CN113234855A - 一种raa-lfd检测鸭圆环病毒的引物和探针组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及病毒检测技术领域，具体公开一种RAA‑LFD检测鸭圆环病毒的引物和探针组合及其应用。所述检测鸭圆环病毒的引物和探针中，上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示，探针的序列如SEQ ID NO:3所示。利用本发明的引物和探针的组合，可实现对鸭圆环病毒的准确检测，且上述引物和探针组合的灵敏度高，对DuCV的最低检测限为102拷贝/μL，同时，检测的准确度高，用时短，在37℃恒温条件下快速扩增，仅需20min就可以达到检测水平，检测时间明显缩短，且无需特殊的仪器和专业的操作人员，实现了在非实验室条件下快速、准确检测DuCV病毒的目的。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种RAA-LFD检测鸭圆环病毒的引物和探针组合及其应用。
背景技术
鸭圆环病毒病(Duck circovirus disease，DuCVD)作为一种21世纪新发现的圆环病毒病，是由鸭感染DuCV引起的。DuCV是已知导致鸭疾病中体积最小的DNA病毒，最早由德国科学家Hattermann等发现并测定序列，之后在世界各地被发现报道。这种二十面体对称、无囊膜的单链环状DNA病毒主要感染鸭的免疫组织和器官，破坏机体的体液免疫和细胞免疫功能，引起免疫抑制，增加DuCV与其他致病因素混合感染的可能性。患病动物往往伴随发育迟缓、脱毛、营养不良等症状，严重的还会出现呼吸困难、贫血、生产性能降低甚至死亡，严重危害养殖户的经济效益。
目前对DuCV的实验室诊断包括电镜观察、酶联免疫吸附试验(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)和分子生物学三种手段。电镜检测要求精密的仪器，ELISA仅能检测出是否有抗体存在，因此，不能进行早期诊断。分子生物学检测能够直接检测鸭靶器官中是否存在病毒，更具有临床意义。目前为止，DuCV的分子生物学检测方法主要包括核酸探针杂交检测法、PCR方法、实时荧光定量PCR、环介导等温扩增技术等进行检测。核酸探针杂交检测法经济成本高、操作繁琐；PCR法反应时间较长，且需要PCR仪等仪器和专业操作人员，不能满足快速检测DuCV的需求；环介导等温扩增技术虽然特异性高、成本低廉，但是一般需要在60-65℃恒温反应1h以上。因此，急需发展一种简便、高特异性、灵敏且又不需要昂贵仪器、非专业人员可操作的DuCV快速检测方法。
发明内容
针对现有检测鸭圆环病毒的方法存在的耗时长、特异性差、灵敏度低以及需要特殊仪器的问题，本发明提供一种RAA-LFD检测鸭圆环病毒的引物和探针组合及其应用，利用该检测鸭圆环病毒的引物和探针可在37-41℃恒温条件下快速检测鸭圆环病毒，且特异性好、灵敏度高等优势，为快速、简便且准确地诊断DuCV提供了基础。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种RAA-LFD检测鸭圆环病毒的引物和探针组合，包括引物对和探针，所述引物对的序列如下：
上游引物DuCV-F:5′-AAAGAGCCGTTATGCATTTGAATTTCCCGCCG-3′(SEQ ID NO:1)，
下游引物DuCV-R:5′-ACGGTCGGTAATTCTCAGCAAATCATCATACG-3′(SEQ ID NO:2)；
所述探针的序列为：
DuCV-T:5′-ATTACAAACCACGCGGGAAGTGGTGGGACGGTTACTCGGGAAATGACGTAG-3′(SEQID NO:3)。
相对于现有技术，本发明提供的检测鸭圆环病毒的引物和探针组合，可以特异性结合到鸭圆环病毒的DNA上，准确检测出鸭圆环病毒，且与鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、新城疫病毒、鸭甲型肝炎病毒、禽流感病毒和禽腺病毒等均无交叉扩增反应，特异性强；且上述引物和探针的灵敏度高，对DuCV的最低检测限为102拷贝/μL(3.18×10-3fg/μL)，能够实现对鸭圆环病毒的早期快速诊断，同时，检测的准确度高，用时短，在37℃恒温条件下快速扩增，仅需20min就可以达到检测水平，检测时间明显缩短，且无需特殊的仪器和专业的操作人员，实现了在非实验室条件下快速检测DuCV病毒的目的，对鸭圆环病毒的疫病防控具有重要意义，具有较高的实用价值。
