CN116043337A - Dna甲基化标志物筛查试剂盒及方法 - Google Patents

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CN116043337A CN202310064681.7A CN202310064681A CN116043337A CN 116043337 A CN116043337 A CN 116043337A CN 202310064681 A CN202310064681 A CN 202310064681A CN 116043337 A CN116043337 A CN 116043337A
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    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Abstract

本发明涉及DNA甲基化标志物筛查试剂盒及方法。本发明方法包括酶切、甲基化接头连接、甲基化处理和索引引物扩增，其中，使用对甲基化不敏感的限制性内切酶对感兴趣DNA序列进行所述酶切，获得酶切产物，其中，所述酶切产物未经末端修复和补齐而直接与带有甲基化修饰的接头连接，且其中，所述酶切产物包含具有粘性末端的酶切产物和任选的具有平末端的酶切产物。本发明也提供相应的接头序列、索引引物序列、经过优选的试剂、试剂盒以及相关的应用。

Description

DNA甲基化标志物筛查试剂盒及方法
本分案申请是申请号为201910793968.7、申请日为2019年8月27日、发明名称为“DNA甲基化标志物筛查试剂盒及方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及DNA甲基化标志物筛查试剂盒及方法。
背景技术
DNA甲基化主要发生在CpG岛，是重要的表观遗传修饰。已知DNA甲基化参与基因转录调控过程，并与众多生物学过程相关，包括癌症的形成。筛选与生物学过程相关的DNA甲基化标志物的方法包括全基因组重亚硫酸氢盐测序法(WGBS)和简化甲基化测序(RRBS)等。WGBS检测虽然全面，但是成本较高，测序大量非DNA甲基化修饰区域。相比较于WGBS，RRBS能够富集CpG位点，大大减少测序成本。传统的RRBS经酶切富集CpG位点，进行末端补齐，通过TA连接方式加上接头，再进行扩增反应。这一方法的缺点是DNA建库起始用量较大，对启动子区及CpG岛区域CpG位点富集程度低(特别是对于DNA质量较差的FFPE样本)，不同样本之间位点重现性不高。因此需要有CpG位点富集程度更高，样本间重现性更好的甲基化标志物筛查方法。
发明内容
本发明提供一种优化的甲基化标志物筛查方法，该方法对传统检测方法的实验流程进行了优化，使用优选的建库试剂及建库流程。
本发明提供一种构建DNA甲基化文库的方法，所述方法包括酶切、甲基化接头连接、甲基化处理和索引引物扩增，其中，使用对甲基化不敏感的限制性内切酶对感兴趣DNA序列进行所述酶切，获得酶切产物，其中，所述酶切产物未经末端修复和补齐而直接与带有甲基化修饰的接头连接，且其中，所述酶切产物包含具有粘性末端的酶切产物。
在一个或多个实施方案中，所述酶切产物还包括具有平末端的酶切产物。
在一个或多个实施方案中，所述甲基化接头包括具有与酶切产物粘性末端相匹配的粘性末端的甲基化接头。
在一个或多个实施方案中，所述甲基化接头还包括与未经酶切和补齐处理的酶切产物的平末端相匹配的平末端的甲基化接头。
在一个或多个实施方案中，所述对甲基化不敏感的限制性内切酶选自MSP I、HaeIII、BanII、HpyCH4V、AluI、SphI和BssSI中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述甲基化接头连接包括使用5’App DNA/RNA连接酶、T4 RNA连接酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶、T7 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、CircLigase连接酶、电转连接酶、平末端/TA连接酶、瞬时黏性连接酶、HiFi Taq DNA连接酶中的一种或多种将甲基化接头连接到酶切产物。
在一个或多个实施方案中，使用亚硫酸氢盐转化试剂盒进行所述甲基化处理。
在一个或多个实施方案中，使用分别含有与所述甲基化接头中未互补的部分互补的序列的索引引物进行索引引物扩增。
在一个或多个实施方案中，使用选自Phusion U Hot Start DNA聚合酶、PfuTurboCx Hotstart DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和LafU DNA聚合酶中的一种或多种DNA聚合酶进行所述索引引物扩增。
在一个或多个实施方案中，酶切前，使用磁珠或柱纯化方法纯化基因组DNA。
在一个或多个实施方案中，甲基化接头连接之后，加入打断或未打断的载体DNA。
在一个或多个实施方案中，采用琼脂糖凝胶割胶回收方法、配置胶割胶回收方法、磁珠纯化片段筛选方法或Blue Pippin法回收连接产物。
在一个或多个实施方案中，所述方法依次包括：
使用磁珠或柱纯化方法纯化基因组DNA，获得纯化的DNA；
使用选自MSP I、HaeIII、BanII、HpyCH4V、AluI、SphI和BssSI中的一种或多种对所述纯化的DNA进行酶切，获得酶切产物；
对所获得的酶切产物进行甲基化接头连接，其中，使用选自T4 DNA连接酶、TaqDNA连接酶、T7 DNA连接酶和T3 DNA连接酶的一种或多种进行连接，获得连接产物；
采用配置胶割胶回收方法纯化所述连接产物；
使用亚硫酸氢盐转化方法对纯化的连接产物进行甲基化处理；和
使用选自Phusion U Hot Start DNA聚合酶、PfuTurbo Cx Hotstart DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶中的一种或多种DNA聚合酶对经甲基化处理的产物进行索引引物扩增。
