CN114592089A

CN114592089A - 一种同时检测三种圆圈病毒的三重TaqMan荧光定量PCR试剂盒

Info

Publication number: CN114592089A
Application number: CN202210189653.3A
Authority: CN
Inventors: 成子强; 李佳琛; 周德方; 严天行; 刘圣龙; 赵钰莹
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2022-02-28
Filing date: 2022-02-28
Publication date: 2022-06-07

Abstract

本发明属于病毒检测领域，具体提供了一种同时检测三种圆圈病毒的三重TaqMan荧光定量PCR试剂盒，其中整合了鸡传染性贫血病毒(CAV)的正向引物、反向引物和特异性荧光探针；圆圈病毒禽源1型(Gyrovirus galga1，GyG1)的正向引物、反向引物和特异性荧光探针；圆圈病毒人源1型(Gyrovirushomsa1,GyH1)的正向引物、反向引物和特异性荧光探针；采用上述组成的试剂盒具备高灵敏性、高特异性、低污染和实时检测的优势，为畜禽养殖场临床圆圈病毒病的早期诊断、监测预警和防治，及动物食品安全检验提供可靠的技术和产品。

Description

一种同时检测三种圆圈病毒的三重TaqMan荧光定量PCR试剂盒

技术领域

本发明属于病毒检测领域，具体提供了一种同时检测三种圆圈病毒的三重TaqMan荧光定量PCR试剂盒。

背景技术

圆圈病毒Gyrovirus为单链环状DNA病毒，该病毒属曾经属于圆环病毒科(Circoviridae)，由于圆圈病毒在结构上和遗传信息上均与细环病毒科 (Anelloviridae)成员更加相似，因此2016年国际病毒分类委员会批准的最新病毒分类法，Gyrovirus被重新分配到细环病毒科家族。圆圈病毒属可以分为三个分支，其中鸡传染性贫血病毒(CAV)、圆圈病毒禽源1型(GyG1)和圆圈病毒人源1型(GyH1)同属于A分支。

其中鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anaemia virus，CAV)呈六角形，有的病毒粒子也呈球形，平均粒子大小约25nm，无囊膜。CAV可引起没有母源抗体保护的幼龄鸡的致死性临床症状和成年鸡的亚临床症状，同时造成严重的免疫抑制，因此加重其他细菌和病毒感染的严重程度并影响其他病原体疫苗接种的效果，从而在全球范围内给家禽业造成巨大的经济损失。无母源抗体的青年鸡感染CAV的临床特征包括精神沉郁、显著的体重下降(生长发育不良)、肌肉出血、皮下出血(“蓝翅病”)、严重贫血和骨髓发育不全，偶见坏疽性皮炎。临床中与CAV密切相关的综合征包括出血综合征、贫血皮炎综合征或蓝翅病。感染CAV最常见的大体病变是胸腺和骨髓萎缩，胸腺小叶体积显著减小甚至完全缺如，呈深红色，股骨骨髓变成黄色或淡粉色。贫血雏鸡的组织病理学特征是全骨髓再生障碍和全身淋巴组织萎缩。CAV的主要靶细胞是成红细胞和淋巴细胞前体细胞。骨髓中的造血细胞遭到破坏，从而使红细胞和髓细胞的数量急剧减少，这是导致贫血和免疫抑制的主要原因。CAV目前只有一种血清型，可通过水平和垂直传播感染所有年龄和类型的鸡，呈世界性地流行。

