CN107663531B - 区分禽流感病毒na基因不同遗传进化分支的pcr-rflp引物及其检测方法和应用 - Google Patents

区分禽流感病毒na基因不同遗传进化分支的pcr-rflp引物及其检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种区分禽流感病毒NA基因不同遗传进化分支的PCR‑RFLP引物及其检测方法和应用，所述引物的序列为：上游引物N6F：5’‑ACAGATGGTCCGGCAAACAAC‑3’；下游引物N6R：5’‑CATTCCTTGTTTGCCCAGTAGT‑3’，利用该引物建立PCR‑RFLP检测方法，该引物对亚分支1神经氨酸酶N6基因以及亚分支2神经氨酸酶N6基因均可扩增，对扩增的PCR产物进行限制性内切酶EcoRⅠ酶切并根据琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物有1条带还是2条带，特异性地对两个亚分支神经氨酸酶N6基因进行鉴别诊断；本发明鉴定方法简单、准确率较高，可应用于两种亚分支神经氨酸酶N6基因的鉴别。

Description

区分禽流感病毒NA基因不同遗传进化分支的PCR-RFLP引物及 其检测方法和应用
技术领域
本发明属于动物传染病学领域，具体涉及一种区分禽流感病毒NA基因不同遗传进化分支的PCR-RFLP引物及其检测方法和应用。
背景技术
禽流感(avian influenza，AI)是由A型流感病毒引起的主要侵害家禽及野鸟的一种急性、高度接触性传染病，可引起禽类出现大量死亡、产蛋量下降、严重的呼吸道系统综合症或隐性感染等多种病型。目前禽流感遍布世界各地，给各国养禽业造成巨大的经济损失。
A型流感病毒不仅对养禽业造成严重危害，而且具有重要的公共卫生学意义，某些亚型的禽流感病毒可以引起人的感染，但通常这种感染不会在人与人之间引起连续传播。禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)属于正黏病毒科、A型流感病毒属，其基因组为单股负链分节段的RNA，其基因组分为8个片段，分别为PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS。依照流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)结构及特性的不同，可将A型流感病毒分为若干亚型，迄今共发现18种HA亚型(H1～H18)和11种NA亚型(N1～N11)。H5N6亚型AIV是近年来发现的基因重组型禽流感病毒，研究表明当前流行的H5N6亚型禽流感病毒的NA基因遗传进化上可分为两个亚分支。目前含有这两个亚分支NA的H5N6亚型禽流感病毒均有流行，然而神经氨酸酶N6基因各毒株之间同源性高达90％，常规分子生物学方法(如普通PCR)不容易区分，亟待一种鉴别两种亚分支N6基因的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高敏感、高特异性的快速区分禽流感病毒NA基因不同遗传进化分支的PCR-RFLP引物和应用及其区分禽流感病毒NA基因不同遗传进化分支的PCR-RFLP检测方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：一种区分禽流感病毒NA基因不同遗传进化分支的PCR-RFLP引物，所述引物的序列如下：
上游引物N6F：5’-ACAGATGGTCCGGCAAACAAC-3’；
下游引物N6R：5’-CATTCCTTGTTTGCCCAGTAGT-3’。
一种区分禽流感病毒NA基因不同遗传进化分支的PCR-RFLP检测方法，
利用上游引物N6F：5’-ACAGATGGTCCGGCAAACAAC-3’和下游引物N6R：5’-CATTCCTTGTTTGCCCAGTAGT-3’建立PCR-RFLP检测方法；所述引物对亚分支1神经氨酸酶N6基因以及亚分支2神经氨酸酶N6基因均可扩增，扩增条带大小均为530bp；对亚分支1神经氨酸酶N6基因以及亚分支2神经氨酸酶N6基因的PCR产物进行限制性内切酶EcoRⅠ酶切，亚分支2神经氨酸酶N6基因扩增的PCR产物可切成2条片段；而亚分支1神经氨酸酶N6基因扩增的PCR产物经限制性内切酶EcoRⅠ酶切后没有变化，还是原来PCR产物的片段，根据琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物有1条带还是2条带，特异性地对两个亚分支神经氨酸酶N6基因进行鉴别诊断。
为了表述方便，本发明将两种亚分支神经氨酸酶N6基因分别命名为亚分支1神经氨酸酶N6基因以及亚分支2神经氨酸酶N6基因。
所述的区分禽流感病毒NA基因不同遗传进化分支的PCR-RFLP引物的应用，在制备区分神经氨酸酶N6基因两个亚分支的试剂盒上的应用。