在一个或多个实施方案中，所述甲基化接头选自下组甲基化接头序列中的一种或多种：
SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:10形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:12形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:14形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:16形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:18形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:19与SEQ ID NO:20形成的甲基化接头序列。
在一个或多个实施方案中，所述索引引物选自：SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:22，和SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。
本发明还提供一种DNA甲基化文库建库试剂盒，所述试剂盒包含对甲基化不敏感的限制性内切酶，和接头序列产品，该接头序列产品包括具有与未经末端修复和补齐处理的酶切产物的粘性末端相匹配的粘性末端的接头序列。
在一个或多个实施方案中，所述DNA甲基化文库建库试剂盒还包括与具有未经末端修复和补齐处理的酶切产物的平末端相匹配的平末端的接头序列。
在一个或多个实施方案中，所述接头序列产品中，所述具有与未经末端修复和补齐处理的酶切产物的粘性末端相匹配的粘性末端的接头序列的浓度为0.1-1.5μM。
在一个或多个实施方案中，所述DNA甲基化文库建库试剂盒还包括以下试剂中的一种或多种：
(1)含特异索引序列的引物；其中，所述引物包括正向和反向引物，正向和反向引物分别包括分别与所述甲基化接头中未互补的部分互补的序列；
(2)DNA连接酶；和
(3)DNA聚合酶。
在一个或多个实施方案中，所述对甲基化不敏感的限制性内切酶选自MSP I、HaeIII、BanII、HpyCH4V、AluI、SphI和BssSI中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，DNA连接酶选自5’App DNA/RNA连接酶、T4 RNA连接酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶、T7 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、CircLigase连接酶、电转连接酶、平末端/TA连接酶、瞬时黏性连接酶、HiFi Taq DNA连接酶中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述DNA聚合酶选自Phusion U Hot Start DNA聚合酶、PfuTurbo Cx Hotstart DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和LafU DNA聚合酶中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括以下试剂中的一种或多种：
(a)进行酶切所需的试剂；
(b)进行甲基化接头的连接所需的试剂；
(c)进行甲基化转化所需的试剂；
(d)进行DNA扩增所需的试剂；
(e)进行DNA纯化所需的试剂；和
(f)进行连接产物纯化或者片段分选所需要用到的片段化或非片段化的载体DNA。
在一个或多个实施方案中，所述进行酶切所需的试剂包括缓冲液和非甲基化λDNA。
在一个或多个实施方案中，所述进行甲基化接头的连接所需的试剂包括缓冲液和ATP。
在一个或多个实施方案中，所述进行甲基化转化所需的试剂为亚硫酸氢盐转化试剂。
在一个或多个实施方案中，所述进行DNA扩增所需的试剂包括扩增缓冲液和4种dNTP。
在一个或多个实施方案中，所述进行DNA纯化所需的试剂包括磁珠和/或纯化柱。
在一个或多个实施方案中，所述甲基化接头选自下组甲基化接头序列中的一种或多种：
SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:10形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:12形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:14形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:16形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:18形成的甲基化接头序列；和
SEQ ID NO:19与SEQ ID NO:20形成的甲基化接头序列。
在一个或多个实施方案中，所述索引引物选自：SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:22，和SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。
本发明还提供一种DNA测序方法，其特征在于，所述方法包括采用本发明任一实施方案所述的方法构建DNA甲基化文库以及对文库中的DNA序列进行测序的步骤。
本发明还提供一种接头序列产品，所述接头序列产品包括具有与未经末端修复和补齐处理的酶切产物的粘性末端相匹配的粘性末端的接头。
在一个或多个实施方案中，所述接头序列产品中，接头的浓度为0.1-1.5μM。
