CN114807324A - 单引物扩增建库技术在检测片段化稀有dna分子突变中的应用及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单引物扩增建库技术在检测片段化稀有DNA分子突变中的应用,所述单引物扩增建库技术包括以下步骤:通过特异性引物线性扩增目标DNA,获得线性扩增产物,所述特异性引物的3’末端核苷酸含有二象性功能基团;对线性扩增产物进行接头连接,获得接头连接产物,接头连接体系中包括单链连接酶和单链接头。本发明还公开了一种用于高灵敏度检测稀有DNA分子突变的试剂盒/试剂。本发明所述方法可以高灵敏度检测样本中丰度极低的稀有突变分子,同时可以检测出早期癌症患者血液样本中的循环肿瘤DNA分子。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,涉及利用单引物扩增建库技术在检测片段化稀有DNA分子突变中的应用,以及试剂/试剂盒。
背景技术
DNA突变是多种疾病的主要成因,癌症就是由DNA突变引起的疾病之一。通过突变检测可以对癌症患者进行分子分型,从而对症治疗,获得更好的疗效。下一代测序(NGS)是一种常用的突变检测技术。NGS检测流程中,一般需要对目标DNA进行扩增或富集以确保目标DNA分子的数量和浓度达到可被NGS测序仪检出的程度;同时还需要在目标DNA分子的两端上加上测序序列才能在测序时被测序引物在测序载体上簇化扩增,进行高通量测序。这种对目标DNA扩增并加上测序序列使之能被NGS测序仪测序的过程称之为“文库构建”,简称“建库”。
近年来精准医学的发展对NGS检测性能要求日渐提高,不但要求可以准确无误的检出目标DNA序列,并且需要检出数量极为稀少的目标DNA分子中的稀有突变(如外周血中的循环肿瘤DNA,ctDNA)。有文献指出(Phylogenetic ctDNA analysis depicts earlystage lung cancer evolution,Nature 2017),在早中期恶性肿瘤患者的外周血中仅含有0.1%以下的ctDNA分子。这些极其稀有的ctDNA分子与外周血其他正常细胞代谢的循环游离DNA(cfDNA)分子极其相似,仅在个别位点上存在突变。如何能有效识别稀有ctDNA分子的突变,对NGS的建库技术的要求上除了提高DNA分子的转化效率之外,降低文库构建/测序时产生的碱基错误(噪声)也十分重要。
基于PCR的测序是目前主流的测序方法之一。PCR法结合前后引物(双端引物)、DNA聚合酶和dNTP,通过对反应混合物的温度控制(变性、退火、延伸)进行目标序列的扩增。对于稀有DNA分子的突变,基于PCR的测序没法有效检测,容易形成假阳性/假阴性结果,原因如下:1.PCR指数扩增的特性(每一轮扩增生成的产物都可以成为下一轮扩增的模板)容易累积引入的错误突变,影响其检测准确性。2.步骤上,一般先进行接头连接,再进行PCR扩增,因为受限于连接酶的效率容易造成漏检。3.PCR检测的灵敏度受限于待测核酸分子长度和PCR扩增子长度的比值,在实际检测中,考虑到引物和检测探针的设计难度,通常对于100-200bp左右的DNA分子,其实际检出效率约在20%左右,远达不到单个分子的水平。4.一般使用不具有纠错功能(即3'-5'内切酶功能,可剪切错配碱基从而确保产物的“保真性”)的DNA聚合酶进行,容易在扩增过程中引入错误突变。5.一般使用单端的样本标签,容易受样本标签的生产质量影响而降低对稀有DNA分子突变的检测准确性(受限于生产工艺,样本标签存在约千分之一的碱基错误,容易导致测序数据的分析问题,影响稀有DNA分子的检测)。6.一般未有利用分子标签序列进行去重分析,没法去除建库/测序时引入的错误突变。因此,如何抑制测序错误(降低噪声)和尽量捕获所有的目标DNA分子(避免漏检),从而有效提高测序结果的准确性,是基因检测技术领域亟需解决的技术问题。
理论上,线性扩增(即通过单个引物捕获并延伸每一个目标区域,每一轮的扩增都只以原始样本中的DNA分子为模板的DNA扩增方式)是一种改善片段化DNA分子突变检出率的潜在方法。但现有技术中的DNA线性扩增的效率有限,要数十个循环才能达到预期的扩增倍数,一旦扩增中出现非特异的PCR指数扩增反应,则会耗尽反应中的底物,令线性扩增无法实现。非特异扩增出现的原因主要有三种:1)引物之间形成的二聚体,由于多重扩增体系中会使用数十种甚至上百种引物,相对反应模板浓度更高,引物之间形成的二聚体(引物的3’端间相互错配扩增形成的产物),会导致引物之间的PCR反应。2)引物脱靶产生非特异性PCR,在多重检测多个目标DNA序列的情况下,引物自身的降解所导致的脱靶结合容易与其他的引物形成PCR反应。3)高保真聚合酶引起的脱靶扩增,一般情况下,引物脱靶结合的DNA序列只要在3’端存在错配碱基,其扩增效率会显着下降。但是在应用高保真聚合酶的情况下,DNA聚合酶的3’-5’外切酶区域会对错配碱基进行剪切,令引物脱靶结合的DNA序列也能扩增,最终形成大量的脱靶产物。
受限于上述问题,现有的技术无法对稀有的突变进行有效检测。因此NGS的应用普遍局限于晚期癌症患者的伴随诊断,无法有效检测早中期癌症患者血液中的稀有突变DNA分子。准确的检出血液中的稀有DNA分子突变以发现并区分出ctDNA分子是实现癌症早期筛查的一种方式,是实现癌症早诊早治、改善癌症患者生存质量的潜在途径,意义重大。
发明内容
为克服现有技术存在的上述缺点,本发明的目的在于提供一种单引物扩增建库技术在检测片段化稀有DNA分子突变中的应用。所述单引物扩增建库技术高灵敏度检测样本中极低拷贝数的稀有突变分子。同时在临床患者样本中,可以检测出早期癌症患者血液样本中的ctDNA分子。
所述片段化稀有DNA分子突变的丰度为0.001%~50%,优选为0.01%~10%,最优选为0.02%~1%。
本发明提供了一种单引物扩增建库技术在检测片段化稀有DNA分子突变中的应用,所述单引物扩增建库技术包括以下步骤:(1)通过特异性引物线性扩增目标DNA,获得线性扩增产物,所述特异性引物的3’末端核苷酸含有二象性功能基团;(2)对步骤(1)所得的线性扩增产物进行接头连接,获得接头连接产物,接头连接体系中包括单链连接酶和单链接头。
所述片段化稀有DNA分子突变包括单碱基变异(SNV)和短片段插入/缺失(smallindel)。
本发明应用中,所述特异性引物的3’末端核苷酸含有二象性功能基团且部分核苷酸之间的磷脂键被硫代修饰;所述特异性引物的3’末端的核苷酸的3位C原子羟基被二象性功能基团取代,所述特异性引物的3’末端的二象性功能基团选自C3 Spacer基团、Invert T基团、磷酸基团、生物素基团、C6 Spacer基团、NH2-C6基团、SH-C6基团;
和/或,所述特异性引物的3’末端的二象性功能基团为核苷酸复合基团,核苷酸复合基团的结构如下:
其中,Base选自A碱基、G碱基、C碱基、T碱基或U碱基;
R1选自羟基基团、C3 Spacer基团、Invert T基团、磷酸基团、生物素基团、C6Spacer基团、NH2-C6基团或SH-C6基团;
R2选自氢原子、氟原子、羟基基团、或甲氧基基团。
本发明应用中,所述特异性引物的3’端部分核苷酸之间的磷脂键被硫代修饰。
所述片段化稀有DNA分子突变的丰度为0.001%~50%,优选为0.01%~10%,最优选为0.02%~1%;
本发明应用中,所述特异性引物的3’端至少部分的序列与所述片段化稀有DNA分子目标区域互补,与目标区域互补的序列的长度≥16nt;
和/或,所述特异性引物还包括第一通用序列、第一样本标签序列、第一测序序列中的一种或多种的组合。
在具体实施方案中,本发明应用中,所述线性扩增过程中退火温度范围是60-75℃,优选65-72℃。
在具体实施方案中,本发明应用中,对片段化稀有DNA分子进行线性扩增的轮数为1-100轮,优选1-60轮,再优选20-40轮。
在具体实施方案中,本发明应用中,在线性扩增和接头连接后,还需要进行预扩增和扩库步骤以构建完整的文库分子,用于测序。
本发明还包括单引物扩增建库技术在片段化稀有DNA分子突变检测中的应用,包括:通过上述所提供的文库产物进行测序,以提供片段化稀有DNA分子突变检测的结果。
本发明的文库产物包含双端样本标签序列,即文库产物的5’端和3’端各有一个独立的样本标签序列。此设计可以有效降低样本标签序列的生产质量对稀有目标DNA分子检测的影响。