所述的区分禽流感病毒NA基因不同遗传进化分支的PCR-RFLP引物的应用，在检测亚分支1神经氨酸酶N6基因病毒以及亚分支2神经氨酸酶N6基因病毒感染情况方面的应用。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：本发明鉴定方法简单，方便高效、准确率较高，可应用于对两种亚分支神经氨酸酶N6基因的快速鉴别。
本发明根据N6基因的两种亚分支基因序列在1077-1082位的酶切位点不同，来设计特异性的引物和选取酶切位点。可达到仅需一组引物，并结合两种基因亚型核苷酸序列的特征，利用EcoRⅠ限制性内切酶进行RFLP酶切分析，即可特异性地对两种亚分支(亚分支1和亚分支2)神经氨酸酶N6基因进行鉴别诊断，当前国内外未见相关研究报道，本发明可填补相关领域空白。
附图说明
图1是神经氨酸酶N6基因的遗传进化分析图。
图2是不同亚分支N6基因酶切位点比较图。
图3是神经氨酸酶N6基因PCR扩增产物及酶切产物的电泳图。
图4是目的片段测序结果分析图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
一种区分禽流感病毒NA基因不同遗传进化分支的PCR-RFLP引物，所述引物的序列如下：
上游引物N6F：5’-ACAGATGGTCCGGCAAACAAC-3’；
下游引物N6R：5’-CATTCCTTGTTTGCCCAGTAGT-3’。
为了对亚分支1神经氨酸酶N6基因以及亚分支2神经氨酸酶N6基因进行精准的区分，本发明的发明人设计了多组引物，但经试验发现该组引物(上游引物N6F以及下游引物N6R)与神经氨酸酶N6基因两种亚分支的核苷酸序列的特征相结合，利用EcoRⅠ限制性内切酶进行RFLP酶切分析，能够特异性的对亚分支1神经氨酸酶N6基因以及亚分支2神经氨酸酶N6基因进行鉴别诊断。
经分子生物学软件分析神经氨酸酶N6基因两种亚分支的核苷酸序列发现，在1077-1082位这两种亚分支的酶切位点不同，一种亚分支的酶切位点为GAATTC，能被EcoRⅠ限制性内切酶所识别，而另一种亚分支该位点的序列为GAACTC(如图2所示)，不能被EcoRⅠ限制性内切酶所识别。本发明就是根据N6基因的两种亚分支基因序列在1077-1082位的酶切位点不同，来设计特异性的引物和选取酶切位点。
本发明的引物对亚分支1神经氨酸酶N6基因以及亚分支2神经氨酸酶N6基因均可扩增，亚分支1神经氨酸酶N6基因以及亚分支2神经氨酸酶N6基因扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，发现两种基因扩增条带大小均为530bp；
对亚分支1神经氨酸酶N6基因以及亚分支2神经氨酸酶N6基因的PCR产物进行限制性内切酶EcoRⅠ酶切，并将酶切后的产物进行凝胶电泳发现：亚分支2神经氨酸酶N6基因扩增的PCR产物可切成2条片段，大小分别为351bp和179bp；而亚分支1神经氨酸酶N6基因扩增的PCR产物经限制性内切酶EcoRⅠ酶切后没有变化(530bp)。根据琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物有1条带(530bp)还是2条带(351bp和179bp)即可特异性地对两个亚分支(亚分支1和亚分支2)神经氨酸酶N6基因进行快速鉴别诊断。
一种区分禽流感病毒NA基因不同遗传进化分支的PCR-RFLP检测方法，利用上游引物N6F：5’-ACAGATGGTCCGGCAAACAAC-3’和下游引物N6R：5’-CATTCCTTGTTTGCCCAGTAGT-3’建立PCR-RFLP检测方法；所述引物对亚分支1神经氨酸酶N6基因以及亚分支2神经氨酸酶N6基因均可扩增，扩增条带大小均为530bp；对亚分支1神经氨酸酶N6基因以及亚分支2神经氨酸酶N6基因的PCR产物进行限制性内切酶EcoRⅠ酶切，亚分支2神经氨酸酶N6基因扩增的PCR产物可切成2条片段；而亚分支1神经氨酸酶N6基因扩增的PCR产物经限制性内切酶EcoRⅠ酶切后没有变化，还是原来PCR产物的片段，根据琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物有1条带还是2条带，特异性地对两个亚分支神经氨酸酶N6基因进行鉴别诊断。
所述的区分禽流感病毒NA基因不同遗传进化分支的PCR-RFLP检测方法，它包括以下步骤：
(1)核酸的提取：提取病毒样本的RNA；
(2)cDNA的制备：将步骤(1)提取的RNA分别反转录为cDNA；
(3)PCR扩增反应：
利用上游引物N6F：5’-ACAGATGGTCCGGCAAACAAC-3’和下游引物N6R：5’-CATTCCTTGTTTGCCCAGTAGT-3’对步骤(2)得到的cDNA进行PCR扩增反应；
(4)PCR产物的酶切：
将步骤(3)扩增的PCR产物利用RFLP进行EcoR I酶切反应；
