JP2023519979A - ゲノム内の構造再編成の検出方法 - Google Patents

Abstract

再編成特異的濃縮プローブまたは再編成特異的増幅プライマーを使用してゲノム内の構造再編成を検出するための方法および組成物が開示される。【選択図】図１

Description

発明の分野
本開示は、核酸配列決定の分野に関する。より具体的には、本発明は、配列決定によってゲノム再編成を検出する分野に関する。

発明の背景
かなりの割合の癌ゲノムは、コピー数増幅（ゲノムの大部分がタンデムに繰り返されるＣＮＡ）、コピー数欠失（ゲノムの大部分が除去されたＣＮＤ）、転座（ゲノムの他の部分との融合）、タンデムリピート（遺伝子よりも小さいゲノムの領域がタンデムに複製される）または欠失（遺伝子よりも小さい領域が欠失される）のいずれかの構造異常を有する。これらのバリアントを検出する能力は、癌の発見および診断、腫瘍の大きさの経時的追跡、ならびに癌患者の最良の個別化治療を特定するのに有用であり得る。

既存のゲノム再編成検出方法は、ハプロタイプ融合ＰＣＲおよびライゲーションハプロタイピングなどの面倒な多段階手順を伴う。Ｔｕｒｎｅｒら，（２００８）Ｌｏｎｇ ｒａｎｇｅ，ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｖｉａ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ ａｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈａｐｌｏｔｙｐｉｎｇ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６：ｅ８２を参照されたい。

これらの構造異常を同定するための現在の配列決定をベースとする技術が存在するが、大量の配列決定を必要とすることが多い。次世代配列決定のコストは、典型的には、アッセイコストの主な要因であるため、より少ない配列決定でそのような構造異常を同定する能力により、アッセイのコストが大幅に削減し、これらの診断ツールへの患者のアクセスが増加する。

発明の概要
本発明は、特別に配置されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーの対を使用して、サンプル中の融合、欠失またはコピー数増幅などの希少なゲノム再編成を検出する方法である。

一実施形態では、本発明は、サンプル中のゲノム再編成を検出する方法であって、ゲノム由来の核酸を含有するサンプルを、フォワードオリゴヌクレオチドプライマーとリバースオリゴヌクレオチドプライマーとの１つ以上の対と接触させる工程であって、参照ゲノム中ではプライマーに対する結合部位が隣接していないかまたは内向きでなく、ゲノム再編成を含むゲノム中ではプライマーに対する結合部位の位置が、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて再編成を含む核酸を指数関数的に増幅できるように、隣接していて内向きである、工程、および再編成を含む核酸を指数関数的に増幅し、それによって再編成を検出することを可能にする工程を含む、方法である。本方法は、増幅された核酸を配列決定し、それによって再編成を検出することをさらに含む。隣接とは、細胞ゲノムＤＮＡにおいて２０００塩基対未満離れていること、または無細胞ＤＮＡにおいて１７５塩基対未満離れていることを意味し得る。

いくつかの実施形態では、ゲノム再編成は遺伝子融合であり、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのための結合部位は、参照ゲノム中では異なる染色体上に位置するが、遺伝子融合を含むゲノム中では同じ染色体上に位置する。いくつかの実施形態では、ゲノム再編成は欠失であり、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの結合部位は、参照ゲノムにおいて隣接していないが、欠失を含むゲノムにおいては隣接している。いくつかの実施形態では、ゲノム再編成は、ブレークポイント配列を作成し、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの結合部位の１つがブレークポイント配列に及んでいる。いくつかの実施形態では、ゲノム再編成は増幅であり、フォワードプライマー結合部位のコピーの少なくとも１つおよびリバースプライマー結合部位のコピーの１つは、増幅を含むゲノム中では内向きである。

いくつかの実施形態では、本発明は、１種以上のゲノム再編成についてサンプルを同時に調べる方法であって、ゲノム由来の核酸を含有するサンプルを、フォワードオリゴヌクレオチドプライマーとリバースオリゴヌクレオチドプライマーとの１つ以上の対と接触させる工程であって、参照ゲノム中ではプライマーに対する結合部位が隣接していないかまたは内向きでなく、ゲノム再編成を含むゲノム中ではプライマーに対する結合部位の位置が、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて再編成を含む核酸を指数関数的に増幅できるように、隣接していて内向きである、工程；再編成を含む核酸を指数関数的に増幅する工程；増幅された核酸のライブラリーを形成する工程；ライブラリー中の核酸を配列決定し、それによりサンプル中の１つ以上のゲノム再編成を検出する工程を含む、方法である。いくつかの実施形態では、方法は、配列決定読み取りを参照ゲノムとアライメントさせて、ゲノム再編成のゲノム供給源を決定する工程をさらに含む。

いくつかの実施形態では、フォワードオリゴヌクレオチドプライマーとリバースオリゴヌクレオチドプライマーとの１つ以上の対が、フォワードプライマーとリバースプライマーとの少なくとも１対について、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの結合位置が、参照ゲノム中では異なる染色体上に位置するが、遺伝子融合を含むゲノム中では同じ染色体上に位置すること；フォワードプライマーとリバースプライマーとの少なくとも１対について、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの結合部位の１つが、ゲノム再編成のブレークポイント配列に及ぶこと；ならびにフォワードプライマーとリバースプライマーとの少なくとも１対について、フォワードプライマー結合部位のコピーの１つおよびリバースプライマー結合部位のコピーの１つが、遺伝子増幅を含むゲノムにおいて内向きであることを含む。

いくつかの実施形態では、再編成は、ＡＬＫ、ＰＰＡＲＧ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＭＥＴ、ＮＲＧ１、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＡＸＬ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＢ、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＲＨＧＡＰ２６、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＰＯＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ４、ＥＲＧ、ＥＳＲ１、ＥＳＲＲＡ、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＷＳＲ１、ＦＧＲ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＮＳＲ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＩＴ、ＭＡＭＬ２、ＭＡＳＴ１、ＭＡＳＴ２、ＭＳＭＢ、ＭＵＳＫ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＵＭＢＬ、ＮＵＴ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＫＮ１、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、ＰＴＫ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＥＬＡ、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＳＹＫ、ＴＥＲＴ、ＴＦＥ３、ＴＦＥＢ、ＴＨＡＤＡ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＳＬＰ、ＴＹ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＣＲ、ＣＡＭＴＡ１、ＣＢＦＢ、ＣＣＮＢ３、ＣＣＮＤ１、ＣＩＣ、ＣＲＦＬ２、ＤＵＳＰ２２、ＥＰＣ１、ＦＯＸＯ１、ＦＵＳ、ＧＬＩ１、ＧＬＩＳ２、ＨＭＧＡ２、ＪＡＺＦ１、ＫＭＴ２Ａ、ＭＡＬＴ１、ＭＥＡＦ６、ＭＥＣＯＭ、ＭＫＬ１、ＭＫＬ２、ＭＴＢ、ＮＣＯＡ２、ＮＵＰ２１４、ＮＵＰ９８、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＢ、ＰＩＣＡＬＭ、ＰＬＡＧ１、ＲＢＭ１５、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ１Ｔ１、ＳＳ１８、ＳＴＡＴ６、ＴＡＦ１５、ＴＡＬ１、ＴＣＦ１２、ＴＣＦ３、ＴＦＧ、ＴＹＫ２、ＵＳＰ６、ＹＷＨＡＥ、ＡＲ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＲＢ８４、ＦＬＴ３、ＫＲＡＳ、ＭＤＭ４、ＭＹＢＬ１、ＮＦ１、ＮＯＴＣＨ４、ＮＵＴＭ１、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＥＮ、ＲＡＤ５１Ｂ、およびＲＢ１から選択される１以上の遺伝子を含む融合、ならびにＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＭＥＴ、ＭＹＣ、ＢＣＬ２、およびＢＣＬ６から選択される１以上の遺伝子を含む欠失または重複を含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプルを、参照ゲノムにおけるプライマーに対する結合部位が隣接しており、内向きではなく、再編成されていない参照配列を指数関数的に増幅することを可能にする、対照フォワードオリゴヌクレオチドプライマーおよび対照リバースオリゴヌクレオチドプライマーの１つ以上の対と接触させる工程をさらに含む。

いくつかの実施形態では、ライブラリーを形成することは、バーコードを含むアダプターを付着させることを含み、配列決定することは、タグ化されたライブラリー核酸の配列を決定すること、タグによって配列をファミリーにグループ化すること、各ファミリーについてコンセンサスリードを決定すること、コンセンサスリードを参照ゲノムに整列させ、それによってゲノム再編成を検出することを含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中のゲノム再編成を検出する方法であって、少なくとも１つのアダプターを含む核酸のライブラリーを形成する工程；プライマー対の第１のプライマーをライブラリー核酸にハイブリダイズさせる工程であって、第１のプライマーがゲノム再編成の一方の側にハイブリダイズし、捕捉部分も含む、プライマー対の第１のプライマーをライブラリー核酸にハイブリダイズさせる工程；ハイブリダイズした第１のプライマーを伸長し、それにより、ゲノム再編成の配列を含み、捕捉部分をさらに含む第１のプライマー伸長複合体を生成する工程；捕捉部分を介して第１のプライマー伸長産物を捕捉する工程；捕捉された核酸に、プライマー対の第２のプライマーをハイブリダイズさせる工程であって、第２のプライマーが、第１のプライマーに対してゲノム再編成の反対側で反対鎖にハイブリダイズし、再編成されたゲノム中では第１のプライマーに隣接するが、参照ゲノム中では隣接していない、捕捉された核酸にプライマー対の第２のプライマーをハイブリダイズさせる；捕捉され再編成された核酸のコピーを形成する工程；再編成された核酸のコピーを配列決定し、それにより、ゲノム再編成を検出する工程を含む、方法である。

いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中のゲノム再編成を含む配列を濃縮する方法であって、サンプル中の核酸に第１のプライマーをハイブリダイズさせる工程であって、第１のプライマーがゲノム再編成の一方の側にハイブリダイズし、捕捉部分も含む、工程；ハイブリダイズした第１のプライマーを伸長し、それにより、ゲノム再編成の配列を含み、捕捉部分をさらに含む第１のプライマー伸長複合体を生成する工程；捕捉部分を介して第１のプライマー伸長産物を捕捉する工程；捕捉された核酸に第２のプライマーをハイブリダイズさせる工程であって、第２のプライマーが、再編成されたゲノム内の第１のプライマーに対してゲノム再編成の同じ側の同じ鎖にハイブリダイズするが、参照ゲノム中にはハイブリダイズせず、バーコードも含む、工程；ハイブリダイズした第２のプライマーを伸長し、それによって第２のプライマー伸長複合体を生成し、捕捉部分を含む第１のプライマー伸長複合体を置換する工程；第２のプライマー伸長複合体に第３のプライマーをハイブリダイズさせる工程であって、第３のプライマーが、第２のプライマーに対してゲノム再編成の反対側の反対鎖にハイブリダイズし、再編成されたゲノム中では第２のプライマーに隣接するが、参照ゲノム中では第２のプライマーにハイブリダイズしない工程；第３のプライマーを伸長させ、それにより、再編成の配列を含む二本鎖産物を形成し、それにより、ゲノム再編成を濃縮することを含む、方法である。第１のオリゴヌクレオチドの捕捉部分は、捕捉配列、リガンドが利用可能な化学的部分、または抗体が利用可能な抗原であり得る。捕捉部分は、捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な捕捉配列であり、捕捉オリゴヌクレオチドの融解温度を上昇させる修飾ヌクレオチド、例えば、５－メチルシトシン、２，６－ジアミノプリン、５－ヒドロキシブチン－２’－デオキシウリジン、８－アザ－７－デアザグアノシン、リボヌクレオチド、２’Ｏ－メチルリボヌクレオチドおよびロックド核酸を含む。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズさせる前に、第１のオリゴヌクレオチドを捕捉部分を介して固体支持体に結合させる。いくつかの態様では、本方法はまた、二本鎖産物を配列決定し、それによってゲノム再編成を検出する工程を含む。配列決定は、二本鎖核酸および結合バーコードの配列を決定すること、バーコードによって配列をファミリーにグループ化すること、各ファミリーについてコンセンサスリードを決定すること、コンセンサスリードを参照ゲノムに整列させ、それによってゲノム再編成を検出することを含み得る。

いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中のＲＮＡ転写物の構造変異を検出する方法であって、サンプルから核酸を得る工程；ゲノム再編成の部位に隣接して配置された第１のプライマーを用いてＲＮＡ転写物をｃＤＮＡ鎖に逆転写する工程；第２のプライマーをｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせる工程であって、第２のプライマーが、第１のプライマーに対してゲノム再編成の反対側の反対鎖にハイブリダイズし、再編成されたゲノム中では前記第１のプライマーに隣接するが参照ゲノム中では前記第１のプライマーに隣接せず、再編成されたゲノム中では第１のプライマーに隣接するが参照ゲノム中では第１のプライマーに隣接せず、再編成されたゲノム配列の指数関数的増幅を可能にするが参照ゲノム配列の指数関数的増幅は可能にしない、第２のプライマーをｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせる工程；およびｃＤＮＡを増幅してアンプリコンを産生し、それによってＲＮＡ転写物中のゲノム再編成を検出する工程を含む、方法である。

いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中の核酸のゲノム再編成を検出する方法であって、核酸を含むサンプルをゲノムから複数の反応体積に分割する工程であって；各反応体積が、（ｉ）ゲノム再編成の一方の側にハイブリダイズし得る第１のプライマー、（ｉｉ）第１のプライマーに対してゲノム再編成の反対側の反対鎖にハイブリダイズし得、再編成されたゲノム中では第１のプライマーに隣接するが、参照ゲノム中では隣接しない、第２のプライマー、および（ｉｉｉ）第１および第２のプライマーのアンプリコンにハイブリダイズし得る検出可能に標識された第１のプローブを含む工程；第１および第２のプライマーを用いて増幅反応を行う工程であって、反応が、プローブを用いる検出工程を含む、工程；第１のプローブが検出された反応体積の数を決定し、それにより、ゲノム再編成を検出する工程を含む、方法である。反応体積は液滴であってもよい。いくつかの実施形態では、反応体積は、参照ゲノム中では、第１のプライマーに対して反対鎖にハイブリダイズし得、第１のプライマーに隣接するが、再編成ゲノム中では第１のプライマーに対して反対鎖にハイブリダイズせず、第１のプライマーに隣接しない第３のプライマー、ならびに第１および第３のプライマーのアンプリコンにハイブリダイズし得るが、第１および第３のアンプリコンにはハイブリダイズしない第２の検出可能に標識されたプローブをさらに含み、方法は、第１のプローブが検出された反応体積の比率を決定し、それによってゲノム再編成の頻度を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のプローブは、再編成されたゲノム中では配列にハイブリダイズするが、参照ゲノム中では配列にハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、第２のプローブは、参照ゲノム中では配列にハイブリダイズするが、再編成されたゲノム中では配列にはハイブリダイズしない。第１および第２のプローブは、種々の検出可能な標識を有し得る。標識は、例えば、フルオロフォアとクエンチャーとの組み合わせであり得る。

図１は、ゲノム再編成に隣接するプライマーの図である。 図２は、融合事象を検出するように設計されたプライマーの図である。 図３は、欠失事象を検出するように設計されたプライマーの図である。 図４は、増幅事象を検出するように設計されたプライマーの図である。 図５は、プライマー伸長標的濃縮（ＰＥＴＥ）による再編成の検出の図である。

発明の詳細な説明
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、当該技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第４版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）を参照されたい。

以下の定義は、本開示の理解を容易にするために提供される。

「アダプター」という用語は、追加の要素および特性をその配列にインポートするために別の配列に付加され得るヌクレオチド配列を指す。さらなる要素としては、バーコード、プライマー結合部位、捕捉部分、標識、二次構造が挙げられるが、これらに限定されない。

「バーコード」という用語は、検出および同定し得る核酸配列を指す。バーコードは、一般に、２ヌクレオチド以上から約５０ヌクレオチドまでの長さであり得る。バーコードは、集団中の他のバーコードとの少なくとも最小数の差を有するように設計される。バーコードは、サンプル中の各分子に固有であってもよいし、サンプルに固有であってもよく、サンプル中の複数の分子によって共有されてもよい。「多重識別子」、「ＭＩＤ」または「サンプルバーコード」という用語は、サンプルまたはサンプルの供給源を識別するバーコードを指す。したがって、単一の供給源またはサンプル由来の全てまたは実質的に全てのＭＩＤバーコード化ポリヌクレオチドは、同じ配列のＭＩＤを共有するが、異なる供給源またはサンプル由来の全ての、または実質的に全ての（例えば、少なくとも９０％または９９％）ＭＩＤバーコード化ポリヌクレオチドは、異なるＭＩＤバーコード配列を有するであろう。ＭＩＤバーコードに符号化されたサンプル情報を維持しながら、異なるＭＩＤを有する異なる供給源からのポリヌクレオチドを混合し、並行して配列決定し得る。「固有の分子識別子」または「ＵＩＤ」という用語は、それが結合しているポリヌクレオチドを識別するバーコードを指す。典型的には、ＵＩＤバーコード化ポリヌクレオチドの混合物中の全てまたは実質的に全て（例えば、少なくとも９０％または９９％）のＵＩＤバーコードは固有である。

「ＤＮＡポリメラーゼ」という用語は、デオキシリボヌクレオチドからポリヌクレオチドの鋳型指向合成を行う酵素を指す。ＤＮＡポリメラーゼには、原核生物Ｐｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ ＩＩ、Ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｐｏｌ ＩＶおよびＰｏｌ Ｖ、真核生物ＤＮＡポリメラーゼ、古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、テロメラーゼおよび逆転写酵素が含まれる。「耐熱性ポリメラーゼ」という用語は、酵素が耐熱性であるために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸の指数関数的増幅に有用な酵素を指す。熱安定性酵素は、その後のポリヌクレオチド伸長反応をもたらすのに十分な活性を保持し、二本鎖核酸の変性をもたらすのに必要な時間にわたって高温に供した場合に不可逆的に変性（不活性化）しない。いくつかの実施形態では、サーモコッカス種（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）、パイロコッカス種（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、スルホロブス種（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、メタノコッカス種（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）からの熱安定性ポリメラーゼ、および他の古細菌Ｂポリメラーゼ。いくつかの場合、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）ポリメラーゼは、改変された天然に存在するＡ型ポリメラーゼであり得る。本発明のさらなる実施形態は、一般に、例えばプライマー伸長、末端修飾（例えば、末端トランスフェラーゼ、分解または研磨（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ））または増幅反応における修飾Ａ型ポリメラーゼが、メイオサーマス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、サーマトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属またはテルモミクロビウム（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属の任意の種から選択され得る方法に関する。本発明の別の実施形態は、一般に、ポリメラーゼが、例えばプライマー伸長、末端修飾（例えば、末端トランスフェラーゼ、分解または研磨）または増幅反応において、サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・カルドフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）またはサーマス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）のいずれかから単離され得る方法に関する。本発明のさらなる実施形態は、一般に、改変されたタイプＡポリメラーゼが、例えばプライマー伸長、末端修飾（例えば、末端トランスフェラーゼ、分解または研磨）または増幅反応において、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スファエロバクター・サーモフィルス（Ｓｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ディクチオグロムス・サーモフィルム（Ｄｉｃｔｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）またはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から単離され得る方法を包含する。別の実施形態では、本発明は、一般に、例えばプライマー伸長、末端修飾（例えば、末端トランスフェラーゼ、分解または研磨）または増幅反応における改変されたＡ型ポリメラーゼが変異Ｔａｑ－Ｅ５０７Ｋポリメラーゼであり得る方法に関する。本発明の別の実施形態は、一般に、熱安定性ポリメラーゼを使用して標的核酸の増幅を行い得る方法に関する。

