CN114410742B - 一种单细胞水平检测hiv整合位点及对应hiv-宿主基因组相互作用的方法 - Google Patents

一种单细胞水平检测hiv整合位点及对应hiv-宿主基因组相互作用的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种单细胞水平检测HIV整合位点及对应HIV‑宿主基因组相互作用的方法，包括以下步骤：透化宿主细胞的细胞膜和细胞核膜，利用限制性内切酶将细胞内DNA进行片段化；使空间上邻近的DNA片段末端和T‑linker发生邻近连接；打断、提纯DNA，构建DNA文库，使用针对HIV LTR的特异性引物进行巢式PCR，获得巢式PCR产物，富集含有LTR的互作信息；通过带有N5序列的N5_REV_LTR2引物和N7短引物对巢式PCR产物进行扩增建库，测序并分析数据，解析细胞中整合位点信息，对应整合位点上HIV LTR与宿主基因组间发生的染色质相互作用信息。

Description

一种单细胞水平检测HIV整合位点及对应HIV-宿主基因组相 互作用的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种单细胞水平检测HIV整合位点及对应HIV-宿主基因组相互作用的方法。
背景技术
LM-PCR的技术方案是：提取整合有HIV的细胞基因组DNA，使用限制性内切酶混合酶对DNA进行随机酶切片段化；修复DNA末端并在片段3’末端补加dA，与人为设计的T-linker发生连接；利用磁珠纯化DNA连接产物，通过HIV LTR特异性引物与T-linker引物扩增出病毒-宿主嵌合片段；经高通量测序并分析数据，检测出细胞群体中HIV病毒的整合位点信息。
4C的技术方案是：细胞中的DNA-蛋白质复合体经甲醛交联处理后，使用可在目标DNA片段(观测位点)附近进行酶切的限制性内切酶将染色质DNA切断；通过DNA连接酶的作用使得空间上相互靠近的DNA片段末端发生邻近连接；DNA经过解交联、纯化后，再使用一种可在目标DNA片段另一侧进行酶切的限制性内切酶将DNA切断；提纯DNA，并进行稀释后将DNA环化；在酶切位点附近针对观测位点序列设计反向引物，特异性扩增与观测位点连接的DNA片段，建成文库；经测序并分析数据，检测出全基因组范围内与观测位点发生染色质相互作用的DNA序列信息。
临床中，HIV病毒感染宿主细胞通常是单次整合，病毒在不同细胞内具有不同的整合位点，且在不同整合位点具有不同的病毒-宿主染色质相互作用。
然而LM-PCR只能获得细胞群体水平病毒整合位点在宿主细胞全基因组的分布图谱，不能解析到单个细胞中病毒在每个整合位点对应发生的相互作用信息。4C技术只能捕获观测位点相关的染色质相互作用信息，不能同时检测HIV整合位点信息，无法将整合位点与相互作用信息一一对应进行解析。此外，4C技术流程复杂，信息捕获效率低，构建单个文库往往需要从超过千万级别的起始细胞量进行实验，无法直接利用数量有限的临床样本。同时，两轮酶切步骤高度依赖于限制性内切酶的选择，在病毒-宿主基因组间相互作用研究中受到需要保护病毒观测位点不被限制性内切酶作用的限制，对于限制性内切酶的选择具有极大的局限性。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种单细胞水平检测HIV整合位点及对应HIV-宿主基因组相互作用的方法。该检测方法(LM-TAG)可以从低细胞数量的临床样本中，检测单个细胞中病毒的整合位点信息，并解析对应整合位点上病毒LTR与宿主基因组间发生的相互作用信息。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
本发明提供了一种单细胞水平检测HIV整合位点及对应HIV-宿主基因组相互作用的方法，包括以下步骤：
1)透化整合有HIV的细胞的细胞膜和细胞核膜，利用限制性内切酶将细胞内DNA进行片段化；
2)通过Klenow大片段修复DNA片段化酶切后产生的黏性末端，并在片段化后的DNA的3’末端加A碱基，加入带有生物素标记的T-linker、T4 DNA连接酶，使空间上邻近的DNA片段末端和T-linker发生邻近连接；
3)打断、提纯DNA，构建DNA文库，使用针对HIV LTR的特异性引物REV_LTR1、REV_LTR2进行巢式PCR，获得巢式PCR产物，富集LTR相关的互作信息、整合位点信息；
4)通过带有N5序列的N5_REV_LTR2引物和N7短引物对巢式PCR产物进行扩增建库，测序并分析数据，解析细胞中整合位点信息，对应整合位点上HIV LTR与宿主基因组间发生的染色质相互作用信息。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述特异性引物REV_LTR1、REV_LTR2的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
作为本发明所述方法的优选实施方式，特异性引物REV_LTR2位于距离5’LTR前130bp范围内、或者距离3’LTR后130bp范围内。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述N5_REV_LTR2引物如SEQ ID NO.3所示，所述N7短引物的序列如SEQ ID NO.4所示。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述步骤3)中，构建DNA文库包括以下步骤：
a)使用Tn5-N7对DNA进行酶切，酶切后的产物片段为700～800bp，通过磁珠富集带有生物素标记的DNA片段；或者，
b)通过磁珠富集带有生物素标记的DNA片段，再使用Tn5-N7对富集的DNA片段进行酶切，酶切后的产物片段为700～800bp。
优选地，a)中磁珠重量为100μg，b)中磁珠重量为300μg。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述磁珠包括M280磁珠。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述限制性内切酶为限制性内切酶DdeI。
本发明利用限制性内切酶DdeI最大限度保持HIV LTR完整性的同时，又能充分将宿主细胞基因组DNA片段化。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述步骤1)中，透化含有HIV的细胞的细胞膜和细胞核膜的具体步骤为：使用浓度为0.1％十二烷基硫酸钠在4℃处理透化细胞膜1小时，随后使用浓度为0.55％十二烷基硫酸钠在25℃、62℃、37℃各透化细胞核膜10分钟。
更优选地，所述步骤3)中，打断的DNA片段大小为2～3kb。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述步骤3)中，巢式PCR进行22+20个循环。
本发明还提供了上述方法在在检测HIV整合位点及检测在整合位点上HIV基因组与宿主基因组的相互作用中的应用。