圆圈病毒禽源1型(Gyrovirus galga1，GyG1)发现于2011年。研究人员分别在巴西患病鸡血清和法国健康志愿者皮肤拭子样品中相继独立鉴定并命名了禽圆圈病毒2型(Avian gyrovirus 2，AGV2)和人圆圈病毒(Human gyrovirus, HGyV)，后鉴于两种病毒蛋白编码序列的高度同源性(93-97％)，借鉴圆环病毒属物种分界阈值80％全基因组核苷酸序列一致的分界规则，将其视为同种病毒。此后，在世界范围内的不同样品中检测到HGyV/GyG1的存在，这些样品包括人类、雪貂、王锦蛇、家猫。在巴西35种商品化疫苗中检测到CAV(7/35)和 GyG1(9/32)的污染，其中包括使用SPF鸡胚或原代成纤维细胞制作的活疫苗，这给行业人员造成极大的不安，但研究者在巴西出口导向的高密度商品代肉鸡场的正常鸡粪便病毒组中发现一系列单链环状DNA病毒，其中包括GyG1，2021 年国际病毒委员会重新将其命名为圆圈病毒禽源1型。

圆圈病毒人源1型(Gyrovirus homsa1,GyH1)2012年发现于智利的腹泻的儿童，2018年发现于传染性病毒性腺胃炎(Transmissible viral proventriculitis，TVP)病鸡。TVP主要引起鸡的吸收不良综合征、粪便过料综合征和发育不全综合征。该病能够显著降低鸡肉的产量，影响鸡肉品质，给养鸡业带来严重的经济损失。该病在世界范围内广泛流行，世界各国均有报道。有研究表明发生TVP后，鸡相关免疫器官发生萎缩，鸡群的免疫功能下降，严重时会导致免疫功能完全丧失。2021年国际病毒委员会重新将其命名为圆圈病毒人源1型。

三种圆圈病毒现在在我国普遍存在，造成了广泛的经济损失，但是目前我国区分鸡传染性贫血病毒(CAV)、圆圈病毒禽源1型(GyG1)、圆圈病毒人源 1型(GyH1)主要通过普通PCR技术，以及分子生物学和免疫学检测方法等，这些方法都存在或对操作者及环境有危害性，或操作复杂，或敏感性低或漏检、假阳性等难以解决的问题。

因此，提供一种能够同时检测三种圆圈病毒的三重实时荧光定量PCR引物和探针及试剂盒是本领域从业人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明针对上述技术存在的不足，提供了一种同时检测三种圆圈病毒的三重TaqMan荧光定量PCR试剂盒，其中整合了鸡传染性贫血病毒(CAV)的正向引物、反向引物和特异性荧光探针；圆圈病毒禽源1型(Gyrovirus galga1， GyG1)的正向引物、反向引物和特异性荧光探针；圆圈病毒人源1型(Gyrovirus homsa1,GyH1)的正向引物、反向引物和特异性荧光探针；采用上述组成的试剂盒具备高灵敏性、高特异性、低污染和实时检测的优势，为畜禽养殖场临床圆圈病毒病的早期诊断、监测预警和防治，及动物食品安全检验提供可靠的技术和产品。

发明人结合现有对于鸡传染性贫血病毒(CAV)、圆圈病毒禽源1型 (Gyrovirusgalga1，GyG1)和圆圈病毒人源1型(Gyrovirus homsa1,GyH1)病毒的研究现状，优选了最佳的引物及探针，并将其整合到快速检测试剂盒中，具体的技术方案如下：

发明人首先提供了用于检测三种病毒的引物和探针，分别为：

用于检测鸡传染性贫血病毒的引物和探针序列如下所示：

正向引物：GGTGTTCAGGCCACCAACAA；其核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示；

反向引物：GCAGATCTTAGCGTGGGAGC；其核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示；

探针：TATCGCTGTGTGGCTGCGCGAATGC；其核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示；

用于检测圆圈病毒禽源1型的引物和探针序列如下所示：

正向引物：AAAGGTGCACCGCCTATGTG；其核苷酸序列如SEQ ID NO.4 所示；

反向引物：GATTCACCGGTAGCCACTGC；其核苷酸序列如SEQ ID NO.5 所示；

探针：TACGGCAACGTGGAGTCGAACGCTCCA；其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

