CN113466444B - 一种染色质构象捕获方法 - Google Patents
一种染色质构象捕获方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113466444B CN113466444B CN202110682551.0A CN202110682551A CN113466444B CN 113466444 B CN113466444 B CN 113466444B CN 202110682551 A CN202110682551 A CN 202110682551A CN 113466444 B CN113466444 B CN 113466444B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- chromatin
- sequence
- biotin
- site
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及生物领域,具体公开了一种染色质构象捕获方法。方法包括以下步骤:在细胞中进行原位邻近连接反应并用生物素标记连接位置;利用生物素抗体和二抗特异性识别邻近连接位置,通过pA与抗体的结合将pA‑Tn5中的Tn5靶向结合到邻近连接位置附近的DNA上,Tn5酶切打断邻近连接位置附近的DNA并同时接入N5接头序列;纯化DNA后用磁珠富集带有生物素的DNA为模板,利用观测位点的特异性引物和P5引物对模板DNA进行PCR扩增构建测序文库,测序和分析数据。该方法大幅度降低观测位点对限制性内切酶位点的依赖性,更高分辨率地检测观测位点参与的染色质三维构象,大幅度降低需要的细胞数量,可应用于临床样本。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其是涉及一种染色质构象捕获方法。
背景技术
染色质相互作用在基因组功能中的重要性一直备受关注。目前,研究染色质相互作用的技术主要有两大类:分子探针技术和分子相互作用图谱(molecular interactionmapping)技术,利用这些技术能够捕获染色质点与点之间或多点之间的相互作用。分子相互作用图谱技术包括染色质构象捕获(3C)技术和基于3C技术的ChIP-3C、4C、5C技术等。
4C的实验流程是:交联后的细胞经过细胞膜透化后,利用一种可以在感兴趣的DNA位点(靶位点/观测位点)一侧切断DNA的限制性内切酶将染色质DNA打断;使用DNA连接酶将空间上邻近的DNA末端连接到一起(邻近连接);DNA提纯后,用另一种可以在观测位点另一侧(一般与第一个酶切位点距离350bp左右)切断DNA的限制性内切酶将DNA进一步片段化;DNA纯化、稀释后进行DNA环化;在观测位点两端(靠近两个酶切位点处)设计反向引物,特异性扩增与观测位点两端相连的DNA片段,建立测序文库;测序后分析数据得到与观测位点相连的DNA序列信息。
4C实验流程冗长,有效信息捕获率低,构建单个文库往往需要从超过千万级别的细胞量开始实验,并且可重复性低。因此,已发表的文献中作者们通常利用基因编辑将感兴趣的变异引入细胞系或动物模型后才能开展4C研究,而无法直接利用数量有限的临床样本。此外,通过初步尝试,申请人发现4C实验流程复杂,操作难度大,耗时间长(6-7天)且耗费的资源和经费多。4C实验中涉及两轮酶切,对于目标区域内的染色质构象的检测高度依赖于限制性内切酶识别位点的分布和引物有效性,不能够将任意位置均当做检测位点进行有效的检测。为了在细胞量非常有限的临床样本中研究可能发生在任意位置的遗传变异对染色质构象的改变,有必要开发一种适用于低细胞量样本、对于限制性内切酶识别位点依赖性低的染色质构象捕获方法。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种染色质构象捕获方法,该方法更不受酶切位点分布限制地检测观测位点参与的染色质三维构象,其使用的细胞数量少,同时可以得到更高分辨率的染色质构象信号。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
一种染色质构象捕获方法,包括以下步骤:
1)对经过交联或未经交联的细胞进行细胞膜透化,利用限制性内切酶将细胞内的染色质DNA进行片段化,得到平末端;
2)在片段化后的染色质DNA平末端的3’末端加A碱基,与带有生物素标记的5’末端均为T碱基的寡聚脱氧核糖核苷酸片段进行邻近连接反应,使空间上邻近的染色质DNA连接在同一寡聚脱氧核糖核苷酸片段的两端,生物素标记发生了邻近连接反应的位置;
3)将pA-Tn5和N5接头序列混合形成pA-Tn5-N5接头复合体;
