CN113337640A - 登革病毒和寨卡病毒检测试剂组合和检测方法 - Google Patents

登革病毒和寨卡病毒检测试剂组合和检测方法 Download PDF

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CN113337640A CN202110629342.XA CN202110629342A CN113337640A CN 113337640 A CN113337640 A CN 113337640A CN 202110629342 A CN202110629342 A CN 202110629342A CN 113337640 A CN113337640 A CN 113337640A
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代函鹰
周兆平
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Abstract

本发明公开一种登革病毒和寨卡病毒检测试剂组合和检测方法，其中，登革病毒和寨卡病毒检测试剂组合包括核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的第一引物，核苷酸序列如SEQ ID No：2所示的第二引物，第三引物以及第四引物；第一引物和第二引物用以结合登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的一致性序列；第三引物和第四引物用以特异性结合寨卡病毒区别于所述一致性序列的序列。本发明检测试剂组合实现了对登革病毒四种血清型毒株、寨卡病毒的同时检测以及对寨卡病毒的特异性检测，在保证检测高特异性和高敏感性的基础上，简化了检测流程，对人群感染登革病毒、寨卡病毒的危险性评估和早期预警具有重要的临床应用价值。

Description

登革病毒和寨卡病毒检测试剂组合和检测方法
技术领域
本发明涉及基因检测领域，特别涉及一种登革病毒和寨卡病毒检测试剂组合和检测方法。
背景技术
登革热(dengue fever，DF)是通过埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedesalbopictus)传播、由登革病毒(dengue virus,DENV)感染引起的人类最严重的虫媒传染病。登革病毒包括四种不同但密切相关的血清型毒株(DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4)。伊蚊除了传播登革病毒以外，还传播寨卡病毒。由于登革病毒和寨卡病毒的早期症状及轻症症状非常相似，传播途径也相似，从临床症状、流行病学很难对此加以区分。现有技术常采用血清学方法和分子生物学方法对登革病毒和寨卡病毒进行检测。但是，在现有的诊断方法中，需要对登革病毒的四种血清型毒株和寨卡病毒进行分别检测，不仅操作流程繁琐，也容易造成二次污染和产生假阳/阴性的结果。
上述内容仅用于辅助理解发明的技术方案，并不代表承认上述内容是现有技术。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种登革病毒和寨卡病毒检测试剂组合及检测方法，旨在解决现有技术检测登革病毒和寨卡病毒操作流程繁琐的技术问题。
为实现上述目的，第一方面，本发明提出一种登革病毒和寨卡病毒检测试剂组合，包括：
第一引物，核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；
第二引物，核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；
第三引物；以及
第四引物；
其中，所述第一引物和所述第二引物用以结合登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的一致性序列，所述第三引物和所述第四引物用以特异性结合寨卡病毒区别于所述一致性序列的序列。
可选地，所述第三引物的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；
所述第四引物的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。
第二方面，本发明还提出一种登革病毒和寨卡病毒检测方法，包括如下步骤：
(1)去除样本总RNA中的mRNA，逆转录得到cDNA；
(2)采用第一引物、第二引物实时荧光定量PCR扩增cDNA，根据获得的荧光曲线得到CT值；
(3)当CT值在15～30范围内时，采用第三引物、第四引物PCR扩增步骤(1)中的cDNA，对PCR产物进行鉴定来判断样本是否感染寨卡病毒；
或，采用第三引物、第四引物实时荧光定量PCR扩增步骤(1)中的cDNA，根据获得的荧光曲线得到CT值，通过CT值的大小来判断样本是否感染寨卡病毒；
其中，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示，所述第一引物和所述第二引物用以结合登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的一致性序列，所述第三引物和所述第四引物用以特异性结合寨卡病毒区别于所述一致性序列的序列。
可选地，所述第三引物的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；
