CN113430274A

CN113430274A - 一种检测肝肠胞虫的rpa引物、探针、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN113430274A
Application number: CN202110659922.3A
Authority: CN
Inventors: 何建国; 庞建虎; 翁少萍
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2021-06-11
Filing date: 2021-06-11
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2041-06-11
Also published as: CN113430274B

Abstract

本发明公开了一种检测肝肠胞虫的RPA引物、探针、试剂盒及方法。本发明以肝肠胞虫的胞壁蛋白基因为靶基因，设计筛选得到了一对特异性强的RPA引物和探针，在此基础上建立了一种检测EHP的Real‑time RPA方法，该方法的操作简单，检测灵敏度高，其最低可检出10copies/μL的质粒DNA分子，且重复性好，检测结果可靠，适用于凡纳滨对虾养殖中EHP病原的检测和鉴定，也是Real‑time RPA首次应用于EHP定量检测的尝试。

Description

一种检测肝肠胞虫的RPA引物、探针、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于水产病原检测技术领域。更具体地，涉及一种检测肝肠胞虫的RPA引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

自1988年我国从夏威夷群岛引进了凡纳滨对虾，并在1992年人工繁殖成功，2000年开始批量育苗生产以来，随着养殖规模逐年扩大，凡纳滨对虾已经成为我国水产养殖业的支柱性品种。近些年我国已经成为世界凡纳滨对虾的第一养殖大国，我国的对虾养殖产业在世界对虾养殖发展中发挥主导作用。然而，病害限制了对虾养殖产业的发展，病毒、细菌、真菌、立克次氏体、寄生虫等都能导致对虾发病。对虾养殖中病毒性病原主要有白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)、桃拉病病毒(Taura Syndrome Virus，TSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious Hypodermal and HematopoieticNecrosis Virus，IHHNV)以及十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1，DIV1)等。其中以白斑综合症病毒(WSSV)的危害最大，但这些病毒目前基本都已建立了相应的检测方法。

近些年来肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)已经成为对虾中仅次于WSSV的第二大病原，目前对该病原的天然宿主、传播途径和感染方式尚无明确结论，亦无针对性治疗方法。EHP主要破坏对虾肝胰腺上皮细胞，中度感染EHP后会出现生长迟缓或停止，重度感染EHP后会出现生长停止或死亡的现象。一般在养殖30～40d后易出现EHP感染，感染早期往往不会影响对虾死亡和摄食率，但偶尔会伴有白便的现象，在对虾仔虾和成虾期均有感染迹象，并且该病有大规模爆发的趋势。为了监测养殖凡纳滨对虾中EHP的感染情况，及时对潜在风险进行针对性处理，有必要建立一种准确、快速、灵敏、特异的检测方法。

目前，针对水产动物病原检测的方法主要有原位杂交、ELISA、胶体金试纸条、PCR及LAMP等。例如中国专利CN 107326074A公开了一种南美白对虾肝肠胞虫LAMP检测的方法及其专用试剂盒。在实际检测过程中，原位杂交和ELISA的耗时长，灵敏度低；胶体金试纸条虽然检测快，但灵敏度偏低；LAMP则存在假阳性较高的情况；PCR检测方法虽然有较高的特异性和敏感性，但是对于精密仪器—PCR仪的依赖，限制了其广泛使用。

重组酶聚合酶核酸扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)具有操作方便，检测速度快，灵敏度高等优点，但该方法的引物设计难度大，方法构建困难，在水产病原检测上的应用较少。中国专利CN111979342A公开了一种利用RPA-LFS快速检测对虾肝肠胞虫的特异性引物对、检测试剂盒及其应用，但其不能对肝肠胞虫进行定量，且对扩增产物进行检测时需要开盖，极易造成污染，从而导致假阳性结果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种检测肝肠胞虫的RPA引物、探针、试剂盒及方法。

