CN114807325A - 单引物扩增建库技术在检测片段化dna分子断点信息中的应用及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了单引物扩增建库技术在检测片段化DNA分子断点信息中的应用，通过特异性引物线性扩增目标DNA，获得线性扩增产物；对线性扩增产物进行接头连接，获得接头连接产物；其中，接头连接体系中包括单链连接酶和单链接头；对接头连接产物进行文库扩增、测序和生信分析，获得DNA分子断点信息。本发明还公开了用于片段化DNA分子断点信息检测的试剂盒/试剂。本发明通过单引物扩增建库技术极好的实现了靶向检测DNA分子断点的功能。同时验证该断点信息与样本来源有关，具有用于预测分子组织来源的潜在功能。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及单引物扩增建库技术在检测片段化DNA分子断点信息中的应用及试剂盒。
背景技术
近年来使用下一代测序(NGS)技术的研究发现，游离DNA分子的天然断点位置信息可作为分子标志物，具有用于预测分子组织来源的潜在功能。但是目前的研究都是基于全基因组游离DNA深度测序的断点分析；此类方法存在测序成本极高和游离DNA分子建库效率低而导致的高噪声问题，导致此类的研究进展缓慢，临床转化研究难以进行。为了降低检测成本，理想的分子断点检测技术应聚焦在目标区域实现，避免大量无关区域高深度测序对成本和分析时间的浪费。为了提高分子断点的检测精度，更应选用高转化效率的游离DNA分子建库方法，来提高目标区域的文库分子数量，从而提升检测精度，降低噪声。
现有的两类可对游离DNA分子的靶向建库技术，多重PCR技术和杂交捕获技术均无法满足这样的要求。PCR技术无法检测未知断点，而杂交捕获技术存在文库建库效率低和靶向探针结合偏好性的问题，也无法有效的检测目标区域的游离DNA分子的断点信息。
发明内容
为克服现有技术存在的上述缺点，本发明的目的在于提供一种单引物扩增建库技术在检测片段化DNA分子断点信息中的应用及试剂盒。本发明通过单引物扩增建库技术极好的实现了靶向检测DNA分子断点的功能。同时验证该断点信息与样本来源有关，具有用于预测分子组织来源的潜在功能。
本发明提供的单引物扩增建库技术在检测片段化DNA分子断点信息中的应用，所述单引物扩增建库技术主要步骤为：1.特异性引物对片段化DNA分子的目标区域进行线性扩增，此扩增保留了片段化DNA分子一端的断点信息；2.线性扩增产物通过单链连接酶与单链接头相连，构建成单链文库分子；3.此文库分子通过后续的文库扩增，用于NGS测序分析；4.NGS测序数据通过参考基因组比对和去重分析，还原得到每个片段化DNA分子一端的断点位置，对目标区域的所有片段化DNA分子一端的断点信息进行数据处理得到的该目标区域不同断点的频率分布。最终，本发明通过不同来源的样本测试(例如健康人血浆与尿液的游离DNA样本以及血细胞基因组DNA使用酶切打断后片段化DNA样本)，证实该频率分布与样本来源高度相关，提示以此方法检测到的DNA分子断点具有用于预测分子组织来源的潜在功能。
本发明提供的单引物扩增建库技术在检测片段化DNA分子断点信息中的应用，所述单引物扩增建库技术包括以下步骤：(1)通过特异性引物线性扩增目标DNA，获得线性扩增产物；(2)对步骤(1)所得的线性扩增产物进行接头连接，获得接头连接产物；其中，接头连接体系中包括单链连接酶和单链接头；(3)对步骤(2)所得的接头连接产物进行文库扩增、测序和生信分析，获得DNA分子断点信息。
本发明应用中，特异性引物的核苷酸序列包括如编号SEQ ID No.1-11所示序列之一种或多种的组合，为可用于线性扩增的特异性引物。
本发明应用中，所述片段化DNA分子的长度为25～500bp/nt，优选为50～200bp/nt；
和/或，所述片段化DNA分子的结构为双链DNA、单链DNA或cDNA；
和/或，所述片段化DNA分子为游离DNA；
和/或，所述片段化DNA分子来源于体液，优选来源于血液和/或尿液；
和/或，所述片段化DNA分子由基因组DNA经打断制备获得，优选为超声打断和/或酶切打断。
本发明应用中，还包括：纯化线性扩增产物，优选的，所述纯化的方法为针对dNTP标记分子的亲和纯化；和/或，至少部分的所述dNTP偶联有标记分子，所述标记分子优选为生物素。
在具体实施方案中，本发明应用中，对目标区域进行线性扩增1-100轮，进一步优选1-60轮，再优选20-40轮。
本发明应用中，所述特异性引物的3’端至少部分的序列与目标区域互补，与目标区域互补的序列的长度≥16nt；
和/或，所述特异性引物的3’末端核苷酸含有封闭基团修饰，优选的，所述的封闭基团为C3 Spacer基团，取代了所述特异性引物的3’末端核苷酸的3位C原子羟基；
和/或，所述特异性引物还包括第一通用序列、第一样本标签序列、第一测序序列中的一种或多种的组合。