4)利用生物素抗体和识别抗生物素抗体的二抗特异性识别步骤2)中的邻近连接位置,通过pA与抗体的特异性结合将Tn5特异性靶向结合到邻近连接位置附近的染色质DNA上,Tn5酶切打断邻近连接位置附近的DNA同时接入N5接头序列;
5)终止Tn5酶切,用SDS将DNA从细胞核中释放出来,纯化DNA后,用磁珠富集带有生物素标记的已经发生了邻近连接反应的DNA为模板,利用观测位点的特异性引物和P5引物对含有观测点序列并且位于邻近连接位置附近被Tn5酶切过的DNA进行扩增,构建测序文库和测序,分析数据得到观测位点在全基因组范围内参与的三维染色体互作;或不进行DNA纯化,改用TritonX-100中和SDS;磁珠富集也可以省略,改用所有DNA为模板进行文库构建;
步骤4)中,邻近连接位置附近的染色质DNA是以通过抗体结合在生物素上的pA位置为球心,在三维空间上半径≤36个氨基酸范围内的染色质DNA,主要是带有生物素标记的已经发生了邻近连接反应的DNA。
作为本发明所述染色质构象捕获方法的优选实施方式,所述观测位点为任意不被某一限制性内切酶酶切的位点,对限制性内切酶位点的位置和分布的依赖性低。
作为本发明所述染色质构象捕获方法的优选实施方式,所述观测位点包括MYC基因或BLK基因。
作为本发明所述染色质构象捕获方法的优选实施方式,所述特异性引物包括观测位点VP引物。
作为本发明所述染色质构象捕获方法的优选实施方式,当观测位点为MYC基因时,VP引物的序列如SEQ ID NO.1所示;当观测位点为BLK基因时,VP引物的序列如SEQ ID NO.7所示。
作为本发明所述染色质构象捕获方法的优选实施方式,所述步骤3)中N5接头序列为序列1和序列2退火互补配对形成,所述序列1为Phos-CTGTCTCTTATACACATC-NH2,所述序列2如SEQ ID NO.3所示。
作为本发明所述染色质构象捕获方法的优选实施方式,所述步骤3)中N5接头序列可以改为测序文库另一侧的N7接头,同时所述步骤5)中P5引物改为P7引物。
在本发明中,P5引物的序列为AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC********TCGTCGGCAGCGTC,其中********是Illumina测序索引序列,可以根据需要改变。
作为本发明所述染色质构象捕获方法的优选实施方式,所述细胞的数量≤五十万。
与现有的4C技术需要的细胞量(千万级别)相比,本发明需要的细胞量仅为50万个或者更低,大幅度降低细胞用量,可以将本发明所述染色质构象捕获方法的应用范围拓展到细胞量有限的样本,如临床样本。
作为本发明所述染色质构象捕获方法的优选实施方式,所述方法需要的时间为2~3天。
更优选地,本发明的染色质构象捕获方法可以分辨染色质环程度的染色质构象。
作为本发明所述染色质构象捕获方法的优选实施方式,所述寡聚脱氧核糖核苷酸片段(linker)的正向链为5'-/5Phos/CGCGATATC/iBIOdT/TATCTGACT-3',带有生物素标记;反向琏为5'-/5Phos/GTCAGATAAGATATCGCGT-3')。寡聚脱氧核糖核苷酸片段的序列不仅限于此,能够实现本发明的技术效果均可使用。
更优选地,限制性内切酶为AluI内切酶,还可以为其他。
本发明方法在邻近连接的同时加入生物素标记,通过抗体识别生物素,利用融合蛋白pA-Tn5中的pA识别抗体将Tn5靶向邻近连接位置附近的DNA,特异性酶切邻近连接位置附近的DNA并接入测序接头,提高反应特异性,降低数据背景,提高了测序文库构建的效率,缩短实验流程和时长;生物素的存在也便于富集发生了邻近连接反应的产物,有利于提高信噪比、降低实验费用、并降低细胞量的使用。本发明的方法使用观测位点特异性引物和与P5引物进行扩增构建测序文库,避免了二轮酶切和二轮环化等步骤,缩减实验流程的同时,降低了实验设计时对酶切位点的依赖性、扩大了可用的限制性内切酶的种类,拓展了作为观测位点的目标区域的范围,使得检测发生在任意位置的遗传变异导致染色质构象发生的改变成为可能。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
1)相比传统4C,本发明方法通过抗体识别生物素,利用融合蛋白pA-Tn5中的pA识别抗体将Tn5靶向邻近连接位置附近的DNA,特异性酶切邻近连接位置附近的DNA并接入测序文库接头,可以提高染色质构象信号捕获的特异性和灵敏度,降低背景,简化文库构建步骤;
2)本发明方法使用观测位点特异性引物和P5引物特异性对含有观测位点序列且位于生物素附近被Tn5酶切了的DNA进行特异性扩增,不需要进行两轮酶切和环化,简化了实验步骤,降低了实验设计时对酶切位点的依赖性、扩大了可用的限制性内切酶的种类,拓展了作为观测位点的目标区域的范围,可以检测任意位置参与的染色质构象;