本发明还提供了上述方法在评估艾滋病的预后中的应用。
LM-PCR需要依靠靠近整合位点附近的LTR引物捕获整合位点信息进行测序解析，而4C技术需要两轮酶切、连接以捕获与观测位点相互作用的染色质片段，由于LTR长达634bp，简单的结合两种技术极易由于酶切将整合位点信息、位点对应LTR互作染色质片段信息两者之间的联系切断。为了防止因酶切而丢失互作信息，申请人首先分析了常见参与转录过程、介导染色质互作的RNAPII在Jurkat 10.6细胞系中的ChIP-seq数据，推测LTR与宿主可能的互作区域位于300-600bp间；然后以HXB2参考基因组LTR序列、The RestrictionEnzyme Database(REBASE)中所有II类限制性内切酶数据为基础进行分析，筛选出所有既能最大限度保持从整合位点至LTR-宿主发生相互作用区域DNA片段完整性的同时，又可以充分片段化基因组其他DNA片段的限制性内切酶，并根据无碱基偏好性、甲基化不敏感等条件筛选出了DdeI作为理想的限制性内切酶。此外，结合二代测序读长150bp限制条件，在5’LTR上靠近整合位点130bp以内设计特异性引物，最终能够同时捕获整合位点信息、位点对应互作信息，并保持两种信息之间一一对应的联系稳定。
利用临床中HIV单次感染宿主细胞的特性，通过在细胞核内将每个细胞的整合位点信息和HIV-宿主染色质DNA相互作用信息原位偶联，进而区分并解析出单个细胞中的整合位点信息以及与每一个整合位点对应的HIV LTR-宿主染色质相互作用信息。并通过使细胞中与HIV发生相互作用的染色质DNA片段与LTR片段发生邻近连接，然后在距离5’LTR前130bp范围内、或者距离3’LTR后130bp范围内设计HIV LTR特异性引物使得可以在保留并检测到HIV-宿主细胞嵌合位点信息的同时，扩增出与LTR发生相互作用的宿主染色质DNA序列。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明方法可同时对应解析单个细胞内病毒整合位点及对应病毒LTR-宿主染色质相互作用信息，现有技术均无法做到；
2)本发明方法可应用于低细胞量临床样本，建库要求最低DNA量为1μg，对应最低可检测约15×104个具有HIV整合的细胞；
3)本发明方法流程简单直接，最快3天即可建成文库，而4C需要5天，一轮酶切使得本发明方法对于限制性内切酶的选择具有更高宽容度，酶的选择更多；
4)本发明方法可通过临床多样本数据分析，依据整合位点检测结果以及染色质互作强度建立临床AIDs预后分子生物学评估方法，为病人预后服药提供精准医疗指导，以及评估病人疾病复发风险的发展潜力。
附图说明
图1为一种检测病毒整合位点并解析相互作用信息的方法的流程图；
图2为本发明方法(LM-TAG)与现有技术方法捕获到的染色质互作信号图；
图3为本发明方法(LM-TAG)与4C技术捕获到的染色质互作信号图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1、使用1％甲醛交联后Jurkat细胞10分钟，使用浓度为0.1％的十二烷基硫酸钠(SDS)在4℃处理透化细胞膜1小时，随后使用浓度为0.55％的十二烷基硫酸钠(SDS)在25℃、62℃、37℃各透化细胞核膜10分钟，使用限制性内切酶DdeI(10个单位每100万个细胞)在保留HIV LTR基本完整的同时对细胞核内DNA进行过夜，在细胞核内原位酶切DNA以片段化至6kb左右。
2、参照ChIA-PET技术末端修复体系，通过Klenow大片段修复DNA片段酶切后产生的黏性末端，并同时在DNA片段3’末端补加A碱基，加入带有生物素标记的T-linker、T4聚合酶，16℃过夜连接，使空间上邻近的DNA片段末端和T-linker发生邻近连接。
3、使用超声破碎仪将DNA打断到2～3kb；通过酚氯仿提纯细胞内所有DNA，可根据以下两种方案进行文库构建：
1)使用适量Tn5-N7对1～10ug DNA进行酶切，使得产物片段主要分布在700～800bp，通过M280磁珠(100μg)富集带有生物素标记的片段；
或先通过M280磁珠(300μg)富集带有生物素标记的DNA片段(<100μg)，再使用适量Tn5-N7将M280磁珠所捕获的DNA酶切至700-800bp；注：Tn5-N7酶用量需要根据细胞系、超声后细胞DNA片段分布实际情况、Tn5酶活性调整。
4、使用针对HIV LTR设计的两条特异性引物REV_LTR1(SEQ ID NO.1，GTGTGTAGTTCTGCCAATCAGG)和REV_LTR2(SEQ ID NO.2，TGCCAATCAGGGAAGTAGCC)进行巢式PCR(22+20个循环)，获得巢式PCR产物，富集含有LTR(长末端重复序列)的互作信息，特异性引物REV_LTR2位于距离5’LTR前130bp范围内、或者距离3’LTR后130bp范围内以保证二代测序平台能够测到至少20bp宿主基因组序列；最后通过带有N5序列的N5_REV_LTR2引物(SEQID NO.3，TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTGCCAATCAGGGAAGTAGCC)与N7短引物(SEQID NO.4，CAAGCAGAAGACGGCATACGA)对巢式PCR产物进行扩增建库；测序并分析数据，解析出每个细胞中的整合位点信息，以及对应整合位点上HIV LTR与宿主基因组间发生的染色质相互作用信息(流程参考图1)。
参考图2为本发明方法(LM-TAG)与现有技术方法捕获到的染色质互作信号图，本发明的方法可以同时对应解析单个细胞内病毒整合位点、对应病毒LTR-宿主染色质相互作用信息，现有技术均无法做到。本发明的检测结果具有更好的可靠性。
图3为本发明方法(LM-TAG)与4C技术捕获到的染色质互作信号图，本发明方法可应用于低细胞量临床样本，建库要求最低DNA量为1μg，对应最低可检测约15×104个具有HIV整合的细胞，而4C建库最低DNA量为64μg；本发明方法用量为1μg，流程简单直接，最快3天即可建成文库，而4C需要5天。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种单细胞水平检测HIV整合位点及对应HIV-宿主基因组相互作用的方法
<130> 2021-12-23
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gtgtgtagtt ctgccaatca gg 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tgccaatcag ggaagtagcc 20
<210> 3
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagtgccaat cagggaagta gcc 53
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
caagcagaag acggcatacg a 21

