CN113528612A

CN113528612A - 用于检测染色质开放位点间染色质相互作用的NicE-C技术

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Publication number: CN113528612A
Application number: CN202110773743.2A
Authority: CN
Inventors: 宋晓元; 罗正誉; 张然; 胡腾飞
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2021-07-08
Filing date: 2021-07-08
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2041-07-08
Also published as: CN113528612B

Abstract

本发明提供了检测染色质开放位点间染色质相互作用的NicE‑C方法，其参考了NicE‑seq与Hi‑C技术，在前期用NicE‑seq技术中使用的Nt.CivPII和DNA聚合酶I这两个酶替代Hi‑C技术中使用的限制性内切酶进行染色质切割，从而实现对染色质开放位点的切割。后续参考Hi‑C技术等在末端补平(不需在此处加入生物素标记)，加dA尾后通过生物素标记的桥接头连接来实现对染色质相互作用的捕获。本发明具有样品起始细胞量少，操作简便，信号富集效果好，分辨率高等特点。

Description

用于检测染色质开放位点间染色质相互作用的NicE-C技术

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可以在全基因组水平上有效、便捷地捕获染色质开放位点以及这些染色质开放位点间的染色质相互作用的技术。

背景技术

Hi-C(高通量染色质构象捕获技术)技术的开发和使用在全基因组水平揭示了不同层次的染色质高级结构，包括染色质隔室(A/B compartments)、染色质拓扑结构域(topologically associated domains)和染色质环(chromatin loops)。其中染色质环的结构可以介导基因启动子与增强子间的相互作用，从而调控基因的转录活动与表达水平。而基因的时空特异性表达在生命过程中具有重要的作用。因此，研究基因时空特异性表达的上游调控机制，即启动子与增强子间相互作用的动态变化，对于研究生命活动以及疾病发生发展过程中的调控机制而言十分重要。此外，基于ATAC-seq技术(assay fortransposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing)等的研究表明活跃的启动子与增强子通常具有染色质开放的特性。目前基于Hi-C技术或染色质开放性以实现对启动子-增强子间相互作用的研究技术主要包括启动子捕获Hi-C(promoterCapture Hi-C)、OCEAN-C(open chromatin enrichment and network Hi-C)和Trac-looping(transposase-mediated analysis of chromatin looping)。

启动子捕获Hi-C技术通过设计针对已知启动子序列的生物素标记的探针库来对Hi-C文库进行筛选(基于碱基互补配对原理)，从而获得与这些靶标启动子相关的染色质相互作用的信息。该技术需要针对已知的启动子进行大量的探针设计工作，生物素标记探针的合成花费大，且需要针对不同物种设计相应的探针库。花费高昂且耗时耗力。OCEAN-C与Trac-looping均利用了启动子与增强子具有染色质开放性的特点，通过捕获开放染色质位点间相互作用的方式来富集启动子-增强子相互作用。其中OCEAN-C结合了Hi-C与FAIRE-seq(formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements)来实现对开放染色质位点间相互作用的捕获，具体做法是在完成Hi-C连接后，对细胞进行超声破碎，然后按照FAIRE-seq的方式通过酚氯仿抽提来分离开放的染色质位点，从而获得开放染色质位点相关的染色质相互作用信息。目前OCEAN-C需要几百万(10⁶)的初始细胞投入量，且其对染色质开放位点的富集程度相对较低，获得的染色质相互作用图谱的分辨率较低(在1kb分辨率下难以提供有效的信息)。Trac-looping技术则基于ATAC-seq技术利用了Tn5转座酶可以特异性地识别并切割开放染色质区域的特性，通过特殊设计的二价ME接头(bivalent MElinker)来实现对开放染色质位点间染色质相互作用的捕获。Trac-looping对染色质开放位点的富集程度较高，所能得到的染色质相互作用图谱的分辨率也可以达到1kb。但是Trac-looping技术所需要的细胞起始量高达一亿(1x10⁸)，且所获得的开放染色质位点间染色质相互作用主要集中在20kb以内。

以上的方法虽然都能够捕获到启动子-增强子间的染色质相互作用，并能在此基础上研究基因表达动态改变的调控机制。但是由于上述分析中提到的一些问题，这些方法在实际适用性，使用便捷性方面仍存在一些问题。因此，目前这些方法还不具有广泛使用的基础。为更好的实现对启动子-增强子间相互作用以及基因时空特异性表达调控方面的研究，促进对生命活动调控以及疾病发生发展机制的研究和认识，需要建立一种具有广泛适用性，操作简单，且能有效获得高分辨率数据的新的启动子-增强子间相互作用的捕获方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：