3)本发明方法经过实验证明,使用五十万细胞(还可以使用更低的细胞量)即可高质量地捕获到观测位点参与的染色质互作,需要的细胞量大幅度下降;
4)本发明的染色质构象捕获方法可以分辨染色质环,可以得到更高分辨率的染色质构象信号;
5)已有的4C技术完成文库构建需要的实验周期长达6-7天,而Tag-C技术需要的时间为2-3天,大幅度缩短实验时长。
附图说明
图1为本发明的染色质构象捕获方法(Tag-C)的原理及流程图;
图2为本发明的染色质构象捕获方法(Tag-C)用于低量细胞中捕获特定位点参与的染色质互作图;
图3为本发明的染色质构象捕获方法(Tag-C)与其它染色质构象捕获技术的比较图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中,所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法,所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1
一种染色质构象捕获方法(命名为Tag-C),包括以下步骤:
1)对经过交联(使用1%甲醛常温交联10分钟)的细胞用0.1%的SDS(十二烷基硫酸钠)进行细胞膜裂解,获取细胞核,用0.55%的SDS进行核膜透化(或用0.05%的TritonX-100对未经交联的细胞进行细胞膜穿孔),利用限制性内切酶(例如AluI,不仅限于此)在细胞核内原位对染色质DNA进行片段化得到平末端,37℃温浴进行酶切反应1~2小时,具体条件如表1所示;
2)用Klenow大片段在片段化后的染色质DNA的3’末端加A碱基(A-tailing),37℃1小时,具体条件如表2所示;然后利用邻近连接的原理,在细胞核内(原位)用T4连接酶将在三维空间上靠近的染色质DNA的3’末端与同一条带有生物素标记的5’末端均为T碱基的寡聚脱氧核糖核苷酸片段(linker;正向链:5'-/5Phos/CGCGATATC/iBIOdT/TATCTGACT-3';反向琏:5'-/5Phos/GTCAGATAAGATATCGCGT-3')进行邻近连接反应,室温反应1小时,后16℃反应2小时,过夜继续进行连接反应,具体条件如表3所示;
3)N5接头序列为序列1和序列2退火互补配对形成,序列1为Phos-CTGTCTCTTATACACATC-NH2,序列2如SEQ ID NO.3(TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG)所示;将pA-Tn5和N5接头序列孵育形成pA-Tn5-N5接头复合体(具体条件如表4所示,30℃1h);
接头序列组装反应条件为:用annealing buffer(诺唯赞)将接头序列1和2溶解到100μM,等体积(10μL)混合,60℃温浴10min,降温至50℃温浴10min,然后降温至40℃温浴10min,最后降温至25℃温浴30min,降温速度0.1℃/s。在本发明中,也可用测序需要的N7接头序列。
4)将步骤2)邻近连接后的细胞与抗生物素抗体常温孵育2h(具体条件如表5所示);然后将一抗孵育后的细胞与识别抗生物素抗体的二抗常温孵育0.5h(具体条件如表6所示);之后将二抗孵育后的细胞与pA-Tn5-N5接头复合体常温孵育1h(具体条件如表7所示),允许转座酶Tn5靶向结合到生物素附近(以通过抗体结合在生物素上的pA为球心,在三维空间上半径≤36个氨基酸范围内)的染色质DNA上;然后将pA-Tn5-N5接头复合体孵育后的细胞重悬浮在Tagmentation buffer(1x,100μL)中(吹打均匀)在37℃下进行Tagmentation反应1h,使Tn5对生物素附近的DNA进行酶切并同时接入测序文库的N5接头序列;终止Tagmentation反应,并释放DNA,65℃ 4小时或过夜(具体条件如表8所示),将释放后的DNA用酚氯仿抽提法提纯,溶解到50μL TEbuffer中;提纯步骤也可省略,改为用TritonX-100中和SDS。