本发明应用中，所述线性扩增的扩增体系中包括特异性引物、DNA聚合酶和dNTP，优选的，所述DNA聚合酶具有3’-5’外切酶活性，更优选的，所述DNA聚合酶选自B族DNA聚合酶。
本发明应用中，所述DNA聚合酶如B族DNA聚合酶，其主要用途是切除所述特异性引物的3’末端核苷酸含有的封闭基团。
本发明应用中，所述单链接头包括第二测序序列、第二样本标签序列、第二通用序列、分子标签序列中的一种或多种的组合；
所述单链连接酶为T4 RNA连接酶或热稳定性RNA连接酶；
所述单链接头的5’末端的核苷酸被修饰、且在接头连接的反应温度下为单链结构；优选的，单链接头的5’末端的核苷酸的5位C原子连接有磷酸基团或腺苷基团；
所述单链接头的3’末端的核苷酸的3位C原子羟基被封闭基团取代，优选的，所述的封闭基团为C3 Spacer基团；
所述单链接头的5’端区域为具有黏性末端的部分双链结构。
在具体实施方案中，本发明应用中，在线性扩增和接头连接后，还需要进行预扩增和扩库步骤以构建完整的文库分子，用于测序。
本发明还包括利用单引物扩增建库技术所得连接产物在构建文库中的应用。本发明在文库构建中的应用，包括：通过连接产物构建文库。
本发明应用中，所述文库扩增的构建方法包括：将连接产物进行预扩增，以提供预扩增产物，所述的预扩增引物的前引物包括与第一通用序列互补的序列、与第一样本标签序列互补的序列、与第一测序序列互补的序列中的一种或多种的组合，所述的预扩增引物的后引物包括与第二测序序列互补的序列；
还包括：将预扩增产物进行扩库，以提供文库产物，所述的扩库引物的前引物包括与第一测序序列互补的序列，所述的扩库引物的后引物包括与第二测序序列互补的序列。
本发明还包括单引物扩增建库技术在片段化DNA分子断点信息目标区域测序中的应用，包括：通过上述所提供的文库产物进行测序，以提供片段化DNA分子断点信息目标区域的测序结果。
本发明应用中，所述的生信分析包括比对分析、ontarget分析、去重分析和断点分析(按延伸长度判断各个reads的断点，并计算各个断点的分子个数，计算公式如下：(1)断点n的分子个数＝“位点n的去重后深度”-“位点n+1的去重后深度”；(2)断点n的频率＝断点n的分子个数÷去重后的总分子个数×100％)。
*比对分析一般以BWA进行、ontarget分析一般以Samtools进行、去重分析一般以Fgbio进行。
本发明的文库产物还包含分子标签序列(通过接头连接添加)。利用分子标签序列进行去重分析，可以去除扩库与测序步骤带来的碱基错误。所述的利用分子标签序列进行去重分析即将相同分子标签序列的类似reads进行归类，去除重复后得到扩库前文库分子的原始序列信息。
本发明还提供了一种试剂盒/试剂，用于片段化DNA分子断点信息中的的检测，其组成包括：特异性引物、DNA聚合酶、单链接头(包含分子标签序列)、单链连接酶。
本发明还提供了所述试剂盒/试剂在检测片段化DNA分子断点信息中的应用。本发明试剂盒/试剂还适用于上述的片段化DNA分子目标区域的扩增方法。
本发明显著有益效果包括，本发明通过单引物扩增建库技术极好的实现了靶向检测DNA分子断点的功能。同时验证该断点信息与样本来源有关，具有用于预测分子组织来源的潜在功能。
附图说明
图1为BRAF第15外显子区域深度信息。
图2为EGFR第21外显子区域深度信息。
图3为KRAS第2外显子区域深度信息。
图4为不同类型样本BRAF第15外显子区域的断点频率分布。
图5为不同类型样本EGFR第21外显子区域的断点频率分布。
图6为不同类型样本KRAS第2外显子区域的断点频率分布。
图7为本发明完整的检测流程图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。以下进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989andThird edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，JohnWiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS INENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
本发明应用中，通常来说，特异性引物可以包括与片段化DNA的目标区域至少部分互补的序列，从而可以实现对片段化DNA的目标区域的特异性扩增，本领域技术人员可选择合适的片段化DNA的目标区域，并根据片段化DNA的目标区域，设计合适的互补的序列。例如，特异性引物与目标区域互补的序列的长度可以为≥16nt、16～45nt、16～20nt、20～25nt、25～30nt、30～35nt、35～40nt、或40～45nt。再例如，特异性引物还包括第一通用序列(例如，Illumina测序体系的SP1)和/或第一样本标签(例如，Illumina测序体系的i5)和/或第一测序序列(例如，Illumina测序体系的P5)等中的一种或多种的组合。