本发明的文库产物还包含分子标签序列(通过接头连接添加)。利用分子标签序列进行去重分析,可以去除扩库与测序步骤带来的碱基错误。所述的利用分子标签序列进行去重分析即将相同分子标签序列的类似reads进行归类,去除重复后得到扩库前文库分子的原始序列信息。
本发明还提供了一种用于高灵敏度检测稀有DNA分子突变的试剂盒/试剂,其中,所述试剂盒的组成包括3’末端核苷酸含有二象性功能基团的特异性引物(且部分核苷酸之间的磷脂键被硫代修饰)、高保真DNA聚合酶、包含分子标签的单链接头、单链连接酶。
本发明还提供了所述试剂盒/试剂在检测稀有DNA分子突变中的应用。
本发明还提供了用于线性扩增的特异性引物的特定序列,包括如编号SEQ IDNo.1-13所示序列之一种或多种的组合。
本发明显著有益效果包括,通过在特异性引物中引入硫代修饰,有效降低了线性扩增过程中的非特异性扩增。本发明中线性扩增获得的扩增产物可以进一步用于构建文库,构建获得的文库数据质量能够符合要求。本发明所述单引物扩增建库技术高灵敏度检测样本中极低拷贝数的稀有突变分子,同时可以检测出早期癌症患者血液样本中的循环肿瘤DNA(ctDNA)分子。
具体实施方式
结合以下具体实施例,对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等,除以下专门提及的内容之外,均为本领域的普遍知识和公知常识,本发明没有特别限制内容。以下进一步说明,但并不因此而限制本申请的范围。除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明,具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989and Thirdedition,2001;Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987and periodic updates;the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Thirdedition,Academic Press,San Diego,1998;METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999;和METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,Chromatin Protocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999等。
本发明通过单引物多重扩增技术检测片段化稀有DNA分子的应用中,包括:通过特异性引物线性扩增包括目标区域的片段化DNA,以提供线性扩增产物,所述特异性引物的3’末端有二象性功能基团修饰,所述特异性引物的3’端部分核苷酸骨架的磷脂键被硫代修饰,所述的二象性功能基团用于阻止特异性引物的3’末端与其他寡聚核苷酸发生连接反应,同时能被特定的酶切除,以进行特异性引物的线性扩增反应。特异性引物中的核苷酸被硫代修饰具体指核苷酸骨架的磷脂键从双键O转换成了双键S,具体可以是如下结构式所示的结构变化。如上所述,在线性扩增的特异性引物中引入硫代修饰,可以有效提升质控文库分子的占比,显示可以显著地降低线性扩增过程中的非特异性扩增。
本发明应用中,上述线性扩增通常可以是多重线性扩增,扩增体系中通常可以包括多个靶向于不同目标区域的特异性引物,例如,所靶向的目标区域的数量≥2、2~3、3~4、4~5、5~6、6~8、8~10、10~15、15~20、或更多的目标区域数量。通常来说,特异性引物可以包括与片段化DNA的目标区域至少部分互补的序列,从而可以实现对片段化DNA的目标区域的特异性扩增,本领域技术人员可选择合适的片段化DNA的目标区域,并根据片段化DNA的目标区域,设计合适的互补的序列。例如,特异性引物与目标区域互补的序列的长度可以为≥16nt、16~45nt、16~20nt、20~25nt、25~30nt、30~35nt、35~40nt、或40~45nt。再例如,特异性引物还包括第一通用序列(例如,Illumina测序体系的SP1)和/或第一样本标签(例如,Illumina测序体系的i5)和/或第一测序序列(例如,Illumina测序体系的P5)等中的一种或多种的组合。
本发明应用中,合适的获取片段化DNA的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。例如,包括目标区域的片段化DNA通常可以源于基因组DNA。再例如,片段化DNA可以是由基因组DNA经(随机)打断(例如,超声打断和/或酶切打断)制备获得的。再例如,片段化DNA可以是游离DNA,其可以来源于体液,再例如,血液和/或尿液等。再例如,片段化DNA的结构可以为双链DNA、单链DNA和cDNA。对于线性扩增体系来说,片段化DNA通常需要具有合适的长度,例如,所述片段化DNA的长度可以为25~500bp/nt、25~30bp/nt、30~40bp/nt、40~50bp/nt、50~60bp/nt、60~80bp/nt、80~100bp/nt、100~150bp/nt、150~200bp/nt、200~300bp/nt、300~400bp/nt、或400~500bp/nt。
本发明应用中,线性扩增的扩增体系中通常可以包括上述的特异性引物、DNA聚合酶和dNTP。通过特异性引物线性扩增包括目标区域的片段化DNA的反应通常可以在DNA聚合酶和/或dNTP存在的条件下进行。所使用的DNA聚合酶通常可以具有3’-5’外切酶活性,从而可以切除结合模板后的引物3’末端的取代基团(例如,二象性功能基团),使引物被活化从而能够延伸,并可以在DNA扩增过程中切除碱基错配的核苷酸,从而确保扩增DNA的序列准确性。例如,所使用的DNA聚合酶可以是B族DNA聚合酶。dNTP(例如,dATP、dGTP、dTTP、dCTP等)是线性扩增中的必要组分,至少部分的dNTP可以是偶联标记分子的dNTP,所偶联的标记分子可以是生物素等,通过偶联标记分子可以对扩增产物进行纯化。
本发明应用中,多重线性扩增的特异性和/或均一度与引物上的硫代修饰的数量有关,当硫代修饰的数量过高或者过低时,都会导致线性扩增的特异性下降,而当硫代修饰的数量较高时,线性扩增会具有相对较好的均一度。通常来说,被硫代修饰的核苷酸的个数可以为1~11个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、或11个,优选可以为3~8个。对于被硫代修饰的核苷酸的分布位置来说,在特异性引物中,被硫代修饰的碱基通常可以是连续的(即硫代修饰的核苷酸的位置在引物上连续),也可以是不连续的,再或者,至少部分的被硫代修饰的核苷酸可以位于特异性引物的3’端,从而可以抑制引物与引物之间的相互作用。位于特异性引物的3’端的被硫代修饰的核苷酸的个数可以为1~11个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、或11个,优选可以为3~8个。
本发明应用中,特异性引物的3’末端的核苷酸的3位C原子羟基可以被二象性功能基团取代,以用于阻止特异性引物的3’末端与其他寡聚核苷酸发生连接反应,同时能被特定的酶切除,以进行特异性引物的线性扩增反应。本领域技术人员可选择合适的二象性功能基团以实现特异性引物3’末端的修饰,例如,所修饰的基团可以取代特异性引物3’末端核苷酸上的天然基团(例如,羟基等),以阻止所述特异性引物3’端发生连接反应。引物通过互补序列与模板上的目标区域结合形成双链结构后,引物3’端的二象性功能基团可以被酶切除,使得引物被活化,从而可以对目标序列进行有效延伸。例如,二象性功能基团可以是C3 Spacer基团、Invert T基团、磷酸基团、生物素基团、C6 Spacer基团、NH2-C6基团、SH-C6基团。再例如,二象性功能基团可以是核苷酸复合基团,核苷酸复合基团的化学结构式如下:
其中Base可以为腺嘌呤(A碱基)、鸟嘌呤(G碱基)、胞嘧啶(C碱基)、胸腺嘧啶(T碱基)或尿嘧啶(U碱基)中的任一碱基;
R1可以为羟基基团(-OH)、C3Spacer基团、Invert T基团、磷酸基团(-PO3)、生物素基团、C6 Spacer基团、NH2-C6基团或SH-C6基团;
R2可以为氢原子(-H)、氟原子(-F)、羟基基团(-OH)或甲氧基基团(-OCH3)。
在本发明一具体实施例中,核苷酸复合基团可以是DL1~DL16,DL1~DL16所涉及的基团的具体组合如表1所示。
表1.