用于检测圆圈病毒人源1型的引物和探针序列如下所示：

正向引物：GTCGGTTGGGACTCTCTCCA；其核苷酸序列如SEQ ID NO.7 所示；

反向引物：GGAACCAGTGGCGTCTGAAG；其核苷酸序列如SEQ ID NO.8 所示；

探针：TTCCTGGCTTCGCGAGTGTTCGCGT；其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

且以上所述的探针的5′端均标记有荧光报告基团FAM，3′端均标记有荧光淬灭基团eclipse。

在引物和探针的基础上，发明人还提供了相应的检测试剂盒，试剂盒中除上述三组引物和探针外还含有荧光定量PCR反应液、标准阳性模板和阴性对照样品；所述阴性对照样品为无RNA酶双蒸水。

其中所述标准阳性模包括CAV标准品、GyG1标准品和GyH1标准品，三者分别为：

CAV标准品为克隆构建的编号为pMD-19T-CAV重组质粒，pMD-19T-CAV 重组克隆质粒含有所述反应液中CAV引物的扩增产物的目标核酸序列，其中目标序列为：

GGTGTTCAGGCCACCAACAAGTTCACGGCCGTTGGAAACCCCTCACT GCAGAGAGATCCGGATTGGTATCGCTGGAATTACAATCACTCTATCGCTGT GTGGCTGCGCGAATGCTCGCGCTCCCACGCTAAGATCTGC；其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

GyG1标准品为克隆构建的编号为pMD-19T-GyG1重组质粒， pMD-19T-GyG1重组克隆质粒含有所述反应液中GyG1引物的扩增产物的目标核酸序列，其中目标序列为：

AAAGGTGCACCGCCTATGTGCACCATGCAAAGAAAGACTCAGCAATA CGGCAACGTGGAGTCGAACGCTCCAGCAGATGAGCAGTGGCTACCGGTG AATC；其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

GyH1标准品为克隆构建的编号为pMD-19T-GyH1重组质粒， pMD-19T-GyH1重组克隆质粒含有所述反应液中GyH1引物的扩增产物的目标核酸序列，其中目标序列为：

GTCGGTTGGGACTCTCTCCAAAGAGATCCAAATTGGGCTCGGGTCAA CTATAATTACCGTATCGCTTCCTGGCTTCGCGAGTGTTCGCGTACTCACGAC GCGATCTGCAACTGCGGGGGCTTCAGACGCCACTGGTTCC；其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

用紫外分光光度计对所述三种重组克隆质粒的浓度进行定量，将定量后的所述重组克隆质粒通过缓冲溶液进行稀释，得到不同浓度梯度的多组重组克隆质粒(10¹～10¹⁰copies/μL)，分别作为一定量阳性对照和一定量参考品。

试剂盒中20μL的实时荧光定量PCR反应液组成如下：

2XPremix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，CAV、GyG1和GyH1正反向引物各0.4μL，探针各0.8μL，DNA样品1μL，加无DNA/RNA酶双蒸水至反应体系总体积为20μL。

上述试剂盒在检测时，所选的扩增程序为：

95℃预变性1min；95℃变性20s，65℃退火/延伸30s；50℃冷却30s，共进行40个循环。

对应检测结果判定有效的条件为：

阴性对照FAM通道检测无Ct值，阳性对照FAM通道检测Ct值≤30。

综上所述，本发明针对三种圆圈病毒，设计开发了一组具有高灵敏性和高特异性的引物探针组，并在该基础上组装成实时荧光定量PCR试剂盒，用于在同一荧光定量PCR反应体系中对病毒目的片段同时进行有效扩增，实现对三种病毒的实时定量检测，检测结果明显好于普通荧光定量PCR，敏感性显著高于常规荧光定量PCR，可以减少假阴性的发生，提升病毒检测水平，支持畜禽养殖场及时预警、早期诊断、防治和动物性食品的安全监测。

