGGGTGAAAGAGTGAGACCCCATCTCCAAAACGAACAAACAAAAAATCCCAAAAAACAAAAGAACTCAGCCAAGTGTAAAAGCCCTTTCTGATCCCAGGTCTTAGTGAGCCACCGGCGGGGCTGGGATTCGAACCCAGTGGAATCAGAACCGTGCAGGTCCCATAACCCACCTAGACCCTAGCAACTCCAGGCTAGAGGGTCACCGCGTCTATGCGAGGCCGGGTGGGCGGGCCGTCAGCTCCGCCCTGGGGAGGGGTCCGCGCTGCTGATTGGCTGTGGCCGGCAGGTGAACCCTCAGCCAATCAGCGGTACGGGGGGCGGTGCCTCCGGGGCTCACCTGGCTGCAGCCACGCACCCCCTCTCAGTGGCGTCGGAACTGCAAAGCACCTGTGAGCTTGCGGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCCCGCTCCAGCCCGGCCCGACCCGACCGCACCCGGCGCCTGCCCTCGCTCGGCGTCCCCGGCCAGCC(SEQ ID NO：11)。
APC基因的CpG岛区：
CTCCTCTATTCTGTACTTCTGTTCCCGTTTTATACAGCAGGAAATTGAAACACTGAGAGGTTAAGTAACTAAAGTTACAGAGCTAGAGTGACAGGAGTAAAGCTTCAACTCAGGCAACCCAGACTTCCAGAGTTCTGATCTCCACTACTAAGCTGCTAGCATAGCTTTTCTGGTAACTATTTTTAATTCAAATATAATTCGAGTGATCTATCTAACAAGTCATCACTCTGACAACTCAGTGACTTGTAATGTAAAATTATTCATTGTAATTCATTTAATATTATTGTTTCTCTGTGCTGCAAAAATCATAGCAATCGAGATGTAATTTATTACTCTCCCTCCCACCTCCGGCATCTTGTGCTAATCCTTCTGCCCTGCGGACCTCCCCCGACTCTTTACTATGCGTGTCAACTGCCATCAACTTCCTTGCTTGCTGGGGACTGGGGCCGCGAGGGCATACCCCCGAGGGGTACGGGGCTAGGGCTAGGCAGGCTGTGCGGTTGGGCGGGGCCCTGTGCCCCACTGCGGAGTGCGGGTCGGGAAGCGGAGAGAGAAGCAGCTGTGTAATCCGCTGGATGCGGACCAGGGCGCTCCCCATTCCCGTCGGGAGCCCGCCGATTGGCTGGGTGTGGGCGCACGTGACCGACATGTGGCTGTATTGGTGCAGCCCGCCAGGGTGTCACTGGAGACAGAATGGAGGTGCTGCCGGACTCGGAAATGGGGTCCAAGGGTAGCCAAGG(SEQ ID NO：12)。
2.针对以上区域进行特异性引物设计：
SPT9-S：
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTCGAAATCCGAAATAATCCCATCCAACTA(SEQID NO：13)。
NDRG4-S：
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCAAAACGATGCCGAACCTAAAACTAATCC(SEQID NO：14)。
BMP3-S：
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACAACCCAACCACAAAAAAAACAACCTAC(SEQID NO：15)。
MGMT-S:
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGAAACCGAAAACCTAAAAAAAACAAAAAAA(SEQID NO：16)。
CDH1-S:
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTACTAAAATCTAGGTGGGTTATAAAACCT(SEQID NO：17)。
APC-S:
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCCAACGAATTACACAACTACTTCTCTCTC(SEQID NO：18)。
3.设计制作illumina测序平台接头序列：
ADT-S:GATCGGAAGAGC(SEQ ID NO：3)。
接头序列中所有的胞嘧啶C均为甲基化修饰。
ADT-AS:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNIIIIIIIGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQID NO：4；5’端使用生物素修饰；NNNNNNNN为单分子标签，用于准确计算甲基化比率；N代表A、T、C、G任何一种碱基；IIIIIII代表7个特定的序列，用以区分样本)。
接头序列中所有的胞嘧啶C均为甲基化修饰。
ADT-S和ADT-AS退火成双链使用。
4.本实施例使用的材料为6例分别在SEPT9、NDRG4、BMP3、MGMT、CDH1、APC(样本编号分别为SE、ND、BM、MG、CD、AP)相关位置甲基化阳性的肿瘤患者外周血。EDTA抗凝管采集外周血各5mL。1600g转速在4℃条件下离心10分钟并分离出血浆。血浆再16000g转速在室温下离心10分钟，冻存备用。取每个样本各2mL血浆，使用QIAamp Circulating Nucleic AcidKit抽提出血浆游离DNA，使用荧光计Qubit定量，SE抽提17.3ng。ND抽提14.9ng。BM抽提12.1ng。MG抽提24.2ng。CD抽提13.6ng。AP抽提10.7ng。
5.游离DNA末端修复、加腺嘌呤尾：
配制如下表9的反应体系：
表9
在PCR仪中进行如下表10的反应：
表10
| 20℃ | 30分钟 |
| 65℃ | 30分钟 |
| 4℃ | 保存 |
6.游离DNA连接接头：
配制如下表11的反应体系：
表11
| 步骤5的产物 | 60μl |
| 连接缓冲液(Ligation Buffer) | 30μl |
| DNA连接酶(DNA Ligase) | 10μl |
| 接头(5uM) | 5μl |