「濃縮」という用語は、複数の分子中の標的分子の相対量を増加させることを指す。濃縮は、標的分子の相対量を、非標的分子を完全にまたはほぼ完全に排除するまで増加させ得る。標的核酸の濃縮の例としては、線形ハイブリダイゼーション捕捉、増幅、指数関数的増幅（ＰＣＲ）およびプライマー伸長標的濃縮（ＰＥＴＥ）が挙げられ、例えば、米国特許出願公開第第１４／９１０，２３７号、第１５／２２８，８０６号、第１５／６４８，１４６号および国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８５７２７号を参照されたい。

「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそれらのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。特に示されない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰおよび相補的配列、ならびに明示的に示された配列も暗黙的に包含する。

「プライマー」 という用語は、一本鎖鋳型核酸分子の特定の領域に結合し、ポリメラーゼ媒介酵素反応を介して核酸合成を開始するオリゴヌクレオチドを指す。典型的には、プライマーは約１００個未満のヌクレオチドを含み、好ましくは約３０個未満のヌクレオチドを含む。標的特異的プライマーは、ハイブリダイゼーション条件下で標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。そのようなハイブリダイゼーション条件としては、等温増幅緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．１％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ｐＨ ８．８、２５℃）中、約４０℃～約７０℃の温度でのハイブリダイゼーションが挙げられ得るが、これに限定されない。標的結合領域に加えて、プライマーは、典型的には５’部分にさらなる領域を有し得る。追加の領域は、ユニバーサルプライマー結合部位またはバーコードを含み得る。指数関数的増幅を行うためには、プライマーは内向きでなければならず、すなわち、標的核酸の反対鎖にハイブリダイズし、３’末端が互いに面していなければならない。増幅プライマーのこの配向は、「正しい配向」と呼ばれることがある。さらに、指数関数的増幅を行うために、プライマーは、互いに適切な距離内で標的核酸にハイブリダイズする。標準的なＰＣＲ条件下では、２０００塩基対を超えて離れた反対鎖にハイブリダイズするプライマーでは、十分な量の産物を得られない。ｃｆＤＮＡサンプルの場合、典型的な断片サイズは１７５塩基対離れており、したがって、１７５塩基対より離れた反対鎖にハイブリダイズするプライマーは、典型的には増幅産物をもたらさない。

「参照ゲノム」および「参照ゲノム配列」という用語は、公開され、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって定期的に更新され、現在ＧＲＣｈ３８を構築しているヒトゲノム配列全体（「ゲノムビルド」）を指す。参照ゲノムは、個々のサンプルからの配列を比較し、サンプル中の任意の配列変化を同定することを可能にするために、染色体位置および配列によって検索可能である。

「再編成されたゲノム」という用語は、参照ゲノムと比較した場合に１つ以上の再編成を含むゲノムを指す。再編成されたゲノムはまた、再編成に関与しない他の遺伝子座に非再編成配列を含むことが理解される。再編成されたゲノム中ではそのような遺伝子座は、対応する参照ゲノム遺伝子座と同じ配列を有する。「再編成されたゲノム配列」という用語は、再編成されたゲノム内の再編成された配列を指す。

「ゲノム再編成」という用語は、参照ゲノムと比較したゲノム配列の変化を指す。再編成は、数個を超えるヌクレオチドが関与する変化である。ゲノム再編成の例としては、コピー数増幅（ゲノムの大部分がタンデムに繰り返されるＣＮＡ）、コピー数欠失（ゲノムの大部分が除去されたＣＮＤ）、転座（ゲノムの他の部分との融合）タンデムリピート（遺伝子よりも小さいゲノムの領域がタンデムに複製される）または欠失（遺伝子よりも小さい領域が欠失される）が挙げられる。対照的に、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）はゲノム再編成ではない。

「サンプル」という用語は、典型的にはＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸分子を含む、あらゆる生物学的サンプルを指す。サンプルは、組織、細胞またはそれらの抽出物であり得るか、または核酸分子の精製サンプルであり得る。「サンプル」という用語は、標的核酸を含有する、または含有すると推定されるいずれかの組成物を指す。「サンプル」 という用語の使用は、サンプル中に存在する核酸分子間の標的配列の存在を必ずしも意味しない。サンプルは、個体から単離された組織または体液、例えば皮膚、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙液、血球、器官および腫瘍の標本、ならびにホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）およびそこから単離された核酸を含む、個体から採取された細胞から樹立されたインビトロ培養物のサンプルであり得る。サンプルにはまた、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含有する無細胞血液画分などの無細胞材料も含まれてもよい。サンプルは、非ヒト対象または環境から収集し得る。

「標的」または「標的核酸」という用語は、サンプル中の目的の核酸を指す。サンプルは、複数の標的ならびに各標的の複数のコピーを含み得る。

「ユニバーサルプライマー」という用語は、ユニバーサルプライマー結合部位にハイブリダイズし得るプライマーを指す。ユニバーサルプライマー結合部位は、非標的特異的様式で標的配列に典型的に付加される天然または人工の配列であり得る。

本発明は、アンプリコンに基づくアプローチを利用してゲノムにおける構造異常としても知られるゲノム再編成を検出する方法である。この方法は、最小限の配列決定深度でゲノム再編成を検出することを可能にする。ゲノム再編成などの構造異常が起こると、再編成されたゲノムに少なくとも１つのブレークポイントが存在する。ブレークポイントとは、通常は隣接していないゲノム領域が隣接するようになる点である。本発明は、ゲノム再編成に関連するそのようなブレークポイントを増幅および検出することを可能にするゲノム再編成を検出する方法である。本発明の方法は、少なくとも１つのフォワードプライマーおよび少なくとも１つのリバースプライマーを利用する任意の２プライマー増幅アプローチで機能するように設計されている。そのようなアプローチの例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびプライマー伸長標的濃縮（ＰＥＴＥ）が挙げられる。

フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、コピー数増幅、コピー数欠失、融合、タンデムリピートまたは大きな欠失の可能性のある領域の周りに設計されている。ゲノム再編成がない場合、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、互いに隣接していないか、または誤って配向されておらず、アンプリコンが作製されないように増幅をサポートし得ない。ゲノム再編成の存在下では、フォワードプライマーおよびリザーブプライマーは、検出され得るアンプリコンの形成を可能にし、それによって再編成を検出する。

本発明は、核酸を含むサンプルを利用する。いくつかの実施形態では、サンプルは、対象または患者に由来する。いくつかの実施形態では、サンプルは、例えば生検によって、対象または患者に由来する固形組織または固形腫瘍の断片を含み得る。サンプルはまた、体液（例えば、尿、痰、血清、血漿またはリンパ、唾液、痰、汗、涙、脳脊髄液、羊水、滑液、心膜液、腹水、胸水、嚢胞液、胆汁、胃液、腸液、または糞便サンプル）を含み得る。サンプルは、正常細胞または腫瘍細胞が存在し得る全血または血液画分を含み得る。いくつかの実施形態では、サンプル、特に液体サンプルは、無細胞腫瘍ＤＮＡまたは無細胞胎児ＤＮＡもしくは胎児ＲＮＡの腫瘍ＲＮＡを含む無細胞ＤＮＡまたはＲＮＡなどの無細胞材料を含み得る。いくつかの実施形態では、サンプルは、無細胞サンプル、例えば、無細胞腫瘍ＤＮＡもしくは腫瘍ＲＮＡまたは無細胞胎児ＤＮＡもしくは胎児ＲＮＡが存在する無細胞血液由来サンプルである。他の実施形態では、サンプルは、培養サンプル、例えば培養物中の細胞または培養物中に存在する感染因子に由来する核酸を含有するかまたは含有すると疑われる培養物または培養上清である。いくつかの実施形態では、感染性因子は、細菌、原虫、真菌、ウイルスまたはマイコプラズマである。

標的核酸は、サンプル中に存在し得る目的の核酸である。各標的は、その核酸配列によって特徴付けられる。本発明は、１つ以上のＲＮＡまたはＤＮＡ標的の検出を可能にする。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的核酸は、遺伝子または遺伝子断片（エクソンおよびイントロンを含む）または遺伝子間領域であり、ＲＮＡ標的核酸は、標的特異的プライマーがハイブリダイズする転写物または転写物の一部である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、遺伝子バリアントの遺伝子座、例えば一塩基多型もしくはバリアント（ＳＮＶのＳＮＰ）を含む多型、または例えば遺伝子融合をもたらす遺伝子再編成を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、バイオマーカー、すなわち、そのバリアントが疾患または状態に関連する遺伝子を含む。例えば、標的核酸は、２０１５年９月１０日に出願された米国特許出願第１４／７７４，５１８号に記載されている。そのようなパネルは、ＡＶＥＮＩＯ ｃｔＤＮＡ分析キット（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、カリフォルニア州プレザントン）として入手可能である。特に興味深いのは、腫瘍において再編成を受けることが知られている遺伝子である。例えば、ＡＬＫ、ＲＥＴ、ＲＯＳ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３およびＮＴＲＫ１は、融合を受けて異常に活性なキナーゼ表現型をもたらすことが知られている。ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＭＥＴ、ＭＹＣ、ＢＣＬ２およびＢＣＬ６は、コピー数の変化を伴う再編成に関与することが知られている遺伝子である。（Ｌｉら．Ｎａｔｕｒｅ ２０２０，Ｈｉｅｒｏｎｙｍｕｓら．ｅＬｉｆｅ ２０１７）。癌に関連する融合を受けることが知られているか、または予想される遺伝子としては、ＡＬＫ、ＰＰＡＲＧ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＭＥＴ、ＮＲＧ１、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＡＸＬ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＢ、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＲＨＧＡＰ２６、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＰＯＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ４、ＥＲＧ、ＥＳＲ１、ＥＳＲＲＡ、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＷＳＲ１、ＦＧＲ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＮＳＲ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＩＴ、ＭＡＭＬ２、ＭＡＳＴ１、ＭＡＳＴ２、ＭＳＭＢ、ＭＵＳＫ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＵＭＢＬ、ＮＵＴ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＫＮ１、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、ＰＴＫ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＥＬＡ、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＳＹＫ、ＴＥＲＴ、ＴＦＥ３、ＴＦＥＢ、ＴＨＡＤＡ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＳＬＰ、ＴＹ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＣＲ、ＣＡＭＴＡ１、ＣＢＦＢ、ＣＣＮＢ３、ＣＣＮＤ１、ＣＩＣ、ＣＲＦＬ２、ＤＵＳＰ２２、ＥＰＣ１、ＦＯＸＯ１、ＦＵＳ、ＧＬＩ１、ＧＬＩＳ２、ＨＭＧＡ２、ＪＡＺＦ１、ＫＭＴ２Ａ、ＭＡＬＴ１、ＭＥＡＦ６、ＭＥＣＯＭ、ＭＫＬ１、ＭＫＬ２、ＭＴＢ、ＮＣＯＡ２、ＮＵＰ２１４、ＮＵＰ９８、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＢ、ＰＩＣＡＬＭ、ＰＬＡＧ１、ＲＢＭ１５、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ１Ｔ１、ＳＳ１８、ＳＴＡＴ６、ＴＡＦ１５、ＴＡＬ１、ＴＣＦ１２、ＴＣＦ３、ＴＦＧ、ＴＹＫ２、ＵＳＰ６、ＹＷＨＡＥ、ＡＲ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＲＢ８４、ＦＬＴ３、ＫＲＡＳ、ＭＤＭ４、ＭＹＢＬ１、ＮＦ１、ＮＯＴＣＨ４、ＮＵＴＭ１、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＥＮ、ＲＡＤ５１Ｂ、およびＲＢ１が挙げられる。