附图说明

图1为重组质粒的PCR鉴定；

其中：(a)pMD-19T-CAV的PCR鉴定结果：M：DL1000 DNA Marker；1： pMD-19T-CAV的PCR产物；

(b)pMD-19T-GyG1的PCR鉴定结果：M：DL1000 DNA Marker；1： pMD-19T-GyG1的PCR产物；

(c)pMD-19T-GyH1的PCR鉴定结果：M：DL1000 DNA Marker；1： pMD-19T-GyH1的PCR产物；

通过以上结果证明重组质粒构建成功；

图2为单重TaqMan荧光定量PCR扩增曲线；

其中：(a)pMD-19T-CAV的荧光定量PCR扩增曲线；(b)pMD-19T-GyG1的荧光定量PCR扩增曲线；(c)pMD-19T-GyH1荧光定量PCR扩增曲线；图中所标数字为病毒拷贝数log值；

图3为单重TaqMan荧光定量PCR标准曲线；

其中：(a)pMD-19T-CAV的荧光定量PCR标准曲线；(b)pMD-19T-GyG1的荧光定量PCR标准曲线；(c)pMD-19T-GyH1的荧光定量PCR标准曲线；纵坐标为Ct值，横坐标为病毒拷贝数log值；

图4为三重TaqMan荧光定量PCR扩增曲线；

其中：图中所标数字为病毒拷贝数log值；

图5为三重TaqMan荧光定量PCR标准曲线；

其中：纵坐标为Ct值，横坐标为病毒拷贝数log值；

图6为三重TaqMan荧光定量PCR敏感性实验；

图7为三重TaqMan荧光定量PCR特异性试验。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成。

实施例1CAV、GyG1和GyH1三重TaqMan荧光定量PCR方法的建立

(1)引物和探针的设计

根据GenBank中登录的圆圈病毒序列，用Primerpremier5.0软件设计了一组三种圆圈病毒的三重实时荧光定量PCR引物探针组。引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司公司合成，序列见表1。

表1荧光定量PCR引物和探针序列

获取目的基因

取现有毒株CAV(Cux-1株)、GyG1(HLJ1508株)和GyH1(SDAU-1株) 的DNA为模板，也可采用其他现有同种毒株的DNA为模板分别进行普通PCR 扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶(1.5％)电泳鉴定，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根)进行纯化回收。

纯化回收步骤如下：

使用前检查漂洗液PW是否按说明加入无水乙醇。

1.将琼脂糖凝胶电泳中单一条带切下，称重后放入干净的2mL EP管中；

2.向EP管中加入适量PN溶液(如0.1g胶块加PN 100μL PN，50℃水浴，不时翻转EP管，至胶块彻底溶解；若回收小于300bp的DNA片段，可在胶块完全溶解后添加0.5倍体积的异丙醇以增加回收效率；

3.向吸附柱中加入平衡液BL 500μL 13000r/min离心1min，弃掉收集管中液体，将吸附柱放回收集管中；

4.胶块溶解后待温度降至室温，转移所有液体至吸附柱中，静置2min 13000 r/min离心1min，弃掉收集管中液体，将吸附柱放回收集管中；

5.向吸附柱中添加600μL PW漂洗液，13000r/min离心1min，弃掉收集管中液体，将吸附柱放回收集管中；

6.重复步骤5；

7.13000r/min离心2min，弃掉收集管；吸附柱室温晾至残余漂洗液完全挥发，防止影响酶切等相关实验；

8.将吸附柱放入一个干净的2mL EP管中，向吸附柱中悬空滴加TE洗脱液 50μL，室温静置2-5min，13000r/min离心2min，将收取的DNA产物-20℃储存备用。

(3)重组质粒连接转化

上一步获取的DNA产物连接至pMD 19-T Vector中，构建重组质粒，连接体系见表2。将下述体系于16℃中连接50min。

表2连接体系

DH5α100μL冰浴中解冻，加入连接后的重组质粒10μL，轻轻混匀；冰浴中反应30min；42℃水浴90s(时间严格控制)后迅速转至冰浴中2min，期间严禁晃动；加入400μL LB培养基于恒温摇床中37℃、200rpm/min摇菌1h；取200μL涂于含有AMP的LB固体培养板中，37℃恒温过夜培养；挑单菌落置于含有AMP的LB液体培养基中37℃、200rpm/min摇菌6h；取少量提细菌DNA后经普通PCR鉴定，一部分4℃保存。重组质粒的PCR鉴定见附图1。

(4)质粒提取

鉴定正确的菌液使用高纯度质粒小提试剂盒(天根)进行细菌质粒提取，提取步骤如下：

使用前检查漂洗液PW是否按说明加入无水乙醇，P1溶液加入Rnase A。

1.将吸附柱放于收集管中，向吸附柱中加入平衡液BL 500μL，13000r/min 离心1min，弃掉收集管中液体，将吸附柱放回收集管中；

2.取2-5mL菌液多次离心将菌体收集于一个2mL EP管中，吸弃上清；

3.向EP管中加入P1溶液250μL，涡旋震荡，使沉淀彻底悬浮；

4.向EP管中加入P2溶液250μL，温和混匀，反应时间控制在5min之内；

5.向EP管中加入P3溶液350μL，立即温和翻转混匀，管内出现白色絮状沉淀，13000r/min离心10min；将过滤柱放入收集管中，用移液枪吸取上清转移至过滤柱中，13000r/min离心2min；

6.将收集管中收集的液体转移至步骤(1)处理过的吸附柱中，13000r/min 离心2min，弃掉收集管中液体，将吸附柱放回收集管中；

7.向吸附柱中加入500μL去蛋白溶液PD1，13000r/min离心2min，弃掉收集管中液体，将吸附柱放回收集管中；

8.向吸附柱中添加600μL PW漂洗液，13000r/min离心1min，弃掉收集管中液体，将吸附柱放回收集管中；

9.重复步骤8；

10.13000r/min离心2min，弃掉收集管；吸附柱室温晾至残余漂洗液完全挥发，防止影响酶切等相关实验；

11.将吸附柱放入一个干净的2mL EP管中，向吸附柱中悬空滴加TB洗脱液60μL，室温静置2-5min，13000r/min离心2min，将收取的DNA产物-20 ℃储存。

使用分光光度计测定上述提取的DNA样品浓度。

(5)计算质粒拷贝数

依据浓度与拷贝数换算公式：拷贝数(copies/μL)＝6.02×10²³(copies/mol) ×质粒浓度(ng/μL)×10^-9/[(载体分子量+插入片段分子量)×660](g/mol)。

(6)单重TaqMan荧光定量PCR标准曲线的制作

用ddH₂O将质粒倍比稀释为1×10¹⁰～1×10³，每一梯度3个平行重复，进行荧光定量PCR，荧光定量PCR体系见表3，使用罗氏荧光定量PCR仪进行定量PCR反应。

荧光定量PCR扩增程序及反应条件：95℃预变性1min；95℃变性20s， 65℃退火/延伸30s；50℃冷却30s，共进行40个循环。三种病毒的单重TaqMan 荧光定量PCR扩增曲线与标准曲线见附图2和3。

表3荧光定量PCR体系

(7)三重荧光定量PCR反应体系及条件的确定

单重荧光定量PCR的建立说明三种圆圈病毒均存在线性关系，可用于荧光定量PCR的检测，因此，在上述单重荧光定量PCR反应条件及体系的基础上，不断摸索三重的反应条件，逐渐改变引物和探针的浓度，以达到最佳的扩增效率和良好的荧光曲线，继而确定三重反应的体系和条件，以最低循环國值(Ct 值)为指标进行优化；最终确定的试剂盒中20μL的实时荧光定量PCR反应液组成如下：

Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2X)10μL，CAV、GyG1和GyH1正反向引物各0.4μL，探针各0.8μL，DNA样品1μL，加无DNA/RNA酶双蒸水至反应体系总体积为20μL。

上述试剂盒在检测时，所选的扩增程序为：

对应检测结果判定有效的条件为：

阴性对照FAM通道检测无Ct值，阳性对照FAM通道检测Ct值≤30。

(8)三重荧光定量PCR标淮曲线

依照己建立的三重荧光定量PCR反应条件，将重组质粒pMD-19T-CAV、 pMD-19T-GyG1和pMD-19T-GyH1标准品用ddH₂0稀释至10¹⁰拷贝/μL，然后取等体积相同拷贝数数量级的质粒进行混合，然后依次进行系列10倍稀释 (10¹⁰～10³拷贝/μL)，以此标准品为模板进行三重荧光定量PCR扩增反应，建立动力扩增曲线和标准曲线。三重TaqMan荧光定量PCR扩增曲线与标准曲线见附图4、5。

(9)三重荧光定量PCR敏感性试验

选取浓度梯度为10¹⁰～10¹拷贝/μL的标准品模板，以DNA酶处理过的ddH₂0 做阴性对照，进行三重TaqMan荧光定量PCR扩增，检测结果见附图6，图中 CAV、GyG1和GyH1皆可在10¹拷贝/μL显示扩增曲线，可见本发明中构建的多实时荧光定量PCR反应体系敏感性较好。

实施例2三重TaqMan荧光定量PCR特异性试验

为了检测本发明试剂盒的特异性，利用本发明上述的试剂盒检测混有鸡J 亚群白血病病毒(ALV-J，NX0101株)、禽网状内皮组织增殖病病毒(REV，SNV 株)、马立克氏病病毒(MDV，Md5株)3种病毒的三重圆圈病毒核酸。三种病毒均为现有已知毒株。

特异性试验结果显示：本发明的试剂盒仅对CAV、GyG1和GyH1进行扩增，表明本发明试剂盒能特异性扩增，而不与鸡J亚群白血病病毒(ALV-J)、禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)、马立克氏病病毒(MDV)等3种病毒发生交叉反应，检测结果见附图7，而ALV-J、REV、MDV等3种病毒未发生扩增，无 Ct值，判为阴性；可见本发明中构建的三重实时荧光定量PCR反应体系特异性好。

实施例3三种圆圈病毒三重实时荧光定量PCR检测

(1)样本采集

采集本实验送诊待检病例共计40份。

(2)总DNA提取

将病例肝脏各取黄豆大小混合置于1.5mL离心管中，利用天根公司的组织基因组DNA提取试剂盒提取，按照产品使用说明书操作，得到组织总DNA，将其置于-20℃保存备用。

(3)单重普通PCR检测和单重荧光定量PCR检测

单重普通PCR检测体系如表4：

表4荧光定量PCR体系

分别对三种圆圈病毒进行单重PCR扩增。反应在PCR扩增仪进行，反应参数为：95℃预变性5min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环，72℃再延伸10min。PCR扩增产物进行1％的琼脂糖电泳检测。

单重荧光定量PCR过程的反应体系和反应程序按组装试剂盒部分实行。

(4)三重荧光定量PCR检测

所述实时荧光定量PCR反应体系和反应程序按组装试剂盒部分实行。

(5)动物组织病料中CAV、GyG1和GyH1筛选结果

单重普通PCR检测、单重荧光定量PCR和三重荧光定量PCR检测结果如表5所示：

表5动物组织病料中CAV、GyG1和GyH1阳性数

以单重实时荧光定量PCR法的检测结果作为标准，由本发明试剂盒检出的阳性样本数量较之普通PCR法检测结果多2份，其它阳性样本检出数量与单重实时荧光定量PCR法检测结果一致。

由上述结果可见，本发明检测效果明显好于普通PCR检测效果，可以减少假阴性的发生，同时一次实验可以检测出混合感染，减少二次PCR验证及不需要PCR扩增后续处理，大大节约时间，提高工作效率。

综上所述，本发明所述引物探针的组合具有高特异性和高灵敏性，能够在同一实时荧光定量PCR反应体系中对三种病毒的目的片段同时进行有效扩增，实现对三种病毒的实时定量检测，检测效果明显好于普通PCR，可以减少假阴性的发生，减少二次PCR验证及不需要PCR扩增后续处理，大大节约时间，提高工作效率，为畜禽临床圆圈病毒感染的预警、早期诊断和防治监测提供可靠的技术和产品。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但是应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制，仍以本发明权利要求书的内容为准。凡根据本发明实质所做的修饰或变换，均落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一种同时检测三种圆圈病毒的三重TaqMan荧光定量PCR试剂盒

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

ggtgttcagg ccaccaacaa 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

gcagatctta gcgtgggagc 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

tatcgctgtg tggctgcgcg aatgc 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

aaaggtgcac cgcctatgtg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

gattcaccgg tagccactgc 20

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

tacggcaacg tggagtcgaa cgctcca 27

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 7

gtcggttggg actctctcca 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 8

ggaaccagtg gcgtctgaag 20

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 9

ttcctggctt cgcgagtgtt cgcgt 25

<210> 10

<211> 138

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 10

ggtgttcagg ccaccaacaa gttcacggcc gttggaaacc cctcactgca gagagatccg 60

gattggtatc gctggaatta caatcactct atcgctgtgt ggctgcgcga atgctcgcgc 120

tcccacgcta agatctgc 138

<210> 11

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 11

aaaggtgcac cgcctatgtg caccatgcaa agaaagactc agcaatacgg caacgtggag 60

tcgaacgctc cagcagatga gcagtggcta ccggtgaatc 100

<210> 12

<211> 139

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 12

gtcggttggg actctctcca aagagatcca aattgggctc gggtcaacta taattaccgt 60

atcgcttcct ggcttcgcga gtgttcgcgt actcacgacg cgatctgcaa ctgcgggggc 120

ttcagacgcc actggttcc 139

Claims

1.一种同时检测三种圆圈病毒的三重TaqMan荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒中包含有：

用于检测鸡传染性贫血病毒的引物和探针序列如下所示：

正向引物：GGTGTTCAGGCCACCAACAA；其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

反向引物：GCAGATCTTAGCGTGGGAGC；其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

探针：TATCGCTGTGTGGCTGCGCGAATGC；其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

用于检测圆圈病毒禽源1型的引物和探针序列如下所示：

正向引物：AAAGGTGCACCGCCTATGTG；其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

反向引物：GATTCACCGGTAGCCACTGC；其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

用于检测圆圈病毒人源1型的引物和探针序列如下所示：

正向引物：GTCGGTTGGGACTCTCTCCA；其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

反向引物：GGAACCAGTGGCGTCTGAAG；其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

探针：TTCCTGGCTTCGCGAGTGTTCGCGT；其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

2.根据权利要求1所述的三重TaqMan荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：

试剂盒中还含有还含有荧光定量PCR反应液、标准阳性模板和阴性对照样品；所述阴性对照样品为无RNA酶双蒸水。

3.根据权利要求2所述的三重TaqMan荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述标准阳性模包括CAV标准品、GyG1标准品和GyH1标准品，三者分别为：

CAV标准品为克隆构建的编号为pMD-19T-CAV重组质粒，pMD-19T-CAV重组克隆质粒含有所述反应液中CAV引物的扩增产物的目标核酸序列；

GyG1标准品为克隆构建的编号为pMD-19T-GyG1重组质粒，pMD-19T-GyG1重组克隆质粒含有所述反应液中GyG1引物的扩增产物的目标核酸序列；

GyH1标准品为克隆构建的编号为pMD-19T-GyH1重组质粒，pMD-19T-GyH1重组克隆质粒含有所述反应液中GyH1引物的扩增产物的目标核酸序列。

4.根据权利要求2所述的三重TaqMan荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：

荧光定量PCR反应液为20μL，具体组成如下：

2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，CAV、GyG1和GyH1正反向引物各0.4μL，探针各0.8μL，DNA模板1μL，加无DNA/RNA酶双蒸水至反应体系总体积为20μL。