优选的，所述下游引物的5′端标记有生物素，所述探针的5′端标记有荧光素，3′进行磷酸化封闭修饰。
优选的，所述荧光素为6-羧基荧光素(6-FAM)。
优选的，所述探针为：5-′FAM-ATTACAAACCACGCGGGAAGTGGTGGGACGGTTA/idSp/TCGGGAAATGACGTAG-3′。
本发明还提供了上述任一项所述的引物和探针组合在非诊断性检测鸭圆环病毒中的应用。
本发明还提供了一种用于检测鸭圆环病毒的试剂盒，包含上述任一项所述的引物和探针组合。
优选的，所述试剂盒还包括还包括基础缓冲液、乙酸镁溶液、RAA干粉试剂和去离子水。
进一步优选的，所述基础缓冲液为用于检测鸭圆环病毒试剂盒中的VI缓冲液。
本发明还提供利用上述试剂盒检测鸭圆环病毒的方法，具体操作为：提取鸭圆环病毒的基因组DNA为模板，用所述试剂盒进行RAA扩增，利用LFD对RAA扩增产物进行检测。
上述检测鸭圆环病毒的方法，耗时短、操作简单、反应结果直观，可用于鸭圆环病毒的快速检测。
优选的，所述RAA扩增的体系包括以下试剂及用量：基础缓冲液24-26μL，RAA干粉试剂2.0-2.5mg，上游引物和下游引物各2.1μL，探针0.6μL，DNA模板1.2μL，乙酸镁溶液2.5μL，去离子水补足至50μL；其中，所述上游引物和下游引物的浓度均为2-10μmol/L，所述探针的浓度为2-10μmol/L，乙酸镁溶液的浓度为280mmol/L。
上述优选的反应条件可进一步提高鸭圆环病毒的检测效率。
优选的，所述RAA扩增的反应温度为37-41℃，反应时间为20-30min。
进一步优选的，所述RAA扩增的反应温度为37℃，反应时间为20min。
优选的，利用LFD对RAA扩增产物进行检测时，LFD出现两条红带为阳性，一条位于质控区，一条位于检测区，阳性结果表明扩增产物中含有待检测核酸片段；LFD的质控区出现一条红带，检测区没有红带，表示为阴性，阴性结果表明扩增产物中不含有检测片段。
附图说明
图1是本发明实施例1中RAA-LFD检测方法在不同温度条件下的检测结果图；
图2是本发明实施例1中RAA-LFD检测方法在不同反应时间条件下的检测结果图；
图3是本发明实施例1中RAA-LFD检测方法在不同引物浓度条件下的检测结果图；
图4是本发明实施例1中RAA-LFD方法特异性测试结果图；
图5是本发明实施例1中RAA-LFD方法敏感性测试结果图；其中，1的模板浓度为105拷贝/μL，2的模板浓度为104拷贝/μL，3的模板浓度为103拷贝/μL，4的模板浓度为102拷贝/μL，5的模板浓度为101拷贝/μL，6的模板浓度为100拷贝/μL，N为阴性对照。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
为了更好的说明本发明实施例提供的，下面通过实施例做进一步的举例说明。
实施例1
1.材料与方法
1.1病毒样本与试剂盒
鸭圆环病毒DuCV、鸭瘟病毒(Duck enteritis virus，DEV)、番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)、禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)、禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)均由本实验室临床检测分离鉴定后保存。
病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒：购自天根生化科技有限公司。
1.2引物和探针的设计
根据DuCV基因组中保守稳定的基因序列(Sequence ID:GU131342.1)设计引物和探针，设计得到的引物序列如表1所示，并由上海生工生化有限公司合成并标记。
表1引物和探针
1.3.病毒DNA/RNA的提取
按照病毒DNA/RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)的使用说明书分别提取DuCV、DEV、MDPV病毒的DNA，以及NDV、DHAV、AIV和FAdV病毒的RNA；将提取的DNA以及RNA病毒反转录后的cDNA保存于-20℃用于后续试验。
对40份临床疑似感染DuCV的法式囊组织样本提取病毒DNA/RNA，以供后续检测。
1.4.用于检测鸭圆环病毒的试剂盒检测鸭圆环病毒的方法的建立
上述试剂盒包括DuCV-F、DuCV-R、DuCV-T、荧光基础缓冲液(VI缓冲液)、乙酸镁溶液、RAA干粉试剂和ddH2O。