いくつかの実施形態では、標的核酸はＲＮＡ（ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ウイルスＲＮＡを含む）である。そのような実施形態では、以下でさらに論じるように、逆転写工程が使用される。他の実施形態では、標的核酸は、細胞ＤＮＡを含むＤＮＡ、または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）および無細胞胎児ＤＮＡを含む無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）である。標的核酸は、短い形態または長い形態で存在し得る。いくつかの態様ではて、より長い標的核酸は、以下に記載されるような酵素的処理または物理的処理によって断片化される。いくつかの実施形態では、標的核酸は、天然に断片化されており、例えば、循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または化学的に保存されたもしくは古いサンプルに見られるものなどの化学的に分解されたＤＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、核酸単離の工程を含む。一般に、長い核酸出発材料および短い核酸出発材料は、いずれも本発明の方法における使用に適しているので、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む単離された核酸を生じる任意の核酸抽出方法を使用し得る。ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡは、溶液ベースまたは固相ベースの核酸抽出技術を使用して、組織、細胞、液体生検サンプル（血液または血漿サンプルを含む）から抽出され得る。核酸の抽出は、界面活性剤ベースの細胞溶解、核タンパク質の変性、および場合により汚染物質の除去を含み得る。保存されたサンプルからの核酸の抽出は、脱パラフィン化の工程をさらに含み得る。溶液ベースの核酸抽出方法は、塩析方法または有機溶媒もしくはカオトロープ法を含み得る。固相核酸抽出方法としては、シリカ樹脂法、陰イオン交換法または磁性ガラス粒子および常磁性ビーズ（ＫＡＰＡ Ｐｕｒｅ Ｂｅａｄｓ，Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，Ｃａｌ．）またはＡＭＰｕｒｅビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，Ｃａｌ．）が挙げられ得るが、これらに限定されない。

典型的な抽出方法は、サンプル中に存在する組織材料および細胞の溶解を含む。溶解された細胞から放出された核酸は、溶液中またはカラムまたは膜中に存在する固体支持体（ビーズまたは粒子）に結合し得、核酸は、タンパク質、脂質およびその断片を含む汚染物質をサンプルから除去するために１以上の洗浄工程を受け得る。最後に、結合した核酸を固体支持体、カラムまたは膜から遊離させ、さらなる処理の準備ができるまで適切な緩衝液に保存し得る。ＤＮＡおよびＲＮＡの両者を単離しなければならないので、ヌクレアーゼを使用し得ず、精製工程中にヌクレアーゼ活性を阻害するように注意すべきである

いくつかの実施形態では、核酸の単離は、２０１９年１０月１４日に出願されたＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０７７７１４および２０１８年１１月１３日に出願されたＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８１０４９に記載されているように、エピタコ電気泳動（ｅｐｉｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＥＴＰ）を利用する。ＥＴＰは、核酸が先行する電解質と後続の電解質との間で移動および濃縮する電極の円形配置を有する装置を利用する。円形構成は、装置の中心に収集された非常に小さな体積に核酸を濃縮することを可能にする。ＥＴＰの使用は、大量の少量の無細胞核酸を含む血漿サンプルに特に有利である。

いくつかの実施形態では、インプットＤＮＡまたはインプットＲＮＡは断片化を必要とする。そのような実施形態では、ＲＮＡは、熱および金属イオン、例えばマグネシウムの組み合わせによって断片化され得る。いくつかの実施形態では、サンプルをマグネシウムの存在下で１～６分間８５℃～９４℃に加熱する。（ＫＡＰＡ ＲＮＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐ Ｋｉｔ，ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ）。ＤＮＡは、市販の機器（Ｃｏｖａｒｉｓ，Ｗｏｂｕｒｎ．Ｍａｓｓ．）または酵素的手段（ＫＡＰＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ Ｋｉｔ，ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、物理的手段、例えば超音波処理によって断片化され得。

いくつかの実施形態では、単離された核酸をＤＮＡ修復酵素で処理する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復酵素には、５’－３’ポリメラーゼ活性および３’－５’一本鎖エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ｄｓＤＮＡ分子に５’リン酸を付加するポリヌクレオチドキナーゼ、およびｄｓＤＮＡ分子の３’末端に単一ｄＡ塩基を付加するＤＮＡポリメラーゼが含まれる。末端修復／Ａテーリングキットは、例えば、Ｋａｐａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、ＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ ＰｒｅｐおよびＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｌｕｓを含むキット（マサチューセッツ州ウィルミントンのＫａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．）が利用可能である。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復酵素は、単離された核酸中の損傷塩基を標的とする。いくつかの実施形態では、サンプル核酸は、保存サンプル、例えばホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥＴ）サンプル由来の部分的に損傷したＤＮＡである。塩基の脱アミノ化および酸化は、配列決定工程中に誤った塩基読み取りをもたらし得る。いくつかの実施形態では、損傷したＤＮＡは、ウラシルＮ－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ／ＵＤＧ）および／または８－オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼで処理される。

いくつかの実施形態では、標的核酸はＲＮＡ、例えば、サンプルからのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。この実施形態では、方法が逆転写の予備工程を含む以外は、サンプルからの二本鎖ＤＮＡを含むＤＮＡに関連して記載される方法が使用される。いくつかの実施形態では、逆転写は、ｍＲＮＡに存在すると予想される再編成の部位に隣接するＲＮＡにアニーリングする遺伝子特異的プライマーによって開始される。他の実施形態では、逆転写はポリＴプライマーによって開始される。さらに他の実施形態では、逆転写は、ランダムプライマー、例えばランダムヘキサマープライマーによって開始される。さらに他の実施形態では、逆転写は、ポリＴ配列およびランダム配列を含む組み合わせプライマーによって開始される。

いくつかの実施形態では、本発明は、増幅工程を含む。単離された核酸は、さらなる処理の前に増幅され得る。この工程は、線形または指数関数的増幅を含み得る。増幅は等温であってもよく、または熱サイクリングを含んでもよい。いくつかの態様では、増幅は指数関数的であり、ＰＣＲを伴う。いくつかの実施形態では、遺伝子特異的プライマーが増幅のために使用される。他の実施形態では、ユニバーサルプライマー結合部位は、例えば、ユニバーサルプライマー結合部位を含むアダプターをライゲーションすることによって標的核酸に付加される。全てのアダプター連結核酸は、同じユニバーサルプライマー結合部位を有し、同じプライマーセットで増幅され得る。ユニバーサルプライマーが使用される増幅サイクルの数は少なくてもよいが、後続の工程に必要な生成物の量に応じて、１０、２０、または約３０以上の高いサイクルであってもよい。ユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲは配列バイアスが低減されているので、増幅バイアスを回避するために増幅サイクルの数を限定する必要はない。

いくつかの実施形態では、本発明は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを利用する増幅工程を含む。フォワードプライマーおよびリバースプライマーの一方または両者は、標的特異的であり得る。標的特異的プライマーは、標的核酸に相補的な少なくとも一部を含む。バーコードまたは第２のプライマー結合部位などのさらなる配列が存在する場合、それらは通常はプライマーの５’部分に位置する。標的は、遺伝子配列（コードまたは非コード）またはＲＮＡ中に存在する調節配列、例えばエンハンサーまたはプロモーターであり得る。標的はまた、遺伝子間配列であり得る。

いくつかの実施形態では、増幅は、再編成特異的工程ではなく、再編成特異的増幅の出発物質または最終生成物の量を増加させる（増幅する）役割を果たす。そのような実施形態では、増幅プライマーは、標的特異的であるが、再編成特異的ではない。例えば、プライマーはユニバーサルであり、例えば、ユニバーサルプライマー結合部位が核酸に導入されている限り、標的配列にかかわらずサンプル中の全ての核酸を増幅し得る。ユニバーサルプライマーは、プライマーの５’領域にユニバーサルプライマー結合部位を有するプライマーを伸長することによって、またはユニバーサルプライマー結合部位を含むアダプターを連結することによって、サンプル中の核酸に付加されたユニバーサルプライマー結合部位にアニールする。