*DL1与DL2的区别是DL1没有LNA修饰,DL2有LNA修饰。
在本发明一具体实施例中,二象性功能基团是C3 Spacer基团时,可以形成如下所示的化学结构:
在本发明一具体实施例中,二象性功能基团是Invert T基团时,可以形成如下所示的化学结构:
在本发明一具体实施例中,二象性功能基团是磷酸基团时,可以形成如下所示的化学结构:
在本发明一具体实施例中,二象性功能基团是生物素基团时,可以形成如下所示的化学结构:
在本发明一具体实施例中,二象性功能基团是C6 Spacer基团时,可以形成如下所示的化学结构:
在本发明一具体实施例中,二象性功能基团是NH2-C6基团时,可以形成如下所示的化学结构:
在本发明一具体实施例中,二象性功能基团是SH-C6基团时,可以形成如下所示的化学结构:
本发明应用中,还可以包括:纯化线性扩增产物。本领域技术人员可选择合适的方法对线性扩增产物进行纯化,例如,如上所述,至少部分的dNTP可以是偶联标记分子的dNTP,所偶联的标记分子可以是生物素等,具体的纯化方法可以是针对dNTP标记分子的亲和纯化等。
本发明单引物多重扩增技术在文库构建中的应用,包括:通过本发明提供的线性扩增产物构建文库。合适的通过上述线性扩增产物构建文库的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。例如,可以包括:连接接头、预扩增、扩库等步骤。
还包括:将所得的线性扩增产物连接单链接头,获得连接产物,所述单链接头包括第二测序序列(例如,Illumina测序体系的P7)和/或第二样本标签序列(例如,Illumina测序体系的i7)和/或第二通用序列(例如,Illumina测序体系的SP2)和/或分子标签序列(用于标记原始样本中的每个DNA分子的随机序列)。在获得针对目标区域的线性扩增产物以后,可以进一步在线性扩增产物上连接接头,以便于后续进行进一步的测序。
本发明中,本领域技术人员通常可以根据后续所需进行的测序方法,在线性扩增产物上连接合适的单链接头。例如,单链接头可以包括第二测序序列和/或第二样本标签序列和/或第二通用序列和/或分子标签序列。再例如,用于接头连接反应的单链连接酶可以为T4RNA连接酶或热稳定性RNA连接酶(虽然使用的是RNA酶,但是连接的是DNA分子)。再例如,单链接头的5’末端的核苷酸被修饰、且在接头连接的反应温度下为单链结构,具体来说,单链接头的5’末端的核苷酸的5位C原子连接有磷酸基团或腺苷基团。再例如,单链接头的3’末端的核苷酸的3位C原子羟基被封闭基团取代,具体来说,单链接头的3’末端的封闭基团选自Invert T基团、磷酸基团、生物素基团、C6 Spacer基团、NH2-C6基团、SH-C6基团、C3 Spacer基团,其所形成的化学基团可以参照上文所给出的化学结构。再例如,单链接头的5’端区域通常为具有黏性末端的部分双链结构。
本发明中,还可以包括:将连接产物进行预扩增,以提供预扩增产物。本领域技术人员通常可以根据后续所需进行的测序方法,选择合适的条件对连接产物进行预扩增,并纯化预扩增产物(例如,磁珠纯化等)。例如,预扩增的反应体系中可以包括预扩增引物、DNA聚合酶和dNTP,所述DNA聚合酶优选为B族DNA聚合酶,所述预扩增引物的前引物包括与第一测序序列互补的序列,和/或,所述预扩增引物的前引物还包括与第一通用序列互补的序列,和/或,所述预扩增引物的前引物还包括与第一样本标签序列互补的序列,所述预扩增引物的后引物包括与第二测序序列互补的序列。
本发明中,还可以包括:将预扩增产物进行扩库,以提供扩库产物。本领域技术人员通常可以根据后续所需进行的测序方法,选择合适的条件将预扩增产物进行扩库,并纯化扩库产物(例如,磁珠纯化等)。例如,扩库体系的反应体系中可以包括扩库引物、DNA聚合酶和dNTP,所述DNA聚合酶优选为B族DNA聚合酶,所述扩库引物的前引物包括与第一测序序列互补的序列,所述扩库引物的后引物包括与第二测序序列互补的序列。
本发明还提供单引物多重扩增技术在DNA目标区域测序方法中的应用,包括:通过所提供的文库,将扩库产物进行测序,以提供目标区域的测序结果。本领域技术人员通常可以根据后续所需进行的测序方法,选择合适的条件将扩库产物进行测序,例如,可以是各种二代测序技术。优选的,文库分子的结构如下:
其中,第一测序序列可以是Illumina测序体系的P5,第一/第二样本标签序列可以是Illumina测序体系的i5或i7,第一/第二通用序列可以是Illumina测序体系的SP1或SP2,第二测序序列可以是Illumina测序体系的P7。
本发明还提供一种基于单引物多重扩增技术的用于片段化稀有DNA分子检测的试剂盒和/或试剂,上述试剂盒和/或试剂适用本发明所提供的基于单引物多重扩增技术的DNA目标区域的扩增方法、或本发明文库构建方法、或本发明DNA目标区域的测序方法。上述试剂盒中,可以包括上述的各种特异性引物,特异性引物的3’端的部分核苷酸骨架的磷脂键可以被硫代修饰。上述试剂盒中,还可以包括DNA聚合酶、dNTP等线性扩增反应体系必要的组分。
本发明基于单引物多重扩增技术的片段化稀有DNA分子突变检测的方法及应用,通过在特异性引物中引入硫代修饰,有效降低了线性扩增过程中的非特异性扩增;且在特异性引物中引入二象性功能基团修饰,用于阻止特异性引物的3’末端与其他寡聚核苷酸发生连接反应,并在特异性引物结合模板后高效的被具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶切除,以达到引物高效延伸的效果;且线性扩增获得的扩增产物可以进一步用于构建文库,构建获得的文库数据质量能够符合要求,具有良好的产业化前景。
实施例1
使用单引物扩增建库技术检测不同丰度的稀有DNA分子突变
使用单引物扩增建库技术对掺有ctDNA标准品的健康人血细胞基因组DNA打断样本,进行引物线性扩增并建库测序,验证单引物扩增建库技术对检测极低掺入比的ctDNA分子突变的性能。
实验材料
1、检测样本
健康人血细胞基因组DNA样本使用以超声打断仪打断成150bp左右,模拟血液中游离DNA分子。未有掺入ctDNA标准品的健康人血细胞基因组DNA打断样本作为阴性样本。在阴性样本中掺入购自Horizon的HD780游离核酸标准品(Multiplex cfDNA ReferenceStandard,含有的ctDNA突变类型为EGFR L858R、EGFRΔE746-A750、EGFR T790M、EGFRV769-D770 insASV、KRAS G12D、NRAS Q61K、NRAS A59T和PIK3CA E545K,各自的突变丰度为5%),得到掺入比分别为0.2%、0.06%和0.02%的稀有ctDNA样本。
所有样本都使用Qubit定量,浓度定为20ng/L。各进行3次重复检测。
2、引物序列详见表2,供应商均为上海生工。
表2.