提取待测病毒的基因组DNA为模板，配制50μL反应体系：VI缓冲液25μL，ddH2O16.5μL，上、下游引物(10μM)各2.1μL，模板DNA1.2μL，探针(10μM)0.6μL，RAA干粉试剂2.0mg，混合后移至基础反应单元内，在管盖内加入乙酸镁溶液(280mM)2.5μL，于RAA恒温振荡混匀仪(江苏奇天基因生物科技有限公司)中39℃反应25min。取10μL的反应产物滴加于LFD试纸条检测区，将试纸条插入装有100μL缓冲液的2mL离心管内，2-3min后观察并记录实验结果。当试纸条出现两条条带，其中一条位于质控区的，另外一条位于测试区，记录结果为阳性。当只存在一条位于质控区的红色条带时，记录结果为阴性。
1.5 RAA-LFD检测鸭圆环病毒方法的优化
1.5.1反应温度优化
按照上述重组聚合酶介导等温核酸扩增体系，对反应温度进行优化，将RAA恒温荧光检测仪的温度分别设置为33℃、35℃、37℃、39℃、41℃，反应时间设置为25min，找出检测区条带清晰的最低反应温度。
观察反应结果，如图1所示，其中在37℃的反应条件下检测区的条带清晰，因此，检测的最佳反应温度为37℃。
1.5.2反应时间优化
按照上述重组聚合酶介导等温核酸扩增体系，对反应时间进行优化，将RAA恒温荧光检测仪的反应温度37℃，反应时间分别设置为11min、14min、17min、20min、23min、26min、29min，找出检测区条带清晰的最低反应时间。
观察反应结果，如图2所示，其中在反应20min时检测区的条带清晰，因此，检测的最低反应时间为20min。
1.5.1引物浓度优化
按照上述重组聚合酶介导等温核酸扩增体系，对引物浓度进行优化，将引物浓度分别设置为625nmol/L、1250nmol/L、2500nmol/L、5000nmol/L、10000nmol/L，反应温度设置为37℃，反应时间设置为20min，按照检测区线条清晰的浓度为最低引物浓度。
观察反应结果，如图3所示，其中引物浓度为625nmol/L时，检测区未有条带，在1250nmol/L时可以看到明显的红色条带，因此，最低的引物浓度为1250nmol/L。
最终确定RAA-LFD的最优反应条件为：在1250nmol/L的引物浓度下，37℃下反应20min。
1.6RAA-LFD检测DuCV的特异性试验
用引物DuCV-F、DuCV-R和探针DuCV-T，以DuCV、DEV、MDPV的DNA和NDV、DHAV、AIV、FAdV的cDNA为模板，ddH2O为阴性对照，在上述优化的条件下进行RAA-LFD检测，观察检测区是否出现红色条带，验证反应的特异性。
检测结果如图4所示，从图中可以看出，仅以DuCV的DNA为模板的RAA扩增产物在试纸条上可以观察到两条符合阳性判断标准的红线，其余病毒的对应的试纸条上均只出现了一条质控线。证明了RAA-LFD检测方法用于检测DuCV具有良好的特异性。
1.7 RAA-LFD检测DuCV的敏感性试验
重组质粒的制备：以DuCV为模板，依据PCR引物设计原则，设计一对长度为20-25bp的引物：
DuCv-PCR-F：5′-CACCGGAAAGAGCCGTTATGCATT-3′(SEQ ID NO:4)；
DuCv-PCR-R：5′-CGGGTAACGGTCGGTAATTCTCAGC-3′(SEQ ID NO:5)。
常规PCR反应体系(50μL)：2×Taq Mix 25μL，模板DNA 3μL，上、下游引物(10μM)各1μL，ddH2O20μL。
常规PCR反应条件：94℃预变性5min，55℃退火30s，72℃延长30s，循环34次，72℃延伸5min。
PCR反应后，胶回收PCR产物，纯化后将目的片段与pMD20-T载体(宝生物医学技术有限公司)连接，并将其导入到DH5α感受态细胞中。经蓝白筛选挑取白色菌落，过夜培养提取质粒，并送至生化公司(上海生工生化有限公司)测序。计算单位体积质粒中包含的DNA拷贝数。
质粒拷贝数(copies/L)＝[质粒浓度(g·μL-1)×6.02×1023]/[总片段长度(bp)×660g/mol]；
总片段长＝载体长度(bp)+目的片段长度(bp)。
通过10倍稀释法，将质粒浓度稀释为109拷贝/μL-100拷贝/μL，并保存。
以不同浓度的质粒为模板，通过优化后的反应条件进行RAA-LFD检测，以ddH2O为阴性对照，确定最低检出限度。
检测结果如图5所示，当模板浓度为102拷贝/μL时，可见明显的检测线，结果显示阳性，证明上述引物及RAA检测方法的灵敏度可达到102拷贝/μL(3.18×10-3fg/μL)。
1.8准确度验证