所述第四引物的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。
可选地，所述去除样本总RNA中的mRNA采用oligo-dT负向选择方法。
可选地，所述逆转录得到cDNA采用随机引物PCR方法。
本发明提出一种登革病毒和寨卡病毒检测试剂组合，包括核苷酸序列如SEQ IDNo：1所示的第一引物，核苷酸序列如SEQ ID No：2所示的第二引物，第三引物以及第四引物；其中，所述第一引物和所述第二引物用以结合登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的一致性序列，所述第三引物和所述第四引物用以特异性结合寨卡病毒区别于所述一致性序列的序列。如此，所述第一引物和所述第二引物结合登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的一致性序列，通过实时定量PCR扩增检测，一次检测即能检测到登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的至少一种，从而判断出样本是否感染上述病毒的至少一种；所述第三引物和所述第四引物特异性结合寨卡病毒区别于所述一致性序列的序列，通过PCR扩增检测，检测出样本是否感染寨卡病毒。这样，本发明试剂盒实现对登革病毒四种血清型毒株、寨卡病毒的同时检测以及对寨卡病毒的特异性检测，在保证检测高特异性和高敏感性的基础上，简化了检测流程，提高了检测效率，对人群感染登革病毒、寨卡病毒的危险性评估和早期预警具有重要的临床应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为登革病毒基因和寨卡病毒基因的一致性序列比对图；
图2为登革病毒基因和寨卡病毒基因的特异性序列比对图；
图3为实施例一中实时定量PCR的荧光曲线图；
图4为实施例一中琼脂糖凝胶电泳结果图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
需要说明，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，全文中出现的“和/或”的含义为，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案，或B方案，或A和B同时满足的方案。
本发明提出一种登革病毒和寨卡病毒检测试剂组合。
本发明提出的登革病毒和寨卡病毒检测试剂组合包括核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的第一引物、核苷酸序列如SEQ ID No：2所示的第二引物、第三引物以及第四引物；其中，所述第一引物和所述第二引物用以结合登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的一致性序列，所述第三引物和所述第四引物用以特异性结合寨卡病毒区别于所述一致性序列的序列。
在本发明中，对登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的全基因组序列进行生物信息学比对，对比结果发现，虽然上述五种病毒的蛋白编码序列差异很大，保守性较低，但是在上述五种病毒NS3基因的个别区域内，存在显著的一致性序列，比对结果请参阅图1。图1中，在第一个一致性序列中，登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒(5’-3’方向)只在第3、6和9个碱基处出现单碱基的差异；在第二个一致性序列中，登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒(5’-3’方向)只在第9、12、15和18个碱基处出现单碱基的差异。在具有差异的单碱基处，可以采用引入简并碱基的方式来保证引物与模板的特异性结合。所以，对上述两个一致性序列中引入简并碱基，得到两个共有序列，通过碱基互补原则，基于两个所述共有序列设计的引物，可以分别以登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的cDNA为模板进行PCR扩增。所述共有序列如SEQ ID No：5和SEQ ID No：6所示，其中，SEQ ID No：5的序列可以为TTYCAYACHATGTGGCA，SEQ ID No：6的序列可以为ATGGATGARGCMCAYTTYAC。在上述序列中，Y为C或T；H为A、T或C；R为A或G；M为A或C。根据上述共有序列设计的引物：所述第一引物和所述第二引物。所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。具体地，SEQ ID No：1的序列为TTYCAYACHATGTGGCA；SEQ ID No：2的序列为GTRAARTGKGCYTCATCCAT。在上述序列中，Y为C或T；H为A、T或C；R为A或G；K为G或T。
还需要说明的是，登革病毒四种血清型毒株与寨卡病毒的一致性序列不仅仅包括如图1中所示的两个序列。但是发明人在选取一致性序列时，考虑到基于共有序列设计的引物用于实时定量PCR检测，为了节约检测成本和降低检测难度，所述第一引物和所述第二引物的扩增产物在200～500bp以内比较合适，因此选取的两个一致性序列之间的距离在200～500bp以内比较合适。但是，当两个一致性序列之间的距离小于200bp或大于500bp时，基于共有序列设计出的引物也可以用于实时定量PCR的检测，本发明对此不做限定。
所述第三引物和所述第四引物用以特异性结合寨卡病毒区别于所述一致性序列的序列。对登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的基因组进行生物信息学比对，获得寨卡病毒区别于所述一致性序列的序列，也即寨卡病毒基因组中排除所述一致性序列的序列。基于上述区别序列设计引物，通过碱基互补配对原则，得到所述第三引物和所述第四引物。所述第三引物和所述第四引物可以被用于普通PCR检测，也可被用于实时定量PCR检测，本发明对此不做限定。因为所述第一引物和所述第二引物结合登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的一致性序列，通过所述第一引物和所述第二引物只能检测到样本是否感染登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的至少一种。所以，当检测到样本感染登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的至少一种时，通过所述第三引物和所述第四引物，可以进一步检测到样品是否感染寨卡病毒。
本发明提出一种登革病毒和寨卡病毒检测试剂组合，包括核苷酸序列如SEQ IDNo：1所示的第一引物，核苷酸序列如SEQ ID No：2所示的第二引物，第三引物以及第四引物；其中，所述第一引物和所述第二引物用以结合登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的一致性序列，所述第三引物和所述第四引物用以特异性结合寨卡病毒区别于所述一致性序列的序列。如此，所述第一引物和所述第二引物结合登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的一致性序列，通过实时定量PCR扩增检测，一次检测即能检测到登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的至少一种，从而判断出样本是否感染上述病毒的至少一种；所述第三引物和所述第四引物特异性结合寨卡病毒区别于所述一致性序列的序列，通过PCR扩增检测，检测出样本是否感染寨卡病毒。这样，本发明试剂盒实现对登革病毒四种血清型毒株、寨卡病毒的同时检测以及对寨卡病毒的特异性检测，在保证检测的高特异性和高敏感性基础上，简化了检测流程，提高了检测效率，对人群感染登革病毒、寨卡病毒的危险性评估和早期预警具有重要的临床应用价值。
可选地，所述第三引物的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；所述第四引物的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。对登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的NS3基因序列进行生物信息学比对，获得寨卡病毒区别于所述一致性序列的序列。比对结果请参阅图2，两个区别序列如SEQ ID No：7和SEQ ID No：8所示，其中，SEQ ID No：7的序列为AAGGAAGTAAAAAAGGGGGAGACCA，SEQ ID NO：8的序列为TGGAGGTGGGTGCGCAGAGAC。基于上述区别序列设计引物：所述第三引物和所述第四引物。所述第三引物的核苷酸序列如SEQ IDNo：3所示；所述第四引物的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。SEQ ID NO：3的序列为AAGGAAGTAAAAAAGGGGGAGACCA，SEQ ID NO：4的序列为GTCTCTGCGCACCCACCTCCA。以登革病毒cDNA为模板，所述第三引物和所述第四引物扩增的产物长约为1500bp左右。
本发明还提出一种登革病毒和寨卡病毒检测方法。
本发明提出的登革病毒和寨卡病毒检测方法，包括如下步骤：(1)去除样本总RNA中的mRNA，逆转录得到cDNA；(2)采用第一引物、第二引物实时荧光定量PCR扩增cDNA，根据获得的荧光曲线得到CT值，(3)当CT值在15～30范围内时，采用第三引物、第四引物PCR扩增步骤(1)中的cDNA，对PCR产物进行鉴定来判断样本是否感染寨卡病毒；或，采用第三引物、第四引物实时荧光定量PCR扩增步骤(1)中的cDNA，根据获得的荧光曲线得到CT值，通过CT值的大小来判断样本是否感染寨卡病毒；其中，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示，所述第一引物和所述第二引物用以结合登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的一致性序列，所述第三引物和所述第四引物用以特异性结合寨卡病毒区别于所述一致性序列的序列。
在本发明检测方法中，PCR的模板采用去除样本mRNA后逆转录得到的cDNA，这样可以避免因样本mRNA污染出现的假阳/阴结果。采用第一引物、第二引物实时荧光定量PCR扩增所述cDNA，其中，SEQ ID No：1的序列为TTYCAYACHATGTGGCA；SEQ ID No：2的序列为GTRAARTGKGCYTCATCCAT。在上述序列中，Y为C或T；H为A、T或C；R为A或G；K为G或T。
荧光PCR仪捕获PCR过程中发出的荧光信号，并生成相应的荧光曲线，根据生成的荧光曲线可以观测到相应的CT值，当所述CT值小于15时，PCR扩增在基线期范围内，未达到荧光阈值，检测结果不可取。若所述CT值大于30，理论上模板起始拷贝数小于1，认为无意义，PCR模板中没有登革病毒四种血清型毒株cDNA和寨卡病毒cDNA的至少一种，也即样本没有感染登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的至少一种。当CT值在15～30范围内时，PCR模板中包含登革病毒四种血清型毒株cDNA和寨卡病毒cDNA的至少一种，即样本感染登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的至少一种。但是，上述检测无法确定样本感染病毒的种类。考虑到市面上已经存在可以单独检测登革病毒四种血清型毒株的试剂盒，本发明检测方法不对登革病毒四种血清型毒株进行单独检测，只对还未存在检测试剂盒的寨卡病毒进行单独检测。
因此，采用本发明登革病毒和寨卡病毒检测方法，可以初步判断样本是否感染登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的至少一种，不需要对样本进行一对一检测登革病毒四种血清型毒株，简化了检测流程，节约了检测成本，提高了检测效率。同时，本发明检测方法一次检测既能确定样本是否感染登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的至少一种，降低因重复取样造成二次污染的概率，提高了检测效果。并且，本发明检测方法采用的模板cDNA中不包含mRNA的逆转录片段，避免了因mRNA产生的假阳/阴性结果。
可选地，所述第三引物的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；所述第四引物的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。SEQ ID NO：3的序列为AAGGAAGTAAAAAAGGGGGAGACCA，SEQ ID NO：4的序列为GTCTCTGCGCACCCACCTCCA。
可选地，所述去除样本总RNA中的mRNA采用oligo-dT负向选择方法。具体而言，宿主mRNA具有多聚polyA尾(3’-polyA)，而登革病毒RNA和寨卡病毒3’末端没有多聚polyA尾(3’-polyA)。可以利用寡dT纤维素(oligoT纤维素)和核酸纯化柱(Spin Column柱)吸附除去样本RNA中大量的mRNA分子，保留没有多聚polyA(3’-polyA)尾的病毒RNA，从而利用负向选择纯化登革病毒RNA和寨卡病毒RNA。
可选地，所述逆转录得到cDNA采用随机引物PCR方法。随机引物逆转录PCR方法反应稳定，对模板的要求不严格，反应产物的比活性较高，可以大量逆转录扩增病毒RNA。可以采用市面上购买的随机引物PCR试剂盒进行PCR反应，反应液的配制和反应步骤请参考试剂盒说明书，不再赘述。
实施例一
(一)病毒RNA的提取纯化
病毒RNA提取纯化的步骤如下：
1、获得病人血清临床样本六份，利用Trizol试剂分别提取总RNA分子；
2、负向选择方法去除总RNA分子中的mRNA；
3、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和紫外分光光度计(OD260/OD280)检测纯化后RNA的浓度和纯度，OD260/OD280≥2.0。
(二)逆转录得到cDNA
随机引物法逆转录纯化后的RNA，得到cDNA片段。所有操作均在冰上进行。具体操作如下：
1、取RNA样本1ug，加入随机引物1ul，再加适量DEPC水至总体积12ul；
2、将上述混合物置于PCR仪上，65℃反应5min，置于冰上2-3min；
3、向上述混合物中分别加入2ul的dNTP Mix(10mM)、1ul的RiboLock RNaseInhibitor、4ul的5×Reaction Buffer、1ul的RevertAidTM M-MuLV ReverseTranscriptase，总体系20uL，充分混匀；
4、将上述反应体系置于PCR仪中，42℃反应60min，然后70℃温育5min，获得逆转录后的cDNA片段。
(三)共有引物的设计
对登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的全基因组序列进行生物信息学比对，请参阅图1，在上述五种病毒NS3基因的个别区域内，存在两个一致性序列。对两个所述一致性序列引入简并碱基，得到两个共有序列。两个所述共有序列的核苷酸序列如SEQ ID No：5和SEQ ID No：6所示，基于两个所述共有序列设计的所述第一引物和所述第二引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示。
(三)实时荧光定量PCR检测
以逆转录获得的cDNA作为模板，进行实时荧光定量PCR检测，内参基因为18SrRNA。18S rRNA是一类核糖体RNA，没有多聚polyA尾(3’-polyA)，在细胞中的表达稳定，且表达丰度高。PCR反应体系为：Real Master mix(2x)，10ul；第一引物，0.4ul；第二引物，0.4ul；cDNA，1ul；H2O，8.2ul；总体积，20ul。PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性15s；50℃退火/延伸40s；共40个循环。PCR反应结束后，荧光PCR仪自动生成荧光曲线，根据获得的荧光曲线得到CT值。
请参阅图3，在六份样本中，CT值的大小分别约为24.98、25.17、27.25、28.70、29.03和31.58，第一至第五份样本的CT值位于15～30范围内，说明第一至第五份样本的PCR模板中包含登革病毒四种血清型毒株cDNA和寨卡病毒cDNA的至少一种，也即第一至第五份样本感染登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的至少一种。第六份样本的CT值大于30，说明第六份样本的PCR模板中不包含登革病毒四种血清型毒株cDNA和寨卡病毒cDNA，也即第六份样本没有感染登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒。六份样本18S rRNA的参考CT值分别为15.30、15.39、15.77、15.49、15.55和15.64，+/-值小于0.5，检测结果具有可信度。
(四)特异性引物的设计
为了进一步确定第一至第五份样本是否感染寨卡病毒，接着对样品进行寨卡病毒的检测。对登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的基因序列进行生物信息学比对，获得寨卡病毒区别于上述一致性序列的序列。所述区别序列的核苷酸序列分别如SEQ ID No：7和SEQ ID No：8所示，基于上述区别序列设计第三引物和第四引物，所述第三引物和所述第四引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示。
(五)PCR特异性检测寨卡病毒
同样以纯化后的cDNA作为模板，进行PCR反应。PCR反应体系为：cDNA，2μl；第三引物(10μM)，0.5μl；第四引物(10μM)，0.5μl；dNTP mix2μl，10×Taq buffer 2μl，Ex Taq 0.5μl；加H2O至总体积20ul。PCR反应程序：预变性，95℃，5min；变性，94℃，1min；退火，45-65℃，1min；延伸，72℃，1min；循环，35cycles；循环结束后，72℃，5min。
PCR结束后，取2-5μl的反应产物，进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。所述第三引物和所述第四引物可以扩增出大约1500bp左右的片段。请参阅图4，第一份样本、第三份样本和第四份样本的PCR产物可以跑出清晰可见的1500bp的条带，说明第一份样本、第三份样本和第四份样本的PCR模板中包含寨卡病毒的cDNA，也即第一份样本、第三份样本和第四份样本感染寨卡病毒。其中，第四份样本的条带清晰度低于第一份样本和第三份样本，说明第四份样本中寨卡病毒的cDNA浓度低于第一份样本和第三份样本的浓度，即第四份样本感染寨卡病毒的程度低于第一份样本和第三份样本。第二份样本的PCR产物没有跑出1500bp的条带，说明第二份样本的PCR模板中不包含寨卡病毒的cDNA，即第二份样本没有感染寨卡病毒。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳大学
<120> 登革病毒和寨卡病毒检测试剂组合和检测方法
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ttycayacha tgtggca 17
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gtraartgkg cytcatccat 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
aaggaagtaa aaaaggggga gacca 25
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gtctctgcgc acccacctcc a 21
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ttycayacha tgtggca 17
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
atggatgarg cmcayttyac 20
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
aaggaagtaa aaaaggggga gacca 25
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
tggaggtggg tgcgcagaga c 21

Claims (6)

1.一种登革病毒和寨卡病毒检测试剂组合，其特征在于，包括：
第一引物，核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；
第二引物，核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；
第三引物；以及
第四引物；
其中，所述第一引物和所述第二引物用以结合登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的一致性序列，所述第三引物和所述第四引物用以特异性结合寨卡病毒区别于所述一致性序列的序列。
2.如权利要求1所述的登革病毒和寨卡病毒检测试剂组合，其特征在于，
