CN110923302A - 一种多基因甲基化联合检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于核酸测定技术领域，具体涉及一种多基因甲基化联合检测方法。本发明针对多个目标基因甲基化区域，在经重亚硫酸盐转化后的DNA序列上设计两组PCR引物。使用第一组引物进行一轮PCR后，产物经纯化后使用第二组引物进行二轮PCR,所得产物与杂交磁珠杂交并进行荧光标记，最后使用液相芯片平台检测。本发明采用多对引物同时进行PCR反应，通过检测偶联不同标签序列的磁珠的荧光信号来确定不同基因位点的甲基化情况，实现多重检测的目的。两次PCR扩增实现了甲基化信号的逐级放大，提高了检测的灵敏度和准确性，使样本的适用范围更加广泛。

Description

一种多基因甲基化联合检测方法
技术领域
本发明属于核酸测定技术领域，具体涉及一种多基因甲基化联合检测方法。
背景技术
DNA甲基化是一种重要的表观遗传学修饰，在人类基因组中甲基化主要发生在CpG二核苷酸。DNA甲基化过程是在DNA甲基转移酶的催化下，将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到CpG二核苷酸的胞嘧啶(C)上，生成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。CpG二核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，通常位于基因启动子的CpG岛。目前常用的甲基化检测方法主要有以下几种：
1.重亚硫酸盐测序PCR(BSP)：DNA经过重亚硫酸盐处理后，设计引物对目的片段进行PCR扩增，并对PCR产物进行克隆测序，将测序序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。该方法操作繁琐，不宜大批量操作。另外，甲基化程度的定量依赖于挑选克隆的数目，因此这种方法属于一种半定量的技术方法。
2.甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-HRM)：DNA样本经过重亚硫酸盐处理后，甲基化与未甲基化DNA会存在序列差异，这种差异可通过熔解曲线分析发现。然而该方法对仪器的要求高，需要带HRM模块的荧光定量PCR仪，并且在进行实时定量PCR的过程中，需要使用饱和的荧光染料。利用MS-HRM技术进行甲基化检测只能对检测片段整体甲基化情况进行分析，并不能明确每个CpG位点的甲基化状态。因此这种技术适用于大量样本的检测，筛选出感兴趣的CpG位点，然后利用其他方法进行单个位点的精确检测及甲基化程度的精确定量。
3.联合重亚硫酸盐的限制性内切酶分析法(COBRA)：这种方法是将重亚硫酸盐处理与酶切相结合来进行甲基化检测。DNA样本经重亚硫酸盐处理后，利用PCR扩增。扩增产物纯化后用限制性内切酶(BstUI)消化。若其识别序列中的胞嘧啶C发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则PCR扩增后仍为CGCG，BstUI能够识别并进行切割；若待测序列中，胞嘧啶C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG，BstUI识别位点丢失，不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可计算出原样本中甲基化的比例。这种方法局限性十分明显，只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，阴性结果并不能排除样品DNA中存在甲基化的可能。
4.荧光定量法(Methylight)：该技术是在甲基化特异性PCR(MSP)技术上发展起来的，在MSP扩增过程中利用荧光染料进行定量。其原理是针对重亚硫酸盐处理之后的DNA片段，在甲基化位点上会存在单碱基的差异，根据这种差异进行探针设计，随后进行实时定量PCR，就能够检测甲基化的差异。但是TaqMan探针订购费用较高，适用于少数位点大量样本筛选。
5.焦磷酸测序(Pyrosequencing)：焦磷酸测序作为一种新的序列分析技术，能够检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测。在序列延伸过程中，根据胞嘧啶C和胸腺嘧啶T的掺入量来定量确定单个位点的C-T比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测，并给出精确的甲基化程度的数据。但是目前来看，焦磷酸测序的片段长度还比较短，只有一百多个碱基，其中有效长度约为60bp。