本发明应用中，合适的获取片段化DNA的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。例如，包括目标区域的片段化DNA通常可以源于基因组DNA。再例如，片段化DNA可以是由基因组DNA经(随机)打断(例如，超声打断和/或酶切打断)制备获得的。再例如，片段化DNA可以是游离DNA，其可以来源于体液，再例如，血液和/或尿液等。再例如，片段化DNA的结构可以为双链DNA、单链DNA和cDNA。对于线性扩增体系来说，片段化DNA通常需要具有合适的长度，例如，所述片段化DNA的长度可以为25～500bp/nt、25～30bp/nt、30～40bp/nt、40～50bp/nt、50～60bp/nt、60～80bp/nt、80～100bp/nt、100～150bp/nt、150～200bp/nt、200～300bp/nt、300～400bp/nt、或400～500bp/nt。
本发明应用中，线性扩增的扩增体系中通常可以包括上述的特异性引物、DNA聚合酶和dNTP。通过特异性引物线性扩增包括目标区域的片段化DNA的反应通常可以在DNA聚合酶和/或dNTP存在的条件下进行。dNTP(例如，dATP、dGTP、dTTP、dCTP等)是线性扩增中的必要组分，至少部分的dNTP可以是偶联标记分子的dNTP，所偶联的标记分子可以是生物素等，通过偶联标记分子可以对扩增产物进行纯化。
本发明应用中，还可以包括：纯化线性扩增产物。本领域技术人员可选择合适的方法对线性扩增产物进行纯化，例如，如上所述，至少部分的dNTP可以是偶联标记分子的dNTP，所偶联的标记分子可以是生物素等，具体的纯化方法可以是针对dNTP标记分子的亲和纯化等。
本发明单引物多重扩增技术在文库构建中的应用，包括：通过本发明提供的线性扩增产物构建文库。合适的通过上述线性扩增产物构建文库的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。例如，可以包括：连接接头、预扩增、扩库等步骤。
还包括：将所得的线性扩增产物连接单链接头，获得连接产物，所述单链接头包括第二测序序列(例如，Illumina测序体系的P7)和/或第二样本标签序列(例如，Illumina测序体系的i7)和/或第二通用序列(例如，Illumina测序体系的SP2)和/或分子标签序列(用于标记原始样本中的每个DNA分子的随机序列)。在获得针对目标区域的线性扩增产物以后，可以进一步在线性扩增产物上连接接头，以便于后续进行进一步的测序。
本发明中，本领域技术人员通常可以根据后续所需进行的测序方法，在线性扩增产物上连接合适的单链接头。例如，单链接头可以包括第二测序序列和/或第二样本标签序列和/或第二通用序列和/或分子标签序列。再例如，用于接头连接反应的单链连接酶可以为T4RNA连接酶或热稳定性RNA连接酶(虽然使用的是RNA酶，但是连接的是DNA分子)。再例如，单链接头在接头连接的反应温度下为单链结构。再例如，单链接头的5’端区域通常为具有黏性末端的部分双链结构。
本发明中，还可以包括：将连接产物进行预扩增，以提供预扩增产物。本领域技术人员通常可以根据后续所需进行的测序方法，选择合适的条件对连接产物进行预扩增，并纯化预扩增产物(例如，磁珠纯化等)。例如，预扩增的反应体系中可以包括预扩增引物、DNA聚合酶和dNTP，所述DNA聚合酶优选为B族DNA聚合酶，所述预扩增引物的前引物包括与第一测序序列互补的序列，和/或，所述预扩增引物的前引物还包括与第一通用序列互补的序列，和/或，所述预扩增引物的前引物还包括与第一样本标签序列互补的序列，所述预扩增引物的后引物包括与第二测序序列互补的序列。
本发明中，还可以包括：将预扩增产物进行扩库，以提供扩库产物。本领域技术人员通常可以根据后续所需进行的测序方法，选择合适的条件将预扩增产物进行扩库，并纯化扩库产物(例如，磁珠纯化等)。例如，扩库体系的反应体系中可以包括扩库引物、DNA聚合酶和dNTP，所述DNA聚合酶优选为B族DNA聚合酶，所述扩库引物的前引物包括与第一测序序列互补的序列，所述扩库引物的后引物包括与第二测序序列互补的序列。
本发明还提供单引物多重扩增技术在DNA目标区域测序方法中的应用，包括：通过所提供的文库，将扩库产物进行测序，以提供目标区域的测序结果。本领域技术人员通常可以根据后续所需进行的测序方法，选择合适的条件将扩库产物进行测序，例如，可以是各种二代测序技术。优选的，文库分子的结构如下：
其中，第一测序序列可以是Illumina测序体系的P5，第一/第二样本标签序列可以是Illumina测序体系的i5或i7，第一/第二通用序列可以是Illumina测序体系的SP1或SP2，第二测序序列可以是Illumina测序体系的P7。