在一个或多个实施方案中，所述未经末端修复和补齐处理的酶切产物的粘性末端是使用选自MSP I、BanII、SphI和BssSI限制性内切酶中的一种或多种进行酶切所产生的粘性末端。
在一个或多个实施方案中，所述接头序列选自下组接头序列中的一种或多种：
SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2形成的接头序列；
SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4形成的接头序列；
SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8形成的接头序列；
SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:10形成的接头序列；
SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:12形成的接头序列；
SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:14形成的接头序列；
SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:18形成的接头序列；和
SEQ ID NO:19与SEQ ID NO:20形成的接头序列。
在一个或多个实施方案中，所述接头序列为甲基化接头序列。
本发明还提供一种接头序列产品，其含有本发明任一实施方案所述的接头序列和任选的具有与未经末端修复和补齐处理的酶切产物的平末端相匹配的平末端的接头序列。
在一个或多个实施方案中，所述具有与未经末端修复和补齐处理的酶切产物的平末端相匹配的平末端的接头序列选自：SEQ ID NO:5和6形成的接头序列，和SEQ ID NO:15和16形成的接头序列。
本发明还提供对甲基化不敏感的限制性内切酶和/或本发明任一实施方案所述的接头序列或接头序列产品在构建DNA甲基化文库中的应用，或在制备构建DNA甲基化文库的试剂盒中的应用。
在一个或多个实施方案中，所述对甲基化不敏感的限制性内切酶选自MSP I、HaeIII、BanII、HpyCH4V、AluI、SphI和BssSI中的一种或多种。
附图说明
图1：本发明建库方法的基本示意图。
图2：实施例1中其中一个样本的DNA甲基化文库片段分析结果。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本发明对传统检测甲基化的方法进行了优化，提供了一种CpG位点富集程度更高、样本间重现性更好的甲基化标志物筛查方法。
图1给出了本发明方法的示意图。使用限制性内切酶对感兴趣的DNA序列进行酶切，从而获得具有粘性末端的酶切产物和任选的具有平末端的酶切产物，之后使用甲基化接头进行连接，再进行甲基化转化，索引引物扩增，从而构建得到DNA甲基化文库，并可对该文库进行测序。本发明的方法中，在获得酶切产物后，不需要对酶切产物进行末端修复、补齐和产生粘性末端(如加A)，而直接使用该酶切产物进行甲基化接头连接，或将该酶切产物纯化后进行甲基化接头连接。
本发明中，限制性内切酶可以是对甲基化不敏感的限制性内切酶，包括但不限于MSP I、HaeIII、BanII、HpyCH4V、AluI、SphI和BssSI。优选地，这类限制性内切酶特异性识别的序列在基因组的高GC序列区域有更高的分布。因而，使用本发明的限制性内切酶可以实现启动子区域及CpG岛区域CpG位点更高的富集效率。
本发明中，可使用一种对甲基化不敏感的限制性内切酶进行酶切，也可以使用两种或两种以上对甲基化不敏感的限制性内切酶进行酶切。在一些实施方案中，仅使用能产生粘性末端的限制性内切酶中的一种或多种进行酶切；在其它实施方案中，使用能产生粘性末端的限制性内切酶中的一种或多种和能产生平末端的限制性内切酶中的一种或多种进行酶切。应理解的是，鉴于所使用的限制性内切酶对甲基化不敏感，且其特异性识别的序列在基因组的高GC序列区域有更高的分布，因此，即便仅使用一种本文所述的限制性内切酶进行酶切，也能产生与使用两种或多种限制性内切酶的混合酶进行酶切相似甚至更好的效果，如相似或更高的富集效率。
本文中，能产生粘性末端的限制性内切酶包括但不限于MSP I、BanII、SphI和BssSI等；能产生平末端的限制性内切酶包括但不限于HaeIII、HpyCH4V和AluI。可采用本领域常见厂商的限制性内切酶对感兴趣DNA，如基因组DNA，进行特异性酶切。合适的限制性内切酶厂商包括但不限于Thermo，NEB和Takara等。
对酶切条件并无特定限制，通常在所使用的内切酶的最适反应条件下进行即可。例如，反应体系中，限制性内切酶的终浓度可在0.1-1U/微升的范围内。酶切反应时间可以是1-14小时。酶切反应温度可以是所选酶的最佳反应温度。例如，示例性的酶切反应条件包括约37℃，反应时间1-5小时反应结束后，在约65-80℃进行酶灭活，最后在约4℃保温。由此获得具有粘性末端的酶切产物和任选的具有平末端的酶切产物。
酶切反应之后可以直接进行后续连接反应，也可以先进行纯化，然后再进行后续连接反应，即不需要进行常规的末端修复、补齐和产生粘性末端(如加A)。可采用本领域周知的技术进行纯化，例如可使用本领域周知的磁珠进行纯化。
在酶切反应之前，可采用磁珠或柱纯化的方法纯化基因组DNA。优选的磁珠可以是选自Backman Ampure Xp beads和Vazyme VAHTS DNA Clean Beads。通常，纯化磁珠与样品体积比可在0.8～2倍的范围内。在使用柱纯化时，可使用天根普通DNA产物纯化试剂盒(DP204)进行过柱纯化。
可采用本领域常用的试剂将接头序列连接到酶切产物两端。合适的连接酶品牌包括5’App DNA/RNA连接酶、T4 RNA连接酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶、T7 DNA连接酶、T3DNA连接酶、CircLigase连接酶、电转连接酶、平末端/TA连接酶、瞬时黏性连接酶、HiFi TaqDNA连接酶中的任一种或多种。可使用市售连接酶进行连接，如可使用Takara(2011A)、ThermoFisher(EL0013)、NEB(M0202T)和KAPA(KK6010，KK6110)中的任意一种进行接头连接。