| 无菌水 | 5μl |
| 总体积 | 110μl |
反应产物使用AmpureXP磁珠进行纯化。
7.步骤6的产物进行亚硫酸氢钠处理：
使用试剂盒为ZYMO RESEARCH公司的EZ-96DNA Methylation-Gold MagPrep(Catalog Nos.D5042)。
8.与M270磁珠结合：
经亚硫酸氢钠处理过的DNA变为单链DNA。通过接头上的生物素修饰与M270磁珠结合。
9.目标区域富集：
配制如下表12的反应体系：
表12
Pooling-primers引物组为各特异性引物的混合物。
以上反应体系把步骤8的磁珠悬浮起来，进行如下PCR反应。
Uni-primer7引物序列：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO：5)。
PCR程序如下表13：
表13
去掉磁珠后使用1X Ampure xp磁珠纯化步骤9的产物。
10.通用引物扩增：
配制如下表14的反应体系：
表14
| 2×KAPA HiFi HotStart Ready Mix | 25μl |
| Uni-primer5(5uM) | 1μl |
| Uni-primer7(5uM) | 1μl |
| 步骤9的PCR产物 | 23μl |
| 总体积 | 50μl |
Uni-primer5引物序列：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACG(SEQ ID NO：6)。
PCR程序如下表15：
表15
使用1X Ampure xp磁珠纯化步骤10的产物。
11.文库经过质控，并在illumina Nextseq500上进行上机测序，测序类型为PE75。经过数据基本分析及甲基化转换数据分析结果如下表16：
表16
该实施例结果表明，本发明的方法能够同时对多个待检测甲基化区域进行有效的特异性富集、测序。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 人和未来生物科技（长沙）有限公司
<120> 一种微量碎片化DNA甲基化检测文库的构建方法和检测方法
<130> 17I24580
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 322
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agccaggggg cctaggggct cctccggcgg ctagctctgc actgcaggag cgcgggcgcg 60
gcgccccagc cagcgcgcag ggcccgggcc ccgccggggg cgcttcctcg ccgctgccct 120
ccgcgcgacc cgctgcccac cagccatcat gtcggacccc gcggtcaacg cgcagctgga 180
tgggatcatt tcggacttcg aaggtgggtg ctgggctggc tgctgcggcc gcggacgtgc 240
tggagaggac cctgcgggtg ggcctggcgc gggacggggg tgcgctgagg ggagacggga 300
gtgcgctgag gggagacggg ac 322
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctttcgaaa tccgaaataa tcccatccaa 60
cta 63
<210> 3
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gatcggaaga gc 12
<210> 4
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(32)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 4
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nnbbbbbbbg tgactggagt tcagacgtgt 60
gctcttccga tct 73
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acg 43
<210> 7
<211> 322
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
agccaggggg cctaggggct cctccggcgg ctagctctgc actgcaggag cgcgggcgcg 60
gcgccccagc cagcgcgcag ggcccgggcc ccgccggggg cgcttcctcg ccgctgccct 120
ccgcgcgacc cgctgcccac cagccatcat gtcggacccc gcggtcaacg cgcagctgga 180
tgggatcatt tcggacttcg aaggtgggtg ctgggctggc tgctgcggcc gcggacgtgc 240
tggagaggac cctgcgggtg ggcctggcgc gggacggggg tgcgctgagg ggagacggga 300
gtgcgctgag gggagacggg ac 322
<210> 8
<211> 457
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tctaaggttc cccttgggag tctaaacaaa gactacggca gcgccgtccc ctcccccggg 60
aacccgacgc cgcgcggcca cagggggcct ggaggggcgg gcagggcctc gcagcgcacc 120
cagcacagtc cgcgcggcgg agcgggtgag aagtcggcgg gggcgcggat cgaccggggt 180
gtcccccagg ctccgcgtcg cggtccccgc tcgccctccc gcccgcccac cgggcacccc 240
agccgcgcag aaggcggaag ccacgcgcga gggaccgcgg tccgtccggg actagcccca 300
ggcccggcac cgccccgcgg gccgagcgcc cacacccgcc aaacccacgc gggcacgccc 360