一方面，本发明提供检测待测样品中染色质开放位点间染色质相互作用的NicE-C方法，其包括：

a.对样品中的染色质包括DNA、蛋白以及RNA进行交联；

b.在染色质开放区域切割基因组DNA；

c.进行末端修复，在修复的末端上加尾，所述加尾选自dA，dT，dG，dC中的任何一种；

d.引入带标记的桥接头，所述标记选自生物素标记或地高辛标记；

e.破碎DNA，富集带标记的DNA片段。

在一些实施方案中，所述样品选自动物细胞，优选人细胞。

在一些实施方案中，采用交联剂对样品中的染色质进行交联，所述交联剂选自由甲醛、戊二醛、福尔马林、多聚甲醛、戊二酸二琥珀酰亚胺酯、二乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯及其组合组成的组。

在一些实施方案中，通过Nt.CivPII和E.coli DNA聚合酶I/T4 DNA聚合酶I/DNA聚合酶大片段(Klenow)在染色质开放区域进行切口反应切割基因组DNA。

在一些实施方案中，通过T4 PNK和Klenow/T4 DNA聚合酶I进行末端修复。

在一些实施方案中，通过Klenow exo-在修复的末端上加尾。

在一些实施方案中，在邻位连接过程中引入带标记的桥接头。

在一些实施方案中，所述桥接头选自由一条单链DNA退火形成的桥接头或由两条单链DNA退火形成的桥接头，优选地，退火形成的桥接头末端多一个碱基，以与修复的末端上的加尾配对，优选地，所述桥接头由合成的/5Phos/TGCAAGCTT(生物素)GCAT片段退火得到。

在一些实施方案中，在步骤d和步骤e之间还包括对DNA进行解交联的步骤，优选地通过加入SDS例如至终浓度1％并加入蛋白酶K，在50-65℃下孵育过夜或至少2小时来进行解交联。

在一些实施方案中，破碎DNA为200-500bp，破碎方式选自超声破碎或DNase I，Tn5，MNase或选自AluI，MboI，DpnII，MseI，MspI的限制性内切酶，优选地通过超声破碎对DNA进行破碎。

在一些实施方案中，通过链霉亲和素磁珠或用带标记的抗体富集带标记的DNA片段，优选地通过链霉亲和素磁珠富集带标记的DNA片段。

在一些实施方案中，还包括步骤f，富集带标记的DNA片段后通过T4 PNK、T4 DNA聚合酶I、Klenow进行末端修复，通过Klenow exo-加尾，所述加尾选自dA，dT，dG，dC中的任何一种，通过DNA连接酶加上测序接头进行连接反应。

在一些实施方案中，还包括步骤g，通过PCR进行文库扩增并对PCR产物进行纯化后即得到可以测序的NicE-C文库，所述纯化方法选自DNA纯化试剂盒、电泳后切胶回收或DNA纯化磁珠。

在一些实施方案中，还包括步骤h，对测序数据进行分析后可以获得染色质开放位点间染色质相互作用数据，所述分析方法选自HiCPro、Juice、Homer、HiCexplorer或HiGlass。

另一方面，本发明提供检测染色质开放位点间染色质相互作用的组合物或试剂盒，其特征在于包括：

a.交联剂，所述交联剂选自由甲醛、戊二醛、福尔马林、多聚甲醛、戊二酸二琥珀酰亚胺酯、二乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯及其组合组成的组；

b.Nt.CivPII和E.coli DNA聚合酶I/T4 DNA聚合酶I/DNA聚合酶大片段(Klenow)；

c.T4 PNK和Klenow/T4 DNA聚合酶I/DNA聚合酶大片段(Klenow)；

d.Klenow exo-；

e.dA，dT，dG，dC中的任何一种；

f.带标记的桥接头，例如由合成的/5Phos/TGCAAGCTT(生物素)GCAT片段退火得到；

g.解交联剂；

h.DNA纯化试剂。

另一方面，本发明提供上述检测染色质开放位点间染色质相互作用的NicE-C方法或上述的检测染色质开放位点间染色质相互作用的组合物或试剂盒在捕获染色质开放位点以及检测染色质开放位点间染色质相互作用中的用途。

另一方面，本发明提供上述的检测染色质开放位点间染色质相互作用的NicE-C方法或上述的检测染色质开放位点间染色质相互作用的组合物或试剂盒在研究基因表达动态改变的调控机制中的用途。

定义

染色质开放位点：未被核小体包裹的并可被转录因子结合的较为松散的染色质区域。

染色质开放位点间相互作用：即发生在染色质开放区域的染色质相互作用，例如本发明中检测到的基因启动子与增强子间的染色质相互作用。染色质相互作用指基因组中在线性DNA上相距较远的位点在蛋白质及RNA等因子的介导下在空间上相互靠近形成的DNA相互作用。