引物浓度为80nM。所有的3’末端引物都有T核苷酸-NH2-C6二象性功能基团修饰,如DL1基团,而且在3’端的末尾3个核苷酸的磷脂键都有硫代修饰。粗体的序列表示第一通用序列,非粗体的序列表示与目标区域互补的序列。
3、单链接头与预扩增引物序列详见表3,供应商均为上海生工。
表3.单链接头与预扩增引物序列
单链接头的5’末端核苷酸的5位C原子连接有磷酸基团,而3’末端核苷酸有C3Spacer基团修饰。单链接头中粗体的序列表示分子标签序列,底横线的序列表示第二通用序列,非粗体/非底横线/非斜体的序列表示第二样本标签序列,斜体的序列表示第二测序序列。预扩增引物中粗体的序列表示第一测序序列,非粗体/非底横线的序列表示第一样本标签序列,底横线的序列表示与第一通用序列互补的序列。
表4.各实验对应的单链接头与预扩增引物
*不同样本类型(0.02%/0.06%/0.20%/0%)分别上机测序,所用的混样体系相同。
4、其他引物和探针
表5.
寡核苷酸名 | 供应商 | 序列 |
P5-AMP | 生工生物工程(上海)股份有限 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTA |
F4-SP1 | 生工生物工程(上海)股份有限 | TCGTCGGCAGCGTCAGATG |
P7-AMP | 上海百力格生物科技有限公司 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT |
MGB-iSP2-1 | 上海百力格生物科技有限公司 | TCTCGTGGGCTCGGAGA |
*P5-AMP是用于扩库的引物,与第一测序序列互补;F4-SP1和P7-AMP是qPCR法体系中用到的引物,其中F4-SP1是与第一通用序列互补的引物,P7-AMP是与第二测序序列互补的引物;而MGB-iSP2-1是qPCR体系中用到的探针,与第二通用序列互补。
5、其他试剂
表6.
*APO-Enchanted DNA聚合酶I是一种具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶,5×ApoBuffer是线性扩增体系的缓冲液,APO biotin-dNTP mix 1是部分偶联有生物素的dNTP混合液,Blocking Reagent是用于封闭链霉亲和素磁珠的试剂,链霉亲和素磁珠是用于纯化线性扩增产物的磁珠,Buffer A-D分别是用于纯化线性扩增产物的结合缓冲液、洗涤缓冲液1、洗涤缓冲液2和洗脱缓冲液,ssDNA ligase是一种单链连接酶,10×ligase buffer是接头连接体系的缓冲液,MnCl2是接头连接体系的组分,5×SLA Buffer是用于预扩增或扩库的缓冲液,SLA高保真DNA聚合酶是用于预扩增或扩库的DNA聚合酶,dNTP Mix是用于预扩增或扩库的dNTP混合液,NA-Beads是用于纯化预扩增产物或扩库产物的磁珠,Buffer E和F分别是用于预扩增产物或扩库产物的结合缓冲液和洗脱缓冲液,Realtime PCR MasterMix是用于qPCR的混合液,Qubit dsDNA HS Assay kit是用于样本定量的试剂盒,QC校准品是用于质控的样本。
6、实验设备
表7.
仪器名称 | 厂家 |
Veriti 96 Well Thermal Cycler l | Thermo |
离心机 | Eppendorf |
掌上离心机 | 其林贝尔 |
磁力架12孔/96孔 | Thermo |
7300 plus Real-time PCR system | Thermo |
纯水仪 | PALL |
实验步骤
1、线性扩增
1.1线性扩增体系配制
表8.
1)按照上表8先将5×Apo Buffer、APO biotin-dNTP mix 1和Apo-Enchanted DNA聚合酶I配制成Mix溶液。
2)后续加入引物组合和样本,使每个样本的反应体积为20μL。
3)开启线性扩增程序。
1.2线性扩增条件设置
表9.
1.3磁珠法纯化线性扩增产物。
2、接头连接反应
2.1接头连接体系配制
表10.
组分 | 体积(μL) |
10×ligase buffer | 2.5 |
MnCl<sub>2</sub> | 0.63 |
ssDNA ligase | 0.63 |
混合液总量 | 3.75 |
单链接头 | 1.25 |
纯化后的线性扩增产物 | 20 |
总量 | 25 |
接头连接体系的单链接头(样本标签序列因样本而不同)单独加,根据样本数,配制好除单链接头之外的相应反应体系混合液,根据建库样本信息表(表4)在相应的反应孔中加入含对应样本标签序列的单链接头。
2.2接头连接程序
表11.
循环数 | 温度(℃) | 时间(分钟) |
1(热盖105℃) | 60 | 60 |
1(热盖105℃) | 90 | 3 |
1 | 8 | / |
3、预扩增反应
3.1预扩增反应体系的配制:
表12.
组份 | 体积(μL) | 终浓度 |
ddH2O | 12.75 | / |
5×SLA Buffer | 10 | 1× |
dNTP Mix | 1 | 200μM |
P5-i_AMP1 | 1 | 100nM |
P7-AMP | 1 | 200nM |
SLA高保真DNA聚合酶 | 0.25 | 0.011U/μL |
总量 | 26 | |
混合液置于4℃ | 26μL/孔 | |
连接产物 | 24 | |
总量 | 50 |
3.1.1预扩增体系的前引物(样本标签序列因样本而不同)单独加,根据样本数,在1.5mL离心管内配制好除前引物之外的相应反应体系混合液,然后分装到8连管中,根据建库样本信息表(表4)在相应的反应孔中加入含对应样本标签序列的前引物。
3.1.2在对应的反应孔中加入24μL连接产物。后放到PCR仪中反应。
3.2预扩增反应体程序
表13.
3.3磁珠法纯化预扩增产物。
4、扩库
4.1扩库反应体系的配制:
4.1.1按照下表配制相应的反应混合液mix。分装到8联管内。
表14.
组份 | 浓度 | 体积(μL) | 终浓度 |
ddH2O | 2 | / | |
5×SLA Buffer | 5× | 6 | 1× |
dNTP Mix | (10mM each) | 0.6 | 200μM |
P5-AMP | 10μM | 0.6 | 200nM |
P7-AMP | 10μM | 0.6 | 200nM |
SLA高保真DNA聚合酶 | (2U/μL) | 0.15 | 0.011U/μL |
总量 | 10 | ||
混合液置于4℃ | 10μL/孔 | ||
纯化后的预扩增产物 | 20 | ||
总量 | 30 |
4.1.2往扩库反应管内加入相应的纯化后的预扩增产物。快速离心10秒,放到PCR仪中反应。
4.2扩库反应程序:
表15.
4.3扩库后磁珠法纯化。
按照如下体系配置文库总量检测体系,用于上机测序前的文库混样评估:
表16.
组份 | 体积(μL) | 终浓度 |
ddH2O | 6.6 | / |
2×Realtime PCR Master Mix | 10 | 1× |
F4-SP1(10μM) | 0.6 | 300nM |
P7-AMP(10μM) | 0.6 | 300nM |
MGB-iSP2-1(10μM) | 0.2 | 100nM |
纯化后的扩库产物/QC校准品 | 2 | / |
总量 | 20 |
检测程序:
表17.