ccgcggcgca ccgcccccag cccggcctcc gcccctgcag ccgcgggcac gcggaggggc 420
tcctggctgc ccgcacctgc acccgcgcgt cggcggc 457
<210> 9
<211> 455
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccgcgaccta cagctctttc tcagcgttgg agtggagacg gcgcccgcag cgccctgcgc 60
gggtgaggtc cgcgcagctg ctggggaaga gcccacctgt caggctgcgc tgggtcagcg 120
cagcaagtgg ggctggccgc tatctcgctg cacccggccg cgtcccgggc tccgtgcgcc 180
ctcgccccag ctggtttgga gttcaaccct cggctccgcc gccggctcct tgcgccttcg 240
gagtgtcccg cagcgacgcc gggagccgac gcgccgcgcg ggtacctagc catggctggg 300
gcgagcaggc tgctctttct gtggctgggc tgcttctgcg tgagcctggc gcagggagag 360
agaccgaagc cacctttccc ggagctccgc aaagctgtgc caggtgaccg cacggcaggt 420
ggtggcccgg actccgagct gcagccgcaa gacaa 455
<210> 10
<211> 467
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cggaagctgg gaaggcgccg cccggcttgt accggccgaa gggccatccg ggtcaggcgc 60
acagggcagc ggcgctgccg gaggaccagg gccggcgtgc cggcgtccag cgaggatgcg 120
cagactgcct caggcccggc gccgccgcac tgggcatgcg ccgacccggt cgggcgggaa 180
caccccgccc cgcccgggct ccgccccagc tccgcccccg cgcgccccgg ccccgccccc 240
gcgcgctctc ttgcttttct caggtcctcg gctccgcccc gctctagacc ccgccccacg 300
ccgccatccc cgtgcccctc ggccccgccc ccgcgccccg gatatgctgg gacagcccgc 360
gcccctagaa cgctttgcgt cccgacgccc gcaggtcctc gcggtgcgca ccgtttgcga 420
cttggtgagt gtctgggtcg cctcgctccc ggaagagtgc ggagctc 467
<210> 11
<211> 710
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
agttcgagac caggctgggc aatacaggga gacacagcgc ccccactgcc cctgtccgcc 60
ccgacttgtc tctctacaaa aaggcaaaag aaaaaaaaat tagcctggcg tggtggtgtg 120
cacctgtact cccagctact agagaggctg gggccagagg accgcttgag cccaggagtt 180
cgaggctgca gtgagctgtg atcgcaccac tgcactccag cttgggtgaa agagtgagac 240
cccatctcca aaacgaacaa acaaaaaatc ccaaaaaaca aaagaactca gccaagtgta 300
aaagcccttt ctgatcccag gtcttagtga gccaccggcg gggctgggat tcgaacccag 360
tggaatcaga accgtgcagg tcccataacc cacctagacc ctagcaactc caggctagag 420
ggtcaccgcg tctatgcgag gccgggtggg cgggccgtca gctccgccct ggggaggggt 480
ccgcgctgct gattggctgt ggccggcagg tgaaccctca gccaatcagc ggtacggggg 540
gcggtgcctc cggggctcac ctggctgcag ccacgcaccc cctctcagtg gcgtcggaac 600
tgcaaagcac ctgtgagctt gcggaagtca gttcagactc cagcccgctc cagcccggcc 660
cgacccgacc gcacccggcg cctgccctcg ctcggcgtcc ccggccagcc 710
<210> 12
<211> 740
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ctcctctatt ctgtacttct gttcccgttt tatacagcag gaaattgaaa cactgagagg 60
ttaagtaact aaagttacag agctagagtg acaggagtaa agcttcaact caggcaaccc 120
agacttccag agttctgatc tccactacta agctgctagc atagcttttc tggtaactat 180
ttttaattca aatataattc gagtgatcta tctaacaagt catcactctg acaactcagt 240
gacttgtaat gtaaaattat tcattgtaat tcatttaata ttattgtttc tctgtgctgc 300
aaaaatcata gcaatcgaga tgtaatttat tactctccct cccacctccg gcatcttgtg 360
ctaatccttc tgccctgcgg acctcccccg actctttact atgcgtgtca actgccatca 420