本发明还提供一种基于单引物扩增建库技术的用于片段化DNA分子断点检测的试剂盒和/或试剂，上述试剂盒和/或试剂适用本发明所提供的基于单引物扩增建库技术的DNA目标区域的扩增方法、或本发明文库构建方法、或本发明DNA目标区域的测序方法。上述试剂盒中，可以包括上述的各种特异性引物。上述试剂盒中，还可以包括DNA聚合酶、dNTP等线性扩增反应体系必要的组分。
实施例1：使用单引物扩增建库技术检测不同来源的片段化DNA样本的断点特征
使用单引物扩增建库技术对健康人血浆与尿液的游离DNA样本以及血细胞基因组DNA使用酶切打断后片段化DNA样本，进行多重引物线性扩增并建库测序，验证单引物扩增建库技术检测不同来源DNA分子断点特征的能力。
实验材料
1、检测样本
2例健康人的血浆与尿液游离DNA样本以及血细胞基因组DNA使用酶切打断后的片段化DNA样本。酶切打断以脱氧核糖核酸酶I(DNase I)进行。
所有片段化DNA样本都使用Qubit定量，浓度在1-5ng之间。取14L用于后续的建库。
2、引物序列详见表1，供应商均为上海生工。
表1
引物浓度为80nM。所有引物的3’末端都有C3 Spacer封闭基团修饰。粗体的序列表示第一通用序列，非粗体的序列表示与目标区域互补的序列。
3、单链接头与预扩增引物序列详见表2，供应商均为上海生工。
表2单链接头与预扩增引物序列
单链接头的5’末端核苷酸的5位C原子连接有磷酸基团，而3’末端核苷酸有C3Spacer基团修饰。单链接头中粗体的序列表示分子标签序列，底横线的序列表示第二通用序列，非粗体/非底横线/非斜体的序列表示第二样本标签序列，斜体的序列表示第二测序序列。预扩增引物中粗体的序列表示第一测序序列，非粗体/非底横线的序列表示第一样本标签序列，底横线的序列表示与第一通用序列互补的序列。
表3各实验对应的单链接头与预扩增引物
| 实验序号 | 样本 | 单链接头 | 预扩增引物 |
| 1 | 血浆1 | UA1 | i1 |
| 2 | 血浆2 | UA2 | i2 |
| 3 | 血细胞1 | UA3 | i3 |
| 4 | 血细胞2 | UA4 | i4 |
| 5 | 尿液1 | UA5 | i5 |
| 6 | 尿液2 | UA6 | i6 |
4、其他引物和探针
表4
| 寡核苷酸名称 | 供应商 | 序列 |
| P5-AMP | 生工生物工程(上海)股份有限公司 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC |
| F4-SP1 | 生工生物工程(上海)股份有限公司 | TCGTCGGCAGCGTCAGATG |
| P7-AMP | 上海百力格生物科技有限公司 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT |
| MGB-iSP2-1 | 上海百力格生物科技有限公司 | TCTCGTGGGCTCGGAGA |
*P5-AMP是用于扩库的引物，与第一测序序列互补；F4-SP1和P7-AMP是qPCR法体系中用到的引物，其中F4-SP1是与第一通用序列互补的引物，P7-AMP是与第二测序序列互补的引物；而MGB-iSP2-1是qPCR体系中用到的探针，与第二通用序列互补。
5、其他试剂
表5
*APO-Enchanted DNA聚合酶I是一种具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶，5×ApoBuffer是线性扩增体系的缓冲液，APO biotin-dNTP mix 1是部分偶联有生物素的dNTP混合液，Blocking Reagent是用于封闭链霉亲和素磁珠的试剂，链霉亲和素磁珠是用于纯化线性扩增产物的磁珠，Buffer A-D分别是用于纯化线性扩增产物的结合缓冲液、洗涤缓冲液1、洗涤缓冲液2和洗脱缓冲液，ssDNA ligase是一种单链连接酶，10×ligase buffer是接头连接体系的缓冲液，MnCl2是接头连接体系的组分，5×SLA Buffer是用于预扩增或扩库的缓冲液，SLA高保真DNA聚合酶是用于预扩增或扩库的DNA聚合酶，dNTP Mix是用于预扩增或扩库的dNTP混合液，NA-Beads是用于纯化预扩增产物或扩库产物的磁珠，Buffer E和F分别是用于预扩增产物或扩库产物的结合缓冲液和洗脱缓冲液，Realtime PCR MasterMix是用于qPCR的混合液，Qubit dsDNA HS Assay kit是用于样本定量的试剂盒，QC校准品是用于质控的样本。
6、实验设备
表6
| 仪器名称 | 厂家 |
| Veriti 96Well Thermal Cycler l | Thermo |
| 离心机 | Eppendorf |