Claims (6)

1.一种单细胞水平检测HIV整合位点及对应HIV-宿主基因组相互作用的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）透化整合有HIV的宿主细胞的细胞膜和细胞核膜，利用限制性内切酶将细胞内DNA进行片段化；所述限制性内切酶为限制性内切酶DdeI；
2）通过Klenow大片段修复DNA片段化酶切后产生的黏性末端，并在片段化后的DNA的3’末端加A碱基，加入带有生物素标记的T-linker、T4 DNA连接酶，使空间上邻近的DNA片段末端和T-linker发生邻近连接；
3）打断、提纯DNA，构建DNA文库，使用针对HIV-LTR的特异性引物REV_LTR1、REV_LTR2进行巢式PCR，获得巢式PCR产物，富集LTR相关的互作信息、整合位点信息；
4）通过带有N5序列的N5_REV_LTR2引物和N7短引物对巢式PCR产物进行扩增建库，测序并分析数据，解析细胞中整合位点信息，对应整合位点上HIV-LTR与宿主基因组间发生的染色质相互作用信息；
所述特异性引物REV_LTR1、REV_LTR2的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
所述步骤3）中，构建DNA文库包括以下步骤：
a）使用Tn5-N7 对DNA进行酶切，酶切后的产物片段为700~800bp，通过磁珠富集带有生物素标记的DNA片段；或者，
b）通过磁珠富集带有生物素标记的DNA片段，再使用Tn5-N7对富集的DNA片段进行酶切，酶切后的产物片段为700~800bp。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述N5_REV_LTR2引物如SEQ ID NO.3所示，所述N7短引物的序列如SEQ ID NO.4所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁珠包括M280磁珠。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，透化整合有HIV的细胞的细胞膜和细胞核膜的具体步骤为：使用浓度为0.1% 十二烷基硫酸钠在4℃处理透化细胞膜1小时，随后使用浓度为0.55% 十二烷基硫酸钠在25℃、62℃、37℃各透化细胞核膜10分钟。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中，巢式PCR进行22+20个循环。
6.如权利要求1～5任一项所述的方法在检测HIV整合位点及检测在整合位点上HIV基因组与宿主基因组的相互作用中的应用。
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