(5)琼脂糖凝胶电泳：
对步骤(4)酶切所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳；观察琼脂糖凝胶电泳，亚分支2神经氨酸酶N6基因扩增的PCR产物可切成2条片段，1条大小为351bp，另1条大小为179bp；而亚分支1神经氨酸酶N6基因扩增的PCR产物经限制性内切酶EcoRⅠ酶切后没有变化，即还是原来PCR产物的那1条片段；
其中，步骤(3)所述PCR扩增反应的优化体系为：在50μL体系中含有以下成分：
Figure BDA0001469411210000041
Figure BDA0001469411210000051
步骤(3)所述PCR扩增反应的反应条件为：94℃5min，预变性；94℃30s，54℃30s，72℃35s，共35个循环；72℃10min。
步骤(4)所述酶切反应的体系为：在30μL体系中含有以下成分：
Figure BDA0001469411210000052
步骤(4)所述酶切反应的反应条件为：37℃水浴反应5min。
实施例一：
1.材料
1.1实验试剂与耗材：200μL PCR管购自Corning公司；
Figure BDA0001469411210000053
One-StepgDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，Premix TaqTM(TaKaRa TaqTM Version 2.0plus dye)PCR试剂盒和QuickCutTM EcoRI限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.2毒株：亚分支1神经氨酸酶N6基因病毒(ZZ03株)、亚分支2神经氨酸酶N6基因病毒(XZ16株)、禽坦布苏病毒(ATV)、鸭甲肝病毒(DAHV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、减蛋综合征病毒(EDSV)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。
2.N6基因遗传进化分析、酶切位点选择及引物设计
2.1N6基因序列遗传进化分析
从GneBank数据库中下载神经氨酸酶N6基因17株，利用分子生物学软件(MEGA6遗传进化软件)进行遗传进化分析。遗传进化分析时采用NJ法(Neighbor-Joining Methods)，计算1000次重复(Bootstrap＝1 000)，绘制其遗传进化树，明确神经氨酸酶N6基因型遗传进化差异。
从遗传进化关系(图1)可以看出，神经氨酸酶N6基因遗传进化上可分为两个亚分支(亚分支1和亚分支2)。
2.2酶切位点选择
结合软件Oligo7和MEGA6比较分析N6基因两个亚分支(亚分支1和亚分支2)核苷酸序列的差异，发现在1077-1082位这两个亚分支的酶切位点不同，如图2所示，亚分支2神经氨酸酶N6基因的酶切位点为GAATTC，能被EcoRⅠ限制性内切酶所识别，而亚分支1神经氨酸酶N6基因该位点的序列为GAACTC，不能被EcoRⅠ限制性内切酶所识别，所以选取该位点作为区分N6基因两种亚分支(亚分支1和亚分支2)的特异性酶切位点。
2.3引物设计
利用引物设计软件Oligo7，针对N6基因(亚分支1和亚分支2)设计引物，引物序列如下：
上游引物N6F：5’-ACAGATGGTCCGGCAAACAAC-3’；
下游引物N6R：5’-CATTCCTTGTTTGCCCAGTAGT-3’；
该引物满足以下特征：①该引物对两个亚分支(亚分支1和亚分支2)神经氨酸酶N6基因均可扩增，扩增条带大小均为530bp。②亚分支2神经氨酸酶N6基因扩增的PCR产物经限制性内切酶EcoRⅠ酶切后，可切成2条片段，1条大小为351bp，另1条大小为179bp，而亚分支1神经氨酸酶N6基因扩增的PCR产物经限制性内切酶EcoRⅠ酶切后没有变化，还是原来PCR产物的片段。根据琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物有1条带(530bp)还是2条带(351bp和179bp)即可特异性地对神经氨酸酶N6基因两个亚分支(亚分支1和亚分支2)进行鉴别诊断。
3.PCR-RFLP方法建立
3.1核酸的提取
利用北京全式金生物技术有限公司的
Figure BDA0001469411210000061
Viral DNA/RNA Kit核酸提取试剂盒，按照说明书的操作方法提取亚分支1神经氨酸酶N6基因(ZZ03株)、亚分支2神经氨酸酶N6基因(XZ16株)、禽坦布苏病毒(ATV)、鸭甲肝病毒(DAHV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、减蛋综合征病毒(EDSV)的核酸。亚分支1神经氨酸酶N6基因(ZZ03株)、亚分支2神经氨酸酶N6基因(XZ16株)的核酸提取在福建省动物生物安全三级实验室进行。