交联：细胞内蛋白和DNA等高分子在甲醛等交联剂作用下以共价键连接成网状或T型高分子的过程，用于保持细胞内蛋白和DNA等之间的空间位置。

末端修复：用dATP、dTTP、dCTP、dGTP四种碱基在酶的作用下补平DNA断口的粘性末端的过程。

dA尾：在酶的作用下在平末端的DNA断口处3’端加上dATP碱基的过程。

桥接头：由一条单链DNA退火形成或由两条单链DNA退火形成的用于连接两段分隔的DNA序列的一段带有例如生物素标记的双链DNA序列。

相互作用图谱分辨率：在对本发明中NicE-C方法或其他捕获染色质相互作用方法得到的数据进行分析后，为进行可视化展示，将基因组划分为等长的窗口(bin)并构建不同bin之间的相互作用矩阵。相互作用图谱中bin的长度称为相互作用图谱的分辨率。

切口反应：利用Nt.CivPII和E.coli DNA聚合酶I/T4 DNA聚合酶I/DNA聚合酶大片段(Klenow)在原来连续的DNA序列上形成单链缺口的过程。

邻位连接：基因组上空间区域较近的两段在线性基因组上相互分离的DNA序列在T4 DNA连接酶的催化反应下相互连接成为一段由原来两段分离的DNA和桥接头组成的连续的DNA序列的过程。

有益效果：

本发明中构建的NicE-C(nicking enzyme assisted open chromatininteraction capture)技术相比于目前已有的启动子捕获Hi-C而言，不涉及物种特异的针对启动子设计的带生物素标记探针库的设计和合成工作。一方面不需要设计一系列的探针，前期准备工作较少，另一方面所需费用也较少，易于推广使用。相比OCEAN-C和Trac-looping而言，NicE-C所需的起始细胞量较少，NicE-C可以处理1x10⁵细胞起始量的样品，而OCEAN-C需要10⁶细胞，Trac-looping则更是需要10⁸细胞。因此，NicE-C需要的样品投入量较少，更加适合用于少量样品的情况，如临床样本。此外，NicE-C相比OCEAN-C对染色质开放位点的富集效果更好，可以得到更高分辨率的染色质相互作用信息，NicE-C可以获得1kb分辨率下的染色质相互作用数据，而OCEAN-C在1kb下难以提供有效的信息。Trac-looping也可以获得1kb分辨率的染色质相互作用信息，但是由于Trac-looping实验得到的数据大部分都是短距离(小于20kb)的，其能提供的较远距离上的(大于20kb)开放位点间染色质相互作用的数据相比NicE-C要少(Trac-looping在20kb以内的数据比较多，NicE-C相比Trac-looping在20kb以内的数据比例要少一些，相应的在20kb以外则是NicE-C的比例比Trac-looping多一些)，即NicE-C可以在较高的分辨率下获得全基因组层面上更为均匀的染色质相互作用数据。此外，NicE-C实验流程与Hi-C基本一致(用切口酶替代了Hi-C中使用的限制性内切酶，缩短了酶切处理的时间)，可以在两天内完成实验获得测序文库，OCEAN-C和Trac-looping则分别需要三天和四天的时间来完成文库的准备工作。

综上，本发明的NicE-C相比已有的技术方法具有细胞起始量少，物种适用性高，开放位点富集程度高，相互作用图谱分辨率高，实验操作简单等优势。

附图说明

图1.图1A为实验流程示意图；图1B、图1C展示了NicE-C技术捕获到的HeLa细胞的染色质开放位点信息，表明NicE-C可以获得与NicE-seq和ATAC-seq高度一致的染色质开放位点数据；图1D、图1E展示了NicE-C技术得到的HeLa局部染色质区域的高分辨率(1kb)染色质开放位点间染色质相互作用(图1D)，作为对照的Hi-C(图1E)数据难以提供有效的信息；图1F绘制了NicE-C、Trac-looping、Ocean-C和Hi-C数据的全基因组层面上平均的启动子-启动子(TSS-TSS)间相互作用。

图2.图2A、图2B展示了局部染色质区域的IMR90细胞系(图2A)以及小鼠肾脏组织细胞(图2B)的NicE-C实验结果，表明NicE-C技术可以适用于不同的细胞系以及不同物种的样品。图2C、图2D为IMR90细胞(图2C)和小鼠肾脏组织细胞(图2D)NicE-C对启动子-启动子(TSS-TSS)间相互作用，增强子-增强子(enhancer-enhancer)间相互作用以及启动子-增强子(TSS-enhancer)间相互作用的富集结果。结果表明NicE-C可以有效地捕获染色质开放位点，即启动子和增强子间的染色质相互作用。