本发明的第一个目的是提供一种检测肝肠胞虫的RPA引物和探针。

本发明的第二个目的是提供一种检测肝肠胞虫的RPA试剂盒。

本发明的第三个目的是提供一种检测肝肠胞虫的Real-time RPA方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明以肝肠胞虫(EHP)的胞壁蛋白SWP的基因(spore wall protein gene)为靶基因，基因登录号为KX258197.1，在该基因的保守区域上选取合适片段设计探针并在其两边设计引物。

由于目前尚未有针对RPA引物和探针进行设计的软件，本发明在设计EHP的RPA引物和探针时进行了大量摸索。为了确保引物和探针的特异性，通过NCBI上的在线软件找到了SWP基因的保守区，设计了3对引物和1条exo探针，然后再经过实验验证设计的引物的扩增效率，筛选出最佳的引物和探针组合。

本发明首先提供了一种检测肝肠胞虫的RPA引物和探针，其包含一对RPA引物和一条特异性探针。RPA引物序列如SEQ ID NO.1～2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示，探针序列的第31位胸腺嘧啶T的标记物为6羧基荧光素(FAM)，第32位胞嘧啶C由四氢呋喃(THF)替换，第34位胸腺嘧啶T标记物为亚磷酰胺(BHQ1)，3’端进行C3间隔臂修饰的阻断基团(C3Spacer)修饰。

本发明同时申请保护上述RPA引物和探针在制备检测肝肠胞虫的试剂/试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种检测肝肠胞虫的RPA试剂盒，其包含SEQ ID NO.1～2所示RPA引物，SEQ ID NO.3所示探针，还包含RPA检测所需试剂。

本发明还提供了一种检测肝肠胞虫的Real-time RPA方法，其包含以下步骤：

S1.提取待测样本DNA；

S2.以步骤S1所得DNA为模板，用SEQ ID NO.1～2所示RPA引物和SEQ ID NO.3所示探针进行RPA反应；

S3.结果判定，若出现扩增曲线则表明待测样本中存在肝肠胞虫，反之为阴性结果。

优选地，步骤S1中样本若为虾苗则取甲壳下组织提取DNA，若为大虾则取肝胰腺，见实施例1。

具体地，步骤S2中的RPA反应体系为20μL，包含各0.84μL的正、反向引物，0.24μL的探针，11.8μL的缓冲液，0.8μL的模板，加水补至19μL，混匀后加入相应冻干酶粉，最后加入1.0μL的启动剂MgAc。

配制反应体系时，将用于扩增EHP目的基因的正、反向引物和RPA探针加入到重组酶聚合酶扩增体系中，再加入DNA模板；随后加入冻干酶粉，混匀后转移到PCR管中，加入启动剂MgAc后进行荧光定量反应。

具体地，步骤S2的RPA反应条件为37℃30s一个循环，共计40个循环。

本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种检测肝肠胞虫的RPA引物和探针，该RPA引物和探针的特异性强，在所述RPA引物和探针基础上，本发明同时建立了一种检测EHP的Real-time RPA方法。本发明通过在反应体系中加入特异的exo探针，可以在不开盖的情况下实时监测反应结果，避免因开盖受污染而导致的假阳性结果，使检测结果更加准确，本发明也是Real-time RPA首次应用于EHP定量检测的尝试。本发明所述Real-time RPA方法的操作简单，检测灵敏度高，重复性好，适用于凡纳滨对虾养殖中EHP病原的检测和鉴定。本发明通过优化Real-timeRPA反应条件，进一步提高了RPA检测的特异性和灵敏度。灵敏度检测结果表明本发明所建立的Real-time RPA方法具有很高的灵敏性，其最低可检出10copies/μL的质粒DNA分子，在95％置信区间可以检出约174copies的质粒DNA分子。同时在合适的模板浓度下，多次实验均能出现扩增曲线，表明检测重复性好。

本发明所述Real-time RPA方法可用于种虾筛选中，及时淘汰携带病原的亲虾传播，也可用于虾苗标粗初期，淘汰携带病原的虾苗以减少标粗过程中大量爆发引起的损失，还可以用于投苗养殖前的EHP检测，淘汰携带病原的虾苗，以减少养殖过程中的损失，适于推广使用。