本発明の文脈において、再編成特異的標的特異的プライマーは、以下にさらに記載されるように、ゲノム再編成のブレークポイントの近くに配置される。指数関数的増幅が起こるためには、プライマーは、互いに適切な距離に配置されなければならず、対向していなければならず、例えば、３’末端が互いに対向しており、フォワードプライマー結合部位とリバースプライマー結合部位との間の配列をコピーするように伸長し得る標的核酸の対向鎖にハイブリダイズしなければならない。フォワードプライマーとリバースプライマーとの間の距離が２０００塩基を超える場合、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による指数関数的増幅は効率的ではない。さらに、プライマー間の距離がサンプル中のＤＮＡ分子の平均サイズを超える場合（例えば、約１７５ｂｐがｃｆＤＮＡ分子の典型的なサイズである）、指数関数的増幅は成功しない。本発明の文脈において、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、標的配列中のゲノム再編成の存在下でのみ効率的な指数関数的増幅が起こるように設計される。予測されるゲノム再編成が存在しない場合、増幅は起こらないか、または検出レベルを下回り、または効率的な増幅のシグナルと明確に区別可能なシグナルを生成するように非効率的である。

いくつかの実施形態では、プライマーはタイル状である。ただ１つのフォワードプライマーおよび１つのリバースプライマーの代わりに、タンデムに配置された一連のフォワードプライマーおよびタンデムに配置された一連のリバースプライマーが使用される。いくつかの実施形態では、単一のフォワードプライマーは、一連のタイル状リバースプライマーと対になる。他の実施形態では、単一のリバースプライマーは、一連のタイル状フォワードプライマーと対になる。さらに他の実施形態では、一連のタイル状のリバースプライマーは、一連のタイル状のフォワードプライマーと対になる。（図１、２または３）。タイル状のプライマー構成は、ブレークポイントの正確な位置が知られていない場合に特に有利である。例えば、いくつかの遺伝子（ＡＬＫ、ＲＯＳおよびＮＴＲＫ１）は、それぞれが遺伝子配列内に異なるブレークポイントを有する様々な融合事象に関与することが知られている。

いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の再編成特異的核酸が濃縮された核酸のライブラリーである。ライブラリーは、本明細書に記載のアダプター配列に隣接する二本鎖核酸分子を含む。ライブラリーは、本明細書に記載のアダプター配列に隣接する二本鎖核酸分子を含む。ライブラリー核酸は、本明細書中下記で記載されるようなアダプター配列中に存在するバーコードおよびユニバーサルプライマー結合部位などのエレメントを含み得る。いくつかの実施形態では、追加のエレメントは、アダプター中に存在し、アダプターライゲーションを介してライブラリー核酸に付加される。他の実施形態では、追加の要素の一部または全部が増幅プライマー中に存在し、プライマーの伸長によるアダプターライゲーションの前にライブラリー核酸に添加される。配列決定される核酸のライブラリーに追加のエレメントを導入するためのアダプターおよび増幅プライマーの有用性は、例えば、米国特許第９４７６０９５号、同第９２６０７５３号、同第８８２２１５０号、同第８５６３４７８号、同第７７４１４６３号、同第８１８２９８９号および同第８０５３１９２号に記載されている。

いくつかの実施形態では、ライブラリーは、本明細書に記載の再編成特異的プライマーの使用前にサンプル中の核酸から形成される。この実施形態では、アダプター分子は、サンプル中の全ての核酸に付加される。再編成特異的濃縮は、ライブラリー分子を出発物質として使用する。いくつかの実施形態では、ユニバーサル増幅（アダプターに位置するプライマー結合部位にハイブリダイズするユニバーサルプライマーを用いる）は、再編成特異的増幅または濃縮の前に行われる。ユニバーサル増幅は、再編成特異的増幅または濃縮のための出発物質の量を増加させる。

他の実施形態では、ライブラリーは、本明細書に記載のように行われた再編成特異的濃縮の産物から形成される。この実施形態の変形では、アダプター配列は、アダプターのライゲーションによって、またはアダプター配列が再編成特異的プライマーの５’部分に存在することによって、再編成特異的濃縮の産物に付加される。いくつかの実施形態では、再編成特異的プライマーを用いた再編成特異的増幅の後に、ユニバーサルプライマーを用いたユニバーサル増幅が続く。

いくつかの実施形態では、本発明は、アダプター核酸を利用する。アダプターは、平滑末端ライゲーションまたは凝粘着末端ライゲーションによって核酸に付加され得る。いくつかの実施形態では、アダプターは、一本鎖ライゲーション法によって付加され得る。いくつかの実施形態では、アダプター分子は、インビトロ合成人工配列である。他の実施形態では、アダプター分子は、インビトロ合成天然配列である。さらに他の実施形態では、アダプター分子は、分離した天然分子または分離した非天然分子である。

ライゲーションによって付加されたアダプターの場合、アダプターオリゴヌクレオチドは、標的核酸にライゲーションされる末端にオーバーハングまたは平滑末端を有し得る。いくつかの実施形態では、アダプターは、標的核酸の平滑末端ライゲーションを適用し得る平滑末端を含む。標的核酸は、平滑末端化され得るか、または酵素処理によって平滑末端化され得る（例えば、「エンドリペア」）。他の実施形態では、平滑末端ＤＮＡは、単一のＡヌクレオチドが一方または両方の平滑末端の３’末端に付加されるＡテーリングを受ける。本明細書中に記載されるアダプターは、核酸とアダプターとの間のライゲーションを容易にするために平滑末端から伸長する単一のＴヌクレオチドを有するように作製されている。アダプターライゲーションを行うための市販のキットとしては、ＡＶＥＮＩＯ ｃｔＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ ＫｉｔまたはＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐ ａｎｄ ＨｙｐｅｒＰｌｕｓ ｋｉｔｓ（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，カリフォルニア州プレザントン）が挙げられるいくつかの実施形態では、アダプター連結ＤＮＡは、過剰なアダプターおよび非連結ＤＮＡから分離され得る。

アダプターは、ユニバーサルプライマー結合部位（配列決定プライマー結合部位を含む）、バーコード配列（サンプルバーコード（ＳＩＤ）またはユニーク分子バーコードまたは識別子（ＵＩＤまたはＵＭＩ）を含む）などの特徴をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、アダプターは上記の特徴の全てを含むが、他の実施形態では、アダプターライゲーション後に上記の要素のいくつかを含有するテール付きプライマーを伸長することによって、特徴のいくつかが追加される。

アダプターは、捕捉部分をさらに含み得る。捕捉部分は、別の捕捉分子と特異的に相互作用し得る任意の部分であり得る。捕捉部分－捕捉分子対としては、アビジン（ストレプトアビジン）－ビオチン、抗原－抗体、磁性（常磁性）粒子－磁石、またはオリゴヌクレオチド－相補的オリゴヌクレオチドが挙げられる。捕捉分子は、捕捉部分が存在する任意の核酸が固体支持体上に捕捉され、サンプルまたは反応混合物の残りから分離されるように、固体支持体に結合し得る。いくつかの実施形態では、捕捉分子は、二次捕捉分子の捕捉部分を含む。例えば、アダプター中の捕捉部分は、捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列であり得る。捕捉オリゴヌクレオチドは、適応核酸－捕捉オリゴヌクレオチドハイブリッドがストレプトアビジンビーズ上に捕捉され得るようにビオチン化され得る。

いくつかの実施形態では、捕捉部分を捕捉し、サンプル中の非ライゲーション核酸からアダプター連結標的核酸を分離することによって、アダプター連結核酸を濃縮する。

いくつかの実施形態では、アダプターのステム部分は、捕捉オリゴヌクレオチド、例えば５－メチルシトシン、２，６－ジアミノプリン、５－ヒドロキシブチン－２’－デオキシウリジン、８－アザ－７－デアザグアノシン、リボヌクレオチド、２’Ｏ－メチルリボヌクレオチドまたはロックされた核酸の融解温度を上昇させる修飾ヌクレオチドを含む。別の態様では、捕捉オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼによる消化、例えばホスホロチオエートヌクレオチドによる消化を阻害するように修飾されている。

いくつかの実施形態では、本発明はバーコードを利用する。個々の分子を検出するには、通常、米国特許第７，３９３，６６５号、第８，１６８，３８５号、第８，４８１，２９２号、第８，６８５，６７８号および第８，７２２，３６８号に記載されているような分子バーコードが必要である。固有の分子バーコードは、典型的にはインビトロ操作の最も早い工程中に患者のサンプル中の各分子に付加される短い人工配列である。該バーコードは分子およびその後代を標識する。固有の分子バーコード（ＵＩＤ）には複数の用途がある。バーコードは、生検なしで癌を検出および監視するために、サンプル中の個々の核酸分子を追跡して、例えば患者の血液中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）分子の存在および量を評価することを可能にする（Ｎｅｗｍａｎ，Ａ．，ら，（２０１４）Ａｎ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ ｐａｔｉｅｎｔ ｃｏｖｅｒａｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３５１９）。

バーコードは、サンプルが混合（多重化）されるサンプルの源を同定するために使用される多重サンプルＩＤ（ＭＩＤ）であってもよい。バーコードはまた、各元の分子およびその後代を同定するために使用される固有分子ＩＤ（ＵＩＤ）としても機能する。バーコードはまた、ＵＩＤとＭＩＤとの組合せであってもよい。いくつかの実施形態では、単一のバーコードが、ＵＩＤおよびＭＩＤの両方として使用される。いくつかの実施形態では、各バーコードは、所定の配列を含む。他の実施形態では、バーコードは、ランダム配列を含む。本発明のいくつかの実施形態では、バーコードは、それぞれが異なる対の同一のバーコードを有する９６個～３８４個の異なるアダプターがヒトゲノムサンプルに付加されるように、約４～２０塩基長である。当業者は、バーコードの数がサンプルの複雑さ（すなわち、固有の標的分子の予想数）に依存し、各実験に適した数のバーコードを作成し得ることを認識するであろう。

固有の分子バーコードは、分子計数および配列決定のエラー訂正にも使用し得る。単一の標的分子の後代全体が同じバーコードを用いて標識され、バーコードを付されたファミリーを形成する。バーコードを付されたファミリーの全メンバーによって共有されていない配列の変動は、人工産物であって真の突然変異ではないとして廃棄される。バーコードは、ファミリー全体が元のサンプル中の単一分子を表すので、位置重複排除および標的定量にも使用し得る（Ｎｅｗｍａｎ，Ａ．，ら．，（２０１６）Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｄｉｇｉｔａｌ ｅｒｒｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４：５４７）。