图3.图3A、图3B展示了在同一染色质区域内NicE-C技术得到的HeLa细胞(3A)和IMR90细胞(3B)在1kb分辨率下的染色质相互作用图谱，结果表明NicE-C技术可以获得高分辨的染色质开放位点间染色质相互作用。图3C展示了在相同染色质区域内Trac-looping得到的CD 4⁺ T细胞在1kb分辨率下的染色质相互作用图谱，Trac-looping技术可以得到高分辨的染色质相互作用，但相对NicE-C而言可以提供的信息相对较少。图3D展示了在相同染色质区域内OCEAN-C得到的GM12878细胞在1kb分辨率下的染色质相互作用图谱，几乎无法提供有效的染色质相互作用信息。

图4.图4展示了HeLa S3细胞在TNFα处理前后(TNFα，control)在TNFAIP3基因(肿瘤坏死因子α诱导蛋白3)及其附近区域的染色质状态以及染色质相互作用。从上到下依次为基因，H3K4me3和H3K27ac的ChIP-seq，Dnase-seq，对照组开放峰，TNFα组开放峰，对照组RNA，TNFα组RNA，NicE-C对照组相互作用图谱，NicE-C TNFα组相互作用图谱(这些是基因，染色质活化的组蛋白修饰图谱，染色质开放位点，以及本发明处理的细胞和对照的细胞的染色质开放位点和基因表达水平的数据)。该图表明NicE-C技术可以捕获到与基因差异表达相关的开放位点间染色质相互作用(启动子-增强子相互作用)层面的变化。带箭头的线条(e1-e3、e4、e5和e6)指示了可能的一些增强子的位点(DNA调控元件一般是染色质开放的位点，主要包括启动子和增强子，而启动子和增强子间的相互作用一般认为对基因的表达调控很重要。其中基因的启动子是确定的，本发明根据染色质开放位点标出了一些可能的增强子，这些增强子与本发明给出的基因的启动子有染色质相互作用，因此，这些增强子可能起到调控该基因表达水平的作用。在处理前后目标基因的启动子与这些增强子间的相互作用有所不同，并且与本发明观察到的基因表达水平的变化相一致)。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

本发明旨在构建一种新的开放染色质位点间染色质相互作用捕获技术NicE-C，以实现对染色质开放位点及染色质开放位点间染色质相互作用，尤其是启动子-增强子间相互作用的有效捕获。NicE-C技术可以用于研究启动子-增强子间相互作用以及与基因表达相关的启动子-增强子间相互作用的动态改变。

本发明参考了NicE-seq(nicking enzyme assisted sequencing)与Hi-C技术，在前期用NicE-seq技术中使用的Nt.CivPII和E.coli DNA聚合酶I这两个酶替代Hi-C技术中使用的限制性内切酶进行染色质切割，从而实现对染色质开放位点的切割。后续参考Hi-C技术等在末端补平(不需在此处加入生物素标记)，加dA尾后通过生物素标记的桥接头连接来实现对染色质相互作用的捕获。

本发明中用于比较的Ocean-C(1)和Trac-looping(2)数据来自文献：

(1)T.Li,L.Jia,Y.Cao,Q.Chen,C.Li,OCEAN-C:mapping hubs of openchromatin interactions across the genome reveals gene regulatorynetworks.Genome Biol 19,54(2018).

(2)B.Lai et al.,Trac-looping measures genome structure and chromatinaccessibility.Nat Methods 15,741-747(2018).

实施例1：运用NicE-C技术获得人类HeLa细胞系染色质开放位点间染色质相互作用图谱。

该实施例旨在确定本发明中构建的NicE-C技术可以达到同时捕获染色质开放位点以及这些开放位点间染色质相互作用的目的。简单而言，发明人利用Nt.CivPII和DNA聚合酶I对收集的HeLa细胞(ATCC：CRM-CCL-2)样品进行处理，在染色质开放位点对基因组进行切割，此后通过T4 PNK和Klenow对切割的DNA末端进行修复，通过Klenow exo-在修复的末端上加上一个dATP尾，最后通过T4 DNA连接酶进行邻位连接，在连接的过程中引入生物素(biotin)标记的桥接头(bridge linker)。桥接头由合成的/5Phos/TGCAAGCTT(生物素)GCAT片段(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)退火得到。在完成染色质开放位点切割和邻位连接后，进行解交联和DNA纯化，并参考Hi-C技术对纯化得到的DNA进行文库构建，文库扩增，文库纯化，最终对得到的NicE-C文库进行高通量测序从而获得NicE-C数据。