| 掌上离心机 | 其林贝尔 |
| 磁力架12孔/96孔 | Thermo |
| 7300plus Real-time PCR system | Thermo |
| 纯水仪 | PALL |
实验步骤
1、线性扩增
1.1线性扩增体系配制
表7
| 组份 | 体积(μL) |
| 5×Apo Buffer | 4 |
| APO biotin-dNTP mix 1 | 0.8 |
| Apo-Enchanted DNA聚合酶I | 0.2 |
| Mix溶液总量 | 5 |
| 引物组合 | 1 |
| 样本 | 14 |
| 总量 | 20 |
1)按照上表先将5×Apo Buffer、APO biotin-dNTP mix 1和Apo-Enchanted DNA聚合酶I配制成Mix溶液。
2)后续加入引物组合和样本，使每个样本的反应体积为20μL。
3)开启线性扩增程序。
1.2线性扩增条件设置
表8
1.3磁珠法纯化线性扩增产物。
2、接头连接反应
2.1接头连接体系配制
表9
| 组分 | 体积(μL) |
| 10×ligase buffer | 2.5 |
| MnCl<sub>2</sub> | 0.63 |
| ssDNA ligase | 0.63 |
| 混合液总量 | 3.75 |
| 单链接头 | 1.25 |
| 纯化后的线性扩增产 | 20 |
| 总量 | 25 |
接头连接体系的单链接头(样本标签序列因样本而不同)单独加，根据样本数，配制好除单链接头之外的相应反应体系混合液，根据建库样本信息表(表3)在相应的反应孔中加入含对应样本标签序列的单链接头。
2.2接头连接程序
表10
| 循环数 | 温度(℃) | 时间(分钟) |
| 1(热盖105℃) | 60 | 60 |
| 1(热盖105℃) | 90 | 3 |
| 1 | 8 | / |
3、预扩增反应
3.1预扩增反应体系的配制：
表11
| 组份 | 体积(μL) | 终浓度 |
| ddH2O | 12.75 | / |
| 5×SLA Buffer | 10 | 1× |
| dNTP Mix | 1 | 200μM |
| P5-i_AMP1 | 1 | 100nM |
| P7-AMP | 1 | 200nM |
| SLA高保真DNA聚合酶 | 0.25 | 0.011U/μL |
| 总量 | 26 | |
| 混合液置于4℃ | 26μL/孔 | |
| 连接产物 | 24 | |
| 总量 | 50 |
3.1.1预扩增体系的前引物(样本标签序列因样本而不同)单独加，根据样本数，在1.5mL离心管内配制好除前引物之外的相应反应体系混合液，然后分装到8连管中，根据建库样本信息表(表3)在相应的反应孔中加入含对应样本标签序列的前引物。
3.1.2在对应的反应孔中加入24μL连接产物。后放到PCR仪中反应。
3.2预扩增反应体程序
表12
3.3磁珠法纯化预扩增产物。
4、扩库
4.1扩库反应体系的配制：
4.1.1按照下表配制相应的反应混合液mix。分装到8联管内。
表13
| 组份 | 浓度 | 体积(μL) | 终浓度 |
| ddH2O | 2 | / | |
| 5×SLA Buffer | 5× | 6 | 1× |
| dNTP Mix | (10mM | 0.6 | 200μM |
| P5-AMP | 10μM | 0.6 | 200nM |
| P7-AMP | 10μM | 0.6 | 200nM |
| SLA高保真DNA聚合酶 | (2U/μL) | 0.15 | 0.011U/μL |
| 总量 | 10 | ||
| 混合液置于4℃ | 10μL/孔 | ||
| 纯化后的预扩增产物 | 20 | ||
| 总量 | 30 |
4.1.2往扩库反应管内加入相应的纯化后的预扩增产物。快速离心10秒，放到PCR仪中反应。
4.2扩库反应程序：
表14
4.3扩库后磁珠法纯化。
按照如下体系配置文库总量检测体系，用于上机测序前的文库混样评估：
表15
检测程序：
表16
5、文库测序
混合样本，采用Illumina的NovaSeq6000平台对文库进行150bp双端测序。
6、生信分析与断点分析
具体的生信分析流程包括：先以BWA进行比对分析，再以Samtools进行ontarget分析，再以Fgbio进行去重分析获得BAM文件。使用IGV工具显示BAM文件中不同断点的深度。最终通过PRISM作图，显示不同位点的断点频率。根据目标区域每个位点的深度分析断点：(1)断点n的分子个数＝“位点n的去重后深度”-“位点n+1的去重后深度”；(2)断点n的频率＝断点n的分子个数÷去重后的总分子个数×100％。
实验结果
1、线性扩增建库后的文库定量结果：
表17
| 样本 | 文库总量 | 混样拷贝数 | 上样体积 |
| 血浆1 | 6.79E+09 | 1.00E+09 | 2.95 |