いくつかの実施形態では、複数のアダプターまたはバーコード含有プライマー中のＵＩＤの数は、複数の核酸中の核酸の数を超え得る。いくつかの実施形態では、複数の核酸中の核酸の数は、複数のアダプター中のＵＩＤの数を超える。

いくつかの実施形態では、本発明は中間精製工程を含む。例えば、過剰なプライマーおよび過剰なアダプターなどの任意の未使用のオリゴヌクレオチドを、例えば、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーから選択されるサイズ選択方法によって除去する。いくつかの実施形態では、サイズ選択は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｂｒｅａ，Ｃａｌ．）製の固相可逆固定（ＳＰＲＩ）技術を使用して実施し得る。いくつかの実施形態では、捕捉部分を使用して、アダプター連結核酸を捕捉し、非連結核酸または過剰プライマーから指数関数的増幅の産物から分離する。

本発明は、フォワードプライマーとリバースプライマーの対を使用してサンプル中のゲノム再編成を検出する方法である。この方法は、サンプル中の２つ以上のタイプのゲノム再編成を含む２つ以上のゲノム再編成についてサンプルを同時に調べることを含む。

図１を参照すると、本発明は、フォワードオリゴヌクレオチドプライマーとリバースオリゴヌクレオチドプライマーとの１以上の対を利用し、プライマーの配向または近接は、再編成が存在する場合には介在配列の増幅が可能であるが、再編成が存在しない場合には増幅が可能でない。

図２を参照すると、再編成は遺伝子融合である。参照ゲノム配列を示すパネルＡでは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは正しい向きで反対鎖にアニーリングしているが、互いに近接していない（同じ染色体上で遠すぎるか、または異なる染色体上にある）。再編成されたゲノム配列では、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、正しい向きで互いに近接している部位にアニールし、したがって介在配列の増幅が可能になる。参照ゲノム配列を示すパネルＢでは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは反対鎖にアニーリングしているが、向きは正しくなく、互いに近接していてもいなくてもよい。再編成されたゲノム配列では、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、正しい向きで互いに近接している部位にアニールし、したがって介在配列の増幅が可能になる。参照ゲノム配列を示すパネルＣでは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは同じ（＋）鎖にアニーリングしており、互いに近接していてもしていなくてもよい。再編成されたゲノム配列では、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、正しい向きで互いに近接して反対鎖上にある部位にアニールし、したがって介在配列の増幅が可能になる。参照ゲノム配列を示すパネルＤでは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは同じ（－）鎖をアニーリングしており、互いに近接していてもしていなくてもよい。再編成されたゲノム配列では、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、正しい向きで互いに近接して反対鎖上にある部位にアニールし、したがって介在配列の増幅が可能になる。

いくつかの実施形態では、（例えば、ＡＬＫ、ＲＯＳまたはＮＴＲＫ１遺伝子の融合物）、正確な融合パートナーは知られていない。これらの場合、プライマーまたは一連のタイル状のプライマーは、複数の融合候補にハイブリダイズするように設計されている。遺伝子融合に実際に関与する融合候補にハイブリダイズするプライマーのみが、融合ブレークポイント配列の増幅を可能にする。他の融合候補にアニーリングするプライマーはいずれもアンプリコンを生じない。

図３を参照すると、再編成は欠失である。参照ゲノム配列を示す図３では、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは正しい向きで反対鎖にアニーリングしているが、互いに近接していない。再編成されたゲノム配列において、欠失により、介在配列の増幅が可能になるため、フォワードプライマーおよびリバースプライマー部位が互いに近接する。この実施形態では、対照フォワードプライマーおよびリバースプライマーの対を使用し得る。対照フォワードプライマーおよび対照リバースプライマーの対の少なくとも一方は、再編成されたゲノムの欠失領域内にある参照ゲノムの部位にアニーリングする。介在配列の増幅は、参照ゲノムでは可能であるが、再編成ゲノムでは可能ではない。いくつかの実施形態では、対照フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、欠失または増幅などのコピー数の変化に関与する可能性が低いゲノムの部位にアニーリングする。

特に、図３に示す方法は、様々なサイズの欠失を検出するのに適している。欠失した領域のサイズを考慮し、プライマーは、介在配列の増幅を可能にするために参照ゲノムにおいて遠すぎるように配置される。

図４を参照すると、再編成は、重複またはより高次の遺伝子増幅である。図４の上段には、参照ゲノム配列を示すが、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、反対鎖にアニーリングしているが、向きが正しくない。再編成されたゲノム（図４下段）において、タンデム重複（またはより高レベルの増幅）事象は、少なくとも１対のフォワードプライマー部位およびリバースプライマー部位を正しい向きにして、介在配列の増幅を可能にする。特に、図４に示す方法は、様々なサイズの重複を検出するのに適している。予想される重複（またはより高レベルの増幅）のサイズを考慮し、プライマーは、再編成の非存在下では、それらが誤った向きにあり、ＰＣＲによる増幅を可能にするには遠すぎるが、遺伝子重複（またはより高レベルの増幅）の存在下では、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの少なくとも１つの対が正しい向きにあり、増幅を可能にするのに十分に近接しているように配置される。

この方法はさらに、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの再編成特異的な対を用いた指数関数的増幅の後、増幅された核酸のライブラリーを形成し、そのライブラリー中の核酸を配列決定し、それによってサンプル中の１つ以上のゲノム再編成を検出することを含む。

いくつかの実施形態では、本方法は多重化されており、これは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの再編成特異的な対が、図２、図３および図４に示されるように配置された複数のプライマー対を含むことを意味する。複数のプライマー対は、１つ以上の遺伝子融合を検出する１つ以上の対、１つ以上の遺伝子欠失を検出する１つ以上の対、および１つ以上の遺伝子増幅を検出する１つ以上の対を含む。例えば、同じ反応混合物は、ＡＬＫ、ＰＰＡＲＧ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＭＥＴ、ＮＲＧ１、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＮＴＲＫ３、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＡＸＬ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＢ、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＲＨＧＡＰ２６、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ１Ｒ、ＥＰＯＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ４、ＥＲＧ、ＥＳＲ１、ＥＳＲＲＡ、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＷＳＲ１、ＦＧＲ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＮＳＲ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＩＴ、ＭＡＭＬ２、ＭＡＳＴ１、ＭＡＳＴ２、ＭＳＭＢ、ＭＵＳＫ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＵＭＢＬ、ＮＵＴ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＫＮ１、ＰＲＫＣＡ、ＰＲＫＣＢ、ＰＴＫ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＥＬＡ、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＳＹＫ、ＴＥＲＴ、ＴＦＥ３、ＴＦＥＢ、ＴＨＡＤＡ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＳＬＰ、ＴＹ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＣＲ、ＣＡＭＴＡ１、ＣＢＦＢ、ＣＣＮＢ３、ＣＣＮＤ１、ＣＩＣ、ＣＲＦＬ２、ＤＵＳＰ２２、ＥＰＣ１、ＦＯＸＯ１、ＦＵＳ、ＧＬＩ１、ＧＬＩＳ２、ＨＭＧＡ２、ＪＡＺＦ１、ＫＭＴ２Ａ、ＭＡＬＴ１、ＭＥＡＦ６、ＭＥＣＯＭ、ＭＫＬ１、ＭＫＬ２、ＭＴＢ、ＮＣＯＡ２、ＮＵＰ２１４、ＮＵＰ９８、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＢ、ＰＩＣＡＬＭ、ＰＬＡＧ１、ＲＢＭ１５、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ１Ｔ１、ＳＳ１８、ＳＴＡＴ６、ＴＡＦ１５、ＴＡＬ１、ＴＣＦ１２、ＴＣＦ３、ＴＦＧ、ＴＹＫ２、ＵＳＰ６、ＹＷＨＡＥ、ＡＲ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＲＢ８４、ＦＬＴ３、ＫＲＡＳ、ＭＤＭ４、ＭＹＢＬ１、ＮＦ１、ＮＯＴＣＨ４、ＮＵＴＭ１、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＥＮ、ＲＡＤ５１Ｂ、およびＲＢ１のそれぞれが関与する融合体を標的とするプライマー対を含んでいてもよい。

いくつかの実施形態では、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、短いインプット核酸に適応するように設計されている。例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む無細胞ＤＮＡは、平均１７５ｂｐ長である。フォワードプライマーおよびリバースプライマーまたは一連のタイル状のフォワードプライマーおよび一連のタイル状リバースプライマーは、最も内側の３’末端の間に約５０塩基以下を有するように配置される。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライマー伸長標的濃縮（ＰＥＴＥ）法によってゲノム再編成を含有する配列を濃縮する方法である。ＰＥＴＥの複数のバージョンが開示されている。米国特許出願第１４／９１０，２３７号、第１５／２２８，８０６号、第１５／６４８，１４６号および国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８５７２７号を参照されたい。簡単に説明すると、プライマー伸長標的濃縮（ＰＥＴＥ）は、捕捉部分を含む第１の標的特異的プライマーで核酸を捕捉し、捕捉部分を捕捉し、それによって標的核酸を濃縮することを含む。任意のさらなる標的特異的プライマーまたはアダプター特異的プライマーは、濃縮された標的核酸にハイブリダイズする。他の実施形態では、ＰＥＴＥは、捕捉部分を含む第１のプライマーをハイブリダイズおよび伸長することによって核酸を捕捉し、捕捉部分を捕捉し、それによって標的核酸を濃縮し、次いで、捕捉された核酸にハイブリダイズする際に、第２の標的特異的プライマーを伸長し、それによって第１の標的特異的プライマーの伸長産物を置換し、第２のプライマー伸長産物にハイブリダイズしたさらなる濃縮された標的核酸を保持することを含む。