具体实验步骤如下：

1.收集培养的HeLa细胞样品，通过交联剂甲醛(终浓度1％)进行交联处理；

2.将收集的HeLa细胞重悬于细胞溶质缓冲液(cytosolic buffer)中(15mM Tris-HCl pH 7.5，5mM MgCl₂，60mM KCl，0.5mM DTT，15mM NaCl，300mM蔗糖和1％NP40(Sigma，127087-87-0)，冰上放置10分钟；

3.离心去上清，将10e5～10e6细胞沉淀重悬于400μl的切口反应(nickingreaction)中，通过Nt.CivPII(NEB，R0626S)和E.coli DNA聚合酶I(NEB，M0209L)在染色质开放位点实现对基因组DNA的切割，具体反应体系如下：

4.混匀后在37℃下间歇震荡(950rpm，15秒开，75秒关)反应20分钟(视不同样品调整时间)；

5.加入EDTA至终浓度20mM，65℃下放置20分钟以终止反应；

6.离心去上清，用洗涤缓冲液(wash buffer)(2mM MgCl₂，1x BSA(Sigma，9048-46-8)，2％PEG8000，0.05％SDS，0.2％Triton X-100)清洗一到两次；

7.重悬于50μl含0.3％SDS的1x T4 DNA连接酶缓冲液(ligase buffer)(NEB，B0202S)中，62℃静置3-5分钟；

8.加入15μl 10％Triton X-100以中和SDS，加入1x T4 DNA连接酶缓冲液至终体积200μl，37℃静置5分钟；

9.离心去上清，重悬于400μl的末端修复反应体系中，具体如下：

试剂	体积
		10x T4 DNA缓冲液	40μl
NEB T4 PNK(NEB，M0201S)	6μl
		NEB Klenow(NEB，M0210S)	6μl
50％PEG8000	20μl
		10mM dNTP(Thermo，R0181)	8μl
10％Triton X-100	20μl
		H<sub>2</sub>O	300μl

10.混匀后在37℃下间歇震荡(950rpm，15秒开，75秒关)反应60分钟；

11.加入EDTA至终浓度20 mM，65℃下放置20分钟以终止反应；

12.离心去上清，用洗涤缓冲液(2mM MgCl₂，1x BSA，2％PEG8000，0.05％SDS，0.2％Triton X-100)清洗一到两次；

13.离心去上清，重悬于400μl的dA加尾反应体系中，具体如下：

14.混匀后在37℃下间歇震荡(950rpm，15秒开，75秒关)反应60分钟；

15.加入EDTA至终浓度20 mM，65℃下放置20分钟以终止反应；

16.离心去上清，用洗涤缓冲液(2mM MgCl₂，1x BSA，2％PEG8000，0.05％SDS，0.2％Triton X-100)清洗一到两次；

17.离心去上清，重悬于600μl的桥接头(bridge linker)连接反应体系中(桥接头的参考序列如下：/5Phos/TGCAAGCTT(biotin)GCAT，合成后重悬于1x NEBuffer2中，通过缓慢的梯度降温进行退火形成双链的接头)：

试剂	体积
		10x T4 DNA缓冲液	60μl
T4 DNA连接酶(NEB，M0202S)	4μl
		50％PEG8000	30μl
桥接头	20μl
		10％Triton X-100	30μl
H<sub>2</sub>O	456μl

18.混匀后在室温下缓慢旋转或间歇震荡(950rpm，15秒开，75秒关)反应4小时(或16℃下过夜)；

19.连接反应结束后，离心去上清，重悬于200μl含10μl蛋白酶K的裂解缓冲液中(10 mM Tris-HCl,pH7.5，1％SDS)，65℃解交联过夜；

20.解交联后通过DNA纯化试剂盒纯化DNA并通过超声破碎将DNA打断到200-500bp，加入链霉亲和素磁珠(Dynabeads M-280 Streptavidin,Thermo,11206D或DynabeadsMyOne Streptavidin C1,Thermo,65002)室温混匀孵育30分钟以富集带生物素标记的DNA片段；

21.在完成生物素富集后参考Hi-C文库构建进行末端修复，加dA尾和测序接头连接反应，步骤如下：

末端修复：结合DNA的磁珠，20μl 10x T4 DNA连接酶缓冲液，5μl NEB T4 PNK，4μlT4 DNA聚合酶I，1μl Klenow，5μl 10mM dNTPs，加水至200μl，在室温下混匀反应30分钟；

dA-tailing(加dA尾):结合DNA的磁珠，20μl 10x NEBuffer2，5μl NEB Klenowexo-，5μl 10mM dATP，加水至200μl，在37℃下混匀反应30分钟；

