CN109182597B

CN109182597B - 一种同时检测禽腺病毒i、ii、iii群多重荧光定量pcr试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN109182597B
Application number: CN201811018507.4A
Authority: CN
Inventors: 张健彬; 邓春兴; 徐贵峰
Original assignee: Guangzhou Weibaxin Biotechnology Co ltd
Current assignee: GUANGZHOU VIPOTION BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2018-09-03
Filing date: 2018-09-03
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2038-09-03
Also published as: CN109182597A

Abstract

本发明公开了一种同时检测禽腺病毒I、II、III群多重荧光PCR试剂盒及检测方法。本发明分别设计了3对特异性引物和3条不同荧光标记的检测探针，实现在一个反应中同时对禽腺病毒I、II、III群进行快速、准确分群的检测。本发明的试剂盒各检测通道荧光信号及扩增效率互不干扰，而且检测灵敏度高特异性好，可用于禽腺病毒感染的疫情检测和防控。

Description

一种同时检测禽腺病毒I、II、III群多重荧光定量PCR试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及了一种同时检测禽腺病毒I、II、III群多重荧光PCR试剂盒及检测方法。

背景技术

禽腺病毒，双链DNA病毒，属于腺病毒科禽腺病毒属。根据群特异性抗原结构不同分为3个群：I群、II群、III群。I群主要是传统的禽腺病毒，有12个血清型，代表株是鸡胚致死性孤儿病毒(CELO)，具有共同的群特异性抗原。II群禽腺病毒包括火鸡出血性肠炎病毒(HEV)、大理石脾病毒和鸡大脾病毒，它们与I群禽腺病毒无抗原相关性。III群禽腺病毒目前只有一个成员，即减蛋综合征病毒(EDSV)，它们只是部分的含有I群禽腺病毒的共同抗原。禽腺病毒引起的临床症状不一：I群腺病毒引起肉鸡出现严重的肝脏炎症，导致高感染率和高死亡率。II群腺病毒引起鸡出现精神沉郁、脾脏肿大、血便、免疫抑制和死亡。III群腺病毒引起禽类产蛋下降和卵壳形成不全等症状。2015年来，禽腺病毒发病区域不断扩大，给我国养禽业造成了巨大经济损失。由于不同群腺病毒之间不能形成交叉保护，故对禽腺病毒进行准确的分群检测，对禽腺病毒感染的预防和控制具有十分重要意义。

当前对于禽腺病毒的检测主要集中在I群和III群，且采用单重凝胶电泳PCR或单重荧光定量PCR法，尚没有对禽腺病毒I群、II群、III群同时进行多重荧光PCR分群检测方法的公开。

发明内容

本发明目的在于提供一种同时检测禽腺病毒I、II、III群多重荧光定量PCR引物和探针。

本发明的另一目的在于提供一种同时检测禽腺病毒I、II、III群多重荧光定量PCR试剂盒。

本发明的再一目的在于提供一种同时检测禽腺病毒I、II、III群多重荧光定量PCR方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种同时检测禽腺病毒I、II、III群多重荧光定量PCR引物组，所述引物组的核苷酸序列如下所示：

I-FADV-F：5’-GCGAGATYCCKCAGATG-3’(SEQ ID NO：1)；

I-FADV-R：5’-GGAGGYCKGTTCTCGAGC-3’(SEQ ID NO：2)；

II-FADV-F：5’-GCTGTTGTGCGATCTGAAG-3’(SEQ ID NO：4)；

II-FADV-R：5’-CATTGGAGGAGCAACGGTA-3’(SEQ ID NO：5)；

III-FADV-F：5’-GTGGGTGATAACAGGATTGTG-3’，(SEQ ID NO：7)；

III-FADV-R：5’-CGCCAAAGGATTGTAAGCT-3’(SEQ ID NO：8)。

一种同时检测禽腺病毒I、II、III群多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有上述所述的引物组。