5、文库测序
混合样本,采用Illumina的NovaSeq6000平台对文库进行150bp双端测序。
6、生信分析与断点分析
具体的生信分析流程包括:先以BWA进行比对分析,再以Samtools进行ontarget分析,再以Fgbio进行去重分析,再以Varscan进行突变识别。
实验结果
1、线性扩增建库后的文库定量结果:
表18.
样本 | 文库总量 | 混样拷贝数 | 上样体积 |
0.02%-1 | 9.36E+09 | 1.25E+09 | 2.7 |
0.02%-2 | 8.14E+09 | 1.25E+09 | 3.1 |
0.02%-3 | 6.18E+09 | 1.25E+09 | 4.0 |
0.06%-1 | 5.96E+09 | 1.25E+09 | 4.2 |
0.06%-2 | 8.52E+09 | 1.25E+09 | 2.9 |
0.06%-3 | 7.12E+09 | 1.25E+09 | 3.5 |
0.20%-1 | 4.38E+09 | 1.25E+09 | 5.7 |
0.20%-2 | 7.45E+09 | 1.25E+09 | 3.4 |
0.20%-3 | 4.03E+09 | 1.25E+09 | 6.2 |
0%-1 | 2.08E+09 | 1.25E+09 | 12.0 |
0%-2 | 4.48E+09 | 1.25E+09 | 5.6 |
0%-3 | 3.09E+09 | 1.25E+09 | 8.1 |
由上表数据可知,使用本建库试剂盒构建的文库分子数量符合预期。
2、下机数据产量和质量:
表19.
由上表数据可知,所有文库的测序数据产量和质量符合要求。
3、生信分析得到的突变和正常的reads数。
不同样本通过比对,去重分析后,得到含有的变异(突变型)的reads数与正常(野生型)的reads数如下表20所示。
表20.
从结果来看,(1)单引物扩增建库技术能建库效率极高,大多数检测位点的覆盖率可达到12000以上,总的检测DNA约60ng,即19000拷贝。考虑到随机片段化的影响。单引物扩增建库技术几乎能没有损失的对片段化DNA分子完成建库。(2)阴性样本中仅有3个数据有极低的检测值,其reads为2,占比为3/24,约12%。(3)与阴性样本相比,单引物扩增建库技术对0.2%,0.06%的总体检出率(24/24)都达到了100%。对于0.02%的样本的总体检出率为83%(20/24),取EGFR_T790M,KRAS_G12D,NRAS_Q61K的cutoff为3,其他位点的cutoff为1。
4、不同样本的突变丰度(AF%)
表21.
从结果来看,不同掺入比样本的实际检出的突变丰度与预期相近,预期0.2%,0.06%,0.02%,0%的实际检测值为0.181%,0.083%,0.038%,0.003%。即使是最低掺入比的阳性样本(0.02%)的检测丰度与阴性样本相比也有显著的区别。
实施例2
使用实施例1的方法检测早期肺癌患者血浆样本的ctDNA与肿瘤组织的ctDNA,同时以健康人的血浆cfDNA检测值为背景,测试单引物扩增建库技术检测早期肺癌患者ctDNA的性能。
临床样本
在手术前采集19例肺癌患者和1例肺炎患者的10mL外周血以及手术中获得的组织标本用于突变检测。所有患者经病理学确诊。健康人志愿者采集10mL外周血。
样本处理
外周血样本经离心分离血浆(约4mL)后提取游离DNA样本,浓缩样本至20L的体积。使用Qubit定量,浓度在1-5ng之间,取15L用于后续的建库。
组织标本研提取基因组DNA,使用Qubit对基因组DNA定量后,使用酶法片段化,最终获得片段化的组织DNA样本。片段化DNA样本都使用Qubit定量,取50ng片段化DNA用于后续的建库。
实验过程
实验步骤与实施例1完全相同。患者的临床信息见下表22:
表22.
肺癌患者中,其肿瘤体积都在10cm3以下。且都为肺癌的早期患者(1期)。
组织标本的突变结果(阳性判断方法:针对肿瘤组织的突变丰度以1%为阈值,大于1%的突变判断为组织突变阳性):
表23.
*代表组织突变阳性。
20例患者中,检测出组织突变阳性的为17例,都为肺癌患者。3例未检测出突变,其中2例为肺癌患者,1例为肺炎(良性疾病)患者。
ctDNA检测结果(阳性判断方法:以20例健康人检测突变结果的最大值为cutoff):
表24.
*代表ctDNA突变与组织一致。
**代表ctDNA突变与组织不一致。
从检测结果来看,总共检测出9例ctDNA阳性的患者,其中8例患者与组织突变类型完全一致,有一例检测两种突变,一种与组织一致,另一种为组织中不包含的突变。总体的突变检测灵敏度达到了50%以上(9/17)。突变检测的特异性超过了99%,20种样本统计的8种突变类型中,仅有一例样本的一种类型突变与组织结果不符。肺炎患者检测的所有突变类型均为阴性。
实施例3硫代的数量对多重线性扩增建库的影响
通过硫代数量不同的硫代引物分别进行多重线性扩增,对人血浆cfDNA样本进行建库,比较硫代数量不同的硫代引物的建库成功率和特异性,筛选适合用于高特异性靶向建库的硫代引物。
实验材料
1、检测样本
样本为人血浆cfDNA样本。
样本使用Qubit定量后,将样本定浓度为20ng/μL。重复检测6次。
2、引物序列详见表25,供应商均为上海生工。
表25.
*panel 3、panel 4、panel 5、panel 6、panel 7和panel 8所使用的引物以及其序列完全相同,只是panel 4的引物没有硫代修饰,而panel 3、panel 5、panel 6、panel 7和panel 8的引物在3’端的末尾分别有3个、1个、5个、8个和12个核苷酸骨架的磷脂键都有硫代修饰。粗体的序列表示第一通用序列,非粗体的序列表示与目标区域互补的序列。所有引物都有DL1基团修饰。
3、单链接头与预扩增引物。
单链接头与预扩增引物都为前述的UA1/UA2和i1/i2(单链接头根据表31加入)。
4、其他引物和探针
表26.
引物和探针名称 | 供应商 | 序列 |
SP-EGFR21-1 | 生工生物工程(上海)股份有限公司 | TACTGGTGAAAACACCGCA |
R-EGFR21 | 上海百力格生物科技有限公司 | TTCCGCACCCAGCAGTTT |
MGB-EGFR21 | 上海百力格生物科技有限公司 | TGTCAAGATCACAGATTTTGGGC |
*SP-EGFR21-1和R-EGFR21是qPCR法体系中用到的引物,其中SP-EGFR21-1是与EGFR第21外显子序列互补的引物,R-EGFR21是与EGFR第21外显子序列互补的引物;而MGB-EGFR21是qPCR体系中用到的探针,与EGFR第21外显子序列互补。
实验步骤
其余实验材料和步骤与实施例1完全相同,另外加有如下步骤:
1.在线性扩增前,按照如下体系配置qPCR检测体系,定量初始质控分子数,检测程序与表17相同。
表27.
2.在接头连接后,取2μL连接产物,加入18μL TE缓冲液,稀释10倍,用于检测建库效率。建库效率使用qPCR法定量。
按照如下体系配置qPCR检测体系,定量质控文库分子数量,检测程序与表17相同:
表28.
组份 | 体积(μL) | 终浓度 |
ddH2O | 6.6 | / |
2×Realtime PCR Master Mix | 10 | 1× |
P7-AMP(10μM) | 0.6 | 300nM |
SP-EGFR21-1(10μM) | 0.6 | 300nM |
MGB-iSP2-1(10μM) | 0.2 | 100nM |
连接产物/QC校准品 | 2 | / |
总量 | 20 |
实验结果
1、不同引物组合线性扩增建库后的文库质控结果(初始质控分子数是以表27的qPCR体系检测得出的分子数,即初始投入的DNA量;质控文库分子数量是以表28的qPCR体系检测得出的分子数;总文库分子数量是以表16的qPCR体系检测得出的分子数;文库质控分子占比=质控文库分子数量/总文库分子数量x100%):
表29.