测序接头连接反应：结合DNA的磁珠，50μl 2x Quik连接酶缓冲液，2μl NEB Quick连接酶(NEB，M2200L)，2μl 50uM接头(adapter)，加水至100μl，在室温下混匀反应30分钟。

22.通过PCR进行文库扩增并纯化后即得到可以测序的NicE-C文库，步骤如下：

PCR：结合DNA文库的磁珠，20μl 5x Q5反应缓冲液，8μl PCR扩增引物(10μM，上下游引物各4μl)，2μl 10mM dNTPs,1μl NEB Q5DNA聚合酶(NEB，M0491L)，加水至100μl。按照以下PCR程序进行扩增：95℃2分钟，(95℃10秒，65℃30秒，72℃30秒)重复10-15次，72℃5分钟。

PCR文库纯化：加入0.6体积(100μl PCR反应体系加入60μl磁珠)的VAHTS DNA纯化磁珠(Vazyme，N411-01)，混匀后室温放置5分钟，用磁力架吸附磁珠。转移不含磁珠的上清至新的离心管中，再加入0.3体积(100μl PCR反应体系加入30μl磁珠)的VAHTS DNA纯化磁珠，混匀后室温放置5分钟。用磁力架吸附磁珠后移除上清，用80％酒精清洗磁珠两次(保持吸附状态)，用30μl水重悬磁珠以洗脱DNA文库，室温放置5分钟。用磁力架吸附磁珠后转移上清至新的离心管中，纯化后的DNA文库可以进行后续的测序。

23.在对测序数据进行分析后可以获得染色质开放位点信息以及开放位点间染色质相互作用数据。通过HiCPro对得到的测序数据进行比对和过滤，并将得到的validpairs转换成.hic文件，得到的.hic文件可以在juicebox或washu genome browser中进行可视化展示，也可以用cooler转换成.cool文件后用coolpupy工具进行后续的分析。HiCPro比对得到的bam文件也可以通过HOMER等转换成bigwig文件，在IGV，juicebox，washu genomebrowser中进行染色质开放性的可视化展示。

结果如图1所示，其中图1A为NicE-C技术的简单实验流程示意图，在NicE-C实验中，我们先通过甲醛等对细胞或组织样品等进行交联，再通过Nt.CviPII和E.coli DNA聚合酶I对染色质进行切割，在末端修复和加dA尾后加入带生物素标记的桥接头进行邻位连接。在连接反应后对细胞进行解交联处理，纯化DNA后进行文库构建和测序，并对测序数据进行分析。图1B、图1C对比了NicE-C技术得到的染色质开放位点信息与NicE-seq和ATAC-seq在相同细胞系中得到的染色质开放位点信息。结果表明NicE-C可以得到与NicE-seq和ATAC-seq高度一致的开放位点数据。从图1B给出的局部染色质区域可以看出NicE-C得到的染色质开放位点峰与NicE-seq和ATAC-seq得到的峰基本一致，图1C对三种方法得到的峰进行了Venn图的绘制，结果表明大部分的NicE-C峰与NicE-seq和ATAC-seq的峰可以很好的重合。图1D、图1E对比了NicE-C技术(图1D)与Hi-C(图1E)的染色质相互作用图谱。结果表明在1kb分辨率下NicE-C可以提供染色质开放位点间的染色质相互作用数据，而Hi-C在1kb分辨率下则几乎无法提供有效的染色质相互数据。图1D图中下方的正方形框中有一些点和线(这里的“点”指染色质相互作用环，chromatin loops，在相互作用图谱中指非对角线区域中存在的相对其它区域颜色较深的点状相互作用。“线”指chromatin stripes，在相互作用图谱中指从对角线上沿水平或垂直方向延伸出的相对其它区域颜色较深的线状相互作用，通常发生在对角线到染色质相互作用“点”以及“点”与“点”之间)，图1E中则没有。图1F绘制了NicE-C、Trac-looping、OCEAN-C、Hi-C数据的全基因组层面上平均的启动子-启动子间相互作用，结果表明NicE-C技术可以有效富集启动子-启动子间染色质相互作用，OCEAN-C的富集作用相对较弱，从图中可以看出在相同的数据量的情况下，NicE-C得到的启动子-启动子相互作用的强度相比OCEAN-C要强很多，以相互作用的中间点为例，在NicE-C中富集程度为4.46和4.32，而在OCEAN-C中则是1.41(富集程度的不同主要是方法的影响，细胞系的影响相对比较小)。以上结果表明NicE-C技术可以有效地捕获HeLa细胞中的染色质开放位点以及染色质开放位点间染色质相互作用信息。