附图说明

图1为最佳RPA引物对的筛选结果。

图2为最佳引物对在不同温度下的检测结果。

图3为Real-time RPA的特异性检测结果。

图4为Real-time RPA的灵敏度检测结果。

图5为巢氏PCR的第一轮检测结果。

图6为巢氏PCR的第二轮检测结果。

图7为Real-time RPA检测方法的标准曲线。

图8为95％置信区间内检出限图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 Real-time RPA反应体系的构建及优化

本发明以肝肠胞虫(EHP)的胞壁蛋白SWP基因(spore wall protein gene)为靶基因，该靶基因的登录号为KX258197.1。

1、首先根据GeneBank中公布的肝肠胞虫胞壁蛋白基因序列，参考文献(JaroenlakP,Sanguanrut P,Williams B,et al.A Nested PCR Assay to Avoid False PositiveDetection of the Microsporidian Enterocytozoonhepatopenaei(EHP)inEnvironmental Samples in Shrimp Farms[J].Plos One,2016,11(11):e0166320.)中的2对PCR扩增引物，对SWP的基因进行PCR扩增并测序。所述引物交由生工生物工程股份有限公司合成。

2对PCR扩增引物的序列如下所示：

swp-514-F：TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTT

swp-514-R：CACGATGTGTCTTTGCAATTTTC

swp-148-F：TTGGCGGCACAATTCTCAAACA

swp-148-R：GCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGA

2、基因组DNA的提取

取0.03g疑似感染EHP的对虾的肝胰腺组织，用匀浆器加1mL Trizol进行重复研磨，然后转移至无菌离心管。按照Omega公司的海洋生物组织基因组DNA提取试剂盒的说明书步骤提取对虾的基因组DNA，将DNA溶解于80μL ddH₂O中，-20℃保存备用。

以提取的DNA为模板，用上述2对PCR扩增引物分别进行扩增，对经PCR扩增、测序获得的编码序列，经Blast比对。对比结果发现所得序列与肝肠胞虫SWP的基因100％匹配。

3、阳性对照质粒的制备

pMD-19T-EHP阳性对照质粒通过以下制备方法获得。以EHP的基因组DNA为模板，用swp-514-F/R引物进行PCR扩增，得到扩增产物。将扩增产物回收并纯化后克隆至pMD-19T载体并测序，选取含有成功构建重组质粒的菌，提取质粒即得。

4、引物、探针的设计、筛选及温度优化

以肝肠胞虫(EHP)的胞壁蛋白SWP基因(spore wall protein gene)为靶基因，根据RPA扩增技术引物设计原则进行设计。由于目前尚未有针对RPA引物和探针进行设计的软件，本发明在设计EHP的RPA引物和探针时进行了大量摸索。为了确保引物和探针的特异性，通过NCBI上的在线软件找到了靶基因SWP基因的保守区，设计了3对引物和1条exo探针，如表1所示。所述引物和探针交由生工生物工程股份有限公司合成。

表1引物和探针序列信息表

使用TwistDx公司的

exo试剂盒，对表1中设计合成的引物进行筛选，并将筛选出的最佳引物组合用于反应温度的优化。

反应体系为20μL，包含各0.84μL(浓度为10μM)的正、反向引物，0.24μL(浓度为10μM)的exo探针，11.8μL的缓冲液(rehydration buffer)，0.8μL的阳性对照重组质粒模板或用0.8μLddH₂O做空白对照组，加ddH₂O至19μL。混匀后，按试剂盒说明书加入相应的冻干酶粉，振荡混匀、离心。最后将配制的体系转移至罗氏专用480板，加入1.0μL启动剂MgAc(280mM)，封上膜，迅速振荡并离心，使管壁上液体收集到管底。

将反应板迅速转移至设定好程序的480实时荧光定量PCR仪(罗氏)。反应条件为：37℃恒等温30s为一个循环，采集一次荧光信号，共40个循环，整个反应过程共20min。