采用上述优化后的RAA-LFD法，以DuCV-F、DuCV-R和DuCV-T为引物和探针，以1.3中提取的40份疑似感染DuCV病的鸭的法式囊组织样本的DNA/RNA为模板，进行检测。同时采用1.7中的常规PCR的反应体系和方法对上述40份样品进行检测，以比较临床检测的符合率。
检测结果显示，RAA-LFD法检出阳性病料31份，阴性9份；常规PCR法检出阳性病例28份，阴性12份。两种方法的符合率为92.50％，RAA-LFD的检出率更高，且经过对RAA-LFD检出的31份阳性样本进行目的片段的测序验证，确定其均为DuCV阳性。
实施例2
一种RAA-LFD检测鸭圆环病毒的引物和探针组合，所述引物对的序列如下：
上游引物DuCV-F:5′-AAAGAGCCGTTATGCATTTGAATTTCCCGCCG-3′,
下游引物DuCV-R:5′-Biotin-ACGGTCGGTAATTCTCAGCAAATCATCATACG-3′；
探针序列为：
DuCV-T:5′-FAM-ATTACAAACCACGCGGGAAGTGGTGGGACGGTTA/idSp/TCGGGAAATGACGTAG-3′。
检测鸭圆环病毒的试剂盒，包括上述引物和探针、荧光基础缓冲液、乙酸镁溶液、RAA干粉试剂、鸭圆环病毒阳性对照基因和去离子水。
利用上述试剂盒检测鸭圆环病毒的方法：分别以实施例1中提取的40份临床样品的基因组为模板，以鸭圆环病毒阳性对照基因为阳性对照，以去离子水为阴性对照，用上述试剂盒进行RAA扩增。
所用的扩增体系包括以下试剂盒用量：VI缓冲液24μL，ddH2O 17.5μL，上、下游引物(10μM)各2.1μL，模板DNA1.2μL，探针(10μM)0.6μL，RAA干粉试剂2.5mg，混合后移至基础反应单元内，在管盖内加入乙酸镁溶液(280mM)2.5μL，于RAA恒温振荡混匀仪(江苏奇天基因生物科技有限公司)中37℃反应20min。取10μL的反应产物滴加于LFD试纸条检测区，将试纸条插入装有100μL缓冲液的2mL离心管内，2-3min后观察并记录实验结果。
经检测，其中阴性对照无检测线，只有一条质控线；阳性对照出现两条符合阳性判断标准的红线；40份临床待测样品中，阳性结果为31份，阴性9份。检测结果与实施例1中的RAA-LFD检测结果相同。
实施例3
一种RAA-LFD检测鸭圆环病毒的引物和探针组合，所述引物对的序列如下：
上游引物DuCV-F:5′-AAAGAGCCGTTATGCATTTGAATTTCCCGCCG-3′,
下游引物DuCV-R:5′-Biotin-ACGGTCGGTAATTCTCAGCAAATCATCATACG-3′；
探针序列为：
DuCV-T:5′-FAM-ATTACAAACCACGCGGGAAGTGGTGGGACGGTTA/idSp/TCGGGAAATGACGTAG-3′。
检测鸭圆环病毒的试剂盒，包括上述引物和探针、荧光基础缓冲液、乙酸镁溶液、RAA干粉试剂、鸭圆环病毒阳性对照基因和去离子水。
利用上述试剂盒检测鸭圆环病毒的方法：分别以实施例1中提取的40份临床样品的基因组为模板，以鸭圆环病毒阳性对照基因为阳性对照，以去离子水为阴性对照，用上述试剂盒进行RAA扩增。
所用的扩增体系包括以下试剂盒用量：VI缓冲液26μL，ddH2O 15.5μL，上、下游引物(2μM)各2.1μL，模板DNA1.2μL，探针(2μM)0.6μL，RAA干粉试剂2.0mg，混合后移至基础反应单元内，在管盖内加入乙酸镁溶液(280mM)2.5μL，于RAA恒温振荡混匀仪(江苏奇天基因生物科技有限公司)中37℃反应20min。取10μL的反应产物滴加于LFD试纸条检测区，将试纸条插入装有100μL缓冲液的2mL离心管内，2-3min后观察并记录实验结果。
经检测，其中阴性对照无检测线，只有一条质控线；阳性对照出现两条符合阳性判断标准的红线；40份临床待测样品中，阳性结果为31份，阴性9份。检测结果与实施例1中的RAA-LFD检测结果相同。
综上所述，本发明通过设计的引物和探针组合，建立了一种针对鸭圆环病毒的重组聚合酶介导恒温扩增-侧向流试纸条(RAA-LFD)的检测方法，该方法可以在37℃条件下快速扩增，于反应20min后就可达到检测水平，将反应产物滴加到试纸条上2-3min内即可观察检测结果，且方法的特异性强、灵敏度高、最低检测限可达102拷贝/μL，准确度好，且与常规PCR相比，具有检测仪器无电源限制，耗时更短，检测快速，实现了在非实验室条件下的快速核酸扩增检测，对鸭圆环病毒的早期临床检测和流行病学调查提供了可靠保障，有利于在临床实践中推广应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北农业大学