由上表数据可知,多重线性扩增的性能与引物上的硫代修饰的数量有关,当硫代修饰的数量在3-8时(panel 3、6、7),文库的特异性较好,文库的转化率也较高,质控文库分子的占比高,符合预期;当硫代修饰的数量小于3(panel 4、5)或大于8(panel 8)时,文库的特异性较差;当硫代修饰的数量达到12(panel 8)时,文库的转化率也显着降低。
2、扩库后的总文库分子定量(连接后文库分子数量=总文库分子数量;扩库后文库分子总数是以表16的qPCR体系检测得出的扩库后的分子数;扩库倍数=扩库后文库分子总数/总文库分子数量x100%;样本拷贝数/μL=扩库后文库分子总数/20;上样拷贝数是扩库后的理论DNA投入量;上样体积μL=上样拷贝数/样本拷贝数/μL):
表30.
由上表数据可知,所有文库的扩库效率符合预期。
3、下机数据产量和质量:
表31.
样本编号 | Q30(%) | 单链接头 | 预扩库引物 |
P3-01 | 88.10 | UA1 | i1 |
P3-02 | 83.51 | UA2 | i2 |
P3-03 | 82.59 | UA1 | i1 |
P3-04 | 84.55 | UA2 | i2 |
P3-05 | 84.60 | UA1 | i1 |
P3-06 | 85.89 | UA2 | i2 |
P4-01 | 89.93 | UA1 | i1 |
P4-02 | 81.93 | UA2 | i2 |
P4-03 | 85.13 | UA1 | i1 |
P4-04 | 84.43 | UA2 | i2 |
P4-05 | 87.06 | UA1 | i1 |
P4-06 | 83.46 | UA2 | i2 |
P5-01 | 85.07 | UA1 | i1 |
P5-02 | 84.29 | UA2 | i2 |
P5-03 | 85.73 | UA1 | i1 |
P5-04 | 84.68 | UA2 | i2 |
P5-05 | 89.41 | UA1 | i1 |
P5-06 | 80.97 | UA2 | i2 |
P6-01 | 80.39 | UA1 | i1 |
P6-02 | 84.38 | UA2 | i2 |
P6-03 | 82.42 | UA1 | i1 |
P6-04 | 89.64 | UA2 | i2 |
P6-05 | 82.23 | UA1 | i1 |
P6-06 | 80.18 | UA2 | i2 |
P7-01 | 81.59 | UA1 | i1 |
P7-02 | 85.33 | UA2 | i2 |
P7-03 | 81.49 | UA1 | i1 |
P7-04 | 86.31 | UA2 | i2 |
P7-05 | 87.46 | UA1 | i1 |
P7-06 | 87.92 | UA2 | i2 |
P8-01 | 86.25 | UA1 | i1 |
P8-02 | 85.83 | UA2 | i2 |
P8-03 | 81.67 | UA1 | i1 |
P8-04 | 88.44 | UA2 | i2 |
P8-05 | 80.43 | UA1 | i1 |
P8-06 | 84.53 | UA2 | i2 |
由上表数据可知,所有文库的测序数据质量符合要求。
4、不同引物线性扩增建库得到的reads与占比
4.1、不同引物线性扩增建库得到的reads数,结果如表32所示。
表32.
样本编号 | Total | ALK_f19-12 | ALK_f19-4 | ALK_f19-n4 | EGFR_i21-2 | TP53_i07-2 |
P3-01 | 797683 | 164564 | 59599 | 95161 | 326509 | 151850 |
P3-02 | 1007044 | 223602 | 83915 | 83159 | 267233 | 349135 |
P3-03 | 816277 | 157037 | 105213 | 94675 | 235397 | 223955 |
P3-04 | 968080 | 263864 | 95506 | 93508 | 253725 | 261477 |
P3-05 | 945432 | 249282 | 55901 | 116089 | 235236 | 288924 |
P3-06 | 754998 | 123415 | 64816 | 80528 | 263815 | 222424 |
P4-01 | 639037 | 598909 | 9790 | 4280 | 20947 | 5111 |
P4-02 | 832211 | 268132 | 26545 | 22348 | 9517 | 505669 |
P4-03 | 694988 | 395368 | 70101 | 93989 | 45708 | 89822 |
P4-04 | 252302 | 71283 | 17994 | 23225 | 21791 | 118009 |
P4-05 | 640702 | 603768 | 5912 | 22773 | 4144 | 4105 |
P4-06 | 725698 | 352411 | 89522 | 116755 | 39710 | 127300 |
P5-01 | 698410 | 292598 | 76517 | 70865 | 79004 | 179426 |
P5-02 | 850890 | 308726 | 96662 | 95029 | 165848 | 184625 |
P5-03 | 810618 | 320381 | 67605 | 119802 | 122385 | 180445 |
P5-04 | 878036 | 346235 | 33040 | 48085 | 83094 | 367582 |
P5-05 | 813157 | 489118 | 82028 | 68600 | 71469 | 101942 |
P5-06 | 772789 | 332328 | 48503 | 51391 | 147825 | 192742 |
P6-01 | 735272 | 177859 | 62953 | 94875 | 223653 | 175932 |
P6-02 | 812742 | 187118 | 55446 | 96705 | 253830 | 219643 |
P6-03 | 875665 | 196616 | 81268 | 90627 | 251445 | 255709 |
P6-04 | 920662 | 180975 | 89664 | 98902 | 314007 | 237114 |
P6-05 | 872204 | 138795 | 70217 | 107529 | 282606 | 273057 |
P6-06 | 855094 | 172882 | 70731 | 111615 | 293565 | 206301 |
P7-01 | 997459 | 256305 | 62517 | 96127 | 282357 | 300153 |
P7-02 | 851328 | 171237 | 84081 | 80445 | 310480 | 205085 |
P7-03 | 971890 | 270653 | 85072 | 122853 | 280687 | 212625 |
P7-04 | 793155 | 113284 | 66184 | 109753 | 255100 | 248834 |
P7-05 | 1021896 | 264933 | 64222 | 96402 | 317142 | 279197 |
P7-06 | 803162 | 214155 | 57192 | 79460 | 276621 | 175734 |
P8-01 | 529794 | 126531 | 61966 | 82283 | 136752 | 122262 |
P8-02 | 572907 | 150872 | 76799 | 118885 | 83138 | 143213 |
P8-03 | 619986 | 203746 | 66488 | 85904 | 76191 | 187657 |
P8-04 | 634987 | 218043 | 83563 | 68107 | 143855 | 121419 |
P8-05 | 641554 | 140549 | 78192 | 102200 | 155334 | 165279 |
P8-06 | 637048 | 190208 | 71224 | 91277 | 117682 | 166657 |
4.2、不同引物线性扩增建库得到的reads占比,结果如表33所示。reads占比通过各引物的reads数÷Total reads数×100%计算所得。
表33.