根据所连接的酶，连接反应的条件可适当调整，以在其最适反应条件下进行。示例性的反应温度可在15-20℃的范围内，连接反应时间可在15-30小时的范围内。连接反应结束后，可在例如约65℃的温度下进行酶灭活。最后可在约4℃保温。
本文中，术语“甲基化接头”指其所有C均被甲基化的接头序列。因此，在本发明的一些实施方案中，本发明方法也包括提供对接头实施甲基化修饰的方法。使用甲基化接头能够有效避免测序接头对后续亚硫酸氢盐处理等操作带来的干扰，例如亚硫酸氢盐处理处理过程中接头序列可能会被改变。本领域的技术人员可以理解，对接头进行甲基化修饰的方法不受特别限制，可以利用本领域已知的任何方法对接头进行甲基化修饰。
在一些实施方案中，甲基化接头中还可以包含标签，由此可方便地同时构建多种样本的基因组特定区域的高通量测序文库，并能够有效地应用于高通量测序平台，从而在对测序结果进行数据分析后，基于标签的序列信息，就能够准确地区分多种样本的基因组特定区域的高通量测序文库的序列信息以及样本的基因组特定区域的甲基化信息。标签的长度通常在5-10bp左右，例如6bp或者8bp。
本发明中，反应体系中具有粘性末端的接头的终浓度优选为0.01-0.10μM，如0.01-0.06μM或0.02-0.05μM。优选地，当使用具有平末端的接头时，其在反应体系内的终浓度也在上述范围之内。上述浓度范围兼顾了目标酶切产物的充分连接并尽可能减少接头之间形成二聚体。当使用两种以上接头序列时，其在反应体系中的终浓度之和也在上述范围内，其对两种或两种以上接头的比例并无特殊限制，例如可以是等比例。
本发明的示例性接头序列可选自：SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2形成的甲基化接头序列；SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4形成的甲基化接头序列；SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6形成的甲基化接头序列；SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8形成的甲基化接头序列；SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:10形成的甲基化接头序列；SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:12形成的甲基化接头序列；SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:14形成的甲基化接头序列；SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:16形成的甲基化接头序列；SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:18形成的甲基化接头序列；SEQ IDNO:19与SEQ ID NO:20形成的甲基化接头序列。应理解，基于所使用的限制性内切酶所产生的酶切产物，可选择合适的接头序列进行甲基化接头连接。例如，当酶切产物具有粘性末端时，可选择具有与酶切产物粘性末端互补的粘性末端的接头序列；当酶切产物既包括具有粘性末端的酶切产物也包括具有平末端的酶切产物时，则使用具有与酶切产物粘性末端互补的粘性末端的接头序列与具有平末端的接头序列的混合物。本发明接头序列的粘性末端与酶切产物的粘性末端相匹配，意指满足碱基互补配对原理。
在本发明的一些实施案例中，连接反应之后可加入适量片段化或未片段化的载体DNA，由此可以提高后续连接产物纯化或者重亚硫酸氢盐转化过程中的回收效率。
连接结束后，可采用琼脂糖凝胶割胶回收方法、配置胶割胶回收方法、磁珠纯化片段筛选方法或Blue Pippin法回收连接产物，以除去接头与接头之间可能形成的二聚体。之后可用无核酸酶水洗脱DNA。由此获得的DNA分子可用于重亚硫酸氢盐转化。在一些实施方案中，采用配置胶割胶回收方法回收连接产物。
本发明中，可采用本领域周知的重亚硫酸氢盐转化方法对感兴趣DNA进行处理，获得重亚硫酸氢盐转化的DNA分子。例如，可使用重亚硫酸氢盐处理感兴趣的DNA序列，使所有未发生甲基化的胞嘧啶(C)被转化为尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶不变。可采用本领域已知的试剂进行转化。例如，在某些实施方案中，使用ThermoFisher公司的MethylCodeTMBisulfite Conversion Kit(MECOV50)或者ZYMO research公司的EZ DNA methylation-Lighting Kit(D5030)或者EZ DNA Methylation-Gold Kit(D5006)进行转化。或者，也可自行配制亚硫酸氢盐转化试剂。转化的条件为本领域所知，例如，将加入了转化试剂的样品置于PCR仪内，运行如下程序：98℃10分钟，64℃2小时30分钟，最后于4℃保温。针对不同的转化试剂，转化程序可有所不同。这可由本领域技术人员根据实际转化情况加以选择和确定。转化结束后，可回收经转化处理的DNA，并可使用洗脱液洗脱DNA。
转化结束后，可使用含有特异索引序列的引物(本文也称为索引引物，包括正向和反向引物)扩增转化产物。在多个样本同时测序时，需要给每个样本加上特定序列的索引。同时，为使DNA可在测序芯片上长成可被测序的簇，必须同时在样本DNA两端加上可与芯片上寡聚序列(oligo)结合的序列。因此，除含有特异索引序列外，所述引物还包括可与芯片上所含的寡聚序列特异性结合的序列。正向和反向引物还分别包括分别与扩增产物的接头序列中未互补的部分互补的序列。可使用本领域常用的特异索引序列。示例性的索引引物对如本文SEQ ID NO:21和22以及SEQ ID NO:23和24所示。