図５を参照すると、本発明の一実施形態はＰＥＴＥを利用する。この方法は、ゲノム再編成（Ｒ）の片側にハイブリダイズする第１の標的特異的プライマーをサンプル中の核酸にハイブリダイズさせることを含む。（図５、工程１）第１のプライマーは、捕捉部分、例えばビオチンを含む。次に、第１のプライマーを伸長させ、捕捉部分を介してハイブリダイズした第１のプライマー伸長産物（またはそれより前に、ハイブリダイズした第１のプライマー）を捕捉する。第１のプライマー伸長産物は、再編成（Ｒ）の部位に及ぶ（図５、工程２）。

第１のプライマー上の捕捉部分は、捕捉配列、リガンドが利用可能な化学的部分（例えば、ビオチン）または抗体が利用可能な抗原から選択され得る。捕捉配列は、第１のプライマーの５’部分に位置し得る。これは、捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な配列である。捕捉を改善するために、捕捉オリゴヌクレオチドは、捕捉オリゴヌクレオチドと第１のプライマー中の捕捉配列との間のハイブリッドの融解温度を上昇させる修飾ヌクレオチドを含み得る。修飾ヌクレオチドは、５－メチルシトシン、２，６－ジアミノプリン、５－ヒドロキシブチン－２’オキシウリジン、８－アザ－７－デアザグアノシン、リボヌクレオチド、２’Ｏ－メチルリボヌクレオチドおよびロックド核酸から選択される。

第１のプライマー伸長複合体が固体支持体上に形成されるように第１のオリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズさせる前に、捕捉部分を介して固体支持体、例えば磁性ポリマーコーティング粒子に第１のプライマーを結合した。

次に、第２の標的特異的プライマーは、第１のプライマーとゲノム再編成の同じ側の標的核酸の同じ鎖にハイブリダイズする。（図５、工程３）第２のプライマーは、核酸バーコードまたはユニバーサルプライマー結合部位などの任意の他の補助配列を含み得る。第２のプライマーは伸長され、それによって第２のプライマー伸長複合体が生成され、第１のプライマー伸長産物が置換される。第２のプライマー伸長産物はまた、再編成（Ｒ）の部位に及んでいる（図５、工程４）。次に、第３のプライマーが、ゲノム再編成の反対側の第２のプライマー伸長産物にハイブリダイズする（図５、工程５）。第３のプライマーは、再編成されたゲノムにおいて指数関数的増幅に適しているが参照ゲノムにおいては適していない位置にハイブリダイズするように、本開示に従って設計される。ゲノム再編成が存在する場合、第３のプライマーおよび第２のプライマーは、再編成部位を含む配列の指数関数的増幅を指示する（図５、工程６）。いくつかの実施形態では、第２のプライマーの代わりに、第２のプライマー伸長産物にハイブリダイズする、第２のプライマーと再編成の同じ側の等価なプライマーが使用される。

いくつかの実施形態では、標的濃縮工程によって得られた増幅された再編成特異的核酸を配列決定して、再編成の配列を決定または確認する。

本明細書に記載のように形成された核酸および核酸のライブラリーまたはそのアンプリコンは、核酸配列決定に供し得る。塩基配列決定は、当技術分野で公知のいずれかの方法によって行い得る。特に有利なのは、ナノ細孔を利用するハイスループット単分子配列決定方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように形成された核酸および核酸のライブラリーは、生物学的ナノポア（米国特許第１０３３７０６０号）または固体ナノポアを貫通することを含む方法（米国特許第１０２８８５９９号、米国特許第２０１８００３８００１号、米国特許第１０３６４５０７号）によって配列決定される。他の実施形態では、配列決定は、タグをナノポアに通すことを含む。（米国特許第８４６１８５４号）またはナノ細孔を利用する任意の他の現在存在するまたは将来のＤＮＡ配列決定技術。

ハイスループット単一分子配列決定の他の適切な技術としては：Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，サンディエゴ、カリフォルニア州）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔプラットフォーム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，グランドアイランド、ニューヨーク州）、Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ（ＳＭＲＴ）技術を利用するＰａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓプラットフォーム（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、メンローパーク、カリフォルニア州）、またはＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（オックスフォード、英国）もしくはＲｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（サンタクララカリフォルニア州）によって製造されたものなどのナノポア技術を利用するプラットフォーム、および合成による配列決定を伴うまたは伴わない任意の他の現在存在するまたは将来のＤＮＡ配列決定技術が挙げられる。配列決定工程は、プラットフォーム特異的配列決定プライマーを利用し得る。これらのプライマーの結合部位は、増幅工程で使用される増幅プライマーの５’部分に導入され得る。プライマー部位がバーコード化分子のライブラリーに存在しない場合、そのような結合部位を導入する追加の短い増幅工程を実施し得る。いくつかの実施形態では、配列決定工程は配列解析を伴う。いくつかの実施形態では、解析は、配列アラインメントの工程を含む。いくつかの実施形態では、整列化を使用して、複数の配列、例えば、同じバーコード（ＵＩＤ）を有する複数の配列からコンセンサス配列を決定する。いくつかの実施形態では、バーコード（ＵＩＤ）は、全てが同一のバーコード（ＵＩＤ）を有する複数の配列からコンセンサスを決定するために使用される。他の実施形態では、バーコード（ＵＩＤ）は、人工産物、すなわち、同一のバーコード（ＵＩＤ）を有する、一部だが全てではない配列において存在する変化物を除去するために使用される。ＰＣＲエラーまたはシーケンシングエラーから生じるこのような人工物は、除去され得る。

いくつかの実施形態では、サンプル中の各配列の数は、サンプル中の各バーコード（ＵＩＤ）を有する配列の相対数を定量することによって定量し得る。各ＵＩＤは、元のサンプル中の単一の分子であり、各配列バリアントと会合した異なるＵＩＤを計数することによって、元のサンプル中の各配列の分率を決定し得る。当業者は、コンセンサス配列を決定するために必要な配列読出しの数を決定し得る。いくつかの実施形態では、関連する数は、正確な定量結果のために必要なＵＩＤ（「配列深度（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｐｔｈ）」）当たりの読出しである。いくつかの実施形態では、所望の深度は、ＵＩＤ当たり５～５０読出しである。

いくつかの実施形態では、配列決定の工程は、コンセンサス決定によるエラー訂正の工程をさらに含む。本明細書に開示されるギャップのある環状鋳型の環状鎖の合成による配列決定により、反復または反復配列決定が可能になる。同じヌクレオチド位置の複数の読み取りにより、各ヌクレオチドまたは配列全体または配列の一部に対するコンセンサスコールの確立を通じて配列決定エラー訂正が可能になる。核酸鎖の最終配列は、各位置でのコンセンサス塩基決定から得られる。いくつかの実施形態では、核酸のコンセンサス配列は、相補鎖の配列を比較することによって、または相補鎖のコンセンサス配列を比較することによって得られるコンセンサスから得られる。いくつかの実施形態では、本発明は、配列決定工程の後に、配列読み取りアラインメントの工程およびコンセンサス配列を生成する工程を含む。いくつかの実施形態では、コンセンサスは、米国特許第８５３５８８２号に記載されている単純多数コンセンサスである。他の実施形態では、コンセンサスは、以下のＬｅｅらに記載されているパーシャルオーダーアラインメント（Ｐａｒｔｉａｌ Ｏｒｄｅｒ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）（ＰＯＡ）法Ｌｅｅら（２００２）’’Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ｐａｒｔｉａｌ ｏｒｄｅｒ ｇｒａｐｈｓ，’’Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１８（３）：４５２－４６４、ならびにＰａｒｋｅｒおよびＬｅｅ（２００３）’’Ｐａｉｒｗｉｓｅ ｐａｒｔｉａｌ ｏｒｄｅｒ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｓ ａ ｓｕｐｅｒｇｒａｐｈ ｐｒｏｂｌｅｍ－ａｌｉｇｎｉｎｇ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ，’’Ｊ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌ．，１１：１－１８により決定される。コンセンサス配列を決定するために使用される反復読み取りの数に基づいて、配列は、ほとんど誤りがないか、または実質的に誤りがない場合がある。

いくつかの実施形態では、本発明に従って形成された再編成特異的アンプリコンおよび任意の対照アンプリコンは、配列決定せずに検出される。アンプリコンは、エンドポイントＰＣＲ、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）またはデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を含むデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）によって検出され得る。いくつかの態様では、ゲノム再編成の検出は、ｑＰＣＲおよびｄＰＣＲによって可能にされる検出のタイプなど、定量的である。他の実施形態では、ゲノム再編成の検出は定性的であり、すなわち、読出しは、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動における再編成特異的増幅産物の有無である。

いくつかの実施形態では、本発明による再編成特異的増幅は、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を含むデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）によって行われる。

デジタルＰＣＲは、例えば、米国特許第９，３４７，０９５号に記載されている核酸の定量的増幅の方法である。このプロセスは、各体積が１コピー以下の標的核酸を含むようにサンプルを反応体積に分割することを含む。各分配は、増幅プライマー、すなわち指数関数的増幅をサポートし得るフォワードプライマーおよびリバースプライマーをさらに含む。いくつかの実施形態では、分配された反応体積は、水性液滴である。

本発明の文脈において、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの第１のプライマーはゲノム再編成の一方の側でハイブリダイズし得、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの第２のプライマーは、第１のプライマーに対してゲノム再編成の反対側の反対鎖にハイブリダイズし得、再編成されたゲノムにおいて第１のプライマーに隣接するが、参照ゲノムにおいては隣接しない。

デジタルＰＣＲ反応体積の各々は、第１および第２のプライマーのアンプリコンにハイブリダイズし得る検出可能に標識されたプローブをさらに含む。検出可能に標識されたプローブは、フルオロフォアの組み合わせで標識されていてもよく、指数関数的増幅は、５’－３’－エキソヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを用いて行われ得る。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、第１および第２のプライマーを用いて増幅反応を実施することを含み、ここで、反応は、プローブを用いてアンプリコンを検出する工程、およびプローブが検出された反応体積の数を決定し、それによってサンプル中のゲノム再編成の存在を検出する工程を含む。