样本编号 | ALK_f19-12 | ALK_f19-4 | ALK_f19-n4 | EGFR_i21-2 | TP53_i07-2 |
P3-01 | 20.63% | 7.47% | 11.93% | 40.93% | 19.04% |
P3-02 | 22.20% | 8.33% | 8.26% | 26.54% | 34.67% |
P3-03 | 19.24% | 12.89% | 11.60% | 28.84% | 27.44% |
P3-04 | 27.26% | 9.87% | 9.66% | 26.21% | 27.01% |
P3-05 | 26.37% | 5.91% | 12.28% | 24.88% | 30.56% |
P3-06 | 16.35% | 8.58% | 10.67% | 34.94% | 29.46% |
P4-01 | 93.72% | 1.53% | 0.67% | 3.28% | 0.80% |
P4-02 | 32.22% | 3.19% | 2.69% | 1.14% | 60.76% |
P4-03 | 56.89% | 10.09% | 13.52% | 6.58% | 12.92% |
P4-04 | 28.25% | 7.13% | 9.21% | 8.64% | 46.77% |
P4-05 | 94.24% | 0.92% | 3.55% | 0.65% | 0.64% |
P4-06 | 48.56% | 12.34% | 16.09% | 5.47% | 17.54% |
P5-01 | 41.89% | 10.96% | 10.15% | 11.31% | 25.69% |
P5-02 | 36.28% | 11.36% | 11.17% | 19.49% | 21.70% |
P5-03 | 39.52% | 8.34% | 14.78% | 15.10% | 22.26% |
P5-04 | 39.43% | 3.76% | 5.48% | 9.46% | 41.86% |
P5-05 | 60.15% | 10.09% | 8.44% | 8.79% | 12.54% |
P5-06 | 43.00% | 6.28% | 6.65% | 19.13% | 24.94% |
P6-01 | 24.19% | 8.56% | 12.90% | 30.42% | 23.93% |
P6-02 | 23.02% | 6.82% | 11.90% | 31.23% | 27.02% |
P6-03 | 22.45% | 9.28% | 10.35% | 28.71% | 29.20% |
P6-04 | 19.66% | 9.74% | 10.74% | 34.11% | 25.75% |
P6-05 | 15.91% | 8.05% | 12.33% | 32.40% | 31.31% |
P6-06 | 20.22% | 8.27% | 13.05% | 34.33% | 24.13% |
P7-01 | 25.70% | 6.27% | 9.64% | 28.31% | 30.09% |
P7-02 | 20.11% | 9.88% | 9.45% | 36.47% | 24.09% |
P7-03 | 27.85% | 8.75% | 12.64% | 28.88% | 21.88% |
P7-04 | 14.28% | 8.34% | 13.84% | 32.16% | 31.37% |
P7-05 | 25.93% | 6.28% | 9.43% | 31.03% | 27.32% |
P7-06 | 26.66% | 7.12% | 9.89% | 34.44% | 21.88% |
P8-01 | 23.88% | 11.70% | 15.53% | 25.81% | 23.08% |
P8-02 | 26.33% | 13.41% | 20.75% | 14.51% | 25.00% |
P8-03 | 32.86% | 10.72% | 13.86% | 12.29% | 30.27% |
P8-04 | 34.34% | 13.16% | 10.73% | 22.65% | 19.12% |
P8-05 | 21.91% | 12.19% | 15.93% | 24.21% | 25.76% |
P8-06 | 29.86% | 11.18% | 14.33% | 18.47% | 26.16% |
由表33~表34可知,随着硫代修饰个数的增多,体系扩增的均一度会有提升。当硫代数量达到3个以上时,多重线性扩增体系具有较好的均一度,出现非特异PCR扩增的几率大幅降低,从无硫代修饰的67%,降到了0%。
5、不同引物线性扩增文库分子的特异性占比,结果如表34所示。特异性占比通过各引物的ontarget reads数÷各引物的reads数×100%计算所得。
表34.
由表34可知,多重线性扩增的特异性与引物上的硫代修饰的数量有关,当硫代修饰的数量在3-8时,文库的特异性较好,当硫代修饰的数量小于3或大于8时,文库的特异性较差。
实施例4不同的引物二象性功能基团对线性扩增建库特异性的影响
通过有不同二象性功能基团修饰的硫代引物分别进行线性扩增,对人血浆cfDNA样本进行建库,比较有不同二象性功能基团修饰的硫代引物的建库特异性,筛选适合用于高特异性靶向建库的硫代引物。
实验材料
1、检测样本
样本为人血浆cfDNA样本。
样本通过qPCR定量,cfDNA定量体系和qPCR程序如之前实施例3中的表27和实施例1的表17所示。
2、引物序列(供应商均为上海生工)。
实施例4所用到的特异性引物(P01-P34)序列都与实施例3中的EGFR_i21-2N序列完全相同,只是做了不一样的修饰,具体修饰如下所述:P01和P02引物未有二象性功能基团修饰,且3’端末尾的硫代修饰个数分别为0个和3个;P03、P04和P05引物的二象性功能基团为NH2-C6基团,且3’端末尾的硫代修饰个数分别为0个、5个和3个;P06、P07和P08引物的二象性功能基团为DL1,且3’端末尾的硫代修饰个数分别为0个、3个和5个;P09引物的二象性功能基团为DL2(LNA修饰),且3’端末尾的硫代修饰个数为3个;P10-P23的3’端末尾的硫代修饰个数都为3个,而P10的二象性功能基团为DL3、P11的二象性功能基团为DL4、P12的二象性功能基团为DL5、P13的二象性功能基团为C6Spacer、P14的二象性功能基团为DL6、P15的二象性功能基团为Invert T、P16的二象性功能基团为DL7、P17的二象性功能基团为磷酸基团、P18的二象性功能基团为DL8、P19的二象性功能基团为C3 Spacer、P20的二象性功能基团为DL9、P21的二象性功能基团为SH-C6、P22的二象性功能基团为DL10;P23和P24引物的二象性功能基团为DL11,且3’端末尾的硫代修饰个数分别为3个和0个;P25和P26引物的二象性功能基团为DL12,且3’端末尾的硫代修饰个数分别为3个和0个;P27和P28引物的二象性功能基团为DL13,且3’端末尾的硫代修饰个数分别为3个和0个;P29和P30引物的二象性功能基团为DL14,且3’端末尾的硫代修饰个数分别为3个和0个;P31和P32引物的二象性功能基团为DL15,且3’端末尾的硫代修饰个数分别为3个和0个;P33和P34引物的二象性功能基团为DL16,且3’端末尾的硫代修饰个数分别为3个和0个。
3、单链接头与预扩增引物都为前述的UA1和i1。
其余实验材料与实验设备均与实施例3相同,各实验步骤也基本参照实施例3的第1-3部分。样本DNA投入分子数是以表27的qPCR体系检测得出的分子数,即初始投入的DNA量。另外补充步骤如下:
在步骤1线性扩增后检测扩增效率。取2μL线性扩增产物,加入18μL TE缓冲液稀释10倍后,使用qPCR检测体系对线性扩增产物定量。线性扩增倍数=线性扩增产物分子数/样本DNA投入分子数。*线性扩增产物分子数是以表27的qPCR体系检测得出的分子数。
在步骤2纯化线性扩增产物后检测纯化效率。取2μL纯化后的线性扩增产物,加入18μL TE缓冲液稀释10倍后,使用qPCR检测体系对纯化后的线性扩增产物定量。纯化后线性扩增倍数=纯化后的线性扩增产物分子数/样本DNA投入分子数。纯化效率=纯化后的线性扩增产物分子数/线性扩增产物分子数。*纯化后的线性扩增产物分子数是以表27的qPCR体系检测得出的分子数。
实验结果具体如下表所示,其中:
连接效率=特异性文库分子数/纯化后的线性扩增产物分子数
特异性文库分子转化率=特异性文库分子数/样本DNA投入分子数
特异性文库分子占比=特异性文库分子数/文库分子总分子数
*特异性文库分子数是以表28的qPCR体系检测得出的分子数。*文库分子总分子数是以表16的qPCR体系检测得出的分子数。
表35.