实施例2：运用NicE-C技术获得其它细胞系(IMR90)和其它物种(小鼠肾脏组织细胞)的染色质开放位点间染色质相互作用图谱。

在通过实施例1证明NicE-C技术可以有效捕获HeLa细胞中的染色质开放位点间染色质相互作用后，本实施例使用了另一种人类细胞系IMR90(ATCC：CCL-186)细胞以及分离自小鼠肾脏组织的细胞进行了NicE-C实验，以说明NicE-C可以广泛适用于不同物种的不同样品。

实验的具体步骤与实施例1所述相同，仅样品为IMR90细胞系和小鼠肾脏组织细胞。

结果如图2所示，图2A和图2B分别展示了一个局部染色质区域内IMR90细胞系和小鼠肾脏组织细胞的NicE-C实验结果，从图中可以看出NicE-C可以有效地捕获到高分辨率(1kb)下的染色质开放位点间染色质相互作用，看相互作用的图谱上是否有一些点和线(这里的“点”指染色质相互作用环，chromatin loops，在相互作用图谱中指非对角线区域中存在的相对其它区域颜色较深的点状相互作用。“线”指chromatin stripes，在相互作用图谱中指从对角线上沿水平或垂直方向延伸出的相对其它区域颜色较深的线状相互作用，通常发生在对角线到染色质相互作用“点”以及“点”与“点”之间)，点和线的位置如果往上方延伸则能够和给出的NicE-C、DNase-seq等峰对应起来，表明点、线的位置是和其它数据的峰重合的。此外，发明人也在全基因组层面上对NicE-C捕获启动子和增强子间相互作用的能力进行了分析。分析结果如图2C、图2D所示，NicE-C可以有效地富集启动子-启动子，增强子-增强子，以及增强子-启动子间的染色质相互作用，具体体现为图2C、图2D中心富集的相互作用点，主要是看是否有“十”字型的交叉线，有的话就是有富集，富集强度可以通过左上角的数值来衡量，对IMR90细胞系的启动子-启动子间的染色质相互作用的富集强度为4.31，对IMR90细胞系的增强子-增强子间的染色质相互作用的富集强度为10.64，对IMR90细胞系的增强子-启动子间的染色质相互作用的富集强度为6.81；对小鼠肾脏组织细胞的启动子-启动子间的染色质相互作用的富集强度为9.56，对小鼠肾脏组织细胞的增强子-增强子间的染色质相互作用的富集强度为15.51，对小鼠肾脏组织细胞的增强子-启动子间的染色质相互作用的富集强度为12.12。图1F的Hi-C对应的图中几乎看不到“十”字型的线，代表富集很弱或几乎没有。除了相互作用点外，NicE-C还可以得到由中心点延伸出去的线(从图2C、图2D来说就是“十”字型的线里面除了中间“点”的部分，从相互作用图谱上看就是连接不同峰间的隐约的线)，体现的是环挤压模型中环挤压的过程。环挤压模型是目前比较好的用于解释染色质高级结构(TADs,loops)形成的一个模型，该模型认为，cohesin等因子在DNA上结合后会形成一个小的DNA环并向两边进行挤压，将环外的DNA拉到环内从而将DNA环不断扩大，环挤压在遇到两个收敛的CTCF后停止。在环挤压的过程中，当一边先遇到CTCF停止后，另一边继续扩展，就会形成相互作用的“线”，即stripes。

实施例3：本发明的NicE-C技术与OCEAN-C和Trac-looping在捕获染色质开放位点间染色质相互作用方面的比较。

我们对比了在实施例1和2中得到的HeLa细胞与IMR90细胞的NicE-C结果与已发表的GM12878细胞OCEAN-C结果以及CD 4⁺T细胞Trac-looping的结果。由于使用的细胞系不同，发明人对比了不同方法在全基因组层面上对启动子-启动子间相互作用捕获的结果(不同细胞间活跃的增强子差异较大，因此未选用进行对比分析)。图1F的结果表明NicE-C和Trac-looping对启动子-启动子间相互作用的富集程度较高，OCEAN-C的富集效果则相对较弱(NicE-C的富集数值是4.46和4.32，Trac-looping的富集数值是8.90，而OCEAN-C的富集数值是1.41，所以说OCEAN-C的比较弱)。为进一步说明，发明人选取了一个在不同细胞系中都表达的基因位点(这个基因位点是图中最上面标记的基因中的JAK1基因)及其附近区域进行可视化对比，图3的结果表明NicE-C和Trac-looping均可以在1kb分辨率下提供开放位点间的染色质相互作用信息，而OCEAN-C在1kb分辨率下则几乎无法提供有效信息。由此可知，在不考虑细胞样品投入量的情况下(本发明可以少到10⁵细胞，相比OCEAN-C的10⁶和Trac-looping的10⁸)，本发明中构建的NicE-C技术具有分辨率较高(相对OCEAN-C，与Trac-looping相似，可以达到1kb分辨率)，富集程度较高(相对OCEAN-C，与Trac-looping相似)等优势。