| 血浆2 | 1.29E+10 | 1.00E+09 | 1.55 |
| 血细胞1 | 1.54E+10 | 1.00E+09 | 1.30 |
| 血细胞2 | 2.36E+10 | 1.00E+09 | 0.85 |
| 尿液1 | 1.45E+10 | 1.00E+09 | 1.38 |
| 尿液2 | 8.74E+09 | 1.00E+09 | 2.29 |
由上表数据可知，使用本建库试剂盒构建的文库分子数量符合预期。
2、下机数据产量和质量：
表18
| 样本 | 数据产量(Gb) | Reads(M) | Q30(％) |
| 血浆1 | 2.983 | 19.89 | 92.23 |
| 血浆2 | 1.521 | 10.14 | 85.84 |
| 血细胞1 | 2.8 | 18.67 | 90.75 |
| 血细胞2 | 2.358 | 15.72 | 92.09 |
| 尿液1 | 2.115 | 14.1 | 80.91 |
| 尿液2 | 2.827 | 18.85 | 80.46 |
由上表数据可知，所有文库的测序数据产量和质量符合要求。
3、IGV数据，不同样本使用单引物扩增建库技术检测得到的目标区域内的测序深度信息。
由图1-3可知，本试剂盒可以有效的同时扩增多个目标区域(受限于篇幅，只显示了引物组合中3个特异性引物的数据)，并对目标区域不同位点的深度信息进行检测。针对同一个目标区域，不同来源样本的深度信息差异最大，如尿液(U1/U2)与血浆(P1/P2)游离DNA样本的差异很大；类似来源的样本深度信息差异较小，如血浆游离DNA与血细胞基因组DNA(W1/W2)用DNase I降解后片段的差异相对较小；相同来源的样本深度信息差异最小，独立比较三种样本类型时，虽然取自2例独立的健康人，但是相互之间的差异最小。
4、定量分析片段化DNA不同断点的频率
从图4-6，可以更清晰的分辨出片段化DNA不同断点的分布频率。结果与图1-3相同，针对同一个目标区域，不同来源样本的断点频率分布差异最大，如尿液(U1/U2)与血浆(P1/P2)游离DNA样本的差异最大；类似来源的样本的断点频率分布差异较小，如血浆游离DNA与血细胞基因组DNA(W1/W2)用DNase I降解后片段的差异相对较小；相同来源的样本的断点比率分布差异最小，独立比较三种样本类型时，虽然取自2例独立的健康人，但是相互之间的差异最小。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 上海羿鸣生物科技有限公司
<120> 单引物扩增建库技术在检测片段化DNA分子断点信息中的应用及试剂盒
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagggatcca gacaactgtt caaactgatg 60
gg 62
<210> 2
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcacatcg aggatttcct tgttggcttt 60
cggag 65
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctggca gccaggaacg tactggtgaa 60
aac 63
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagtcaccag ctgcaccgtg gatgtcag 58
<210> 5
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagggcctgc tgaaaatgac tgaatataaa 60
cttgtg 66
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagtccccag tcctcatgta ctggtccctc 60
<210> 7
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcagagga agccttcgcc tgtcctcatg 60
tattg 65
<210> 8
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagagaatct ccattttagc acttacctgt 60
gactc 65
<210> 9
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggactttc aactctgtct ccttcctctt 60
cctac 65
<210> 10