发明内容
针对上述甲基化研究方法中存在的问题，本发明旨在提供一种多基因甲基化联合检测方法，其目的在于使DNA甲基化检测方法更加灵敏、准确，增加通量并更适用于微量DNA样本。
本发明提供的一种多基因甲基化联合检测方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)使用第一组PCR引物对经重亚硫酸盐处理的DNA样本进行一轮PCR扩增,得到甲基化特异性产物；
(b)使用第二组PCR引物对步骤(a)的产物进行二轮PCR扩增，使甲基化特异性产物带有生物素标记及标签序列；
(c)将步骤(b)的PCR产物通过其标签序列与杂交磁珠上的标签互补序列杂交，并使用链霉亲和素-藻红蛋白进行荧光标记；
(d)步骤(c)产物使用液相芯片平台进行检测，并判断目的基因甲基化情况。
优选的，步骤(a)中的DNA样本可以来源于任何生物。
优选的，所述步骤(a)中第一组引物上游引物针对目的基因甲基化位点设计，下游引物针对目的基因非甲基化位点设计，并且在下游引物5’端添加通用引物序列；
优选的，所述步骤(b)中第二组PCR引物的上游引物针对目的基因甲基化位点设计，同时5’端添加标签序列和间隔序列，下游引物为5’端添加生物素标记的通用引物。
优选的，所述步骤(a)和步骤(b)两组PCR引物下游使用的通用引物序列相同。
优选的，所述步骤(b)中对步骤(a)产物进行二轮PCR前还应使用虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I的混合物或磁珠纯化或纯化柱纯化中的任意一种方法对步骤(a)产物进行纯化。
优选的，所述步骤(a)和步骤(b)中PCR扩增采用热启动Taq DNA聚合酶作为酶反应试剂。
优选的，所述步骤(c)中杂交磁珠为已经预先偶联不同标签互补序列的磁珠混合而成，从而能够与带有不同标签序列的目的基因产物特异性结合。
优选的，步骤(d)中的甲基化情况判断依据为：检测结果值大于或等于阴性对照3倍以上即判定为该位点发生甲基化，检测结果值小于阴性对照3倍则判定为该位点未发生甲基化。
本发明的显著效果是：本发明采用针对不同目的基因的多对引物同时进行PCR反应，利用PCR产物不同标签序列与不同磁珠互补标签序列特异性杂交，通过检测偶联不同标签序列的磁珠的荧光信号来确定不同基因位点的甲基化情况，适用于多达100个目标区域甲基化检测，实现了多重检测的目的。两次PCR扩增实现了甲基化信号的逐级放大，提高了检测的灵敏度和准确性，对DNA模板量较少的样本同样适用，使样本的适用范围更加广泛。
附图说明
图1为本发明流程示意图。
图2为本发明实施例检测结果示意图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但是本领域技术人员将会理解下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例
本实施例采用本发明提供的方法，包括下述步骤：
1)使用经重亚硫酸盐转化后的人类甲基化DNA和人类非甲基化DNA(ZYMORESEARCH,D5014)作为阳性和阴性标准品，经重亚硫酸盐转化后的人类组织DNA样本作为待测样本。
2)PCR引物合成：第一组PCR引物针对甲基化位点设计，下游引物5’端添加通用引物序列,序列如下：
Figure BDA0002282362540000031
二轮PCR引物的上游引物针对甲基化位点设计，同时5’端添加标签序列和间隔序列，下游引物为5’端添加生物素标记的通用引物,序列如下：
Figure BDA0002282362540000041
3)一轮PCR扩增反应：
配制PCR体系，每个反应包括：2×Taq酶mix(
Figure BDA0002282362540000042
Taq 2×mastermix，203443)，10μl；步骤2)第一组PCR引物，1.6μl；水，4.4μl，转化后的DNA模板4μl，混合后震荡均匀。按如下条件设置PCR仪并进行反应：
Figure BDA0002282362540000043
4)纯化:取5μl步骤3)一轮PCR产物，加入2μl
Figure BDA0002282362540000044
(GE Healthcare,US78200)，37℃30min，85℃15min。
5)二轮PCR扩增反应:配制PCR体系，每个反应包括：2×Taq酶mix(
Figure BDA0002282362540000045
Taq 2×master mix，203443)，10μl；步骤2)第二组PCR引物，1.6μl；水，7.4μl，转化后的DNA模板1μl，混合后震荡均匀。按如下条件设置PCR仪并进行反应：
Figure BDA0002282362540000051