为了适用于不同的测序平台，也可以使用说明书表A以外的接头序列、说明书表B以外的索引引物序列，这些接头和索引引物的改变使得最终构建文库可以适用于ThermoFisher Ion系列测序平台或者其他读取DNA序列的平台的测序。
扩增所用的PCR试剂包括常规的实施PCR所需的试剂，包括但不限于扩增缓冲液、4种dNTP和DNA聚合酶等，其中扩增缓冲液中通常含有Mg2+离子。使用对dUTP不敏感的DNA聚合酶进行扩增。可以使用的聚合酶包括Phusion U Hot Start DNA聚合酶(ThermoScientificTM，F555L)，PfuTurbo Cx Hotstart DNA聚合酶(Agilent Technologies，600410)，Taq DNA聚合酶(Takara，R007Q)，LafU DNA聚合酶(Cvent，LafU DNAPolymerase)，Taq DNA聚合酶(NEB，E5000S)等。反应结束后，纯化扩增产物，从而构建得到本发明所述的文库。纯化可是本领域常规的纯化方法，例如，可使用磁珠纯化或者柱纯化方法进行纯化。
可采用PerkinElmer公司labChip GX Touch片段分析仪，也可以是Agilent 2100Bioanalyzer、琼脂糖凝胶电泳或者其他DNA片段分析方法进行文库分析。测序时，可采用Illumina测序平台、Thermo Fisher Ion系列测序平台或者其他读取DNA序列的平台。由于甲基化处理时，感兴趣DNA序列中未发生甲基化的胞嘧啶(C)被转化为尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶不变，因此，根据测序结果可确定感兴趣DNA分子中CpG位点的甲基化程度。
因此，本申请提供的构建DNA甲基化文库或DNA测序方法的特征至少包括使用经过优选之后的限制性内切酶对基因组DNA进行酶切处理；在未对酶切产物进行常规的末端修复、补齐和并产生粘性末端的情况下，直接使该酶切产物与与其配套的经过优选的接头进行连接；再进行本领域常规的甲基化转化和索引引物扩增，由此构建得到DNA甲基化文库，并可获得测序结果。优选地，反应体系中具有粘性末端的接头的终浓度在0.01-0.10μM的范围内。
本发明包括本文所述的接头序列，该接头序列与酶切所产生的粘性末端相匹配。在一些实施方案中，该接头序列可以是甲基化接头序列。本发明的接头序列可以是在常规接头序列的基础上在其5’端或者3’端的一条链上增加碱基形成粘性末端而获得，该粘性末端与未经末端修复、补齐和产生粘性末端处理的限制性内切酶酶切产物的原始产生的粘性末端互补。因此，除非另有说明，否则本文所述的接头序列除粘性末端外，其余部分通常均为DNA文库和测序中常规使用的接头的序列。示例性的接头序列见说明书表A所示序列。本发明还提供一种接头序列产品，其含有本文所述的具有粘性末端的接头序列以及任选的具有平末端的接头序列。
本发明还包括一种试剂盒，其含有本文所述的接头序列或接头序列产品。该试剂盒可以是DNA甲基化建库试剂盒。因此，试剂盒中还可以含有构建DNA甲基化文库所需的其它试剂，包括但不限于下述试剂中的一种或多种：进行酶切所需的试剂、进行甲基化接头的连接所需的试剂、进行甲基化转化所需的试剂、进行DNA扩增所需的试剂、以及进行DNA纯化所需的试剂。优选地，试剂盒中的接头序列产品中，具有粘性末端的接头的浓度为0.1-1.5μM，优选0.3-1.0μM。在产品中含有具有平末端的接头时，其浓度也可在上述浓度范围内。
进行酶切所需的试剂包括缓冲液、酶切所需的酶和非甲基化λDNA。示例性的缓冲液可以是Tango缓冲液或者Cutsmart缓冲液或者其它自配的缓冲液。示例性的酶包括MSPI、HaeIII、BanII、HpyCH4V、AluI、SphI、BssSI等混合限制性内切酶。优选的限制性内切酶厂商为Thermo、NEB和Takara。非甲基化λDNA可以使本领域常规用于DNA甲基化建库所用的非甲基化λDNA。
进行甲基化接头的连接所需的试剂包括缓冲液、DNA连接酶和ATP。合适的连接酶包括5’App DNA/RNA连接酶、T4 RNA连接酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶、T7 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、CircLigase连接酶、电转连接酶、平末端/TA连接酶、瞬时黏性连接酶、HiFiTaq DNA连接酶中的任一种或多种。可使用市售连接酶进行连接，如可使用Takara(2011A)、ThermoFisher(EL0013)、NEB(M0202T)和KAPA(KK6010，KK6110)中的任意一种进行接头连接。
进行甲基化转化所需的试剂为亚硫酸氢盐转化试剂。示例性的转化试剂包括ThermoFisher公司的MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit(MECOV50)或者ZYMOresearch公司的EZ DNA methylation-Lighting Kit(D5030)或者EZ DNA Methylation-Gold Kit(D5006)。
DNA扩增所需试剂包括扩增缓冲液、4种dNTP、索引引物和DNA聚合酶。示例性的DNA聚合酶包括Phusion U Hot Start DNA Polymerase(Thermo ScientificTM，F555L)，PfuTurbo Cx Hotstart DNA Polymerase(Agilent Technologies，600410)，Taq DNAPolymerase(Takara，R007Q)，LafU DNA Polymerase(Cvent，LafU DNA Polymerase)，TaqDNA Polymerase(NEB，E5000S)。示例性的索引引物包括说明书表B所示的引物序列。