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggccatgg ccatctacaa gcagtcac 58
<210> 11
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagctggccc ctcctcagca tcttatcc 58
<210> 12
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctgtctctta tacacatctc cgagcccacg agaccgagta atatctcgta tgccgtcttc 60
tgcttg 66
<210> 13
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgtctctta tacacatctc cgagcccacg agactctccg gaatctcgta tgccgtcttc 60
tgcttg 66
<210> 14
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgtctctta tacacatctc cgagcccacg agacaatgag cgatctcgta tgccgtcttc 60
tgcttg 66
<210> 15
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgtctctta tacacatctc cgagcccacg agacggaatc tcatctcgta tgccgtcttc 60
tgcttg 66
<210> 16
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctgtctctta tacacatctc cgagcccacg agacttctga atatctcgta tgccgtcttc 60
tgcttg 66
<210> 17
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctgtctctta tacacatctc cgagcccacg agacacgaat tcatctcgta tgccgtcttc 60
tgcttg 66
<210> 18
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ggctatatcg tcggcagcgt cagatg 56
<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg cctctattcg tcggcagcgt cagatg 56
<210> 20
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ggataggtcg tcggcagcgt cagatg 56
<210> 21
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact tatgcgatcg tcggcagcgt cagatg 56
<210> 22
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc ttcgccttcg tcggcagcgt cagatg 56
<210> 23
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact aagattatcg tcggcagcgt cagatg 56
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aatgatacgg cgaccaccga gatctac 27
<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcgtcggcag cgtcagatg 19
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 27
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tctcgtgggc tcggaga 17
Claims (10)
1.单引物扩增建库技术在检测片段化DNA分子断点信息中的应用，其特征在于，所述单引物扩增建库技术包括以下步骤：(1)通过特异性引物线性扩增目标DNA，获得线性扩增产物；(2)对步骤(1)所得的线性扩增产物进行接头连接，获得接头连接产物；其中，接头连接体系中包括单链连接酶和单链接头；(3)对步骤(2)所得的接头连接产物进行文库扩增、测序和生信分析，获得DNA分子断点信息。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述片段化DNA分子的长度为25～500bp/nt，优选为50～200bp/nt；