6)杂交：96孔板(AXYGEN,PCR-96-LP-FLT-C)每个反应孔中分别加入25μl 2×Tm杂交液(0.4M NaCl，0.2M Tris,0.16％Triton X-100,pH 8.0)、16μl去离子水，6μl步骤5)二轮PCR产物及2μl磁珠混合物(Luminex,MagPlex-TAG Micros pheres)，封膜后震荡混匀20s。按照如下条件设置PCR仪并进行反应：37℃，15min。
7)荧光标记：制备SAPE混合液，包括SAPE原液(Life Technologies,S-866)1.125μl；1×Tm杂交液(0.2M NaCl，0.1M Tris,0.08％Triton X-100,pH 8.0)75μl。将步骤6)杂交产物从PCR仪取下后立即置于磁力板(V&P Scientific,VP771LD-4CS)上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入配置好的SAPE混合液25μl，封膜后震荡混匀20s。按如下条件设置PCR仪并进行反应：37℃，15min。反应结束后将96孔板立即置于磁力板上60s后弃去上清。分别向每个反应孔中加入1×Tm杂交液50μl，震荡混匀20s，之后置于磁力板30-60s后弃去上清，重复1次。最后分别向每个反应孔中加入1×Tm杂交液75μl，震荡混匀20s。
8)液相芯片平台检测：步骤7)得到的产物使用Luminex200液相芯片平台进行检测，检测操作步骤及参数设置按照Luminex200操作说明书操作。
9)检测结果判定：样本检测结果与阴性标准品结果进行比对，如果某一基因的检测数值大于或等于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因为阳性，如果样本某一基因的检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定为阴性。
本发明不限于前面详细描述的实施方案。本发明可延伸至本申请文本(包括所附的权利要求书/摘要和附图)中所公开的特征的任何新的一个特征或任何新的组合，或者延伸至如此公开的任何方法或过程的步骤任何一个新的特征或任何新的组合。

Claims (9)

1.一种多基因甲基化联合检测方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
(a)使用第一组PCR引物对经重亚硫酸盐处理的DNA样本进行一轮PCR扩增,得到甲基化特异性产物；
(b)使用第二组PCR引物对步骤(a)的产物进行二轮PCR扩增，使甲基化特异性产物带有生物素标记及标签序列；
(c)将步骤(b)的PCR产物通过其标签序列与杂交磁珠上的标签互补序列杂交，并使用链霉亲和素-藻红蛋白进行荧光标记；
(d)步骤(c)产物使用液相芯片平台进行检测，并判断目的基因甲基化情况。
2.根据权利要求1所述的一种多基因甲基化联合检测方法，其特征在于，步骤(a)中的DNA样本可以来源于任何生物。
3.根据权利要求1所述的一种多基因甲基化联合检测方法，其特征在于，所述步骤(a)中第一组引物针对目的基因甲基化位点设计，下游引物5’端添加通用引物序列。
4.根据权利要求1所述的一种多基因甲基化联合检测方法，其特征在于，所述步骤(b)中第二组PCR引物的上游引物针对目的基因甲基化位点设计，同时5’端添加标签序列和间隔序列，下游引物为5’端添加生物素标记的通用引物序列。
5.根据权利要求1所述的一种多基因甲基化联合检测方法，其特征在于，所述两组PCR引物下游使用的通用引物序列相同。
6.根据权利要求1所述的一种多基因甲基化联合检测方法，其特征在于，所述步骤(b)中对步骤(a)产物进行二轮PCR前还应使用虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I的混合物或磁珠纯化或纯化柱纯化中的任意一种方法对步骤(a)产物进行纯化。
7.根据权利要求1所述的一种多基因甲基化联合检测方法，其特征在于，所述步骤(a)和步骤(b)中PCR扩增采用热启动Taq DNA聚合酶作为PCR反应试剂。
8.根据权利要求1所述的一种多基因甲基化联合检测方法，其特征在于，所述步骤(c)中杂交磁珠为已经预先偶联不同标签互补序列的磁珠混合而成，从而能够与带有不同标签序列的目的基因产物特异性结合。
9.根据权利要求1所述的一种多基因甲基化联合检测方法，其特征在于，步骤(d)中的甲基化情况判断依据为：检测结果值大于或等于阴性标准品3倍以上即判定为该位点发生甲基化，检测结果值小于阴性对照3倍则判定为该位点未发生甲基化。
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