5)用磁珠与DNA孵育30分钟富集带有生物素标记的DNA,清洗磁珠,重悬在10μL的EB中(具体条件如表9所示)(或者省略此磁珠富集步骤),利用观测位点的特异性引物(VP引物,例如以MYC基因观测位点,序列如SEQ ID NO.1;或以BLK基因为观测点,序列如SEQ IDNO.7所示;但不仅限于这两位点,VP引物序列可以根据不同观测点需要而改变)和引物P5(序列如SEQ ID NO.4所示,AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACtagatcgcTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTAT;其中小写部分为索引序列,可以按照测序平台需要更换)对含有VP序列并且位于邻近连接位置附近被Tn5酶切过的DNA进行扩增(具体条件如表10所示),获得扩增产物;然后利用引物P1(序列如SEQ ID NO.2所示)和Primer VP-adapter(序列如SEQ ID NO.5所示,ACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTcagcatagcgattggttgctc,小写部分与MYC基因的VP引物一致,随着不同观测位点的序列改变而改变,大写部分为二代测序文库接头)对扩增产物继续扩增13个循环,扩增的具体条件如表11所示;将扩增产物纯化,利用引物P1和引物P7(序列如SEQ ID NO.6所示,CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATcatgcctaGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT,小写部分为文库索引,可以根据测序需要改变,索引后面的序列与primer VP-adapter5’端的接头序列一致)扩增4个循环,构建完整文库;测序和分析数据得到观测位点在全基因组范围内参与的三维染色体互作(参考图1)。
在本实施例中,寡聚脱氧核糖核苷酸片段的正向链为5'-/5Phos/CGCGATATC/iBIOdT/TATCTGACT-3';反向琏为5'-/5Phos/GTCAGATAAGATATCGCGT-3'),也可使用其他可区分于细胞基因组序列的序列。
在本发明中,观测位点为任意不包含某一限制性内切酶酶切位点的位点,上述技术特征不仅限于此,能够实现本发明的技术效果,均在本发明的保护范围之内。
表1
试剂 | 体积(μL) |
透化后的细胞(5x105)沉淀 | - |
酶切buffer(10x) | 20 |
限制性内切酶AluI(NEB)100U/μL | 1.5 |
H2O | 178.5 |
总体积 | 200 |
表2
试剂 | 体积(μL) |
酶切后的细胞沉淀 | - |
20%BSA | 2 |
10x CutSmart buffer(NEB) | 20 |
dATP 100mM(NEB) | 2 |
Klenow(exo-) | 2 |
H2O | 174 |
总体积 | 200 |
表3
表4
试剂 | 体积(μL) |
5μg pA-Tn5(诺唯赞) | 10 |
接头序列(序列1+序列2) | 1.75 |
Coupling buffer(诺唯赞) | 7 |
总体积 | 18.75 |
表5
试剂 | 体积(μL) |
连接后的细胞沉淀 | - |
抗生物素抗体 | 1 |
Wash buffer(Cut&Tag) | 49 |
总体积 | 50 |
表6
试剂 | 体积(μL) |
一抗孵育后的细胞沉淀 | - |
二抗 | 1 |
Wash buffer(Cut&Tag) | 49 |
总体积 | 50 |
表7
试剂 | 体积(μL) |
二抗孵育后的细胞沉淀 | - |
pA-Tn5-N5接头复合体 | 1 |
Wash buffer(Cut&Tag) | 49 |
总体积 | 50 |
表8
试剂 | 体积(μL) |
Tagmentation反应体系 | 100 |
0.5MEDTA | 1 |
10%SDS | 1 |
蛋白酶K(20mg/mL) | 3 |
总体积 | 105 |
表9
试剂 | 体积(μL) |
纯化后的DNA | 50 |
清洗后的M280磁珠(原10μL) | - |
2xWash&Bind buffer | 50 |
总体积 | 100 |
表10
表11
其中SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6的序列如表12所示。
表12
参考图2,图2(a)为Tag-C实验过程中邻近连接反应的效果。黑色曲线和浅灰色曲线分别为AluI酶切后和邻近连接反应后DNA片段的长度分布,连接反应后DNA长度显著变长,说明连接效果好。
图2(b)为Tag-C文库的长度分布,最左和最右的信号峰分别指示20bp和5000bp。
图2(c)为Tag-C捕获到的观测点参与的染色质互作。SMC1A、CTCF和RNAPIIloops为CHIA-PET在该区域捕获到的染色质互作。竖线位置为观测位点(VP,view point)。根据这些CHIA-PET数据,Tag-C捕获到的染色质互作可分由RNAPII、CTCF、SMC1A单独或同时介导的(阴影)以及其它蛋白介导的(空方框)。