实施例4：运用NicE-C技术捕获不同细胞状态间与基因差异表达相关的启动子-增强子相互作用的动态变化。

在本实施例中，发明人利用NicE-C技术来检测与基因差异表达相关的开放位点间染色质相互作用的动态变化。本实施例中使用的是TNFα诱导(将终浓度为10ng/ml的TNFα加入细胞培养基中，于37℃孵育1小时)前后的HeLa S3细胞样品(ATCC：CCL-2.2)(此外，也可以检测不同发育过程，不同生物学过程，以及疾病发生发展过程中的细胞或组织样品)。

具体实验步骤与实施例1相同，仅样品为TNFα诱导前后的HeLa S3细胞样品。

如图4所示，本实施例中得到的NicE-C数据结果一方面可以检测出TNFα诱导前后染色质开放位点层面的动态变化(NicE-C得到的开放峰(open peaks))，另一方面也可以获得TNFα诱导前后这些染色质开放位点间动态的染色质相互作用水平的改变。根据图4展示的结果，最下面的半圆形曲线表示两个基因组位点间有染色质相互作用，对比处理组和对照组，可以看出染色质相互作用是有改变的(曲线不同)。并且这些改变与TNFα诱导导致的基因的差异表达相一致，即NicE-C技术可以用于研究基因转录调控的上游机制(在染色质开放程度与染色质相互作用的层面上)。本实施例的结果表明NicE-C技术可以用于动态捕获生命活动变化中基因时空特异性表达的上游调控机制，这在研究生命发育过程，疾病发生发展机制等方面具有重要的应用价值。)

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.检测待测样品中染色质开放位点间染色质相互作用的NicE-C方法，其特征在于，包括：

a.对样品中的染色质包括DNA、蛋白以及RNA进行交联；

b.在染色质开放区域切割基因组DNA；

e.解交联，破碎DNA，富集带标记的DNA片段。

2.根据权利要求1所述的检测染色质开放位点间染色质相互作用的NicE-C方法，其特征在于，所述样品选自动物细胞，优选人细胞。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的检测染色质开放位点间染色质相互作用的NicE-C方法，其特征在于，采用交联剂对样品中的染色质进行交联，所述交联剂选自由甲醛、戊二醛、福尔马林、多聚甲醛、戊二酸二琥珀酰亚胺酯、二乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯及其组合组成的组。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的检测染色质开放位点间染色质相互作用的NicE-C方法，其特征在于，通过Nt.CivPII和选自E.coli DNA聚合酶I、T4 DNA聚合酶I、DNA聚合酶大片段(Klenow)的聚合酶在染色质开放区域进行切口反应切割基因组DNA。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的检测染色质开放位点间染色质相互作用的NicE-C方法，其特征在于，通过T4 PNK和选自Klenow、T4 DNA聚合酶I的聚合酶进行末端修复。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的检测染色质开放位点间染色质相互作用的NicE-C方法，其特征在于，通过Klenow exo-在修复的末端上加尾，所述加尾选自dA，dT，dG，dC中的任何一种。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的检测染色质开放位点间染色质相互作用的NicE-C方法，其特征在于，在邻位连接过程中引入带标记的桥接头。

8.根据权利要求7所述的检测染色质开放位点间染色质相互作用的NicE-C方法，其特征在于，所述桥接头选自由一条单链DNA退火形成的桥接头或由两条单链DNA退火形成的桥接头，优选地，退火形成的桥接头末端多一个碱基，以与修复的末端上的加尾配对，优选地，所述桥接头由合成的/5Phos/TGCAAGCTT(生物素)GCAT片段退火得到。

9.检测染色质开放位点间染色质相互作用的组合物或试剂盒，其特征在于包括：

c.T4 PNK和Klenow/T4 DNA聚合酶I/DNA聚合酶大片段(Klenow)；

d.Klenow exo-；

e.dA，dT，dG，dC中的任何一种；

g.解交联剂；

h.DNA纯化试剂。

10.根据权利要求1-8中所述的检测染色质开放位点间染色质相互作用的NicE-C方法或根据权利要求9所述的检测染色质开放位点间染色质相互作用的组合物或试剂盒在捕获染色质开放位点以及检测染色质开放位点间染色质相互作用中的用途或在研究基因表达动态改变的调控机制中的用途。