从上表可见,对比没有二象性功能基团修饰的P01和P02,采用其他有二象性功能基团修饰的引物进行线性扩增的连接效率、特异性文库分子转化率和特异性文库分子占比要明显更高。
综上所述,本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 上海羿鸣生物科技有限公司
<120> 单引物扩增建库技术在检测片段化稀有DNA分子突变中的应用及试剂盒
<160> 31
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagggatcca gacaactgtt caaactgatg 60
gg 62
<210> 2
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcacatcg aggatttcct tgttggcttt 60
cggag 65
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctggca gccaggaacg tactggtgaa 60
aac 63
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagtcaccag ctgcaccgtg gatgtcag 58
<210> 5
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagggcctgc tgaaaatgac tgaatataaa 60
cttgtg 66
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagtccccag tcctcatgta ctggtccctc 60
<210> 7
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcagagga agccttcgcc tgtcctcatg 60
tattg 65
<210> 8
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagagaatct ccattttagc acttacctgt 60
gactc 65
<210> 9
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggactttc aactctgtct ccttcctctt 60
cctac 65
<210> 10
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggccatgg ccatctacaa gcagtcac 58
<210> 11
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagctggccc ctcctcagca tcttatcc 58
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagatgcgaa gccacactga cgtgcctctc 60
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctgctg ggcatctgcc tcacctccac 60
<210> 14
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctgtctctta tacacatctc cgagcccacg agaccgagta atatctcgta tgccgtcttc 60
tgcttg 66
<210> 15
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctgtctctta tacacatctc cgagcccacg agactctccg gaatctcgta tgccgtcttc 60
tgcttg 66
<210> 16
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctgtctctta tacacatctc cgagcccacg agacaatgag cgatctcgta tgccgtcttc 60
tgcttg 66
<210> 17
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ggctatatcg tcggcagcgt cagatg 56
<210> 18
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg cctctattcg tcggcagcgt cagatg 56
<210> 19
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ggataggtcg tcggcagcgt cagatg 56
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tcgtcggcag cgtcagatg 19
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tctcgtgggc tcggaga 17
<210> 24
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctgatc agccaggagg atacacacg 59
<210> 25
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagtgccaag ccacagagtt ggagaagag 59
<210> 26
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcaagtat aaccccacgt gaacgag 57
<210> 27
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctggca gccaggaacg tactggtgaa 60
aac 63
<210> 28
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagagtcttc cagtgtgatg atggtgagga 60
tg 62
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tactggtgaa aacaccgca 19
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ttccgcaccc agcagttt 18
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tgtcaagatc acagattttg ggc 23
Claims (11)
1.一种单引物扩增建库技术在检测片段化稀有DNA分子突变中的应用,其特征在于,所述单引物扩增建库技术包括以下步骤:(1)通过特异性引物线性扩增目标DNA,获得线性扩增产物,所述特异性引物的3’末端核苷酸含有二象性功能基团;(2)对步骤(1)所得的线性扩增产物进行接头连接,获得接头连接产物,接头连接体系中包括单链连接酶和单链接头;
所述片段化稀有DNA分子突变包括单碱基变异(SNV)和短片段插入/缺失(smallindel)。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,还包括将所述连接产物进行预扩增、扩库、测序的步骤;
其中,所述预扩增的步骤为:将所述连接产物进行预扩增,以提供预扩增产物,所述的预扩增引物的前引物包括与第一通用序列互补的序列、与第一样本标签序列互补的序列、与第一测序序列互补的序列中的一种或多种的组合,所述的预扩增引物的后引物包括与第二测序序列互补的序列;
所述扩库的步骤为:将所述预扩增产物进行扩库,以提供文库产物,所述的扩库引物的前引物包括与第一测序序列互补的序列,所述的扩库引物的后引物包括与第二测序序列互补的序列;
所述测序的步骤为:通过对所述文库产物进行测序,以提供片段化稀有DNA分子目标区域的测序结果。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述特异性引物的3’末端核苷酸含有二象性功能基团;所述特异性引物的3’末端的核苷酸的3位C原子羟基被二象性功能基团取代,所述特异性引物的3’末端的二象性功能基团选自C3 Spacer基团、Invert T基团、磷酸基团、生物素基团、C6 Spacer基团、NH2-C6基团、SH-C6基团;
和/或,所述特异性引物的3’末端的二象性功能基团为核苷酸复合基团,核苷酸复合基团的结构如下:
其中,Base选自A碱基、G碱基、C碱基、T碱基或U碱基;
R1选自羟基基团、C3 Spacer基团、Invert T基团、磷酸基团、生物素基团、C6 Spacer基团、NH2-C6基团或SH-C6基团;
R2选自氢原子、氟原子、羟基基团、或甲氧基基团。
4.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述特异性引物的3’端部分核苷酸之间的磷脂键被硫代修饰;
其中,所述特异性引物中,被硫代修饰的核苷酸的个数为1~11个,优选为3~8个;
和/或,所述特异性引物中,被硫代修饰的核苷酸为连续的;
和/或,所述特异性引物中,位于特异性引物的3’端的被硫代修饰的核苷酸的个数为1-11个,优选为3-8个。
5.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述线性扩增包括多重线性扩增;
所述多重线性扩增中,所述靶向的片段化稀有DNA分子目标区域的数量≥2;
和/或,所述片段化稀有DNA分子突变的丰度为0.001%~50%,优选为0.01%~10%,最优选为0.02%~1%;
和/或,所述片段化稀有DNA分子的长度为25~500bp/nt,优选为50~200bp/nt;
和/或,所述片段化稀有DNA分子的结构为双链DNA、单链DNA或cDNA;
和/或,所述片段化稀有DNA分子为游离DNA;
和/或,所述片段化稀有DNA分子来源于体液,优选来源于血液和/或尿液;
和/或,所述片段化稀有DNA分子由基因组DNA经打断制备获得,优选为超声打断和/或酶切打断。
6.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述特异性引物的3’端至少部分的序列与所述片段化稀有DNA分子目标区域互补,与目标区域互补的序列的长度≥16nt;
和/或,所述特异性引物还包括第一通用序列、第一样本标签序列、第一测序序列中的一种或多种的组合;
和/或,所述线性扩增的扩增体系中包括特异性引物、DNA聚合酶和dNTP;优选的,所述DNA聚合酶具有3’-5’外切酶活性;更优选的,所述DNA聚合酶选自B族DNA聚合酶。
7.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述单链接头包括第二测序序列、第二样本标签序列、第二通用序列、分子标签序列中的一种或多种的组合;
其中,所述单链连接酶为T4 RNA连接酶或热稳定性RNA连接酶;
和/或,所述单链接头的5’末端的核苷酸被修饰、且在接头连接的反应温度下为单链结构,优选的,单链接头的5’末端的核苷酸的5位C原子连接有磷酸基团或腺苷基团;
和/或,所述单链接头的3’末端的核苷酸的3位C原子羟基被封闭基团取代,优选的,所述单链接头的3’末端的封闭基团选自Invert T基团、磷酸基团、生物素基团、C6 Spacer基团、NH2-C6基团、SH-C6基团、C3 Spacer基团;
和/或,所述单链接头的5’端区域为具有黏性末端的部分双链结构。
8.一种片段化稀有DNA分子突变检测试剂盒/试剂,其特征在于,所述试剂/试剂盒包括:3’末端核苷酸含有二象性功能基团的特异性引物,且部分核苷酸之间的磷脂键被硫代修饰、高保真DNA聚合酶、包含分子标签的单链接头、单链连接酶。
9.如权利要求8所述的试剂盒/试剂在检测片段化稀有DNA分子突变中的应用。
10.一种特异性引物,其特征在于,所述特异性引物为SEQ ID No.1-SEQ ID No.13所示序列之一种或多种组合。
11.如权利要求10所述的特异性引物在单引物扩增建库技术用于检测片段化稀有DNA分子突变中的应用。
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CN202110085290.4A CN114807324A (zh) | 2021-01-22 | 2021-01-22 | 单引物扩增建库技术在检测片段化稀有dna分子突变中的应用及试剂盒 |
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CN116200478A (zh) * | 2023-03-07 | 2023-06-02 | 安徽安龙基因科技有限公司 | 一种基于单链连接的捕获建库方法和应用 |
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