试剂盒中包括的纯化试剂可纯化基因组DNA的试剂和/或纯化酶切产物的试剂。可采用磁珠或柱纯化的方法纯化基因组DNA。优选的磁珠可以是选自Backman Ampure Xpbeads和Vazyme VAHTS DNA Clean Beads。通常，纯化磁珠与样品体积比可在0.8～2倍的范围内。在使用柱纯化时，可使用天根普通DNA产物纯化试剂盒(DP204)进行过柱纯化。对于酶切产物，可采用磁珠进行纯化。因此，本发明的试剂盒中可包括纯化用的磁珠和/或柱。
该试剂盒还可以是DNA测序试剂盒。因此，试剂盒中还可包括DNA测试所需的试剂。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒含有所述限制性内切酶以及与之配套的接头序列。优选地，这类试剂盒还可含有T4 DNA连接酶和索引引物。
本发明还包括限制性内切酶，如MSP I、HaeIII、BanII、HpyCH4V、AluI、SphI、BssSI限制性内切酶中的一种或多种和与具有其酶切产物的末端相匹配的末端的接头序列在构建DNA甲基化文库中的应用，或在制备构建DNA甲基化文库用的试剂盒中的应用。
本发明优点包括但不限于：酶切反应前进行纯化，保证充分酶切，避免出现酶切偏向性，酶切不充分；使用优选的限制性内切酶进行酶切，使用与之配套经过优选之后的甲基化接头序列进行连接，提高基因组中启动子区及CpG岛区CpG位点的富集效率；连接反应后加入载体DNA提高连接产物纯化和重亚硫酸氢盐转化回收效率；优选的片段分选方法保证实验操作稳定性及样本重现性。此外优选的试剂及实验程序或者方法选择保证实验操作稳定性，样本重现性。此外，常规的方法需要对酶切产物进行末端修复、补齐和加A，如此，所有酶切产物均具有粘性末端A而无特异性，因而对于质量较差的DNA样品，如FFPE DNA和cfDNA，后续处理会将杂质DNA序列一同扩增出来，从而极大地降低了富集效率；与现有方法不同的是，本发明不进行末端修复、补齐和产生粘性末端，因此，本发明能回收只有两端都被酶切的酶切产物。因此，即便对于质量较差的DNA样品，如FFPE DNA和cfDNA，本发明也可获得非常高的实验稳定性和更好的CpG岛或者启动子区域富集效率。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的保护范围。实施例中所用到的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂，例如，可从市售途径购买得到这些试剂。
实施例1
一.对提取的DNA进行磁珠纯化
1.提前半小时取出AMPure磁珠，室温放置。涡旋混匀磁珠后，加入50微升磁珠到50微升DNA溶液中，用移液枪吹打混匀。室温放置5分钟。
2.转移到磁力架上，直至液体完全澄清。
3.保持在磁力架上，弃掉上清液，用150微升新鲜配置的80％乙醇洗涤磁珠。
4.重复第3步。
5.完全去除乙醇，开盖干燥5分钟。
6.将样本从磁力架上取下，加32微升无核酸酶水，用移液枪充分重悬磁珠，室温放置5分钟。
7.将样本转移至磁力架，直至完全澄清。
8.转移30微升洗脱液到新的管子中。
9.对纯化之后的DNA进行Qubit定量。
二.取100ng纯化后的样本DNA。配置如下反应体系，进行混合酶酶切反应：
反应混合物 体积/微升
10x反应缓冲液 4.0
混合限制性内切酶 1.0
1.2pg/μL非甲基化lambda DNA 0.8
DNA+无核酸酶水 34.2
总计 40
反应温度如下：37℃3小时，80℃20分钟，4℃保存。其中37℃为酶切反应温度，80℃为酶灭活温度。
混合酶包含7种限制性内切酶：MSP I(NEB，R0106L)、HaeIII(NEB，R0108L)、BanII(Thermo ScientificTM，ER0281)、HpyCH4V(NEB，R0620L)、AluI(Thermo ScientificTM，ER0011)、SphI(NEB，R0182L)和BssSI(Thermo ScientificTM，ER1841)
三.对上述酶切产物进行甲基化接头的连接
接头连接反应混合物 体积/微升
酶切DNA产物 40.00
10X反应缓冲液 1.00
T4 DNA连接酶(30U/μL) 1.00
10mM ATP 2.50
0.75μM混合甲基化接头(等比例) 2.00
无核酸酶水 3.50
总计 50.0
反应温度如下：16℃22小时，65℃20分钟，4℃保存。其中16℃为连接反应温度，65℃为酶灭活温度。
甲基化接头序列信息参见下表A，本实验使用组合1或2。
表A：混合甲基化接头序列信息
Figure BDA0004073602560000161
Figure BDA0004073602560000171
接头序列中所有的C均已进行了甲基化转化处理。S、W、R和Y为简并碱基，分别表示g或c，a或t，g或a，和t或c。
四.对上述连接产物进行磁珠纯化
1.提前半小时取出AMPure磁珠，室温放置。涡旋混匀磁珠后，加入50微升到连接产物中，加入1微升载体DNA，用移液枪吹打混匀。室温放置5分钟。
2.转移到磁力架上，直至液体完全澄清。
3.保持在磁力架上，弃掉上清液，用150微升新鲜配置的80％乙醇洗涤磁珠。
4.重复第3步。
5.完全去除乙醇，开盖干燥5分钟。
6.将样本从磁力架上取下，加32微升无核酸酶水，用移液枪充分重悬磁珠，室温放置5分钟。
7.将样本转移至磁力架，直至完全澄清。
8.转移30微升洗脱液到新的管子中。
五.使用ZYMO research公司的EZ DNA Methylation-Gold Kit进行亚硫酸氢盐转化处理。
1.按如下比例配置转化试剂
Figure BDA0004073602560000172
Figure BDA0004073602560000181
2.加120ul上述转化试剂到步骤三产物中。
