CN110938707A - 一种鸡新型环状病毒GyV3的荧光定量PCR检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测鸡新型环状病毒GyV3的特异性引物，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。一种鸡新型环状病毒GyV3的荧光定量PCR检测方法：(1)实时荧光定量PCR反应：提取待测物的基因组DNA，利用特异性引物进行PCR扩增；推导出标准线性回归方程(标准曲线)；(2)结果判定：无Ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；Ct值≤36，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。本发明所建立的方法，可实现对GyV3安全、特异、快速、灵敏、简单的快速检测，从而为鸡新型环状病毒GyV3的流行病学调查、早期诊断提供一种方法，具有重要的意义，填补了国内外相关领域空白。

Description

一种鸡新型环状病毒GyV3的荧光定量PCR检测方法
技术领域
本发明涉及一种鸡新型环状病毒GyV3的荧光定量PCR检测方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
鸡新型环状病毒(Gyrovirus3,GyV3)是近几年新发现的能引起鸡腺胃炎的病原，目前，该病毒在鸡群中属于第二个被鉴定的单链环状DNA病毒，第一个单链环状DNA病毒是鸡传染性贫血。GyV3病毒可引起免疫抑制、贫血以及腺胃肿大等症状。鉴于此病毒的危害，亟需建立快速敏感的检测方法用于早期诊断，对动物进行有效保护。
实时荧光定量PCR方法(Real time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。
目前，国内外尚未见此病毒的各种检测方法的报道，因此本研究建立的利用SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR检测鸡新型环状病毒GyV3的荧光定量PCR检测方法为目前检测此类病毒唯一的检测方法。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种鸡新型环状病毒GyV3的荧光定量PCR检测方法，以及所涉及的特异性引物、试剂盒。本发明所建立的方法，可实现对GyV3安全、特异、快速、灵敏、简单的快速检测，从而为鸡新型环状病毒GyV3的流行病学调查、早期诊断提供一种方法，具有重要的意义，填补了国内外相关领域空白。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种检测鸡新型环状病毒GyV3的特异性引物，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如下所示，如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；其所特异性扩增的目的片段大小为125bp；
上游引物9-GyV3forward：5'-TCCAATAAGTTCGTCGGAGTC-3'(SEQ ID NO.1)；
下游引物9-GyV3reverse：5'-GCAGATCGCGTCGTGAGTA-3'(SEQ ID NO.2)。
上述引物在制备检测鸡新型环状病毒GyV3的试剂盒中的应用。
一种检测鸡新型环状病毒GyV3的试剂盒，包括上述特异性引物，以及检测所必须的试剂。
一种鸡新型环状病毒GyV3的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)实时荧光定量PCR反应：提取待测物的基因组DNA，利用特异性引物进行PCR扩增，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；
进一步地，反应体系如下：反应液每管20μL，含有SYBR Green I UniversalMaster Mix10μL，10pmol/μL 9-GyV3forward、9-GyV3reverse各1μL，RNase Free dH2O 6μL，待检测的样品DNA模板2μL；
进一步地，反应条件为：95℃预变性60s；95℃10s，60℃10s，72℃10s，40个循环；
扩增结束后，做出溶解曲线，获得扩增动力学曲线；以标准品起始拷贝数的常用对数(lgC)为横坐标，以循环数阈值(cycle threshold，Ct值)为纵坐标，推导出标准线性回归方程(标准曲线)，获得其敏感性试验数据；以T-GyV3作为阳性标准质粒；设空白作为阴性对照；
(2)结果判定：
结果分析条件设定：读取检测结果；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果；
质控标准：阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤28.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效；
结果描述及判定：无Ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；Ct值≤36，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。
本发明的鸡新型环状病毒GyV3的荧光定量PCR检测方法，以T-GyV3作为阳性标准质粒(是经过分析比对，选取目前所有的GyV3的序列进行比对后，选择出的保守区域)，经线性化酶切后进行连续10倍梯度稀释后-80℃冻存备用(质粒浓度为3.076×101copies/μL～3.076×1010copies/μL)。
本发明的鸡新型环状病毒GyV3的荧光定量PCR检测方法，具有以下优点和效果：
1、检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过和实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。从核酸提取到结果判定仅需2h，且一次可以同时进行96个样品检测。
2、定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，可根据实时荧光定量试验检测的待检样品中的Ct值，直接计算出待检样品(检测结果为阳性)的拷贝数，可直接对鸡新型环状病毒GyV3感染程度进行准确定量。
3、灵敏度高：最低可检测30.76个拷贝。
4、特异性强：对鸡群中的常见传染病(如IBV、IBDV、ILTV、H5、H9、Reov、FAV、REV、ARV、CAV)均无反应信号，仅对鸡新型环状病毒GyV3检测出现单一的特异性峰，无引物二聚体及非特异性产物。
5、重复性好：建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法进行鸡新型环状病毒GyV3检测的组内变异系数为0.09-0.6％，组间变异系数0.3-0.65％，重复性好。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
附图说明
图1：设计合成的四对引物进行梯度荧光定量PCR的溶解曲线对比图。
图2：实时荧光定量检测鸡新型环状病毒GyV3的PCR方法的扩增曲线，其中1～7：3.076×102copies/μL～3.076×108copies/μL。
图3：实时荧光定量检测鸡新型环状病毒GyV3PCR方法的标准曲线。
图4：IBV、IBDV、ILTV、H5、H9、Reov、FAV、REV、ARV、CAV的扩增曲线，因均没有特异性Tm峰值，肉眼无法区分。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例鸡新型环状病毒GyV3的荧光定量PCR检测
1、相关试验病原：IBV、IBDV、ILTV、H5、H9、Reov、FAV、REV、ARV、CAV，均由山东省农业科学院家禽研究所鉴定和保存。
2、引物设计：参考鸡新型环状病毒GyV3现有的基因序列，进行比对，选择保守区域，设计实时荧光定量检测鸡新型环状病毒GyV3的PCR方法的特异性引物。本发明设计了四对引物(9-Gyv3、10-Gyv3、11-Gyv3、12-Gyv3)，对这四对引物进行扩增、灵敏度的对比试验，最终筛选出灵敏度高、特异性好的序列用于本方法的建立。
设计的特异性引物序列为：
上游引物9-GyV3 forward：5'TCCAATAAGTTCGTCGGAGTC 3'(SEQ ID NO:1)；
下游引物9-GyV3 reverse：5'GCAGATCGCGTCGTGAGTA 3'(SEQ ID NO:2)；
目的片段大小为126bp。
上游引物10-GyV3 forward：5'CCCGAAACTGATGACCCTR 3'；
下游引物10-GyV3 reverse：5'ATTGGYGGTTGTCCCGATA 3'；
目的片段大小为198bp。
上游引物11-GyV3 forward：5'GCGATGGGCACTTCTTCTTA 3'；
下游引物11-GyV3 reverse：5'TTTGTGGTAGGGTCATCAGYTT 3'；
目的片段大小为80bp。
上游引物12-GyV3 forward：5'ATTCACGCTCAACATACCCA 3'；
下游引物12-GyV3 reverse：5'TCCATTCTTGTTCTTTCGGTA 3'；
目的片段大小为177bp。
并在NCBI数据库进行引物Blast分析，验证设计引物的特异性。
上述引物均在青岛擎科生物技术有限公司合合成。
在同样条件下进行实时荧光定量梯度PCR，最佳引物为9-Gyv3，如图1所示。可见，虽然本发明的引物是通过软件设计得到的，然而保守区域的选择是发明人经过对比后得出的，付出了创造性劳动。且引物设计的原则是由发明人根据保守区域的特点(比如碱基分布比例)所设定的(比如引物长度)。通过设计软件得到若干组引物后，这些引物的特异性如何、灵敏度如何，是无法预知的(设计软件在设计引物时，是不会考虑特异性、灵敏度的平衡的)，其仅能作为一个参考，以协助发明人初步确定引物设计的大致位置，但要想得到特异性强、灵敏度高的引物(引物的长度越长，特异性越高，但是灵敏度越低；引物的长度越短，灵敏度越高，但特异性越差；这两方面需要有一个平衡点)，需要发明人付出创造性劳动，进行大量的、繁复的设计、筛选和验证工作，选择合适长度的引物，以实现特异性和灵敏度的统一。因此，设计软件所起到的作用是辅助，要想得到成熟的可实际应用的引物和探针，需要发明人付出创造性劳动。
3、实时荧光定量PCR检测方法的建立
3.1新型环状病毒GyV3阳性标准品的构建
本研究经过分析比对，选取目前所有的GyV3的序列进行比对，选择保守区域来设计引物。将扩增的片段与pMD18-T载体连接，并将获得的质粒作为本研究的阳性标准质粒(T-GyV3)，经线性化酶切后进行连续10倍梯度稀释后-80℃冻存备用(质粒浓度为3.076×101copies/μL～3.076×1010copies/μL)。
3.2鸡新型环状病毒GyV3的荧光定量PCR检测方法
以鸡新型环状病毒GyV3阳性标准品(T-GyV3)为模板，进行连续稀释(质粒浓度为3.076×108、3.076×107、3.076×106、3.076×105、3.076×104、3.076×103、3.076×102copies/μL)，在不同退火温度和引物浓度下进行实时荧光定量PCR反应，对反应条件进行优化。
优化的反应体系，反应液每管20μL：含有SYBR Green I Universal Master Mix10μL、10pmol/μL 9-GyV3forward、9-GyV3reverse各1μL、RNase Free dH2O 6μL、待检测的样品DNA模板2μL。
优化的最佳反应条件设置为：95℃预变性60s；95℃10s，60℃10s，72℃10s，40个循环，保存文件，运行，循环结束后，做出溶解曲线。
用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数(lgC)为横坐标，以循环数阈值(cycle threshold，Ct值)为纵坐标，推导出标准线性回归方程(标准曲线)，获得其敏感性试验数据。
从图3可以看出，建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为30.76copies/μL(图2中第7号)。以各标准品中质粒含量(C)的常用对数(lgC)为横坐标，以循环数阈值(cyclethreshold，Ct值)为纵坐标，获得鸡新型环状病毒GyV3实时荧光定量PCR标准曲线(图2)，所获得标准曲线斜率为-3.4351，Y轴截距为48.59，相关系数为0.99，扩增效率为1.95，符合实验预期。
观察溶解曲线峰值(Tm值)分析试验结果：在Tm＝(85±0.5)℃出现单一的特异性峰判为鸡新型环状病毒GyV3阳性(图4)。对其他病原(如：IBV、IBDV、ILTV、H5、H9、Reov、FAV、REV、ARV、CAV)均未见特异性扩增(图4)。
3.3重复性试验
实时荧光定量PCR方法检测标准阳性样品的组内变异系数为0.09-0.6％，组间变异系数0.3-0.65％，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。
4、临床应用
对57份临床鸡源病料进行GyV3的实时荧光定量PCR检测，用BioSpin组织细胞DNA/RNA共提取试剂盒提取相应的DNA，按照建立实时荧光定量PCR体系和条件进行检测。结果发现，在Tm＝85.0℃出现单一的特异性峰，除本研究合成的阳性质粒对照外，临床收集的57份鸡病料共检出7份阳性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
序列表
<110>山东省农业科学院家禽研究所
<120>一种鸡新型环状病毒GyV3的荧光定量PCR检测方法
<141> 2019-07-11
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tccaataagt tcgtcggagt c 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gcagatcgcg tcgtgagta 19

Claims (6)

1.一种检测鸡新型环状病毒GyV3的特异性引物，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如下所示，如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
上游引物9-GyV3 forward：5'-TCCAATAAGTTCGTCGGAGTC-3'；
下游引物9-GyV3 reverse：5'-GCAGATCGCGTCGTGAGTA-3'。
2.权利要求1所述的特异性引物对在制备检测鸡新型环状病毒GyV3的试剂盒中的应用。
3.一种检测鸡新型环状病毒GyV3的试剂盒，包括权利要求1所述的特异性引物，以及检测所必须的试剂。
4.一种鸡新型环状病毒GyV3的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)实时荧光定量PCR反应：提取待测物的基因组DNA，利用特异性引物进行PCR扩增，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
扩增结束后，做出溶解曲线，获得扩增动力学曲线；以标准品起始拷贝数的常用对数(lgC)为横坐标，以循环数阈值(cycle threshold，Ct值)为纵坐标，推导出标准线性回归方程(标准曲线)，获得其敏感性试验数据；以T-GyV3作为阳性标准质粒；设空白作为阴性对照；
(2)结果判定：
质控标准：阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤28.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效；
结果描述及判定：无Ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；Ct值≤36，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。
5.根据权利要求4所述的鸡新型环状病毒GyV3的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系如下：反应液每管20μL，含有SYBR Green I Universal MasterMix10μL，10pmol/μL GyV3 forward、GyV3 reverse各1μL，RNase Free dH2O6μL，待检测的样品DNA模板2μL。
6.根据权利要求4所述的鸡新型环状病毒GyV3的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性60s；95℃10s，60℃10s，72℃10s，40个循环。
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