参考图3,图3(a)为Tag-C技术与其它染色质构象捕获技术捕获到的染色质互作信号图。图3(b)为Tag-C技术与其它的染色质构象捕获技术每百万条测序序列可捕获到的带有观测位点特异引物序列的测序序列数。图3(c)为Tag-C技术与其它的染色质构象捕获技术(4C、3C和ChIA-PET)在实验流程上的对比。
本发明使用的细胞的数量为五十万,但使用更低量的细胞(10-20万)也可以得到很好的效果,可以将本发明染色质构象捕获方法的应用范围拓展到细胞量有限的样本,如临床样本。
本发明的方法需要的时间为2~3天,较传统4C技术完成文库构建需要的实验周期长达6~7天,本发明方法大幅度缩短了实验时长。
本发明方法在邻近连接的同时加入生物素标记,便于使用抗体特异识别邻近连接位置,并通过pA与抗体的特异性结合将pA-Tn5中的Tn5靶向邻近连接位置附近的DNA,特异性酶切邻近连接位置附近的DNA并同时加入测序接头,有利于提高构象捕获效率、提高信噪比、降低实验费用、降低细胞量的使用、提高测序文库构建的效率,并缩短实验流程和时长。
已有的4C技术需要进行两轮酶切,对于酶切位点的分布依赖程度大,不是所有任意位点参与的染色质构象均可被4C有效捕获;本发明方法使用观测位点特异的引物和P5引物对含有观测位点序列并位于生物素附近被Tn5酶切过的DNA进行扩增,不需要进行两轮酶切和连接,简化了实验步骤、提高了反应效率、提高了观测位点信息捕获的灵敏度、降低了实验设计时对酶切位点的依赖性、扩大了可用的限制性内切酶的种类,拓展了作为观测位点的目标区域的范围,可以检测任意位置参与的染色质构象。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种染色质构象捕获方法
<130> 2021.06.09
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cagcatagcg attggttgct c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物P1
<400> 2
cagcatagcg attggttgct c 21
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 序列2
<400> 3
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33
<210> 4
<211> 61
<212> DNA
<213> 引物P5
<400> 4
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact agatcgctcg tcggcagcgt cagatgtgta 60
t 61
<210> 5
<211> 52
<212> DNA
<213> Primer VP-adapter
<400> 5
actggagttc agacgtgtgc tcttccgatc tcagcatagc gattggttgc tc 52
<210> 6
<211> 56
<212> DNA
<213> 引物P7
<400> 6
caagcagaag acggcatacg agatcatgcc tagtgactgg agttcagacg tgtgct 56
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
gtgagcaaag cagtagccct 20
Claims (7)
1.一种染色质构象捕获方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)对经过交联或未经交联的细胞进行细胞膜透化,利用限制性内切酶将细胞内的染色质DNA进行片段化,得到平末端;
2)在片段化后的染色质DNA平末端的3’末端加A碱基,与带有生物素标记的5’末端均为T碱基的寡聚脱氧核糖核苷酸片段进行邻近连接反应,使空间上邻近的染色质DNA连接在同一寡聚脱氧核糖核苷酸片段的两端,生物素标记发生了邻近连接反应的位置;
3)将pA-Tn5融合蛋白和N5接头序列连接形成pA-Tn5-N5接头复合体;
4)利用生物素抗体和识别抗生物素抗体的二抗特异性识别步骤2)中的邻近连接位置,通过pA与抗体的特异性结合将Tn5特异性靶向结合到邻近连接位置附近的染色质DNA上,Tn5酶切打断邻近连接位置附近的DNA同时接入N5接头序列;
5)终止Tn5酶切,用SDS将DNA从细胞核中释放出来,纯化DNA后,用磁珠富集带有生物素标记的已经发生了邻近连接反应的DNA为模板,利用观测位点的特异性引物和P5引物对含有观测点序列并且位于邻近连接位置附近被Tn5酶切过的DNA进行扩增,构建测序文库和测序,分析数据得到观测位点在全基因组范围内参与的三维染色体互作;或不进行DNA纯化,改用TritonX-100中和SDS;磁珠富集也可以省略,改用所有DNA为模板进行文库构建;