acttccttgc ttgctgggga ctggggccgc gagggcatac ccccgagggg tacggggcta 480
gggctaggca ggctgtgcgg ttgggcgggg ccctgtgccc cactgcggag tgcgggtcgg 540
gaagcggaga gagaagcagc tgtgtaatcc gctggatgcg gaccagggcg ctccccattc 600
ccgtcgggag cccgccgatt ggctgggtgt gggcgcacgt gaccgacatg tggctgtatt 660
ggtgcagccc gccagggtgt cactggagac agaatggagg tgctgccgga ctcggaaatg 720
gggtccaagg gtagccaagg 740
<210> 13
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctttcgaaa tccgaaataa tcccatccaa 60
cta 63
<210> 14
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgcaaaac gatgccgaac ctaaaactaa 60
tcc 63
<210> 15
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaacaacc caaccacaaa aaaaacaacc 60
tac 63
<210> 16
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgaaaccg aaaacctaaa aaaaacaaaa 60
aaa 63
<210> 17
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctttactaa aatctaggtg ggttataaaa 60
cct 63
<210> 18
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttccaacg aattacacaa ctacttctct 60
ctc 63
Claims (10)
1.一种微量碎片化DNA甲基化检测文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
将碎片化DNA与甲基化接头连接，其中所述甲基化接头上所有的胞嘧啶均为甲基化胞嘧啶，所述甲基化接头包括长链和短链，所述长链和所述短链部分互补形成双链，所述长链包括测序平台通用序列、单分子标签序列、样本标签序列和测序引物结合序列，其中所述单分子标签序列用于在测序后计算甲基化比率，所述样本标签序列用于区分不同样本，所述测序引物结合序列用于提供测序引物的结合位点；
对连接了甲基化接头的DNA进行亚硫酸氢钠处理，以将非甲基化的CpG岛中的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U；
使用特异性引物和通用引物对经过亚硫酸氢钠处理以后的、含有待测CpG位点的目标区域进行PCR扩增富集，得到可用于上机测序的文库，其中所述特异性引物的结合位点位于所述待测CpG位点下游。
2.根据权利要求1所述的检测文库的构建方法，其特征在于，所述甲基化接头中含有生物素标记，用于通过生物素链霉亲和素结合作用来回收亚硫酸氢钠处理后的单链DNA；
优选地，所述生物素标记位于所述甲基化接头的长链的5’端。
3.根据权利要求1所述的检测文库的构建方法，其特征在于，所述目标区域内包含多个待测CpG位点。
4.根据权利要求1所述的检测文库的构建方法，其特征在于，所述特异性引物的设计区域距离最近的待测CpG位点1-10个碱基。
5.根据权利要求4所述的检测文库的构建方法，其特征在于，所述特异性引物的设计区域的长度基本上是25-45bp碱基。
6.根据权利要求4所述的检测文库的构建方法，其特征在于，所述特异性引物的设计区域的3’端前10-30bp碱基不含CpG位点，优选前30bp以上碱基不含CpG位点。
7.根据权利要求1所述的检测文库的构建方法，其特征在于，所述单分子标签序列是一段长度基本上是6-10个的随机碱基，每个位点上的随机碱基可以是A、T、G、C中的任一种。
8.根据权利要求1所述的检测文库的构建方法，其特征在于，所述特异性引物包括两条嵌套式引物，其中一个比另一个更靠近所述待测CpG位点。
9.根据权利要求1所述的检测文库的构建方法，其特征在于，所述碎片化DNA经末端修复后在3’端有A碱基；所述甲基化接头在3’端有T碱基；所述A碱基和所述T碱基形成配对连接。
10.一种微量碎片化DNA甲基化检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
将碎片化DNA与甲基化接头连接，其中所述甲基化接头上所有的胞嘧啶均为甲基化胞嘧啶，所述甲基化接头包括长链和短链，所述长链和所述短链部分互补形成双链，所述长链包括测序平台通用序列、单分子标签序列、样本标签序列和测序引物结合序列，其中所述单分子标签序列用于在测序后计算甲基化比率，所述样本标签序列用于区分不同样本，所述测序引物结合序列用于提供测序引物的结合位点；
对连接了甲基化接头的DNA进行亚硫酸氢钠处理，以将非甲基化的CpG岛中的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U；
使用特异性引物和通用引物对经过亚硫酸氢钠处理以后的、含有待测CpG位点的目标区域进行PCR扩增富集，得到可用于上机测序的文库，其中所述特异性引物的结合位点位于所述待测CpG位点下游；
对所述文库进行上机测序和数据分析，得到所述碎片化DNA的DNA甲基化信息。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Song Zhuo Inventor after: Wang Yongli Inventor after: Chuan Jun Inventor before: Song Zhuo Inventor before: Wang Yongli |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180420 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |