CN111118218B - 对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组、试剂盒及其检测方法 - Google Patents

对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组、试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种对虾虹彩病毒的CRISPR‑Cas12a蛋白酶等温检测引物组、试剂盒及其检测方法，该引物组包括一对RPA引物、crRNA和一个包含荧光基团和猝灭基团的分子探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。本发明提供的对虾虹彩病毒的CRISPR‑Cas12a蛋白酶等温检测引物组及其试剂盒，能够特异性识别对虾虹彩病毒CMP基因的特异性序列，故其特异性和灵敏度极高，最低检测极限可达到0.1ag/μL，且非常稳定，能够有效的避免非特异性扩增而产生的假阳性，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的早期监测。

Description

对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组、试剂 盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组、试剂盒及其检测方法。
背景技术
虹彩病毒(简写为SHIV)属于虹彩病毒科，是一种二十面体对称的胞浆型、双链DNA病毒，该病毒的宿主很广，能够感染鱼类、两栖类和无脊椎动物。而感染该病毒会造成虾的造血组织、鳃丝、肝胰腺、附肢和肌肉的血细胞中出现嗜碱性包涵体和核固缩现象，主要的症状是游水，趴边，身体微红，肝胰腺萎缩以及空肠空胃。
对于该病的防治方法，国内外学者普遍认为，综合预防是相对有效的方法，即尽早发现疾病并采取诸多措施阻止病毒传播。因此，建立灵敏、准确、快捷、方便的SHIV病原检测方法是减少虹彩病发生和危害的重要途径。
目前，对于对虾是否感染虹彩病毒的检验通常采用病理学显微镜观察、生化测定、免疫学试验、细胞培养和PCR等，这些方法耗时、耗力、操作复杂，很难适应当前快速、准确检测的需要。
近年来，Recombinase Polymerase Amplification(RPA)技术和基因编辑技术的出现为其带来了一种更简便灵敏的检测方式，这是一种在恒温下可以快速检测的方法。在该方法中首先重组酶在37℃恒温条件下可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，然后利用Cas12a酶在crRNA的引导下与目标序列结合后，便会切换为激活状态，高效的切割体系内其它的单链DNA。在体系内加入含有报告基团的单链DNA探针底物后，如果Cas12a识别到靶序列的存在，就会切割单链探针底物从而释放荧光报告基团。
目前，关于对虾虹彩病毒的检测试剂盒的报道还较少，仅有采用RAA技术检测虾虹彩病毒的专利文献，即：申请公布号为CN107988428A发明专利申请公开了一种虾虹彩病毒(SIV)RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒，而采用RPA反应体系检测虾虹彩病毒的也较少，采用基因编辑技术的则未见报道。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组，该引物组的敏度高、特异性高且稳定性好，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的早期监测。
本发明的第二目的在于提供一种对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测试剂盒同样也具有高灵敏度、高特异性和高稳定性的特点，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的早期监测。
本发明的第三目的在于提供一种对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测方法，该方法能够快速高效地进行扩增，不仅操作简便，而且鉴定也更为简便。
具体技术方案如下：
本发明提供了一种对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组，包括：一对RPA引物、crRNA和一个包含荧光基团和猝灭基团的分子探针，其核苷酸序列如下所示：
SHIV-F：CAGATCAGAGCGCATTCGATCCCATAGGCACCGC(如SEQ ID NO.1所示)；
SHIV-R：CGTAAGAGAACATGTGGTATCCGGTGAGTTCGGG(如SEQ ID NO.2所示)；
SHIV-crRNA：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGGUGCCUAUGGGAUCGAAU(如SEQ ID NO.3所示)；
SHIV-P：Fam-TTATT-BHQ1(即Fam-SEQ ID NO.4-BHQ1)。
其中，NCBI中对虾虹彩病毒的gene bank号为KY681039.1，SHIV-F为RPA正向引物，SHIV-R为RPA反向引物，SHIV-crRNA为向导RNA，SHIV-P为包含荧光基团Fam和猝灭基团BHQ1的单链DNA分子探针。
本发明还提供了一种对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测试剂盒，包括CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组，所述CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组如上所述。
所述的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测试剂盒还包括：RPA反应液，CRISPR-Cas12a蛋白酶缓冲液，CRISPR-Cas12a蛋白酶，RNA酶抑制剂，阳性对照和阴性对照；
所述RPA反应液由RPA Buffer，20×Core reaction，10×E-Mix和MgOAc组成；
所述阳性对照为含有对虾虹彩病毒CMP基因片段的T载体；
所述阴性对照为超纯水。
本发明还提供了所述的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组或所述的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测试剂盒在快速鉴定对虾虹彩病毒中的应用。
本发明还提供了一种对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待检样品的DNA；
(2)利用权利要求1所述CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组或权利要求2所述CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测试剂盒对步骤(1)获得的待检样品的DNA依次进行重组酶聚合酶等温扩增反应和CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应，并根据扩增产物的荧光变化判断扩增结果。
在重组酶聚合酶等温扩增反应中，本发明提供的一对特异性RPA引物能够对对虾虹彩病毒特异性识别，且显著增加对虾虹彩病毒核酸的拷贝数；在CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应中，本发明提供的向导RNA、CRISPR-Cas12a蛋白酶与对虾虹彩病毒共同形成的反应体系能够激活CRISPR-Cas12a蛋白酶的切割活性，并通过切割分子探针的单链DNA产生荧光信号，从而即时、准确的检测对虾虹彩病毒。
进一步地，所述重组酶聚合酶等温扩增反应的反应体系为：总体积为25μl；
其中，10μM SHIV-F 1μl，10μM SHIV-R 1μl，RPA Buffer 12.5μl，20×corereaction 1.25μL，10×E-Mix 2.5μL，280mM醋酸镁1.25μl，待检DNA1～100ng，超纯水补齐到25μL；
所述CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应的反应体系为：总体积为20μl；
其中，10×Fncas12a Bufffer 2.5μl，10μM Fncas12a酶1μl，10μM crRNA2μl；5U/μL RNase抑制剂1μl；10μM SHIV-P 1μl，重组酶聚合酶等温扩增反应的扩增产物1μL，超纯水补齐至20μL。
进一步地，所述重组酶聚合酶等温扩增反应的反应条件为：37℃反应10～20min；所述CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应的反应程序为：37℃预变性1s，37℃变性45s，37℃退火、延伸15s，循环40次。
进一步地，所述判断扩增结果的方法为：收集荧光信号，如果出现扩增曲线则判定为阳性；如果无扩增曲线，则判定为阴性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组及其试剂盒，能够特异性识别对虾虹彩病毒CMP基因的特异性序列，故其特异性和灵敏度极高，最低检测极限可达到0.1ag/μL，且非常稳定，能够有效的避免非特异性扩增而产生的假阳性。
(2)本发明提供的对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测方法快速高效，整个过程仅需要1h，反应时间仅需要40min即可出实验结果。
(3)本发明提供的对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测方法操作简便，不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要控制反应温度为37℃就能反应和检测，条件比较温和。
(4)本发明提供的对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测方法可根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。
附图说明
图1为实施例1中CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应后的荧光检测结果图；
图2为实施例1中在紫外灯照射下CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应后反应管的荧光图。
图3为实施例2中引物特异性实验的结果图。
图4为实施例3中灵敏度实验的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。以下实施例中如无特殊说明，所使用原料均来源于市售，所采用方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。
实施例1
1、实验材料
样本1：杭州虾苗基地获取的虾苗(由浙江省水产技术推广总站提供)。
阳性质控品：Pet28a-CMP质粒，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2、对虾虹彩病毒DNA的提取
(1)称取30mg的实验样本(取整颗虾苗)，加入500μL的生理盐水，颠倒混匀后去除液体，重复该步骤一次；
(2)将洗净的虾苗置于研磨管中，加入1颗研磨珠(直径8mm)，加入100μL的裂解液，放入均质仪中，以6m/s匀浆20s；
(3)再加入100μL的裂解液，并加入20μL的蛋白酶K，56℃温浴1h；
(4)加入200μL的结合液，70℃下孵育10min；
(5)加入200μL的无水乙醇，颠倒混匀后加入吸附柱中，12000rpm离心30s；
(6)倒掉废液，向吸附柱中加入500μL的盐洗液，12000rpm离心30s；
(7)倒掉废液，向吸附柱中加入600μL的漂洗液，12000rpm离心30s；
(8)重复步骤7；
(9)彻底晾干漂洗液，加入100μLTE Buffer，离心，获得对虾血虹彩病毒DNA。
3、RPA引物、试剂盒及CRISPR-Cas12a蛋白酶检测方法
3.1 RPA引物的筛选
以第2部分提取获得的对虾血虹彩病毒DNA为模板，根据RPA引物的设计原则，设计多条RPA引物，经过筛选，得到最优引物的序列如下：
SHIV-F：CAGATCAGAGCGCATTCGATCCCATAGGCACCGC；
SHIV-R：CGTAAGAGAACATGTGGTATCCGGTGAGTTCGGG；
3.2 SHIV-crRNA的制备
3.2.1引物合成：
根据重组酶聚合酶等温扩增产物序列设计特异性的SHIV-crRNA引物，引物如下：
F：TAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATCGGTGCCTATGGGATCGAAT(如SEQID NO.6所示)；
R：ATTCGATCCCATAGGCACCGATCTACACTTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTA(如SEQID NO.7所示)；
3.2.2双链DNA的合成
以重组酶聚合酶等温扩增产物序列为模板，利用上述SHIV-crRNA引物进行扩增反应，反应体系的试剂配制和扩增程序如下：
试剂配制：
试剂名称 体积(50μL)
10×Buffer(without MgCl2) 5μL
引物F(100μM) 5μL
引物R(100μM) 5μL
水 35μL
程序：99℃10min；85℃，5min；80℃，5min；75℃，5min；70℃，5min；将扩增产物(双链DNA)切胶回收。
3.2.3转录和纯化RNA
对3.2.2扩增得到的双链DNA进行转录和RNA的纯化，转录所用试剂和转录试剂如下：
1、转录试剂配制:
其中，转录试剂盒购于南京诺唯赞(货号：TR101)
程序：37℃6h，结束后加入DNaseI，37℃消化15min，去除模板DNA。
2、RNA纯化(天根RNA纯化试剂盒(货号：DP412))：
(1)将未纯化的RNA产物用RNase-Free ddH2O补足至100μL，然后加入350μL的PK溶液；
(2)混匀后加入250μL无水乙醇；
将混合物加入至纯化柱中，12000rpm离心30s，弃废液；
(3)向管中加入500μL的漂洗液，室温放置2min，12000rpm离心30s，弃废液；
(4)重复上述步骤；
(5)加入14-20μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12000rpm离心2min；
(6)转录产物置于-80℃冰箱保存备用。
3.3重组酶聚合酶等温扩增反应
采用3.1筛选的RPA引物和3.2制备的SHIV-crRNA引物进行重组酶聚合酶等温扩增反应，反应体系如表1所示(总体积25μL)。
表1反应体系
其中，RPA试剂盒(RPA Buffer、20×Core Reaction、10×E-Mix和MgOAc)购置于英国Twist DX公司；反应体系混匀后，在37℃下放置15min。
3.4 CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应
利用3.3中放置15min后的完成重组酶聚合酶等温扩增反应的扩增产物以及3.2中制备crRNA构建反应体系，进行CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应，反应体系如表2所示(总体积20μL)。
表2反应体系
其中，Fncas12a酶、10×Fncas12a Bufffer购置于New England Biolabs(NEB)公司；RNase抑制剂购自于上海生工生物工程有限公司。
3.5荧光检测的方法和结果
检测方法：将3.4配制好的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应体系的反应管进行离心，置于ABI Step One仪器中，设置程序，程序如下：
最终得到CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应的检测结果。
检测结果：根据实验结果，出现扩增曲线的为阳性，无扩增曲线的则为阴性，实际样本和阳性质控品都出现了扩增曲线，而阴性对照未出现扩增(如图1所示)，在紫外灯下有明显的荧光(如图2所示)。
实施例2引物特异性实验
1、检测方法
为检测实施例1提供的试剂盒的引物特异性，采用上述实施例1第3部分提供的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温扩增检测方法，分别对病毒WSSV(对虾白斑综合症病毒)、IHHNV(传染性皮下及造血组织坏死病毒)、EHP(虾肝肠胞虫)、SHIV(对虾虹彩病毒)进行检测，分析试剂对SHIV病毒和对虾其他常见病毒的检测情况。
2、检测结果
检测结果表明，仅病毒SHIV样品出现“S”型扩增曲线，阴性对照(超纯水)及病毒WSSV、IHHNV、EHP样品均未出现扩增(如图3所示)。
上述实验结果说明，实施例1第3部分提供的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温扩增检测试剂盒能特异性扩增检测出病毒SHIV中的靶序列，而不与其它病毒核酸发生交叉反应，说明实施例1第3部分提供的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温扩增检测方法及试剂盒特异性好，未出现假阳性。
实施例3灵敏度实验
1、检测方法
提取阳性质粒(含有靶序列片段的T载体)，通过NanoDrop One对阳性质粒进行定量，并将其分别稀释到10pg/μL、1pg/μL、100ag/μL、10ag/μL、1ag/μL、0.1ag/μL。采用上述CRISPR-Cas12a蛋白酶检测方法，对稀释后的各浓度阳性质粒进行扩增检测。
2、检测结果
检测结果如图4所示，从左到右的曲线依次为10pg/μL、1pg/μL、100ag/μL、10ag/μL、1ag/μL、0.1ag/μL的阳性标准品的扩增结果，从中可以看出本发明的CRISPR-Cas12a试剂盒检测的灵敏度可达0.1ag/μL，精确性优于普通PCR检测方法，表明本发明的CRISPR-Cas12a蛋白酶检测试剂盒和检测方法对病毒SHIV的诊断具有高度的灵敏性。
序列表
<110> 杭州奥盛仪器有限公司
浙江科技学院
浙江省水产技术推广总站
<120> 对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组、试剂盒及其检测方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagatcagag cgcattcgat cccataggca ccgc 34
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgtaagagaa catgtggtat ccggtgagtt cggg 34
<210> 3
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uaauuucuac uaaguguaga ucggugccua ugggaucgaa u 41
<210> 4
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttatt 5
<210> 5
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgttgagat ttatttatga aaaaaaaatc ttgttaataa aaaattgtaa aatggctaat 60
attgcaggag ctctacaaga tatggctaat ctaggggcgg ttgaaaggta ccagtacgga 120
accaccaacg ccgtcactta ttttattcgt gaaacgagaa agtctacatt gttttctcaa 180
ctcccaattc aactctcatc taaaaatgga aatcccgatt tcgatcgtga atggtctgta 240
gaaccaagta aggcgttcga ttatctgatc catatgtgga tccgggttac cgttcccgaa 300
gttaaacttt tggcgggtaa tgtatataag gagcacggtc gaattcgctg gacccgaaac 360
tttatgcaca atcttatcaa gaaggtttca ttcaacgtaa acgatctcga gattgaaaag 420
tttgacaact atttcctcga tttctggaac caatttactc tgtcctcttc aaagaaggat 480
ggatacaaca acatgattgg aaacgatgat gatcttctga tcccaaaatc caaggatgga 540
aagattgaat caaagagtct tacacttcct atccccttct tcttttctcg tgattctggt 600
ttggctctcc cagtcggtgg tgtcaagtgg aacaagctca ggattgattt cgaattcagg 660
aactggacag agcttctgat tcttgaaaat gttggtgcgg cccacaatgg agagaaaaat 720
ccatgcaagg ttcctcaggt tggaagtgat atcgccgttg ccccctcact gtcaaatgtg 780
caatgttggg tgaatggtgg tcttatcccc gaagccgagc gagcacgtat gggatgtgtt 840
caccgcgaca tgttgattga atctatccag acttcttcca agctcaactt taaccccgtc 900
ctcaacccaa atccctctta cgacatcagg ttccagagaa ctgtaaaggc tctcttcttc 960
ggtgtcagga acactaccaa tccaaatgtt tggtccaatt acacaaccgc atcacccgta 1020
cccgacgccg acaagattga tttcgaccca gatcagagcg cattcgatcc cataggcacc 1080
gcaaacatta gatacgaatc ttcagatcgt attcccgtga tgactgccga ttacttctca 1140
ctgatcgaac cctactacaa ggcaccggcc attcccgaac tcaccggata ccacatgttc 1200
tcttacgctc tcaagatgaa caatgttgat ccttctgggt ctgccaatta cagcatcctg 1260
aacaatgtga gtatccaact tcaatgctcc gaagctgcta ttaaagcggc aaagggtgaa 1320
ggtgaagcca agactggtac cgattatgcg cagagcttcc agtttctggt tatcgccatc 1380
tctcagaatg ttcttactct gaagaacgga atgttgggtc taccatttat gtaa 1434
<210> 6
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taatacgact cactataggg taatttctac taagtgtaga tcggtgccta tgggatcgaa 60
t 61
<210> 7
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
attcgatccc ataggcaccg atctacactt agtagaaatt accctatagt gagtcgtatt 60
a 61

Claims (8)

1.一种对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组，包括：一对RPA引物、crRNA和一个包含荧光基团和猝灭基团的分子探针，其核苷酸序列如下所示：
SHIV- F：cagatcagagcgcattcgatcccataggcaccgc；
SHIV-R：CGTAAGAGAACATGTGGTATCCGGTGAGTTCGGG；
SHIV-crRNA：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCGGUGCCUAUGGGAUCGAAU；
SHIV-P：Fam-TTATT-BHQ1。
2.一种对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测试剂盒，包括CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组，其特征在于，所述CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组如权利要求1所示。
3.如权利要求2所述的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测试剂盒，其特征在于，还包括：RPA反应液，CRISPR-Cas12a蛋白酶缓冲液，CRISPR-Cas12a蛋白酶，RNA酶抑制剂，阳性对照和阴性对照；
所述RPA反应液由RPA Buffer，20 × Core reaction，10 ×E-Mix和280mM醋酸镁组成；
所述阳性对照为含有对虾虹彩病毒CMP基因片段的T载体；
所述阴性对照为超纯水。
4.如权利要求1所述的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组或权利要求2~3所述的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测试剂盒任一项在制备快速鉴定对虾虹彩病毒产品中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取待检样品的DNA；
（2）利用权利要求1所述CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组或权利要求2所述CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测试剂盒对步骤（1）获得的待检样品的DNA依次进行重组酶聚合酶等温扩增反应和CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应，并根据扩增产物的荧光变化判断扩增结果。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，
所述重组酶聚合酶等温扩增反应的反应体系为：总体积为25μl；
其中，10μM SHIV-F 1μl；10μM SHIV-R 1μl；RPA Buffer 12.5μl；20 × corereaction 1.25μL；10 × E-Mix 2.5μL；280mM MgOAc 1.25μl，待检DNA 1~100ng，超纯水补齐到25 μL；
所述CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应的反应体系为：总体积为20μl；
其中，10 × Fncas12a Bufffer 2.5μl；10μM Fncas12a酶 1μl；10μM crRNA 2μl；5U/μL RNase 抑制剂 1μl；10μM SHIV-P 1 μl；重组酶聚合酶等温扩增反应的扩增产物1μL；超纯水补齐至20μL。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组酶聚合酶等温扩增反应的反应条件为：37 ℃反应10~20 min；所述CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测反应的反应程序为：37℃预变性1s，37℃变性45s，37℃退火、延伸15s，循环40次。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述判断扩增结果的方法为：收集荧光信号，如果出现扩增曲线则判定为阳性；如果无扩增曲线，则判定为阴性。
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