进一步的，上述试剂盒中还含有探针组，所述探针组的核苷酸序列为：

I-FADV-P：5’-CCTGGGTCAAACCGAACATGTASTC-3’(SEQ ID NO：3)；

II-FADV-P：5’-TCAGCTTTATTAGAACCGCAAACGAG-3’(SEQ ID NO：6)；

III-FADV-P：5’-CTACTTCGACATCCAGGGCATCTTG-3’(SEQ ID NO：9)；

或者为该些序列的核苷酸互补序列。

进一步的，上述探针组的序列两端分别标有荧光基团和淬灭基团；各探针序列之间标记的荧光基团不同。

进一步的，上述试剂盒中还含有PCR反应液、Taq酶液、阴性质控品、阳性质控品。

进一步的，上述PCR反应液含有200～300mM Tris、45～55mM KCl、23～27mMMgCl₂、0.02％～0.03％Trixon-X100、4.5～5.5％甘油、6～7mM dNTP。

进一步的，上述Taq酶液由2.5U/μL热启动Taq酶、25mM Tris、30％甘油、1mM DTT组成。

一种同时检测禽腺病毒I、II、III群多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)从样品中提取核酸；

2)以提取的核酸为模板，用上述所述的引物组及上述所述探针组进行多重荧光定量PCR扩增反应并收集荧光信号；

3)根据荧光信号判定样品中是否含有禽腺病毒I、II、III群；

上述方法用于非疾病的诊断和治疗。

进一步的，上述步骤2)中的多重荧光定量PCR扩增反应体系为：

所述引物探针混合液中含有上述所述的引物组及上述所述探针组。

进一步的，上述步骤2)中多重荧光定量PCR扩增反应程序为：93～95℃，3～10min；93～95℃15～35s，52～58℃35～60s，40个循环。

本发明的有益效果是：

(1)本发明突破了普通PCR方法的限制，可同时实时定量样品中禽腺病毒I、II、III群的含量，灵敏度高、特异性强，重复性好。并突破了单荧光PCR检测的限制，可实现同时检测禽腺病毒I、II、III群，进一步减少了实验时间和成本，可根据构建的标准品DNA进行定量检测；非常适合大量临床样品的检测和疫情监控，为诊断和防控疫情提供技术支持。

(2)本发明在一管反应中只进行1次PCR扩增即可对禽腺病毒I、II、III群进行分群的多重荧光定量检测，旨在能快速准确区分禽腺病毒I群、II群和III群。为禽腺病毒感染的快速预防和控制提供便利。

附图说明

图1为本发明检测禽腺病毒样本的扩增结果图；

图2为本发明检测梯度标准阳性质控品的扩增结果图；

图3为本发明检测禽腺病毒I群FAM灵敏度结果图；

图4为本发明检测禽腺病毒II群VIC灵敏度结果图；

图5为本发明检测禽腺病毒III群TXR灵敏度结果图；

图6为本发明检测阴性质控品扩增结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1一种同时检测禽腺病毒I、II、III群多重荧光PCR试剂盒

(1)特异性引物及探针

本发明根据禽腺病毒I、II、III群的基因组序列，比对分析3类群的序列差异，然后设计大量的特异性的引物和探针，经大量实验筛选出一组同时对禽腺病毒I、II、III群具有高灵敏度的引物和探针序列，其序列如下：

