CN105177186A - 快速鉴别鸭圆环病毒基因型的pcr-rflp引物及方法 - Google Patents

快速鉴别鸭圆环病毒基因型的pcr-rflp引物及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速鉴别鸭圆环病毒基因型的PCR-RFLP引物及方法，所述引物为上游引物引物P1：5’-？TGCGCCAAAGAGTCGACATAC？-3’，下游引物P2：5’-？CAAATTGGTCTCAGTAGTTTATT？-3’，该方法是利用鸭圆环病毒不同基因型（基因1型和基因2型）复制蛋白基因编码区所含有的酶切位点差异来进行区别的，包括DNA的提取，PCR扩增得到相应的目的片段后KpnⅠ酶切后进行RFLP分析。本发明鉴定方法操作简单快速，准确率高。

Description

快速鉴别鸭圆环病毒基因型的PCR-RFLP引物及方法
技术领域
本发明属于兽医传染病快速诊断技术领域，具体涉及一种快速鉴别鸭圆环病毒基因型的PCR-RFLP引物及方法。
背景技术
自2003年Hattermann等首次报道鸭圆环病毒（duckcircovirus，DuCV）以来，国内外学者相继对鸭圆环病毒感染进行研究，但目前有关其感染的报道不一。Fringuelli等从匈牙利患病或死亡鸭的法氏囊中检出圆环病毒的阳性率为84%（85/101），从而推测该病毒可能已在当地普遍流行；Chen等对台湾地区2002~2003年间所采集的样品进行检测表明，圆环病毒检出率为38.2%（13/34），而Banda等的研究显示圆环病毒在纽约长岛地区饲养的鸭群中检出率很低；Zhang等从山东省部分发生散发性死亡和生长缓慢的樱桃谷鸭群中进行鸭圆环病毒的调查发现DuCV的阳性率为33.9%。自2006年以来，本研究室从福建、浙江、江西、广东、广西、山东、安徽、海南、河南等九省主要养鸭区的番鸭、半番鸭、樱桃谷鸭、麻鸭、杂交鸭、野鸭等采集的病鸭样品319份、病死鸭样品755份、同群中活的消瘦鸭样品133份，共1207份，分别进行临床诊断疑似疫病的实验室病原学确诊和鸭圆环病毒感染的检测，发现鸭圆环病毒感染的临床表现主要为鸭体生长不良、鸭体器官萎缩和混合感染严重。
鸭圆环病毒的基因组特征国内外进行了大量的研究，目前认为，鸭圆环病毒根据是基因组和Cap蛋白在遗传进化上呈现两个大的遗传进化分支，并将鸭圆环病毒分为鸭圆环病毒基因1型和鸭圆环病毒基因2型。目前，关于鸭圆环病毒基因型（基因1型和基因2型）快速鉴别的多重PCR方法已建有研究报道，但该方法需要分别针对鸭圆环病毒基因型（基因1型和基因2型）设计特异性引物，建立双重PCR检测，但双重PCR条件优化较为繁琐。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速鉴别鸭圆环病毒基因型的PCR-RFLP引物及方法。该特异性引物能有效区分于鸭圆环病毒基因型（基因1型和基因2型）感染（或共感染），为水禽养殖业健康养殖提供技术保证。
本发明根据鸭圆环病毒（基因1型和基因2型）复制蛋白基因编码区中序列特征，设计一组引物能同时对鸭圆环病毒（基因1型和基因2型）进行PCR阳性扩增，根据鸭圆环病毒基因2型（代表株GenBank登录号GQ423745）扩增PCR产物中有特异性的KpnⅠ酶切位点（GGTACC），而鸭圆环病毒基因1型（代表株GenBank登录号EF451157）扩增PCR产物中没有KpnⅠ酶切位点（GTTGCC）（见图1），来对建立一种快速鉴别鸭圆环病毒基因型的PCR-RFLP方法。
本发明采用以下技术方案：
一种快速鉴别鸭圆环病毒基因型的PCR-RFLP方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）提取鸭圆环病毒（基因1型和基因2型）基因组DNA；
（2）用引物P1和P2同时对鸭圆环病毒（基因1型和基因2型）进行PCR扩增，得到相应的目的基因片段；
（3）取PCR产物经KpnⅠ酶切后进行RFLP分析。
其中，PCR引物需满足如下要求：
（1）该PCR产物需选择鸭圆环病毒（基因1型和基因2型）复制蛋白基因编码区基因中的保守区域进行设计，以便能一个PCR反应能对鸭圆环病毒（基因1型和基因2型）基因组DNA均能进行PCR扩增，并获得相同大小的目的基因片段；
（2）该PCR产物需选择鸭圆环病毒（基因1型和基因2型）复制蛋白基因编码区的保守区域进行设计时必须跨过鸭圆环病毒（基因1型和基因2型）中的KpnⅠ酶切位点，以便对PCR产物能够进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析。
根据以上要求，所述的步骤（2）的扩增引物P1和P2的序列为：P1：5’-TGCGCCAAAGAGTCGACATAC-3’，下游引物P2：5’-CAAATTGGTCTCAGTAGTTTATT-3’。
其中，所述的步骤（2）PCR扩增产物经大小为616nt。
其中，所述的步骤（3）PCR产物经KpnⅠ酶切后进行RFLP分析：在所扩增的目的片段中仅鸭圆环病毒基因2型可被KpnⅠ酶切后经常规琼脂糖凝胶电泳检测片段为2段，大小分别为360nt和256nt，而鸭圆环病毒基因1型的目的片段中不含被KpnⅠ酶切位点，PCR产物被KpnⅠ酶切后经常规琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变，仍然是616nt。
本发明的有益效果：鉴定方法简单，快捷和准确率较高。使用本方法对本临床送检15份疑似鸭圆环病毒感染病料进行鸭圆环病毒基因型检测，提取基因组DNA后进行PCR扩增，后进行KpnⅠ酶切检测，其中鸭圆环病毒基因1型感染4株、鸭圆环病毒基因1型感染6株，该15份样品没有检测到共感染。同时对本研究鉴定的鸭圆环病毒基因1型（代表株GenBank登录号EF451157）和鸭圆环病毒基因2型（代表株GenBank登录号GQ423745）进行验证，仅鸭圆环病毒基因2型代表株能够被酶切成2段，而鸭圆环病毒基因1型片段大小不变。本发明提供的方法仅需一组引物（比分别设计特异性引物检测时少1组引物）结合酶切位点差异进行RFLP分析，无虚复杂繁琐的条件优化过程，本发明在快速鉴别鸭圆环病毒基因型检测上快捷准确，可填补国内外相关领域研究空白。
附图说明
图1鸭圆环病毒（基因1型和基因2型）基因分析。
图2为鸭圆环病毒基因型进行快速检测的PCR-RFLP方法的电泳图。M为DL2000DNAMarker,1为阴性对照，2为经KpnⅠ酶切鸭圆环病毒基因1型PCR产物，3为经KpnⅠ酶切鸭圆环病毒基因2型PCR产物，4为鸭圆环病毒基因1型PCR产物，5为鸭圆环病毒基因2型PCR产物。
具体实施方式
下面实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1
1、毒株：
鸭圆环病毒基因1型（代表株GenBank登录号EF451157）和鸭圆环病毒基因2型（代表株GenBank登录号GQ423745）均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。
2、引物设计与合成
根据鸭圆环病毒（基因1型和基因2型）复制蛋白基因编码区基因中基因特征设计引物P1和P2，其中引物P1和P2序列为：P1：5’-TGCGCCAAAGAGTCGACATAC-3’，下游引物P2：5’-CAAATTGGTCTCAGTAGTTTATT-3’。
3、PCR扩增
将临床送检的疑似病料，按照TransDirectAnimalTissuePCRKit（北京全式金生物技术有限公司）说明书进行操作，取40μL的AD1Buffer中加入10μL的AD2Buffer，混匀后，加入用干净无菌的剪刀剪碎的待检测病料，室温放置10min后95℃孵育3min，加入40μLAD3Buffer，混匀后直接作为模板进行PCR扩增。反应体系为20μL，其中模板4μL、上下游引物（10μM/mL）各0.4μL、2×TransDirectPCRSuperMix10μL，补充灭菌去离子水至终体积20μL。反应条件为94℃预变性8min，随后进行94℃40s、52℃30s、72℃40s，进行40个循环后，72℃延伸10min。
4、RFLP分析
PCR反应结束后，将鸭圆环病毒（基因1型和基因2型）PCR产物进行KpnⅠ酶切。酶切体系为30μL，其中10×LBuffer3μL，PCR产物15μL，KpnⅠ酶1.5μL、补充灭菌去离子水至终体积30μL。混匀后，经37℃水浴60min，加入3μL10×LoadingBuffer终止，进行常规琼脂糖凝胶电泳分析，对检测样品进行分析鸭圆环病毒（基因1型和基因2型）感染类型。
5、临床应用
使用本方法对本临床送检15份疑似鸭圆环病毒感染病料进行鸭圆环病毒基因型检测，提取基因组DNA后进行PCR扩增，后进行KpnⅠ酶切检测，其中鸭圆环病毒基因1型感染4株、鸭圆环病毒基因1型感染6株，该15份样品没有检测到共感染。同时对本研究鉴定的鸭圆环病毒基因1型（代表株GenBank登录号EF451157）和鸭圆环病毒基因2型（代表株GenBank登录号GQ423745）进行验证，仅鸭圆环病毒基因2型代表株能够被酶切成2段，而鸭圆环病毒基因1型片段大小不变。在临床样品检测时若选用TransDirectAnimalTissuePCRKit相关产品，可省去常规提取基因组DNA的繁琐步骤，节省操作时间，大大提高检测效率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCELISTING
<110>福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120>快速鉴别鸭圆环病毒基因型的PCR-RFLP引物及方法
<130>2
<160>2
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tgcgccaaagagtcgacatac21
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
caaattggtctcagtagtttatt23

Claims (3)

1.一种快速鉴别鸭圆环病毒基因型的PCR-RFLP引物，其特征在于：所述引物为上游引物引物P1：5’-TGCGCCAAAGAGTCGACATAC-3’，下游引物P2：5’-CAAATTGGTCTCAGTAGTTTATT-3’。
2.一种快速鉴别鸭圆环病毒基因型的PCR-RFLP方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）从检测样品中提取病毒的DNA；
（2）用上游引物引物P1：5’-TGCGCCAAAGAGTCGACATAC-3’，下游引物P2：5’-CAAATTGGTCTCAGTAGTTTATT-3’，同时对鸭肝炎病毒1型和新血清型进行RT-PCR扩增，得到相应的目的片段，大小均为616nt；
（3）取PCR产物经KpnⅠ酶切后进行RFLP分析：在所扩增的目的片段中仅鸭圆环病毒基因2型可被KpnⅠ酶切后经常规琼脂糖凝胶电泳检测片段为2段，大小分别为360nt和256nt，而鸭圆环病毒基因1型的目的片段中不含被KpnⅠ酶切位点，PCR产物被KpnⅠ酶切后经常规琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变，仍然是616nt。
3.一种如权利要求1所述的引物在鉴别鸭圆环病毒基因1型和基因2型鉴别诊断试剂盒上的应用。
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