3.将样本放至PCR仪，运行如下程序：98℃10分钟，64℃2小时30分钟，4℃保持。
按照试剂说明书回收处理后的DNA，最后用42微升洗脱液洗脱DNA，转移41.25微升到下一步反应中。
六.索引引物扩增
扩增反应混合物 体积/微升
亚硫酸氢盐转化DNA 41.25
10X反应缓冲液 5
dNTP，10mM 1.25
i7和i5索引引物，各10μM 1.5
Taq DNA Polymerase 1
总计 50
反应温度如下：98℃30秒，98℃10秒加65℃75秒20个循环，65摄氏度5分钟，4℃保持。
索引引物序列信息参加下表B，本实验使用索引引物对1或2。
表B：索引引物序列信息
Figure BDA0004073602560000182
Figure BDA0004073602560000191
注：若接头序列使用组合1，则索引引物使用索引引物对1；若接头序列使用组合2，则索引引物使用索引引物对2。N表示a、c、t或g。
七.对上述扩增产物进行磁珠纯化
1.提前半小时取出AMPure磁珠，室温放置。涡旋混匀磁珠后，加入50微升到连接产物中，用移液枪吹打混匀。室温放置5分钟。
2.转移到磁力架上，直至液体完全澄清。
3.保持在磁力架上，弃掉上清液，用150微升新鲜配置的80％乙醇洗涤磁珠。
4.重复第3步。
5.完全去除乙醇，开盖干燥5分钟。
6.将样本从磁力架上取下，加42微升无核酸酶水，用移液枪充分重悬磁珠，室温放置5分钟。
7.将样本转移至磁力架，直至完全澄清。
8.转移40微升洗脱液到新的管子中。
八.文库质控：用Qubit和qPCR两种方法测定文库浓度，并用PerkinElmer公司labChip片段分析仪分析文库片段大小。结果如图2所示。
九.测序：用Illumina平台仪器Hiseq X Ten进行测序。
十.结果
结果如下表1所示。表1显示了采用传统方法(Genome-scale DNA methylationmapping of clinical samples at single-nucleotide resolution，Nat Methods.2010February；7(2)：133–136.doi:10.1038/nmeth.1414)和本文上述方法获得的高通量测序读数评估结果。结果显示，经过改良之后检测到CpG位点更加集中在CpG岛区域或者启动子区域，实现对这两个区域更好的富集。
表1：甲基化文库高通量测序读数评估结果
Figure BDA0004073602560000201

Claims (15)

1.一种构建DNA甲基化文库的方法，其特征在于，所述方法依次包括酶切，甲基化接头连接，采用琼脂糖凝胶割胶回收方法、配置胶割胶回收方法、磁珠纯化片段筛选方法或BluePippin法回收连接产物，甲基化处理和索引引物扩增；
其中，使用对甲基化不敏感的限制性内切酶对感兴趣DNA序列进行所述酶切，获得酶切产物，所述限制性内切酶特异性识别的序列在高GC序列区域有更高的分布；
其中，所述酶切产物未经末端修复和补齐而直接与带有甲基化修饰的接头连接；
其中，所述酶切产物包含具有粘性末端的酶切产物，所述甲基化接头连接的反应体系中包括具有与酶切产物的粘性末端相匹配的粘性末端的甲基化接头，且反应体系中该甲基化接头的终浓度为0.01-0.05μM；
其中，任选地，甲基化接头连接之后，加入打断或未打断的载体DNA。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切产物还包括具有平末端的酶切产物，所述甲基化接头连接的反应体系中还包括具有与该酶切产物的平末端相匹配的平末端的甲基化接头。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述对甲基化不敏感的限制性内切酶选自MSPI、HaeIII、BanII、HpyCH4V、AluI、SphI和BssSI中的一种或多种；
所述甲基化接头连接包括使用5’App DNA/RNA连接酶、T4 RNA连接酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶、T7 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、CircLigase连接酶、电转连接酶、平末端/TA连接酶、瞬时黏性连接酶、HiFi Taq DNA连接酶中的一种或多种将甲基化接头连接到酶切产物；
使用亚硫酸氢盐转化试剂盒进行所述甲基化处理；
使用分别含有与所述甲基化接头中未互补的部分互补的序列的索引引物进行索引引物扩增。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使用选自Phusion U Hot Start DNA聚合酶、PfuTurbo Cx Hotstart DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和LafU DNA聚合酶中的一种或多种DNA聚合酶进行所述索引引物扩增。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，酶切前，使用磁珠或柱纯化方法纯化基因组DNA。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法依次包括：
使用磁珠或柱纯化方法纯化基因组DNA，获得纯化的DNA；
使用选自MSPI、HaeIII、BanII、HpyCH4V、AluI、SphI和BssSI中的一种或多种对所述纯化的DNA进行酶切，获得酶切产物；
对所获得的酶切产物进行甲基化接头连接，其中，使用选自T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶、T7 DNA连接酶和T3 DNA连接酶的一种或多种进行连接，获得连接产物；
采用配置胶割胶回收方法纯化所述连接产物；
使用亚硫酸氢盐转化方法对纯化的连接产物进行甲基化处理；和