引物的筛选结果如图1所示，由图可知，有2对引物得到了扩增曲线，根据Ct值及荧光强度，选定引物EHP-F1/R1为最佳引物进行后续实验。

最终确定使用的RPA引物和探针序列如下：

正向引物(SEQ ID NO.1)：

5’-GTAGGATATGAGCTTTCAAATACAGTTGGAGAC-3’；

反向引物(SEQ ID NO.2)：

5’-TTTTTTCTAAATTTTCTTTTTGATCTTCTT-3’；

探针序列及荧光标记(SEQ ID NO.3)：

5’-AAGTATTTTAAAAAAGAAGTGCAAACAAATTGATCATCAACGCAAAACTG-3’；

本发明对探针序列中的个别碱基进行了修饰，其中，第31位胸腺嘧啶T的标记物为FAM，第32位鸟嘌呤G由THF替换，第34位胸腺嘧啶T标记物为BHQ1，3’端进行C3Spacer修饰。

利用引物EHP-F1/R1，根据exo试剂盒说明书上推荐的反应温度，选择对37、38、39℃这3个不同的反应温度进行Real-time RPA扩增，选出最优反应温度，反应体系同上。

最佳反应温度的筛选结果如图2所示，由图可知，在同样的反应体系中，反应温度为37℃时的Ct值最小、荧光强度最强，故确定Real-time RPA等温扩增技术反应温度为37℃。

实施例2特异性测试

为检测Real-time RPA检测方法的特异性，本发明选择了几种常见对虾病原基因组DNA，包括白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)、桃拉病病毒(TauraSyndrome Virus，TSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious Hypodermal andHematopoietic Necrosis Virus，IHHNV)、十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus1，DIV1)以及急性肝胰腺坏死(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease，AHPND)。

将各种基因组的DNA稀释到10ng/μL，反应体系和温度同实施例1，以验证优化后的Real-time RPA检测方法的特异性。特异性检测结果如图3所示，结果表明，除了EHP出现阳性扩增曲线外，其他病原未出现扩增曲线，加水的对照组也无扩增曲线出现，说明构建的Real-time RPA检测方法特异性强。

实施例3灵敏度测试

将实施例1中构建的阳性对照质粒用ddH₂O依次稀释，稀释浓度分别为10⁸copies/μL、10⁷copies/μL、10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL、10⁰copies/μL共9个浓度梯度。取0.8μL不同浓度的模板DNA分别进行Real-time RPA和巢氏PCR检测，通过不同方法测试灵敏度差异，以ddH₂O为对照。Real-time RPA的反应体系和反应条件同实施例1。

本发明引用文献中已经报道的引物序列，作为构建的Real-time RPA方法的对照。巢氏PCR的扩增引物分别为swp-514-F/R和swp-148-F/R，具体序列参见实施例1，其中swp-514-F/R为一扩引物，swp-148-F/R为二扩引物。巢式PCR检测使用的是AG公司的AccurateTaq PCR Kit，PCR扩增体系为20μL，包括2×Accurate Taq Master Mix(dye plus)10μL，正、反向引物各1μL，DNA模板或ddH₂O 0.8μL，用ddH₂O补齐至20μL。巢氏PCR的反应程序为：94℃预变性30s；98℃变性10s、58℃退火45s、72℃延伸60s，共设30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。扩增结束后取5μL PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测。

若样品第一轮PCR扩增产物未检测出阳性条带，将产物用灭菌水稀释50倍作为模板，使用引物swp-148-F/R进行第二轮PCR扩增，PCR反应体系和扩增程序同上。取5μL第二轮PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。

Real-time RPA的结果如图4所示，表明本发明的引物、探针的最低能检测限为10copies/μL。巢式PCR的第一轮检测结果如图5所示，第二轮检测结果如图6所示，巢氏PCR能检测出的最低的模板浓度为10copies/μL。本发明所述方法的检测灵敏度与巢氏PCR相当，但操作更为简便，所需时间少。

实施例4重复性测试

以实施例3中各浓度梯度的质粒DNA为模板，按实施例1中构建的反应体系和条件，进行8组平行实验，验证建立的检测方法的可重复性，同时构建标准曲线和95％置信区间内检出限图。

在8组平行实验中，浓度10³～10⁸copies/μL均出现了阳性扩增曲线；而10²copies/μL的8组平行有7组出现扩增曲线；10copies/μL的8组平行有1组出现扩增曲线；1copy/μL的8组平行有0组出现扩增曲线。

本发明是Real-time RPA首次应用于EHP定量检测的尝试，构建的标准曲线如图7所示，R²＝0.9418。95％置信区间内检出限图如图8所示，由SPSS软件评估出的95％置信区间内检出限(LOD)为174copies，说明构建的Real-time RPA的检测方法的稳定性良好。

实施例5实际样品的检测

从广州周边某对虾养殖场疑似暴发EHP感染的养殖池中，随机捞取50尾凡纳滨对虾，立即冰冻运回实验室。按照实施例1中的步骤提取基因组DNA，用构建的Real-time RPA检测体系和对照的巢氏PCR检测方法进行检测。巢氏和RT-RPA对50个样品的检测结果如表2所示，Real-time RPA检测方法检测50个实际样品结果如表3所示，在50份实际检测样品中，巢氏PCR共检测出43份阳性，7份阴性；在43份阳性样本中用本发明所构建的Real-time RPA方法检测出42份阳性，灵敏度为97.7％，没有阴性样本被检出为阳性，特异性为100％。通过实施例4中构建的标准曲线计算，50份实际样品的检出时间为5.905～12.58min范围内，拷贝数在10²～10⁷copies/μL范围内。

表2巢氏和RT-RPA对50个样品的检测结果

表3 Real-time RPA检测方法检测50个实际样品结果

上述结果表明本发明所提供的引物、探针以及构建的检测方法的检测灵敏度高，能够特异地检测出不同来源的EHP，而其他水产常见病原均呈现阴性，其特异性及重复性良好。由于是在恒等温的条件下进行，不需要对模板链进行预变性，故扩增的效率大大提高，仅需20min即可完成扩增，而PCR技术检测时间则需要1～2h，所以本发明方法在检测时间上具有巨大优势，非常适合水产病害的检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> 一种检测肝肠胞虫的RPA引物、探针、试剂盒及方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtaggatatg agctttcaaa tacagttgga gac 33

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttttttctaa attttctttt tgatcttctt 30

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagtatttta aaaaagaagt gcaaacaaat tgatcatcaa cgcaaaactg 50

Claims

1.一种检测肝肠胞虫的RPA引物和探针，其特征在于，所述RPA引物序列如SEQ ID NO.1～2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示，探针序列第31位胸腺嘧啶T的标记物为FAM，第32位胞嘧啶C由THF替换，第34位胸腺嘧啶T标记物为BHQ1，3’端进行C3Spacer修饰。

2.权利要求1所述引物和探针在制备检测肝肠胞虫的试剂/试剂盒中的应用。

3.一种检测肝肠胞虫的RPA试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述RPA引物和探针。

4.根据权利要求3所述RPA试剂盒，其特征在于，还包含RPA检测所需试剂。

5.一种检测肝肠胞虫的Real-time RPA方法，其特征在于，包含以下步骤：

S1.提取待测样本DNA；

S2.以步骤S1所得DNA为模板，用权利要求1所述引物和探针进行RPA反应；

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤S1中样本若为虾苗则取甲壳下组织提取DNA，若为大虾则取肝胰腺。

7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤S2所述RPA反应体系为20μL，包含各0.84μL的正、反向引物，0.24μL的探针，11.8μL的缓冲液，0.8μL的模板，加水补至19μL，混匀后加入相应冻干酶粉，最后加入1.0μL的启动剂MgAc。

8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤S2所述RPA反应条件为37℃30s一个循环，共计40个循环。