步骤4)中,邻近连接位置附近的染色质DNA是以通过抗体结合在生物素上的pA位置为球心,在三维空间上半径≤36个氨基酸范围内的染色质DNA,主要是带有生物素标记的已经发生了邻近连接反应的DNA;所述观测位点为任意不被某一限制性内切酶酶切的位点,对限制性内切酶位点的位置和分布的依赖性低;
实验过程不需要进行两轮环化连接;所得结果为观测位点参与的所有三维染色质互作。
2.如权利要求1所述的染色质构象捕获方法,其特征在于,所述观测位点包括MYC基因或BLK基因。
3.如权利要求1所述的染色质构象捕获方法,其特征在于,所述特异性引物包括观测位点VP引物。
4.如权利要求3所述的染色质构象捕获方法,其特征在于,当观测位点为MYC基因时,VP引物的序列如SEQ ID NO.1所示;当观测位点为BLK基因时,VP引物的序列如SEQ ID NO.7所示。
5.如权利要求1所述的染色质构象捕获方法,其特征在于,所述步骤3)中N5接头序列为序列1和序列2退火互补配对形成,所述序列1为Phos-CTGTCTCTTATACACATC-NH2,所述序列2如SEQ ID NO.3所示。
6.如权利要求1所述的染色质构象捕获方法,其特征在于,所述细胞的数量≤五十万。
7.如权利要求1所述的染色质构象捕获方法,其特征在于,所述方法需要的时间为2~3天。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110682551.0A CN113466444B (zh) | 2021-06-18 | 2021-06-18 | 一种染色质构象捕获方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110682551.0A CN113466444B (zh) | 2021-06-18 | 2021-06-18 | 一种染色质构象捕获方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113466444A CN113466444A (zh) | 2021-10-01 |
CN113466444B true CN113466444B (zh) | 2023-07-18 |
Family
ID=77868862
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110682551.0A Active CN113466444B (zh) | 2021-06-18 | 2021-06-18 | 一种染色质构象捕获方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113466444B (zh) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114410742B (zh) * | 2022-01-13 | 2022-12-20 | 中山大学 | 一种单细胞水平检测hiv整合位点及对应hiv-宿主基因组相互作用的方法 |
CN114438183B (zh) * | 2022-02-25 | 2024-08-20 | 南方科技大学 | Rna介导的染色质构象捕获方法 |
CN114891858B (zh) * | 2022-07-13 | 2023-05-02 | 广州国家实验室 | 染色质三维构象捕获方法及其应用 |
CN116004768A (zh) * | 2023-02-21 | 2023-04-25 | 华中农业大学 | 染色质和/或染色体构象捕获方法及其所用试剂 |
CN116254323B (zh) * | 2023-04-14 | 2023-07-25 | 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种用于获取植物叶肉细胞染色质构象信息的方法及试剂盒 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107119120A (zh) * | 2017-05-04 | 2017-09-01 | 河海大学常州校区 | 一种基于染色质3d构象技术的关键作用分子检测方法 |
US20200123591A1 (en) * | 2017-07-17 | 2020-04-23 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Epigenetic profiling using targeted chromatin ligation |