使用选自Phusion U Hot Start DNA聚合酶、PfuTurbo Cx Hotstart DNA聚合酶和TaqDNA聚合酶中的一种或多种DNA聚合酶对经甲基化处理的产物进行索引引物扩增。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，
所述甲基化接头选自下组甲基化接头序列中的一种或多种：
SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:10形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:12形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:14形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:16形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:18形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:19与SEQ ID NO:20形成的甲基化接头序列；
所述索引引物选自：SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:22，和SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。
8.如权利要求1-4和5中任一项所述的方法，其特征在于，用于构建所述DNA甲基化文库的DNA样品为FFPE DNA或cfDNA。
9.一种用于实施权利要求1所述方法的DNA甲基化文库建库试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：
对甲基化不敏感的限制性内切酶；
接头序列产品，该接头序列产品含有浓度为0.1-1.5μM的具有与未经末端修复和补齐处理的酶切产物的粘性末端相匹配的粘性末端的接头；
含特异索引序列的引物；其中，所述引物包括正向和反向引物，正向和反向引物分别包括分别与所述甲基化接头中未互补的部分互补的序列；
DNA连接酶；
DNA聚合酶；和
任选的与未经末端修复和补齐处理的酶切产物的平末端相匹配的平末端的接头序列；
其中，所述酶切产物使用所述对甲基化不敏感的限制性内切酶酶切得到。
10.如权利要求9所述的DNA甲基化文库建库试剂盒，其特征在于，所述对甲基化不敏感的限制性内切酶选自MSPI、HaeIII、BanII、HpyCH4V、AluI、SphI和BssSI中的一种或多种。
11.如权利要求9所述的DNA甲基化文库建库试剂盒，其特征在于，
DNA连接酶选自5’App DNA/RNA连接酶、T4 RNA连接酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶、T7 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、CircLigase连接酶、电转连接酶、平末端/TA连接酶、瞬时黏性连接酶、HiFi Taq DNA连接酶中的一种或多种；
所述DNA聚合酶选自Phusion U Hot Start DNA聚合酶、PfuTurbo Cx Hotstart DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和LafU DNA聚合酶中的一种或多种。
12.如权利要求9所述的DNA甲基化文库建库试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括以下试剂中的一种或多种：
(a)进行酶切所需的试剂；
(b)进行甲基化接头的连接所需的试剂；
(c)进行甲基化转化所需的试剂；
(d)进行DNA扩增所需的试剂；
(e)进行DNA纯化所需的试剂；和
(f)进行连接产物纯化或者片段分选所需要用到的片段化或非片段化的载体DNA。
13.如权利要求12所述的DNA甲基化文库建库试剂盒，其特征在于：
所述进行酶切所需的试剂包括缓冲液和非甲基化λDNA；
所述进行甲基化接头的连接所需的试剂包括缓冲液和ATP；
所述进行甲基化转化所需的试剂为亚硫酸氢盐转化试剂；
所述进行DNA扩增所需的试剂包括扩增缓冲液和4种dNTP；
所述进行DNA纯化所需的试剂包括磁珠和/或纯化柱。
14.如权利要求9所述的DNA甲基化文库建库试剂盒，其特征在于，
所述甲基化接头选自下组甲基化接头序列中的一种或多种：
SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:10形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:12形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:14形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:16形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:18形成的甲基化接头序列；
SEQ ID NO:19与SEQ ID NO:20形成的甲基化接头序列；
所述索引引物选自：SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:22，和SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。
15.一种DNA测序方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1-8中任一项所述的方法构建DNA甲基化文库以及对文库中的DNA序列进行测序的步骤。
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