1)I群禽腺病毒特异性的正向、反向的引物和探针序列分别是：

I-FADV-F：5’-GCGAGATYCCKCAGATG-3’(SEQ ID NO：1)；

I-FADV-R：5’-GGAGGYCKGTTCTCGAGC-3’(SEQ ID NO：2)；

I-FADV-P：5’-FAM-CCTGGGTCAAACCGAACATGTASTC-BHQ1-3’(SEQ ID NO：3)；

2)II群禽腺病毒特异性的正向、反向的引物和探针序列分别是：

II-FADV-F：5’-GCTGTTGTGCGATCTGAAG-3’(SEQ ID NO：4)；

II-FADV-R：5’-CATTGGAGGAGCAACGGTA-3’(SEQ ID NO：5)；

II-FADV-P：5’-VIC-TCAGCTTTATTAGAACCGCAAACGAG-BHQ1-3’(SEQ ID NO：6)；

3)III群禽腺病毒特异性的正向、反向的引物和探针序列分别是：

III-FADV-F：5’-GTGGGTGATAACAGGATTGTG-3’，(SEQ ID NO：7)；

III-FADV-R：5’-CGCCAAAGGATTGTAAGCT-3’(SEQ ID NO：8)；

III-FADV-P：5’-TXR-CTACTTCGACATCCAGGGCATCTTG-BHQ2-3’(SEQ ID NO：9)。

(2)一种同时检测禽腺病毒I、II、III群多重荧光PCR试剂盒包括如下成分：

1)优选的引物探针混合液中引物浓度均为2.5μM，I群禽腺病毒探针浓度为1.5μM，II群禽腺病毒探针浓度为2μM，III群禽腺病毒探针浓度为2μM。优选的引物探针混合液经过在0.5～4μM浓度范围内以0.5μM梯度变化筛选获得。

2)优选的PCR反应液含有250mM Tris、50mM KCl、25mM MgCl₂、0.025％Trixon-X100、5％甘油、6.5mM dNTP。

3)优选的酶液含有2.5U/μL热启动Taq酶、25mM Tris、30％甘油、1mM DTT。优选的酶液主要是热启动Taq酶在0.5～5U/μL浓度范围内以0.5U/μL梯度变化筛选获得。

4)阳性质控品

以禽腺病毒I、II、III类群引物扩增标准菌株，利用上述引物PCR扩增获得目的片段，然后将3段目的片段运用多片段重组方式构建与质粒载体中获得。

5)阴性质控品：为不含禽腺病毒核酸的生理盐水溶液。

实施例2一种同时检测禽腺病毒I、II、III群多重荧光PCR检测方法

本实施例采用实施例1中所述的试剂盒进行相应的实时荧光定量PCR检测。

(1)核酸提取

1)本方法及试剂盒适用标本类型包括禽呼吸道分泌物、脾脏、肝脏组织、肠道内容物、分泌排泄物、卵黄和病毒培养液等。

以实际样本为例(10例)：

已知I群禽腺病毒感染鸡脾脏组织2例和致死性孤儿病毒、FADV-4细胞培养液各1例；

已知II群禽腺病毒(火鸡出血性肠炎病毒)感染鸡肠道内容物3例；

已知III群禽腺病毒感染鸡的卵黄3例。

其它已知样本：H9亚型禽流感、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、鸭瘟病毒、禽网状内皮组织增生病毒、禽呼肠孤病毒、马立克病毒。

2)样本处理：

组织样品：取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5ml的EP管中，8000rpm离心2min，取上清200μl于1.5ml的EP管中；液体样品直接取200μl用于DNA/RNA提取。

3)核酸提取：取上述处理好的样本，再用QUEGEN的专用病毒总DNA/RNA核酸提取试剂盒进行核酸提取。

(2)PCR扩增

每个测试反应体系配制如下，

待检测样本的DNA、阴阳性对照都加4μl。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，设置各检测的名称和荧光基团种类，报告基团为FAM、VIC、TXR，淬灭基团选择none，设定扩增条件：93～95℃，3～7min；93～95℃15～35s，52～58℃35～60s，40个循环。优选的扩增条件为95℃，5min；95℃20s，55℃40s，40个循环。

(3)结果分析和判定：

1、结果分析条件设定

1)设置基线(baseline)：6-15cycle荧光信号。可根据具体情况对基线适当调整。

2)设置阈值(threshold)：以阈值线刚超过阴性对照扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点。

2、结果判断标准

阳性：检测样本Ct值小于等于35.0，且曲线有明显的指数增长期；

可疑：检测样本Ct值大于35.0且小于38.0，重复一次实验，如果Ct值仍小于38.0，且曲线有明显的指数增长期，为阳性，否则为阴性；

阴性：检测不到样本Ct值或Ct值大于38。

3、结果显示已知禽腺病毒I、II、III群的10例样本全为阳性；已知H9亚型禽流感、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、鸭瘟病毒、禽网状内皮组织增生病毒、禽呼肠孤病毒、马立克病毒、阴性对照组共计8例样本全为阴性。实验结果见图1所示。从中可以看出，本发明引物和探针检测靶标的准确率达100％，具有很好的特异性。

实施例3一种同时检测禽腺病毒I、II、III群多重荧光PCR试剂盒灵敏度实验

用紫外分光光光度计测定阳性质控品核酸浓度为3.5×10⁶，将其依次进行10倍梯度稀释为3.5×10⁵、3.5×10⁴、3.5×10³、3.5×10²、3.5×10¹copies/mL，PCR扩增进行灵敏度实验。

检测禽腺病毒I、II、III群多重荧光PCR试剂盒敏感性，实验结果见图2～图6，其中图3～5分别为本发明检测禽腺病毒I群中荧光FAM的灵敏度结果、II群中荧光的VIC灵敏度结果图、III群中荧光TXR灵敏度结果，图从左到右的样本浓度依次为3.5×10⁶、3.5×10⁵、3.5×10⁴、3.5×10³、3.5×10²copies/mL的扩增结果，3.5×10¹copies/mL无扩增曲线。说明本发明检测灵敏度为：3.5×10²copies/mL。图2为本发明3组引物对检测梯度标准阳性质控品的扩增结果图；图6为本发明检测阴性质控品扩增结果图。

上述结果说明本发明对禽腺病毒I、II、III群的检测限分别可达3.5×10²copies/mL。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州维伯鑫生物科技有限公司

<120> 一种同时检测禽腺病毒I、II、III群多重荧光定量PCR试剂盒及其检测方法

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcgagatycc kcagatg 17

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggaggyckgt tctcgagc 18

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctgggtcaa accgaacatg tastc 25

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctgttgtgc gatctgaag 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cattggagga gcaacggta 19

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcagctttat tagaaccgca aacgag 26

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtgggtgata acaggattgt g 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgccaaagga ttgtaagct 19

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctacttcgac atccagggca tcttg 25

Claims

1.一种同时检测禽腺病毒I、II、III群多重荧光定量PCR引物组和探针组，所述引物组的核苷酸序列如下所示：

I-FADV-F：5’- GCGAGATYCCKCAGATG -3’（SEQ ID NO：1）；

I-FADV-R：5’- GGAGGYCKGTTCTCGAGC -3’（SEQ ID NO：2）；

II-FADV-F：5’- GCTGTTGTGCGATCTGAAG -3’（SEQ ID NO：4）；

II-FADV-R：5’- CATTGGAGGAGCAACGGTA -3’ （SEQ ID NO：5）；

III-FADV-F：5’- GTGGGTGATAACAGGATTGTG -3’，（SEQ ID NO：7）；

III-FADV-R：5’- CGCCAAAGGATTGTAAGCT -3’（SEQ ID NO：8）；

所述探针组的核苷酸序列为：

I-FADV-P： 5’ - CCTGGGTCAAACCGAACATGTASTC -3’（SEQ ID NO：3）；

II-FADV-P： 5’- TCAGCTTTATTAGAACCGCAAACGAG -3’（SEQ ID NO：6）；

III-FADV-P：5’-CTACTTCGACATCCAGGGCATCTTG -3’（SEQ ID NO：9）；

或者为所述序列的核苷酸互补序列；

所述探针组的序列两端分别标有荧光基团和淬灭基团，各探针序列之间标记的荧光基团不同。

2.一种同时检测禽腺病毒I、II、III群多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述的引物组和探针组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有PCR反应液、Taq酶液、阴性质控品、阳性质控品。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，PCR反应液含有200～300mM Tris、45～55mM KCl、23～27mM MgCl₂、0.02%～0.03%Trixon-X100、4.5～5.5%甘油、6～7mM dNTP。

5.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，Taq酶液由2.5U/μL热启动Taq酶、25mMTris、30%甘油、1mM DTT组成。

6.一种同时检测禽腺病毒I、II、III群多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）从样品中提取核酸；

2）以提取的核酸为模板，用权利要求1所述的引物组及探针组进行多重荧光定量PCR扩增反应并收集荧光信号；

3）根据荧光信号判定样品中是否含有禽腺病毒I、II、III群；

上述方法用于非疾病的诊断和治疗。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤2）中的多重荧光定量PCR扩增反应体系为：

PCR反应液 18μl

引物探针混合液 2μl

Taq酶液 1μl

核酸模板 4μl

总体积共25μl。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤2）中多重荧光定量PCR扩增反应程序为：93~95℃，3~10min；93~95℃ 15~35s，52~58℃ 35~60s，40个循环。