いくつかの実施形態では、反応体積は、第１のプライマーとは反対の鎖にハイブリダイズし得、参照ゲノム内では第１のプライマーに隣接するが再編成ゲノム内ではハイブリダイズしない第３のプライマーと、第１および第３のプライマーのアンプリコンにハイブリダイズし得るが、第１および第２のプライマーのアンプリコンにハイブリダイズしない第２の検出可能に標識されたプローブとをさらに含む。第２のプローブは、第１および第２のプライマーのアンプリコンにハイブリダイズするプローブ（第１のプローブ）とは異なる。そのような実施形態では、本方法は、第２のプローブが検出された反応体積の数に対する、第１のプローブが検出された反応体積の比を決定し、それにより、ゲノム再編成の頻度を検出する工程をさらに含む。

Claims (15)

1. サンプル中のゲノム再編成を検出する方法であって、
   ゲノム由来の核酸を含有するサンプルを、フォワードオリゴヌクレオチドプライマーとリバースオリゴヌクレオチドプライマーとの１つ以上の対と接触させる工程であって、ここで、参照ゲノム中では前記プライマーに対する結合部位が隣接していないかまたは内向きでなく、ゲノム再編成を含むゲノム中では前記プライマーに対する結合部位の位置が、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーを用いて前記再編成を含む前記核酸を指数関数的に増幅できるように、隣接していて内向きである、前記工程、ならびに
   前記再編成を含む前記核酸を指数関数的に増幅し、それによって前記再編成を検出する工程
   を含む、方法。
2. 増幅された前記核酸を配列決定し、それによって前記再編成を検出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 細胞ゲノムＤＮＡ内で、隣接する塩基対の間隔が２０００未満である、請求項１に記載の方法。
4. 無細胞ＤＮＡ内で、隣接する塩基対の間隔が１７５未満である、請求項１に記載の方法。
5. 前記ゲノム再編成が遺伝子融合であり、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーに対する前記結合部位が、参照ゲノム中では異なる染色体上に位置するが、前記遺伝子融合を含む前記ゲノム中では同じ染色体上に位置する、請求項１に記載の方法。
6. 前記ゲノム再編成が欠失であり、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーに対する前記結合部位が、参照ゲノム中ではｘ塩基対よりも離れて位置するが、前記欠失を含むゲノム中ではｘ塩基対未満離れて位置する、請求項１に記載の方法。
7. 前記ゲノム再編成によりブレークポイント配列が作成され、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーに対する前記結合部位の１つが前記ブレークポイント配列に及ぶ、請求項１に記載の方法。
8. 前記ゲノム再編成が増幅であり、前記フォワードプライマー結合部位のコピーの少なくとも１つ、および前記リバースプライマー結合部位のコピーの１つが、前記増幅を含むゲノム中で内向きである、請求項１に記載の方法。
9. １種以上のゲノム再編成についてサンプルを同時に調べる方法であって、
   （ａ）ゲノム由来の核酸を含有するサンプルを、フォワードオリゴヌクレオチドプライマーとリバースオリゴヌクレオチドプライマーとの１つ以上の対と接触させる工程であって、ここで、参照ゲノム中では前記プライマーに対する結合部位が隣接していないかまたは内向きでなく、ゲノム再編成を含むゲノム中では前記プライマーに対する結合部位の位置が、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーを用いて前記再編成を含む前記核酸を指数関数的に増幅できるように、隣接していて内向きである、前記工程；
   （ｂ）前記再編成を含む前記核酸を指数関数的に増幅する工程；
   （ｃ）増幅された核酸のライブラリーを形成する工程；
   （ｄ）前記ライブラリー中の前記核酸を配列決定し、それにより前記サンプル中の１つ以上のゲノム再編成を検出する工程
   を含む、方法。
10. 工程（ｄ）からの配列決定読み取りを前記参照ゲノムとアライメントさせて、前記ゲノム再編成のゲノム供給源を決定する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
11. フォワードオリゴヌクレオチドプライマーとリバースオリゴヌクレオチドプライマーとの１つ以上の対が、
    （ａ）フォワードプライマーとリバースプライマーとの少なくとも１対について、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーの前記結合位置が、参照ゲノム中では異なる染色体上に位置するが、遺伝子融合を含むゲノム中では同じ染色体上に位置すること；
    （ｂ）フォワードプライマーとリバースプライマーとの少なくとも１対について、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーの前記結合部位の１つが、ゲノム再編成のブレークポイント配列に及ぶこと；ならびに
    （ｃ）フォワードプライマーとリバースプライマーとの少なくとも１対について、前記フォワードプライマー結合部位のコピーの１つおよび前記リバースプライマー結合部位のコピーの１つが、遺伝子増幅を含むゲノムにおいて内向きであること、
    を含む、請求項９に記載の方法。
12. サンプル中のゲノム再編成を検出する方法であって、
    （ａ）少なくとも１つのアダプターを含む核酸のライブラリーを形成する工程；
    （ｂ）プライマー対の第１のプライマーをライブラリー核酸にハイブリダイズさせる工程であって、ここで、前記第１のプライマーがゲノム再編成の一方の側にハイブリダイズし、捕捉部分も含む、前記工程；
    （ｃ）ハイブリダイズした前記第１のプライマーを伸長し、それにより、前記ゲノム再編成の配列を含み、捕捉部分をさらに含む第１のプライマー伸長複合体を生成する工程；
    （ｄ）前記捕捉部分を介して第１のプライマー伸長産物を捕捉する工程；
    （ｅ）捕捉された前記核酸にプライマー対の第２のプライマーをハイブリダイズさせる工程であって、ここで、前記第２のプライマーが、前記第１のプライマーに対して前記ゲノム再編成の反対側で反対鎖にハイブリダイズし、再編成されたゲノム中では前記第１のプライマーに隣接するが、参照ゲノム中では隣接していない、前記工程；
    （ｆ）捕捉され再編成された前記核酸のコピーを形成する工程；
    （ｇ）再編成された前記核酸の前記コピーを配列決定し、それにより、前記ゲノム再編成を検出する工程
    を含む、方法。
13. サンプル中のゲノム再編成を含む配列を濃縮する方法であって、
    （ａ）サンプル中の核酸に第１のプライマーをハイブリダイズさせる工程であって、ここで、前記第１のプライマーがゲノム再編成の一方の側にハイブリダイズし、捕捉部分も含む、前記工程；
    （ｂ）ハイブリダイズした前記第１のプライマーを伸長し、それにより、前記ゲノム再編成の配列を含み、前記捕捉部分をさらに含む第１のプライマー伸長複合体を生成する工程；
    （ｃ）前記捕捉部分を介して第１のプライマー伸長産物を捕捉する工程；
    （ｄ）捕捉された前記核酸に第２のプライマーをハイブリダイズさせる工程であって、ここで、前記第２のプライマーが、再編成されたゲノム中では前記第１のプライマーに対して前記ゲノム再編成の同じ側の同じ鎖にハイブリダイズするが参照ゲノム中では前記第１のプライマーに対して前記ゲノム再編成の同じ側の同じ鎖にはハイブリダイズせず、バーコードも含む、前記工程；
    （ｅ）ハイブリダイズした前記第２のプライマーを伸長し、それによって第２のプライマー伸長複合体を生成し、前記捕捉部分を含む前記第１のプライマー伸長複合体を置換する工程；
    （ｆ）前記第２のプライマー伸長複合体に第３のプライマーをハイブリダイズさせる工程であって、ここで、前記第３のプライマーが、前記第２のプライマーに対して前記ゲノム再編成の反対側の反対鎖にハイブリダイズし、前記再編成されたゲノム中では前記第２のプライマーに隣接するが、前記参照ゲノム中では前記第２のプライマーにハイブリダイズしない、前記工程；
    （ｇ）前記第３のプライマーを伸長させ、それにより、前記再編成の配列を含む二本鎖産物を形成し、それにより、前記ゲノム再編成を濃縮する工程
    を含む、方法。
14. サンプル中のＲＮＡ転写物の構造変異を検出する方法であって、
    （ａ）サンプルから核酸を得る工程；
    （ｂ）ゲノム再編成の部位に隣接して配置された第１のプライマーを用いてＲＮＡ転写物をｃＤＮＡ鎖に逆転写する工程；
    （ｃ）第２のプライマーを前記ｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせる工程であって、ここで、前記第２のプライマーが、前記第１のプライマーに対して前記ゲノム再編成の反対側の反対鎖にハイブリダイズし、再編成されたゲノム中では前記第１のプライマーに隣接するが参照ゲノム中では前記第１のプライマーに隣接せず、再編成されたゲノム配列の指数関数的増幅を可能にするが参照ゲノム配列の指数関数的増幅は可能にしない、前記工程；および
    （ｄ）前記ｃＤＮＡを増幅してアンプリコンを産生し、それによって前記ＲＮＡ転写物中のゲノム再編成を検出する工程を含む、方法。
15. サンプル中の核酸のゲノム再編成を検出する方法であって、
    （ａ）核酸を含むサンプルをゲノムから複数の反応体積に分割する工程であって、ここで、各反応体積が、（ｉ）ゲノム再編成の一方の側にハイブリダイズし得る第１のプライマー、（ｉｉ）前記第１のプライマーに対して前記ゲノム再編成の反対側の反対鎖にハイブリダイズし得、再編成されたゲノム中では前記第１のプライマーに隣接するが、参照ゲノム中では前記第１のプライマーに隣接しない、第２のプライマー、および（ｉｉｉ）前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーのアンプリコンにハイブリダイズし得る検出可能に標識された第１のプローブを含む、前記工程；
    （ｂ）前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーを用いて増幅反応を行う工程であって、ここで、前記反応が、前記プローブを用いる検出工程を含む、前記工程；
    （ｃ）前記第１のプローブが検出された反応体積の数を決定し、それにより、前記ゲノム再編成を検出する工程
    を含む、方法。
    

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