3.2cDNA的制备
利用北京全式金生物技术有限公司的
Figure BDA0001469411210000071
One-Step gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒，按照说明书的操作方法将以上提取的RNA病毒(N6基因亚分支1、N6基因亚分支2、鸭呼肠孤病毒、禽坦布苏病毒、鸭甲肝病毒)的RNA反转录为cDNA。
3.3PCR反应及其条件的优化
本发明使用的Premix TaqTM(TaKaRa TaqTM Version 2.0plus dye)PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，在结合试剂盒推荐的反应体系配置的基础上对PCR反应液进行了优化，优化出的50μL最佳反应体系的具体配置方法见表1，最佳反应条件为：94℃5min，预变性；94℃30s，54℃30s，72℃35s，共35个循环；72℃10min。
表1PCR反应液的配置
Figure BDA0001469411210000072
3.4PCR产物的酶切
将PCR产物利用RFLP进行EcoR I酶切分析。按照宝生物工程(大连)有限公司的QuickCutTM EcoR I试剂盒推荐的酶切反应体系(30μL体系，具体配置见表2)配置反应液。反应条件：37℃水浴反应5min。
表2酶切反应液的配置
Figure BDA0001469411210000073
Figure BDA0001469411210000081
4.PCR-RFLP的特异性试验
以制备的cDNA或DNA病毒中直接提取的DNA为模板，利用优化的条件进行PCR检测，反应结束后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示，在图3中，M为DL2000分子量标准；1为亚分支1神经氨酸酶N6基因(ZZ03株)PCR扩增产物；2为亚分支2神经氨酸酶N6基因(XZ16株)PCR扩增产物；5为阴性对照；6为禽坦布苏病毒(ATV)；7为鸭甲肝病毒(DHAV)；8为番鸭细小病毒(MDPV)；9为鹅细小病毒(GPV)；10为鸭呼肠孤病毒(DRV)；11为减蛋综合征病毒(EDSV)。
从图3可知：两个亚分支(亚分支1和亚分支2)N6基因均可扩增530bp片段。对家禽常见病原(ATV、DAHV、MDPV、GPV、DRV、EDSV)进行检测，没有扩增出任何条带，说明该引物的特异性好。
对亚分支1神经氨酸酶N6基因以及亚分支2神经氨酸酶N6基因的PCR产物按上述酶切反应体系及反应条件进行限制性内切酶EcoRⅠ酶切，并将酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3中的3与4所示，在图3中，3为亚分支2神经氨酸酶N6基因(XZ16株)PCR扩增产物的酶切产物；4为亚分支1神经氨酸酶N6基因(ZZ03株)PCR扩增产物的酶切产物；从图3可知：亚分支2神经氨酸酶N6基因扩增的PCR产物经限制性内切酶EcoRⅠ酶切后，可切成2条片段，1条大小为351bp，另1条大小为179bp，而亚分支1神经氨酸酶N6基因扩增的PCR产物经限制性内切酶EcoRⅠ酶切后没有变化，还是原来PCR产物的片段(530bp)。
5.临床应用
使用本研究建立的PCR-RFLP方法和设计的引物对前期鉴定的N6基因(亚分支1)FQ08株、CL103，N6基因(亚分支2)MQ13株、PT10和QZ06株进行检测，均和预期的相符，经特异性的PCR检测引物Bm-N6-1：5’-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTGAAAATG-3’、Bm-NS-890R:5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3’(引物来源于文献：Hoffmann E,Stech J,Guan Y,et al.Universal primer set for the full-length amplification of allinfluenza A viruses.Arch Virol,2001,146(12):2275-2289.)检测，也为N6基因阳性，阳性符合率为100％。将目的片段进行克隆测序，序列分析也符合上述特征，如图4所示。
对临床送检的103份鸭源病料样品进行检测后发现，N6基因(亚分支1)有1份，阳性率为0.97％，N6基因(亚分支2)有2份，阳性率为1.94％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 区分禽流感病毒NA基因不同遗传进化分支的PCR-RFLP引物及其检测方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
acagatggtc cggcaaacaa c 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
cattccttgt ttgcccagta gt 22

Claims (6)

1.一种区分H5N6亚型禽流感病毒亚分支1神经氨酸酶N6基因和亚分支2神经氨酸酶N6基因的PCR-RFLP检测方法，所述方法为非疾病诊断目的的方法，其特征在于：
利用上游引物N6F：5’-ACAGATGGTCCGGCAAACAAC-3’和下游引物N6R：5’-CATTCCTTGTTTGCCCAGTAGT-3’建立PCR-RFLP检测方法；所述引物对亚分支1神经氨酸酶N6基因以及亚分支2神经氨酸酶N6基因均可扩增，扩增条带大小均为530 bp；对亚分支1神经氨酸酶N6基因以及亚分支2神经氨酸酶N6基因的PCR产物进行限制性内切酶EcoRⅠ酶切，亚分支2神经氨酸酶N6基因扩增的PCR产物可切成2条片段，1条大小为351 bp，另1条大小为179bp；亚分支1神经氨酸酶N6基因扩增的PCR产物经限制性内切酶EcoRⅠ酶切后没有变化，仍为一条片段，大小为530 bp；根据琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物有1条带还是2条带，特异性地对两个亚分支神经氨酸酶N6基因进行鉴别；
所述亚分支1神经氨酸酶N6基因的GenBank登录号为KP732681.1、KP286439.1、KU042821.1、KJ938660.1、KP083453.1、KM251490.1、KM873640.1或KJ807783.1；
所述亚分支2神经氨酸酶N6基因的GenBank登录号为KT952282.1、KX151178.1、MF182416.1、KX652138.1、KT454949.1、KU143365.1、KR063689.1、KY415719.1或KP090449.1。
2.根据权利要求1所述的区分H5N6亚型禽流感病毒亚分支1神经氨酸酶N6基因和亚分支2神经氨酸酶N6基因的PCR-RFLP检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：
（1）核酸的提取：提取病毒样本的RNA；
（2）cDNA的制备：将步骤（1）提取的RNA分别反转录为cDNA；
（3）PCR扩增反应：
利用上游引物N6F：5’-ACAGATGGTCCGGCAAACAAC-3’和下游引物N6R：5’-CATTCCTTGTTTGCCCAGTAGT-3’对步骤（2）得到的cDNA进行PCR 扩增反应；
（4）PCR产物的酶切：
将步骤（3）扩增的PCR产物进行EcoR I酶切反应；
（5）琼脂糖凝胶电泳：
对步骤（4）酶切所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳；观察琼脂糖凝胶电泳，亚分支2神经氨酸酶N6基因扩增的PCR产物可切成2条片段，1条大小为351 bp，另1条大小为179 bp；而亚分支1神经氨酸酶N6基因扩增的PCR产物经限制性内切酶EcoRⅠ酶切后没有变化，仍为一条片段，大小为530 bp。
3.根据权利要求2所述的区分H5N6亚型禽流感病毒亚分支1神经氨酸酶N6基因和亚分支2神经氨酸酶N6基因的PCR-RFLP检测方法，其特征在于：步骤（3）所述PCR扩增反应的优化体系为：在50 μL体系中含有以下成分：
Figure 401924DEST_PATH_IMAGE001
。
4.根据权利要求2所述的区分H5N6亚型禽流感病毒亚分支1神经氨酸酶N6基因和亚分支2神经氨酸酶N6基因的PCR-RFLP检测方法，其特征在于：步骤（3）所述PCR扩增反应的反应条件为：94 ℃ 5min，预变性；94 ℃ 30 s、54℃ 30 s、72℃ 35 s，共35个循环；72℃ 10min。
5.根据权利要求2所述的区分H5N6亚型禽流感病毒亚分支1神经氨酸酶N6基因和亚分支2神经氨酸酶N6基因的PCR-RFLP检测方法，其特征在于：步骤（4）所述酶切反应的体系为：
在30 μL体系中含有以下成分：
Figure 552282DEST_PATH_IMAGE002
。
6.根据权利要求2所述的区分H5N6亚型禽流感病毒亚分支1神经氨酸酶N6基因和亚分支2神经氨酸酶N6基因的PCR-RFLP检测方法，其特征在于：步骤（4）所述酶切反应的反应条件为：37℃水浴反应5 min。
CN201711131516.XA 2017-11-15 2017-11-15 区分禽流感病毒na基因不同遗传进化分支的pcr-rflp引物及其检测方法和应用 Active CN107663531B (zh)

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