所述第三引物的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；
所述第四引物的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。
3.一种登革病毒和寨卡病毒检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)去除样本总RNA中的mRNA，逆转录得到cDNA；
(2)采用第一引物、第二引物实时荧光定量PCR扩增cDNA，根据获得的荧光曲线得到CT值；
(3)当CT值在15～30范围内时，采用第三引物、第四引物PCR扩增步骤(1)中的cDNA，对PCR产物进行鉴定来判断样本是否感染寨卡病毒；
或，采用第三引物、第四引物实时荧光定量PCR扩增步骤(1)中的cDNA，根据获得的荧光曲线得到CT值，通过CT值的大小来判断样本是否感染寨卡病毒；
其中，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示，所述第一引物和所述第二引物用以结合登革病毒四种血清型毒株和寨卡病毒的一致性序列，所述第三引物和所述第四引物用以特异性结合寨卡病毒区别于所述一致性序列的序列。
4.如权利要求3所述的登革病毒和寨卡病毒检测方法，其特征在于，
所述第三引物的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；
所述第四引物的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。
5.如权利要求3所述的登革病毒和寨卡病毒检测方法，其特征在于，所述去除样本总RNA中的mRNA采用oligo-dT负向选择方法。
6.如权利要求3所述的登革病毒和寨卡病毒检测方法，其特征在于，所述逆转录得到cDNA采用随机引物PCR方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115029479A (zh) * 2021-11-16 2022-09-09 江汉大学 一种寨卡病毒的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107151711A (zh) * 2017-06-26 2017-09-12 湖州市第人民医院 一种检测登革病毒和寨卡病毒的双重荧光定量rt‑pcr试剂盒
US20170369931A1 (en) * 2016-06-27 2017-12-28 Abbott Molecular Inc. Compositions and methods for detecting zika virus
CN109207564A (zh) * 2017-06-30 2019-01-15 青岛科技大学 一种等温核酸扩增的方法
CN110229931A (zh) * 2019-05-07 2019-09-13 山东国际旅行卫生保健中心 以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒检测试剂盒及其检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170369931A1 (en) * 2016-06-27 2017-12-28 Abbott Molecular Inc. Compositions and methods for detecting zika virus
CN107151711A (zh) * 2017-06-26 2017-09-12 湖州市第人民医院 一种检测登革病毒和寨卡病毒的双重荧光定量rt‑pcr试剂盒
CN109207564A (zh) * 2017-06-30 2019-01-15 青岛科技大学 一种等温核酸扩增的方法
CN110229931A (zh) * 2019-05-07 2019-09-13 山东国际旅行卫生保健中心 以高分辨率熔解曲线为基础的寨卡病毒检测试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OUMAR FAYE等: "Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught Mosquitoes", 《VIROL J.》 *
V T CHOW等: "Use of NS3 consensus primers for the polymerase chain reaction amplification and sequencing of dengue viruses and other flaviviruses", 《ARCH VIROL》 *
狄弘玮等: "寨卡病毒基因序列分析及核酸检测方法", 《第二军医大学学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115029479A (zh) * 2021-11-16 2022-09-09 江汉大学 一种寨卡病毒的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用
CN115029479B (zh) * 2021-11-16 2023-06-16 江汉大学 一种寨卡病毒的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用

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