<120> 一种RAA-LFD检测鸭圆环病毒的引物和探针组合及其应用
<130> 2021.4.19
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成（DuCV-F）
<400> 1
aaagagccgt tatgcatttg aatttcccgc cg 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成（DuCV-R）
<400> 2
acggtcggta attctcagca aatcatcata cg 32
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工合成（DuCV-T）
<400> 3
attacaaacc acgcgggaag tggtgggacg gttactcggg aaatgacgta g 51
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成（PCR-DuCV-F）
<400> 4
caccggaaag agccgttatg catt 24
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成（PCR-DuCV-R）
<400> 5
cgggtaacgg tcggtaattc tcagc 25
Claims (10)
1.一种RAA-LFD检测鸭圆环病毒的引物和探针组合，其特征在于，包括引物对和探针，所述引物对的序列如下：
上游引物DuCV-F:5′-AAAGAGCCGTTATGCATTTGAATTTCCCGCCG-3′,
下游引物DuCV-R:5′-ACGGTCGGTAATTCTCAGCAAATCATCATACG-3′；
所述探针的序列为：
DuCV-T:5′-ATTACAAACCACGCGGGAAGTGGTGGGACGGTTACTCGGGAAATGACGTAG-3′。
2.如权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，所述下游引物的5′端标记有生物素，所述探针的5′端标记有荧光素，3′进行磷酸化封闭修饰。
3.如权利要求2所述的引物和探针组合，其特征在于，所述探针为：5′-FAM-ATTACAAACCACGCGGGAAGTGGTGGGACGGTTA/idSp/TCGGGAAATGACGTAG-3′。
4.权利要求1-3任一项所述的引物和探针组合在非诊断性检测鸭圆环病毒中的应用。
5.一种用于检测鸭圆环病毒的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的引物和探针组合。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括基础缓冲液、乙酸镁溶液、RAA干粉试剂和去离子水。
7.利用权利要求5所述的试剂盒检测鸭圆环病毒的方法，其特征在于，具体操作为：提取鸭圆环病毒的基因组DNA为模板，用所述试剂盒进行RAA扩增，利用LFD对RAA扩增产物进行检测。
8.如权利要求7所述的检测鸭圆环病毒的方法，其特征在于：所述RAA扩增的体系包括以下试剂及用量：基础缓冲液24-26μL，RAA干粉试剂2.0-2.5mg，上游引物和下游引物各2.1μL，探针0.6μL，DNA模板1.2μL，乙酸镁溶液2.5μL，去离子水补足至50μL；其中，所述上游引物和下游引物的浓度均为2-10μmol/L，所述探针的浓度为2-10μmol/L，乙酸镁溶液的浓度为280mmol/L。
9.如权利要求7所述的检测鸭圆环病毒的方法，其特征在于：所述RAA扩增的反应温度为37-41℃，反应时间为20-30min。
10.如权利要求9所述的检测鸭圆环病毒的方法，其特征在于：所述RAA扩增的反应温度为37℃，反应时间为20min。
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| CN110257562A (zh) * | 2019-07-31 | 2019-09-20 | 河北农业大学 | 一种raa-lfd检测鸡传染性喉气管炎病毒的引物和探针组合及其应用 |
-
2021
- 2021-04-22 CN CN202110435298.9A patent/CN113234855A/zh active Pending
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