CN108285494B (zh) * | 2018-02-11 | 2021-09-07 | 北京大学 | 一种融合蛋白、试剂盒以及CHIP-seq检测方法 |
CN112553695B (zh) * | 2021-02-23 | 2021-05-11 | 翌圣生物科技(上海)有限公司 | 鉴定靶蛋白染色质结合图谱的快速建库方法 |
-
2021
- 2021-06-18 CN CN202110682551.0A patent/CN113466444B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113466444A (zh) | 2021-10-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN113466444B (zh) | 一种染色质构象捕获方法 | |
US8728733B1 (en) | Methyl-CpG island-associated genome signature tags | |
US10400279B2 (en) | Method for constructing a sequencing library based on a single-stranded DNA molecule and application thereof | |
US20210010062A1 (en) | Method for analyzing an interaction effect of nucleic acid segments in nucleic acid complex | |
US20070161024A1 (en) | Method for Gene Identification Signature (GIS) Analysis | |
CN110079592B (zh) | 用于检测基因突变和已知、未知基因融合类型的高通量测序靶向捕获目标区域的探针和方法 | |
CN113444768B (zh) | 一种检测染色体互作的方法 | |
US20240096441A1 (en) | Genome-wide identification of chromatin interactions | |
JP2010514452A (ja) | ヘテロ二重鎖による濃縮 | |
US10900974B2 (en) | Methods for identifying macromolecule interactions | |
CN109477132A (zh) | 核糖核酸(rna)相互作用 | |
EP4256081A1 (en) | Method of detection of a target nucleic acid sequence | |
CN113481283A (zh) | 等温扩增核酸靶序列的方法 | |
CN113528612B (zh) | 用于检测染色质开放位点间染色质相互作用的NicE-C技术 | |
WO2008097340A2 (en) | Methods of detecting dna n-glycosylases, methods of determining n-glycosylase activity, and n-glycolsylase assay kits | |
CN116287124A (zh) | 单链接头预连接方法、高通量测序文库的建库方法及试剂盒 | |
WO2020259303A1 (zh) | 一种快速构建rna 3'端基因表达文库的方法 | |
JP4755974B2 (ja) | 核酸の選択的断片化によるdna断片の作製方法およびその適用 | |
CN116194591A (zh) | 序列转换反应 | |
CN116536409B (zh) | 一种兼容宽范围ChIP DNA投入量的三维基因组检测方法 | |
WO2022242739A1 (zh) | 用于检测碱基编辑器编辑位点的方法和试剂盒 | |
CN113832221B (zh) | R环的高通量检测方法 | |
CN115537419A (zh) | 一种尿苷二磷酸的核酸适体及其筛选方法和应用 | |
CN118727162A (zh) | 单细胞4c文库构建方法和检测方法 | |
US20130084562A1 (en) | Tethered enzyme mediated nucleic acid detection |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |