CN116083646A - 用于检测鸡圆环病毒的实时荧光定量pcr引物、试剂盒与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测鸡圆环病毒的实时荧光定量PCR引物、试剂盒与应用，属于分子生物学技术领域，根据CCV病毒基因组设计特异性引物，该引物对CCV最低检出限为2.87×10¹copies/μL，灵敏度比常规PCR高100倍。对鸡传染性贫血病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、新城疫病毒等常见鸡病毒性病原均无特异性扩增，批内和批间变异系数均不超过1％。本发明采用的实时荧光定量PCR引物检测CCV具有良好的敏感性、特异性和重复性，可以用于CCV的快速定量检测，为CCV的临床诊断及后期研究提供了技术支持。

Description

用于检测鸡圆环病毒的实时荧光定量PCR引物、试剂盒与应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于检测鸡圆环病毒的实时荧光定量PCR引物、试剂盒与应用。

背景技术

鸡圆环病毒(Chicken circovirus，CCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)，在2019年由李根等使用高通量宏病毒测序技术首次从患有急性肠胃炎的商品鸡中分离鉴定出来，基因组全长为1911bp，与其他已知圆环病毒的同源性低于40％，CCV成为圆环病毒属中一种新型病毒。

圆环病毒属成员具有广泛的宿主范围，在哺乳动物(包括人类)、鸟类、低等脊椎动物和无脊椎动物中均有发现，大量圆环病毒已确定能够引起动物疾病，例如猪圆环病毒2型(PCV2)引起仔猪断奶断奶仔猪多系统衰竭综合征；犬圆环病毒(CaCV)、水貂圆环病毒(MiCV)和猫圆环病毒(FeSCV)导致腹泻。金丝雀、鹅、鸽子和鹦鹉等圆环病毒能够引起免疫抑制、发育不良等症状。前期研究表明CCV与鸡急性胃肠炎关系密切，然而CCV的致病特征以及在鸡群中的流行情况仍然未知。目前已报道CCV的检测方法只有常规PCR一种方法，但是常规PCR方法存在灵敏度低，病毒滴度低时不能检出等问题。因此需要建立一种快速高效的检测方法，对于CCV的致病特征研究，以及掌握鸡群中CCV的流行情况具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于检测鸡圆环病毒的实时荧光定量PCR引物、试剂盒与应用，本发明的实时荧光定量PCR引物具有良好的敏感性、特异性和重复性，其灵敏度比常规PCR高100倍，可用于CCV的快速检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种用于检测鸡圆环病毒的实时荧光定量PCR引物，包括上游引物CCV-q-F和下游引物CCV-q-R，所述上游引物CCV-q-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物CCV-q-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了一种检测鸡圆环病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物。

优选的，所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR反应体系、阳性质控品和阴性质控品。

优选的，所述实时荧光定量PCR反应体系包括2×Taq Pro Universal SYBR qPCRMaster Mix 9～11μL、8～12μmoL/μL上游引物0.4μL、8～12μmoL/μL下游引物0.4μL、DNA模板0.8～1.2μL、ddH₂O 7.5～9μL，总体积为20μL。

优选的，所述阳性质控品为含有鸡圆环病毒的pMD19-T载体质粒。

优选的，所述阴性质控品为pMD19-T空载体。

本发明还提供了一种上述引物在制备检测鸡圆环病毒的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种鸡圆环病毒的实时荧光定量PCR检测方法，所述检测方法用于非诊断目的，包括以下步骤：

S1、从阳性鸡圆环病毒样本中提取目标DNA，以提取的目标DNA为模板，通过上游引物CCV-F、下游引物CCV-R进行PCR扩增，获得目的基因；

S2、将目的基因与pMD19-T载体载体连接，得到CCV-pMD19-T阳性重组质粒；

S3、将CCV-pMD19-T阳性重组质粒作为标准品进行梯度稀释，建立标准曲线；

S4、将待测样本提取DNA，以提取的DNA为模板，采用上游引物CCV-q-F和下游引物CCV-q-R进行实时荧光定量PCR扩增，根据结果计算待测样本中鸡圆环病毒。

优选的，所述上游引物CCV-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述下游引物CCV-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，S1步骤中，所述的PCR扩增反应条件为95℃10min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min；S4步骤中，所述的实时荧光定量PCR扩增反应条件为95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种用于检测鸡圆环病毒的实时荧光定量PCR引物，根据CCV病毒基因组设计特异性引物，该引物对CCV最低检出限为2.87×10¹copies/μL，灵敏度比常规PCR高100倍。对鸡传染性贫血病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、新城疫病毒等常见鸡病毒性病原均无特异性扩增，批内和批间变异系数均不超过1％。本发明采用的实时荧光定量PCR引物检测CCV具有良好的敏感性、特异性和重复性，可以用于CCV的快速定量检测，为CCV的临床诊断及后期研究提供了技术支持。

附图说明

图1为CCV常规PCR扩增结果，其中，M：DNA分子量标准(DL1000)；1：CCVPCR扩增片段；2：阴性对照；

图2为标准曲线的建立，A为重组阳性质粒扩增曲线(1～8:2.87×10⁸～2.87×10¹copies/μL阳性质粒标准品)；B为标准曲线；C为融解曲线；

图3为荧光定量PCR敏感性检测结果，1～8：2.87×10⁸～2.87×10¹copies/μL阳性质粒标准品；9：阴性对照；

图4为常规PCR敏感性检测结果，M：DNA分子量标准(DL1000)；1～9：2.87×10⁸～2.87copies/μL阳性质粒标准品；10：阴性对照；

图5为荧光定量PCR特异性检测结果，1：2.87×10⁵copies/μL阳性质粒标准品；2～9：分别为REV、IBV、IBDV、ReoV、ALV-J、MDV、CIAV、NDV；10：阴性对照。

具体实施方式

本发明提供了一种用于检测鸡圆环病毒的实时荧光定量PCR引物，包括上游引物CCV-q-F和下游引物CCV-q-R，所述上游引物CCV-q-F的核苷酸序列5’-GCGTATGCGTAGCCTGTT-3’，如SEQ ID No.1所示；所述下游引物CCV-q-R的核苷酸序列5’-TGCTGAGTGTAGCCTTCC-3’，如SEQ ID No.2所示。

在本发明中，所述实时荧光定量PCR时的染料优选为SYBR GreenⅠ。

本发明还提供了一种检测鸡圆环病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物。

在本发明中，所述试剂盒还优选的包括实时荧光定量PCR反应体系、阳性质控品和阴性质控品。所述实时荧光定量PCR反应体系优选的包括2×Taq Pro Universal SYBRqPCR Master Mix 9～11μL、8～12μmoL/μL上游引物0.4μL、8～12μmoL/μL下游引物0.4μL、DNA模板0.8～1.2μL、ddH₂O 7.5～9μL，总体积为20μL。所述阳性质控品优选为含有鸡圆环病毒的pMD19-T载体质粒。所述阴性质控品优选为pMD19-T空载体。

本发明还提供了一种上述引物在制备检测鸡圆环病毒的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种鸡圆环病毒的实时荧光定量PCR检测方法，所述检测方法用于非诊断目的，包括以下步骤：

S1、从阳性鸡圆环病毒样本中提取目标DNA，以提取的目标DNA为模板，通过上游引物CCV-F、下游引物CCV-R进行PCR扩增，获得目的基因；

S2、将目的基因与pMD19-T载体载体连接，得到CCV-pMD19-T阳性重组质粒；

S3、将CCV-pMD19-T阳性重组质粒作为标准品进行梯度稀释，建立标准曲线；

S4、将待测样本提取DNA，以提取的DNA为模板，采用上游引物CCV-q-F和下游引物CCV-q-R进行实时荧光定量PCR扩增，根据结果计算待测样本中鸡圆环病毒。

本发明根据CCV的全基因组序列设计常规PCR引物CCV-F/CCV-R，进行PCR扩增。其中，所述上游引物CCV-F的核苷酸序列5’-GCCGTTCGTGATGAAATA-3’，如SEQ ID No.3所示；所述下游引物CCV-R的核苷酸序列5’-CCCAGGAGCATAAGGAGA-3’，如SEQ ID No.4所示。所述的PCR扩增反应条件为95℃10min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。所述CCV的全基因组序列的登录号为GenBank数据库的MK250991.1。本发明中，PCR扩增的目的基因大小为426bp，PCR扩增的目的基因鉴定为阳性的PCR产物。

在本发明中，将上述目的基因与pMD19-T载体载体连接，转化至DH5α感受态细胞中，扩大培养后提取质粒进行PCR鉴定。将重组阳性质粒标准品进行10倍梯度稀释，选取其中8个浓度梯度作为qPCR反应模板，进行荧光定量PCR反应，建立标准曲线。其中，所述的实时荧光定量PCR扩增反应条件优选为95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。

本发明对2.87×10⁸-2.87×10¹copies/μL浓度范围的CCV阳性标准品呈现良好的线性关系，相关系数R²为0.9936。

本发明使用染料法荧光定量PCR，以已知浓度的目的基因为模板，稀释，然后绘制标准曲线，未知浓度的样本按标准曲线换算出其拷贝数。本发明无需设计荧光探针，降低成本，操作简便，检测只需在1小时内即可完成，大大缩短了检测时间。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1材料和方法

1.1实验材料

鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus，CIAV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)、传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease Virus，IBDV)、网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)、禽呼肠孤病毒(Avian reovirus，ReoV)、J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J，ALV-J)、马立克氏病病毒(Marek's disease virus，MDV)，60份疑似鸡圆环病毒感染病料。

1.2试剂与仪器

Taq Pro Universal SYBR qPCR MasterMix购自Vazyme公司；质粒小提试剂盒、病毒基因组提取试剂盒购自天根生化科技与限公司；Biospin胶回收和PCR产物纯化试剂盒购自杭州博日科技股份有限公司；pMD19-T载体、DH5α感受态细胞购自大连宝生物技术有限公司；Quant Studio 5实时荧光定量PCR仪、NanoDrop 2000、普通PCR仪购自AppliedBiosystems公司。

1.3引物设计与合成

参考GenBank数据库中CCV的全基因组序列(MK250991.1)设计荧光定量PCR引物CCV-q-F/CCV-q-R，设计常规PCR引物CCV-F/CCV-R(表1)，常规PCR引物扩增序列包含荧光定量PCR引物扩增序列，引物由华大基因公司合成。

表1引物信息

1.4重组标准品的制备

按照病毒核酸提取试剂盒说明书从阳性病料中提取CCV的DNA，以提取的DNA为模板，使用合成引物CCV-F/CCV-R进行常规PCR扩增。反应条件为：95℃10min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。PCR产物胶回收后连接至pMD19-T载体上，转化至DH5α感受态细胞中。扩大培养后提取质粒进行PCR鉴定，将重组阳性质粒送至华大基因公司测序。使用NanoDrop 2000测定质粒浓度，并按公式(质粒浓度×6.02×10²³)/(质粒长度×660×10⁹)计算质粒拷贝数。实验中以pMD19-T空载体作为阴性对照。

由图1可知，以CCV阳性病料为模板，使用引物CCV-F/CCV-R进行常规PCR扩增，片段大小符合预期。将扩增片段连接到pMD19-T载体上，测序正确，结果显示成功构建重组阳性质粒，质粒浓度为90ng/μL，经计算拷贝数为2.87×10¹⁰copies/μL。

1.5实时荧光定量PCR方法的建立及条件优化

以CCV重组阳性质粒为模板，按照Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒推荐的扩增程序进行反应，总体系为20μL。采用矩阵法分别对退火温度(56℃、58℃、60℃、62℃、64℃)、引物浓度(5μmoL/μL、10μmoL/μL、15μmoL/μL)进行优化。

本发明确定最佳反应体系为：2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix10.0uL、上下游引物(10μmoL/μL)各0.4μL、DNA模板1μL、ddH₂O 8.2μL，总体积为20μL。最优反应条件为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。

1.6标准曲线的建立

将重组阳性质粒标准品进行10倍梯度稀释，选取其中2.87×10⁸copies/μL～2.87×10¹copies/μL 8个浓度梯度作为qPCR反应模板，每个浓度设置三个重复，按照优化后的qPCR方法进行荧光定量PCR反应，得到扩增曲线。以循环阈值(Ct值)作为纵坐标，质粒标准品拷贝数的对数作为横坐标，建立标准曲线。

本发明的扩增曲线(见图2中的A)，且呈现良好的线性关系(见图2中的B)。标准曲线方程为y＝-3.4868x+36.965，相关系数R2为0.9936，扩增效率为93.551％，熔解曲线波峰单一(见图2中的C)，无引物二聚体及非特异峰。

1.7敏感性试验

将重组阳性质粒进行10倍稀释至2.87×10⁸copies/μL～2.87×10¹copies/μL，以此为模板进行qPCR和常规PCR反应检测该方法的敏感性，对两种方法的敏感性进行评估。

结果显示，荧光定量PCR检测到的最小拷贝数为2.87×10¹copies/μL(图3)，常规PCR可以检测到的最小拷贝数为2.87×10³copies/μL(图4)，荧光定量PCR灵敏度是常规PCR的100倍。

1.8特异性试验

利用荧光定量PCR引物对REV、IBV、IBDV、ReoV、ALV-J、MDV、CIAV、NDV等鸡常见病毒的DNA或cDNA进行荧光定量PCR反应，以pMD19-T空载体作为阴性对照，验证该方法的特异性。

结果显示，只有CCV出现特异性扩增，其他病毒均无特异性扩增(图5)，表明该方法的特异性良好。

1.9重复性试验

选取2.87×10⁷copies/μL、2.87×10⁶copies/μL、2.87×10⁵copies/μL 3个浓度的质粒标准品为模板，分别进行批内重复性试验和批间重复性实验，每个浓度3个重复。根据实验结果的Ct值计算批内和批间的平均值、标准差、和变异系数，以评价该方法的重复性。

表2批内、批间重复性试验结果

结果显示，批内变异系数为0.074％～0.300％，批间变异系数为0.108％～0.997％，均低于1％(表2)，表明本发明建立的方法具有较好的重复性。

2.0临床样本检测

采用建立的荧光定量PCR引物对实验室采集的60份疑似鸡圆环病毒感染样品进行检测，同时使用常规PCR方法进行检测。

结果显示，荧光定量PCR检测出10份阳性样品，检出率为16.67％，常规PCR检测出9份阳性样品，检出率为15.00％，说明本试验建立的荧光定量PCR方法比常规PCR更准确，更适合临床样品的检测。

综上可知，本发明设计的荧光定量PCR特异性引物，建立了针对CCV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法，该方法敏感性高，检测下限可达2.87×10¹copies/μL。该荧光定量PCR特异性引物对REV、IBV、IBDV、ReoV等病毒进行检测时无特异性扩增，具有良好的特异性，并且变异系数均低于1％，重复性良好。通过该荧光定量PCR特异性引物对60份疑似CCV感染临床样品的阳性检出率可达16.67％，具有良好的适用性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于检测鸡圆环病毒的实时荧光定量PCR引物，其特征在于，包括上游引物CCV-q-F和下游引物CCV-q-R，所述上游引物CCV-q-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物CCV-q-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种检测鸡圆环病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR反应体系、阳性质控品和阴性质控品。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述实时荧光定量PCR反应体系包括2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 9～11uL、8～12μmoL/μL上游引物0.4μL、8～12μmoL/μL下游引物0.4μL、DNA模板0.8～1.2μL、ddH₂O 7.5～9μL，总体积为20μL。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含有鸡圆环病毒的pMD19-T载体质粒。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为pMD19-T空载体。

7.权利要求1所述的引物在制备检测鸡圆环病毒的试剂盒中的应用。

8.一种鸡圆环病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法用于非诊断目的，包括以下步骤：

S1、从阳性鸡圆环病毒样本中提取目标DNA，以提取的目标DNA为模板，通过上游引物CCV-F、下游引物CCV-R进行PCR扩增，获得目的基因；

S2、将目的基因与pMD19-T载体载体连接，得到CCV-pMD19-T阳性重组质粒；

S3、将CCV-pMD19-T阳性重组质粒作为标准品进行梯度稀释，建立标准曲线；

S4、将待测样本提取DNA，以提取的DNA为模板，采用权利要求1所述的引物进行实时荧光定量PCR扩增，根据结果计算待测样本中鸡圆环病毒。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述上游引物CCV-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述下游引物CCV-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，S1步骤中，所述的PCR扩增反应条件为95℃10min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min；S4步骤中，所述的实时荧光定量PCR扩增反应条件为95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。

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