和/或，所述片段化DNA分子的结构为双链DNA、单链DNA或cDNA；
和/或，所述片段化DNA分子为游离DNA；
和/或，所述片段化DNA分子来源于体液，优选来源于血液和/或尿液；
和/或，所述片段化DNA分子由基因组DNA经打断制备获得，优选为超声打断和/或酶切打断。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述特异性引物的3’端至少部分的序列与目标区域互补，与目标区域互补的序列的长度≥16nt；
和/或，所述特异性引物的3’末端核苷酸含有封闭基团修饰，优选的，所述的封闭基团为C3 Spacer基团，取代了所述特异性引物的3’末端核苷酸的3位C原子羟基；
和/或，所述特异性引物还包括第一通用序列、第一样本标签序列、第一测序序列中的一种或多种的组合。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述线性扩增的扩增体系中包括特异性引物、DNA聚合酶和dNTP，优选的，所述DNA聚合酶具有3’-5’外切酶活性，更优选的，所述DNA聚合酶选自B族DNA聚合酶。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述单链接头包括第二测序序列、第二样本标签序列、第二通用序列、分子标签序列中的一种或多种的组合；
所述单链连接酶为T4 RNA连接酶或热稳定性RNA连接酶；
所述单链接头的5’末端的核苷酸被修饰、且在接头连接的反应温度下为单链结构，优选的，单链接头的5’末端的核苷酸的5位C原子连接有磷酸基团或腺苷基团；
所述单链接头的3’末端的核苷酸的3位C原子羟基被封闭基团取代，优选的，所述的封闭基团为C3 Spacer基团；
所述单链接头的5’端区域为具有黏性末端的部分双链结构。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述文库扩增的构建方法包括：将连接产物进行预扩增，以提供预扩增产物，所述的预扩增引物的前引物包括与第一通用序列互补的序列、与第一样本标签序列互补的序列、与第一测序序列互补的序列中的一种或多种的组合，所述的预扩增引物的后引物包括与第二测序序列互补的序列；
还包括：将所述预扩增产物进行扩库，以提供文库产物，所述的扩库引物的前引物包括与第一测序序列互补的序列，所述的扩库引物的后引物包括与第二测序序列互补的序列。
和/或，所述测序步骤包括：通过对文库产物进行测序，以提供片段化DNA分子的测序结果。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的生信分析包括比对分析、ontarget分析、去重分析和断点分析；所述断点分析为：按延伸长度判断各个reads的断点，并计算各个断点的分子个数，计算公式如下：(1)断点n的分子个数＝“位点n的去重后深度”-“位点n+1的去重后深度”；(2)断点n的频率＝断点n的分子个数÷去重后的总分子个数×100％。
8.一种片段化DNA分子断点信息检测试剂盒/试剂，其特征在于，所述试剂盒/试剂包括：特异性引物、DNA聚合酶、单链接头、单链连接酶。
9.如权利要求8所述的试剂盒/试剂，其特征在于，所述单链接头包含分子标签序列。
10.如权利要求8或9所述的试剂盒/试剂在检测片段化DNA分子断点信息中的应用。
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| CN202110085311.2A CN114807325A (zh) | 2021-01-22 | 2021-01-22 | 单引物扩增建库技术在检测片段化dna分子断点信息中的应用及试剂盒 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116200478A (zh) * | 2023-03-07 | 2023-06-02 | 安徽安龙基因科技有限公司 | 一种基于单链连接的捕获建库方法和应用 |
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2021
- 2021-01-22 CN CN202110085311.2A patent/CN114807325A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN116200478A (zh) * | 2023-03-07 | 2023-06-02 | 安徽安龙基因科技有限公司 | 一种基于单链连接的捕获建库方法和应用 |
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